NGHIÊN cứu xây DỰNG QUY TRÌNH sản XUẤT mẫu HUYẾT THANH sử DỤNG TRONG CHƯƠNG TRÌNH nội KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG xét NGHIỆM

nội bộ một phòng xét nghiệm, được thực hiện bởi nhân viên của phòng xétnghiệm nhằm đánh giá liên tục các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng xétnghiệm, từ đó đi đến quyết định liệu kết quả x

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới Ban Giám hiệu, Phòng Quản lý đào tạo đại học trường Đại học Y Hà Nội đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS.TS Đặng Thị Ngọc Dung cùng ThS Phạm Thị Hương Trang các cô đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong

quá trình học tập cũng như nghiên cứu khoa học

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, anh chị trong khoa xét nghiệm Bệnh viện Đại học Y Hà Nội đã giúp đỡ tôi nhiệt tình, tạo mọi thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận này.

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới cha mẹ, những người đã sinh thành và nuôi dạy tôi, cùng với những người thân trong gia đình, anh em bè bạn đã chia sẻ động viên giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập.

Hà Nội, tháng 5 năm 2016

Sinh viên Nguyễn Xuân Đạt

Tôi là Nguyễn xuân Đạt, sinh viên Trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Cử Nhân Kỹ Thuật Y Học, xin cam đoan:

1 Đây là khoá luận do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Đặng Thị Ngọc Dung cùng ThS Phạm Thị Hương Trang.

2 Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn trung thực và khách quan.

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những cam kết này.

Hà Nội, tháng 5 năm 2016

Sinh viên Nguyễn Xuân Đạt

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Bệnh viêm gan B 3

1.1.1 Lịch sử bệnh viêm gan B 3

1.1.2 Đặc điểm sinh học của bệnh viêm gan B 5

1.1.3 Cấu trúc của virus viêm gan B 5

1.1.4 Cấu trúc kháng nguyên của virus viêm gan B 6

1.1.5 Dấu ấn HBsAg huyết thanh khi nhiễm HBV 7

1.1.6 Phòng bệnh không đặc hiệu 9

1.1.7 Phòng bệnh đặc hiệu 9

1.1.8 Phương pháp trực tiếp: 10

1.1.9 Phương pháp gián tiếp 10

1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng xét nghiệm 13

1.2.1 Giai đoạn trước xét nghiệm 17

1.2.2 Giai đoạn xét nghiệm 17

1.2.3 Giai đoạn sau xét nghiệm 17

1.2.4 Yếu tố ảnh hưởng ở giai đoạn trước xét nghiệm 18

1.2.5 Yếu tố ảnh hưởng ở giai đoạn xét nghiệm 19

1.2.6 Yếu tố ảnh hưởng ở giai đoạn sau xét nghiệm 19

1.2.7 Kiểm tra độ chính xác 20

1.2.8 Kiểm tra độ xác thực 21

1.3 Đông khô mẫu huyết thanh xét nghiệm 21

1.4 Cách tạo mẫu huyết thanh nội kiểm và đánh giá chất lượng mẫu huyết thanh 22

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1.2 Tiêu chuẩn loại bỏ mẫu 24

2.2 Hóa chất và thiết bị 25

2.2.1 Dụng cụ và thiết bị 25

2.2.2 Hóa chất thiết bị sử dụng 26

2.3 Phương pháp nghiên cứu 26

2.3.1 Nguyên lý xét nghiệm 26

2.3.2 Phân tích kết qủa 26

2.3.3 Phân ngưỡng phản ứng 27

2.4 Thiết kế nghiên cứu 28

2.4.1 giai đoạn 1: “tạo các mẫu nội kiểm” 28

2.4.2 giai đoạn 2: “phân điều kiện bảo quản cho lô mẫu” 28

2.4.3 giai đoạn 3: “đánh giá chất lượng của lô mẫu” 28

2.4.4 Thiết kế nghiên cứu 28

2.5 Thu thập và xử lý số liệu 30

2.5.1 Thu thập số liệu 30

2.5.2 Số liệu sử dụng trong kiểm tra độ đồng nhất và độ ổn định 30

2.5.3 Đánh giá các giá trị thông qua tiêu chuẩn của CLIA đề ra 30

2.5.4 Theo kiểm định toán học dưới hướng dẫn của tổ chức ILAC 30

2.5.5 Theo quy tắc kiểm tra chất lượng xét nghiệm quy tắc Westgard 31

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 35

3.1 Chất lượng của các mẫu huyết thanh 35

3.2 Độ đồng nhất của các mẫu 37

3.2.1 Độ đồng nhất của mẫu ban đầu khi chưa đông lạnh hay đông khô 37

3.2.2 Độ đồng nhất của các mẫu sau bảo quản 38

3.3 Độ ổn định của mẫu 39

3.3.2 Theo kiểm định toán học 47

3.4 Tổng hợp 48

Chương 4: BÀN LUẬN 49

4.1 Bàn luận về quy trình sản xuất mẫu huyết thanh nội kiểm 49

4.2 Chất lượng của lô mẫu huyết thanh nội kiểm tự tạo 50

4.2.1 Độ đồng nhất của mẫu 50

4.2.2 Bàn luận về độ ổn định của lô mẫu trong suốt quá trình nghiên cứu 51

KẾT LUẬN 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO

Bảng 3.1: kết quả định lượng các mẫu trước bảo quản 37Bảng 3.2: Thông số xác định độ đồng nhất của các mẫu trước bảo quản 38Bảng 3.3: Thông số xác định độ đồng nhất của các mẫu sau bảo quản 39Bảng 3.4: Các giá trị thiết lập trong 20 ngày liên tiếp để vẽ biểu đồ levey-

jenning cho các lô mẫu 40Bảng 3.5: Tổng hợp số ngày chấp nhận sự ổn định của các mẫu xét nghiệm.48

Hình 3.1 : Biểu đồ westgard cho thấy các kết quả phân tích mẫu A trong 32

ngày 41

Hình 3.2: Kết quả phân tích sau 30 ngày của mẫu C 42

Hình 3.3: kết quả định lượng của mẫu D sau 32 ngày liên tiếp 43

Hình 3.4: kết quả định lượng của mẫu E sau 32 ngày 44

ĐẶT VẤN ĐỀ

Các bộ phận trên cơ thể khi sinh ra đề nắm giữ những vai trò riêng biệtkhi vai trò này mất đi thì bộ phận đó cũng sẽ tiêu biến theo thời gian Là mộttrong ngũ tạng quan trọng nhất trên cơ thể gan nắm giữ những chức năng vôcùng thiết yếu như: chuyển hóa glucid – lipid - protid, tổng hợp protein, dựtrữ B12 – sắt – glucid, tạo mật… Tuy nhiên song hành với cơ thể tốt thì cần điđôi với giữ gìn và tập luyện duy trì do có rất nhiều yếu tố có thể tác động gâytổn hại cho cơ thể, và viêm gan virus B là một trong số đó

Kể từ khi được phát hiện bởi Blumberg vào năm 1965 cho tới nay, theo

tổ chức y tế thế giới ước tính có khoảng 1/3 dân số thế giới đã từng nhiễmHBV, hàng năm có khoảng 240 triệu người mắc viêm gan B mạn tính và 780nghìn người chết bởi viêm gan B [1] Do bệnh có những diễn biến thầm lặngvới các triệu chứng mơ hồ nhưng để lại các biến chứng nặng nề như xơ gan,ung thư gan làm ảnh hưởng không ít đến chất lượng cuộc sống của mọi người

Việt Nam nằm trong khu vực lưu hành cao, tỷ lệ viêm gan B trong quầnthể từ 10-15% đặc biệt có những vùng lên đến 20% Điều này tương đươngrằng Việt Nam có khoảng 8,6 triệu người nhiễm viêm gan hàng năm [2] Tuynhiên hiểu biết của người dân về bệnh viêm gan virus B lại chưa được đầy đủ,chính xác và còn có cả những sai lệch

Ở phòng xét nghiệm việc chẩn đoán viêm gan virus B chủ yếu dựa trênviệc phát hiện kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan B Kháng nguyên nàyđược phát hiện thông qua sàng lọc nhanh bằng test định tính hay xét nghiệmđịnh lượng Các xét nghiệm này được thực hiện bởi các bộ kit do các hãngkhác nhau cung cấp và nó được phổ biến ở hầu hết các đơn vị từ công lập chotới đơn vị tư nhân Tuy nhiên chất lượng của xét nghiệm ở các phòng xétnghiệm này đang là một vấn đề nóng mà toàn xã hội quan tâm

Để tạo được niềm tin ở bệnh nhân phòng xét nghiệm cần phải xây

nghiệm nói chung và của xét nghiệm viêm gan virus B nói riêng Chươngtrình này bao hàm hai chương trình con là nội kiểm tra chất lượng và ngoạikiểm tra chất lượng

nội bộ một phòng xét nghiệm, được thực hiện bởi nhân viên của phòng xétnghiệm nhằm đánh giá liên tục các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng xétnghiệm, từ đó đi đến quyết định liệu kết quả xét nghiệm có đủ tin cậy trướckhi trả cho bác sỹ lâm sàng hoặc bệnh nhân [3]

Ngoại kiểm tra chất lượng là công tác đánh giá việc thực hiện xétnghiệm của các phòng xét nghiệm thông qua so sánh liên phòng xét nghiệm,nghĩa là đánh giá các xét nghiệm trên cùng một mẫu thử nghiệm hay nhữngmẫu nghiệm tương tự được phân tích bởi hai hay nhiều phòng xét nghiệmtheo các điều kiện đã xác định trước [4] Nhằm đem lại sự chính xác trong xétnghiệm viêm gan virus B và nâng cao niềm tin của bệnh nhân với phòng xét

nghiệm chúng tôi xin tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu xây dựng

quy trình sản xuất mẫu huyết thanh sử dụng trong chương trình nội kiểm tra chất lượng xét nghiệm định lượng kháng nguyên HBsAg” với mục tiêu:

1 Nghiên cứu quy trình sản xuất mẫu huyết thanh chuẩn dùng trong xét

nghiệm HBV.

2 Đưa ra những đánh giá ban đầu về chất lượng của mẫu huyết thanh

đông lạnh và đông khô dùng trong xét nghiệm viêm gan virus B.

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Bệnh viêm gan B

1.1.1 Lịch sử bệnh viêm gan B

Vào năm 1963 trong một nghiên cứu về các protein huyết thanh đa hình(polymorphic) Blumberg đã phát hiện ra một protein trong máu của thổ dânAustralia mà trước đó chưa từng được biết tới Hai năm sau đó protein nàyđược gọi với cái tên kháng nguyên Australia nhờ việc ứng dụng của kỹ thuậtxét nghiệm miễn dịch men Tới năm 1968 trong nghiên cứu của Prince,Okochi và Murakami đã xác định được kháng nguyên Australia chỉ được tìmthấy trong huyết thanh của người nhiễm virus viêm gan B, từ đó virus viêmgan B mới được nhận biết và xác lập đặc điểm

Nhờ phát hiện và nghiên cứu về kháng nguyên này mà năm 1976Blumberg đã được trao giải Nobel y học cho công hiến của ông [5]

Tuy nhiên lịch sử loài người đã ghi nhận được rất nhiều trường hợp mắccác bệnh khác nhau gây nên vàng da, các dấu hiệu đó có thể là toàn thân hoặcchỉ diễn ra chủ yếu ở gan Các biểu hiện này được y văn ghi lại với cái tênchung là hội chứng hoàng đảm

Virchow đã mô tả bệnh gan là bệnh vàng da xuất tiết, ông cho rằng vàng

da xuất tiết có nguyên nhân từ viêm đường tắc mật, chất nhầy bám dính làmtắc đường mật, từ đó gây viêm chỗ nối đường mật – tá tràng và do vi khuẩngây ra Năm 1908 Mc.Donald cho rằng tác nhân của vàng da xuất tiết là viruschứ không phải vi khuẩn

Tại Thụy Điển 10 năm sau đó người ta đã đặt ra thuật ngữ viêm gan chobệnh vàng da xuất tiết, đồng thời cũng đã chẩn đoán phân biệt được viêm gandịch tễ và viêm gan huyết thanh

Các nghiên cứu ở Anh và quân y Mỹ đã chỉ ra rằng viêm gan B hiện diệntrong huyết thanh gây vàng da và thường được mang bởi người khỏe mạnhbình thường không vàng da Nhưng tới tận chiến tranh thê giới lần thứ II nhậnthức tổng quát và chính xác về bản chất lây nhiễm của bệnh vàng da xuất tiết

mà Virchow mô tả mới được rõ ràng và chính xác MacCallum cũng đã đềnghị gọi viêm gan B thay cho cái tên viêm gan nhiễm huyết thanh và thuậtngữ này đã được chấp thuận bởi ủy ban của tổ chức y tế thế giới vào năm

1947 [5]

Sau công trình nghiên cứu của Blumberg, các nghiên cứu về viêm gan

B đã được diễn ra ngay trên chính con người Nhờ đó mà các đặc điểm dịch

tễ, bệnh sử và phòng ngừa bệnh viêm gan B được hiểu biết rõ hơn Tuynhiên nó lại rấy lên những vi phạm về đạo đức nên những nghiên cứu nàyphải dừng lại

Nhờ những tiến bộ của ngành sinh học phân tử vào năm 1970 Dane đãphát hiện dưới kính hiểm vi điện tử các hạt nhỏ kích thước khoảng 42nm, nómang trên bề mặt kháng nguyên Australia trong huyết thanh của bệnh nhânviêm gan B và những hạt này được gọi là hạt Dane

Cũng chính nhờ sự tiến bộ không ngừng của ngành công nghệ mà chỉsau đó vài năm Robinson đã nhân dòng và xác định mã chuỗi nucleotideDNA toàn phần của hạt Dane chính là virus viêm gan B bộ gen của virusviêm gan B là bộ gen độc đáo trong thế giới virus do bản chất đậm đặc củachúng, các khung đọc gối lên nhau và do phụ thuộc vào bước phiên mãngược, dù rằng virion chứa chủ yếu là DNA [5]

Cho tới ngày nay chúng ta đã đạt được những tiến bộ không ngừng vềsinh bệnh học, dịch tễ, chẩn đoán điều trị cũng như dự phòng bệnh viêmgan B

1.1.2 Đặc điểm sinh học của bệnh viêm gan B

Virus gây viêm gan là những virus có ái tính với tế bào gan Sau khivirus viêm gan sâm nhập vào cơ thể thì việc gây tổn thương cho các tế bàokhác chỉ là thứ yếu do tế bào đích mà virus hướng tới, xâm nhập nhân lên vàgây tổn thương chủ yếu là tế bào gan Các virus viêm gan đều có tế bào đíchchung là các tế bào viêm gan, nhưng chúng có cấu trúc, đường sâm nhập, cơchế lan truyền… khác nhau Dựa theo kiểu gen hiện nay các virus viêm ganchính được chia làm 8 loại là: HAV, HBV, HCV, HDV, HEV, HFV, HGV vàHHV [6]

1.1.3 Cấu trúc của virus viêm gan B (HBV)

HBV được xếp trong họ Hepadnaviridae, là một virus hình cầu có

đường kính khoảng 42nm Trước đây được gọi là hạt Dane

Cấu tạo của virus từ ngoài vào trong gồm có: bao ngoài cùng là lớp vỏlipid có chứa kháng nguyên bề

mặt là HBsAg Bao quanh một

nucleocapsid bên trong gồm

kháng nguyên lõi viêm gan B

(HbcAg) phức với polymerase

giúp mã hóa và trong cùng là

bộ gen DNA của virus [7]

Cấu trúc của HBsAg có

thể thay đổi để tạo thành nhiểu

thứ týp khác nhau Trong cấu

trúc HBsAg của mọi HBV đều

có thành phần “a” giống nhau

còn các thành phần cấu trúc

khác “y” hoặc “d” “v” “w”

hoặc “r” của các thứ týp là

khác nhau [6]

1.1.4 Cấu trúc kháng nguyên của virus viêm gan B (HBV)

Hạt Dane: huyết thanh người bị nhiễm trùng có chứa một số lượng lớn nhữnghạt có kích thước khoảng 42 nm, đó là những virus còn nguyên vẹn và có khảnăng lây nhiễm [8]

HBV có ba loại kháng nguyên chính :

- HBsAg: có sự thay đổi giữa chính các thứ týp Trọng lượng phân tử thay đổi

từ 21000 đến 24000 dalton Giúp cho sự bám của virus vào tế bào gan

- HBcAg: có trọng lượng phân tử từ 18000 đến 19000 dalton HBcAg chỉ tìm được trong tế bào gan không tìm được trong máu người nhiễm HBV.

- HBeAg: có cấu trúc thay đổi ở các thứ týp Trọng lượng phân tử từ 16000 đến 19000 dalton Kháng nguyên này cũng giống như HBsAg có thể tìm trongmáu, huyêt thanh bệnh nhân [9]

1.1.5 Dấu ấn HBsAg huyết thanh khi nhiễm HBV.

Hình 1 : Thay đổi về dấu ấn huyết thanh của HBV trong giai đoạn

nhiễm viêm gan B cấp tính

http://www.nrl.gov.au/CA25782200833499/Lookup/Presentations/$file/

AmpScrn%20HBV%20Val%20Presentation1.pdf

HBsAg là kháng nguyên bề mặt của HBV, là dấu ấn xác nhận đangnhiễm HBV.

HBsAg xuất hiện trong huyết thanh 1-10 tuần sau khi tiếp xúc cấp vớiHBV, xuất hiện trước khi có triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng

Đối với bệnh nhân phục hồi sau giai đoạn nhiễm cấp, HBsAg sẽ biếnmất sau 4-6 tháng Nhiễm HBV mạn khi HBsAg xuất hiện kéo dài trên 6tháng Ở những người nhiễm mạn, tỷ lệ không còn xuất hiện kháng nguyênHBsAg khoảng 0.5% mỗi năm

Sự xuất hiện Anti HBs chứng tỏ bệnh nhân đã miễn nhiễm với HBV vàhầu như sẽ không nhiễm HBV nữa Một số ít trường hợp, HBsAg xuất hiệntrở lại trên người đã có anti HBc và anti HBs khi bị suy giảm miễn dịch hay

do sử dụng thuốc ức chế miễn dịch hay hóa trị liệu

Hầu hết Anti HBs xuất hiện ngay sau khi HBsAg biến mất Một sốbệnh nhân anti HBs không xuất hiện ngay sau khi HBsAg biến mất mà chỉxuất hiện sau giai đoạn cửa sổ (window period) kéo dài vài tuần hay vàitháng Vì vậy, trong giai đoạn này HBsAg âm, Anti HBs âm chỉ có IgM anti-HBc dương là một dấu ấn cho thấy đang nhiễm cấp

Anti HBs cũng được tạo ra sau chủng ngừa HBV Chủng ngừa chỉ có

thể tạo ra một loại kháng thể duy nhất là Anti HBs

Anti HBs (+) có thể xảy ra trong 2 trường hợp sau :

- anti HBs (+) > đã nhiễm hiện đã lành

- anti HBs (-) > chưa từng bị nhiễm, đáp ứng miễn dịch sau chíchngừa HBV

Sự hiện diện của cả hai HBsAg và antiHBs trong huyết tương gặp trong24% trường hợp có HBsAg (+) [24] Trong tình huống này, cơ thể có tạo ra Anti HBs nhưng với nồng độ thấp không đủ trung hòa hạt tử virus hay virion

trong huyết thanh, vì vậy, những bệnh nhân này cũng được xem như người mang HBV.

Đặc điểm dịch tễ học

Viêm gan B là một trong những bệnh truyền nhiễm phổ biến nhất vànghiêm trọng nhất thế giới Người ta ước tính rằng hơn một phần ba dân sốthế giới đã bị nhiễm viêm gan B Có khoảng 5% dân số (350 triệu người)mang HBV mạn tính Nhiễm HBV gây ra hơn một trăm triệu ca tử vong mỗinăm [10],[11],[12]

Bệnh viêm gan virus B trước đây thường gặp sau truyền máu Ngày nayviệc kiểm tra HBsAg của những người cho máu, nguyên nhân của nhiễmHBV vẫn luôn là một vấn đề thời sự Đường lây truyền hiện nay do tiêmchích, nghiện ma túy, qua đường tình dục, từ mẹ sang con, qua các thiết bị y

tế chưa được tiệt trùng… Có nhiều con đường do vậy trách nghiệm của ngườithầy thuốc rất lớn trong việc tuyên truyền cho mọi người hiểu rõ để tự điềuchỉnh hành vi phòng bệnh

Theo ước tính của tổ chức y tế thế giới khu vực Tây Thái Bình Dươngthì Việt Nam hiện có khoảng 8,6 triệu người nhiễm virus viêm gan B Tỷ lệnhiễm virus mạn tính được ước tính khoảng 8,8% ở phụ nữ và 12,3% ở namgiới [10]

Phòng ngừa và điều trị HBV.

1.1.6 Phòng bệnh không đặc hiệu.

Vấn đề phòng bệnh không đặc là rất quan trọng nó phụ thuộc vào mức

độ nhận thức của từng người để tự điều chỉnh hành vi, tránh nguy cơ lâynhiễm Phòng bằng tiêm huyết thanh người bình thường không có hiệu quảvới HBV có thể dùng globulin đặc hiệu có anti HBV phòng bệnh đặc hiệu.Quan trọng nhất vẫn là nâng cao tầm hiểu biết của mọi người để mọi tự phòngtránh vẫn là cách hiệu quả nhất

1.1.7 Phòng bệnh đặc hiệu.

Vacxin HBsAg được sản xuất bằng cách tinh chế huyết tương củangười nhiễm HBV và hiện có vacxin HBV sản xuất tổ hợp là trụ cột của côngtác phòng bệnh [4]

Thế giới khuyến cáo rằng tất cả các trẻ sơ sinh cần được tiêm phòngcáng sớm càng tốt Tốt nhất là trong vòng 24 giờ đầu sau khi sinh

Tiếp theo liều sau sinh, cần tiêm thêm ba liều nữa để hoàn thành loạttiêm ban đầu

Những người thuộc nhóm có nguy cơ cao cũng cần được chủng ngừa

Họ bao gồm các nhóm đối tượng:

 Những người thường xuyên cần truyền máu hoặc các sản phẩm củamáu, bệnh nhân lọc máu, người nhận ghép tạng

 Người bị giữ trong nhà tù

 Người tiêm chích ma túy

 Người có tiếp xúc với những thành viên gia đình và quan hệ tình dụcvới những người bị nhiễm vi rút viêm gan B mạn tính

 Những người có nhiều bạn tình cũng như nhân viên y tế và nhữngngười có thể phơi nhiễm với máu và các sản phẩm của máu trong khilàm việc

 Du khách chưa hoàn thành liệu trình tiêm chủng vắc xin viêm gan Bcũng cần được tiêm vắc xin trước khi đến vùng có dịch lưu hành [10]

Chẩn đoán lâm sàng

Để chẩn đoán viêm gan B cấp và mạn tính, người ta đã áp dụng các thửnghiệm phát hiện HBsAg và các kỹ thuật miễn dịch học để phát hiện khángnguyên và kháng thể của virus Bên cạnh đó kỹ thuật kính hiển vi điện tử cóthể được sử dụng để xác định HBV trong máu hoặc trong sinh thiết các tổchức gan

1.1.8 Phương pháp trực tiếp:

Là phát hiện hạt virus (hạt Dane) hoặc các thành phần cấu trúc của virus

Cụ thể là phát hiện: hạt virus, DNA của virus, kháng nguyên HBsAg, khángnguyên HBeAg, kháng nguyên HbcAg trong tế bào gan(kết hợp với làm sinhthiết gan)

1.1.9 Phương pháp gián tiếp (phương pháp huyết thanh học):

Là phát hiện các sản phẩm tương tác của virus với cơ thể (kháng thể), cụ thể là phát hiện: HbsAg, anti - HBsAg, anti - HbeAg, anti - HBcAg

Các kỹ thuật được dùng để phát hiện bao gồm:

 Miễn dịch điện hóa phát quang (elctro-chemiluminescence

immunoassay: eclia ):

Khái niệm: Miễn địch điện hóa phát quang là quá trình phản ứng mạnhcủa các chất được tạo ra từ những chất bền vững có trước trên bề mặt của điệncực Phản ứng mạnh của các chất này sẽ tác động trở lại chất tương tự đôngthời phát quang

Nó dựa trên việc sử dụng phức hợp ruthenium-tris (bypyridil) vàtripropylamin (TPA) và cuối cùng sản phẩm quang hóa được tạo ra tại thờiđiểm phát hiện ra bước sóng.

Ba nguyên lý chính được áp đụng ở kỹ thuật này là:

sự phát sáng và cường độ ánh ánh phát ra được đo bằng bộ nhân quang Ánhsáng được phát ra tỷ lệ thuận với nồng độ HBsAg có trong mẫu thử

Nguyên lý này thường được áp dụng rộng rãi ở các máy định lượng này nay

 Miễn dịch gắn enzym (ELISA – Enzyme linked immunosorbent assay):

Kỹ thuật này sử dụng kháng thể hoặc kháng nguyên cố định vào mộttấm polystyren Sau đó nó được dùng để bắt kháng nguyên hoặc kháng thể đốiứng ở dung dịch thử nghiệm và phức hợp được phát hiện nhờ enzyme gắn vớikháng thể hoặc kháng nguyên tác động lên cơ chất đặc hiệu Cơ chất củaenzyme thủy phân đo ở quang phổ kế, tỷ lệ với nồng độ của kháng thể hoặckháng nguyên không biết ở trong dung dịch thử nghiệm Kháng nguyên hoặckháng thể liên hợp với enzyme vẫn giữ hoạt tính miễn dịch Enzyme được sửdụng có thể là photphatase kiễm hoặc peroxydase Thử nghiệm cho kết quảkhách quan và rất nhạy Thử nghiệm miễn dịch liên kết enzyme được áp dựng

để chẩn đoán những vi khuẩn như giang mai, Brucella, Salmonella , vi khuẩntả và các virus như virus viêm gan, virus sởi, virus rota

 Miễn dịch huỳnh quang:

Những thuốc nhuộm huỳnh quang như Fluorescein, Rhodamin có thểkết hợp với kháng thể mà không phá hủy tính chất đặc hiệu của kháng thể.Kháng thể liên hợp ấy có khả năng kết hợp với kháng nguyên và phức hợpkháng nguyên – kháng thể có thể quan sát ở kính hiển vi huỳnh quang Khángthể được liên hợp với thuốc nhuộm huỳnh quang rồi cho tác dụng với khángnguyên (phương pháp trực tiếp) hoặc kháng thể được cho tác dụng trực tiếpvới kháng nguyên rồi cho kết hợp với kháng globulin người liên hợp vớiFluorescein Trước hết cho kháng nguyên cố định lên tiêu bản rồi cho tácdụng với huyết thanh bệnh nhân, rửa để loại bỏ kháng thể thừa sau đó nhỏmột giọt globulin người gắn Fluorescein rồi quan sát ở kính hiển vi huỳnhquang (phương pháp gián tiếp)

 Miễn dịch phóng xạ (Radioimmunoassay- RIA):

Dùng đồng vị phóng xạ như Thymidin H 3, Cacbon 14, I 125 đánhdấu kháng nguyên hoặc kháng thể để theo dõi phản ứng kết hợp khángnguyên kháng thể Có thể xác định vị trí của kháng nguyên (hoặc kháng thể)

đã đánh dấu đồng vị phóng xạ bằng cách cho nhũ tương ảnh lên trên tiêu bản

tổ chức học, sau đó phát hiện bằng các phương pháp chụp ảnh thông thường

Để phát hiện và đo lường đồng vị phóng xạ trong môi trường lỏng, ví dụ cácđồng vị phát xạ beta (như thymidin H3, Cacbon C14), cần dùng một dungdịch nhấp nháy và đo trong máy đếm tự động Phương pháp đồng vị phóng xạkhông những có thể khu trú vị trí kết hợp một cách chính xác mà còn làm tăng

độ nhạy cảm phản ứng lên hàng nghìn lần

1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng xét nghiệm.

Các khái niệm về chất lượng xét nghiệm.

 Chất lượng (Quality): Là mức độ của tập hợp các đặc tính vốn có đáp

ứng các yêu cầu

 Quản lý chất lượng (Quality Management-QM): Là một loạt các hoạt

động có phối hợp để định hướng và kiểm soát một tổ chức về chất lượng.Việc định hướng và kiểm soát về chất lượng một tổ chức nói chung bao gồm:chính sách chất lượng; mục tiêu chất lượng; hoạch định chất lượng; kiểmsoát chất lượng; đảm bảo chất lượng và cải tiến chất lượng

 Kiểm soát chất lượng (Quality Control-QC): Các hoạt động và kỹ

thuật được sử dụng nhằm đáp ứng đầy đủ các yêu cầu chất lượng

 Đảm bảo chất lượng (Quality Assurance-QA): Tất cả các hoạt động

hệ thống được lập kế hoạch thiết yếu nhằm cung cấp độ tin cậy chắc chắnrằng sản phẩm hoặc dịch vụ thỏa mãn các yêu cầu chất lượng

 Đánh giá chất lượng bên ngoài (External Quality Assessment-EQA):

còn được gọi ngoại kiểm hay thử nghiệm thành thạo phòng thí nghiệm:Việc xác định hoạt động thử nghiệm của phòng thí nghiệm bằng so sánh liênphòng [13],[14]

 Nội kiểm tra chất lượng (Internal Quality Control – IQC), gọi tắt là nội

kiểm tra, là công cụ kiểm tra chất lượng hàng ngày trong nội bộ một PXN,được thực hiện bởi nhân viên của PXN nhằm đánh giá liên tục các yếu tố ảnhhưởng đến chất lượng XN, từ đó đi đến quyết định liệu kết quả XN có đủ tincậy trước khi trả cho bác sỹ lâm sàng hoặc bệnh nhân [11]

 Ngoại kiểm tra chất lượng (External Quality Assessment – EQA) thường

được diễn giải là công tác đánh giá việc thực hiện XN của các PXN thông qua

so sánh liên PXN, nghĩa là đánh giá các XN trên cùng một mẫu thử nghiệm

hay những mẫu nghiệm tương tự được phân tích bởi hai hay nhiều PXN theocác điều kiện đã xác định trước [12]

 So sánh liên phòng: Việc tổ chức, thực hiện và đánh giá các thử

nghiệm trên cùng một mẫu thử nghiệm hoặc mẫu thử nghiệm tương tự đượcthực hiện bởi hai hay nhiều phòng thí nghiệm theo các điều kiện xác địnhtrước

Hệ thống đảm bảo chất lượng của phòng xét nghiệm

Hệ thống quản lý chất lượng (HTQLCL) do Viện tiêu chuẩnphòng thí nghiệm và lâm sàng CLSI Hoa Kỳ đề xuất , hệ thống này baohồm 12 thành tố cơ bản bao trùm tất cả các hoạt động của phòng thínghiệm

Tổ chức: Để có hệ thống quản lý chất lượng có chức năng tốt, phòng thí nghiệm phải có cơ cấu tổ chức, quản lý nhằm thực hiện được các chính sách về chất lượng.

 Nhân sự: Nguồn lực của phòng thí nghiệm là vấn đề quan trọngnhất, đó là những nhân viên đủ năng lực, năng động, có tầm nhìn

và điều quan trọng phải có sự khích lệ thúc đẩy các cán bộ tận tâm với côngviệc và tuân thủ các quy định

Trang thiết bị: Thiết bị phải phù hợp với kỹ thuật xét nghiệm, cácthiết bị đảm bảo hoạt đọng tốt và có bảo dưỡng định kỳ

Mua sắm và kiểm kê: Quản lý về cung ứng sinh phẩm và vật tưphòng thí nghiệm nhằm đảm bảo các sinh phẩm và vật tư có chất lượng tốt,

sử dụng đúng mục đích

Kiểm soát quá trình: Bao gồm nhiều yếu tố để đảm bảo chấtlượng của phòng thí nghiệm trong quá trình thực hiện xét nghiệm Nhữngyếu tố này bao gồm kiểm soát chất lượng, thẩm định và công nhận

Quản lý thông tin: Các thông tin phòng thí nghiệm cần được quản lýcẩn thận đảm bảo sự chính xác và bí mật.

Tài liệu và hồ sơ: Tài liệu và hồ sơ luôn được lưu giữ cẩn thận đểđảm bảo sự chính xác và có thể đánh giá được

Quản lý sự cố: Phòng thí nghiệm luôn cần một hệ thống để phát hiệnnhững vấn đề và sự cố, hành động khắc phục, tìm hiểu nguyên nhân và đưa ranhững hành động để không tái diễn các sự cố

Đánh giá: Quá trình đánh giá chính là công cụ để kiểm soát việcthực hiện của phòng thí nghiệm và so sánh với các chuẩn mực để đánh giá

Cải tiến quá trình: Mục đích đầu tiên của HTQLCL là sự cải tiến liêntục các quá trình trong phòng thí nghiệm và sự cải tiến được thực hiện mộtcách hệ thống

Dịch vụ khách hàng: Đảm bảo khách hàng nhận được các dịch vụ cầnthiết cho họ

Cơ sở vật chất và an toàn: Cơ sở vật chất và an toàn bao gồmnhiều vấn đề như: An ninh, an toàn, sức khỏe, môi trường làm việc

Hoạt động của phòng xét nghiệm [18]

Hoạt động của phòng xét nghiệm được chia thành ba giai đoạn: Giaiđoạn trước xét nghiệm, giai đoạn trong xét nghiệm và giai đoạn sau xétnghiệm

1.2.1 Giai đoạn trước xét nghiệm

Là giai đoạn chuẩn bị làm xét nghiệm, chuẩn bị cho việc lấy bệnh phẩm, chuẩn bị bênh nhân, chuẩn bị thuốc thử và các trang thiết bị - dụng cụ cần thiết cho việc làm xét nghiệm

1.2.2 Giai đoạn xét nghiệm

Bao gồm tất cả các bước tiến hành xét nghiệm, tiến hành làm bằng tay bằng máy và tính kết quả xét nghiệm

1.2.3 Giai đoạn sau xét nghiệm

Sử dụng kết quả xét nghiệm vào các mục đích đặt ra

Ở các giai đoạn trên đều có những nguyên nhân dẫn đến sai số Vì vậy cần phối hợp mọi khâu, mọi giai đoạn để khắc phục và loại trừ sai số để cho

ra kết quả xét nghiệm có độ tin cậy

Yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng xét nghiệm.

Chất lượng xét nghiệm đóng vai trò quan trọng trong việc chẩn đoán,điều trị và tiên lượng bệnh Nhiệm vụ cơ bản của cán bộ làm công tác xétnghiệm y học là đảm bảo kết quả của mình phải chính xác, gần với trị số thựcnhất, do có rất nhiều yếu tố có thể ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm, nó cóthể xẩy ra trong cả ba giai đoạn của quá trình xét nghiệm

1.2.4 Yếu tố ảnh hưởng ở giai đoạn trước xét nghiệm

Trong giai đoạn này việc đảm bảo lấy mẫu xét nghiệm một cách chínhxác góp phần không nhỏ vào kết quả tin cậy của xét nghiệm Lấy mẫu làm xétnghiệm là khâu đầu tiên của công tác xét nghiệm nếu khâu này cán bộchuyên trách không nắm vững hiểu rõ xét nghiệm của mình thì rất có thể saisót trong các giai đoạn về sau

 Các yếu tố sinh lý có thể làm sai, lệch kết quả:

Đó là các yếu tố như: Giới, tuổi, chế độ dinh dưỡng, tình trạng tập luyện…

Ví dụ: Một số chất như hemoglobin, acid uric nam cao hơn nữ Cácenzyme AST, ALT ở nam có khoảng giao động cao hơn nữ

Giai đoạn sau xét nghiệm

Giai đoạn trong xét nghiệm

Giai đoạn trước xét nghiệm

Chất lượng xét nghiệm

 Chuẩn bị dụng cụ để lấy bệnh phẩm:

Cần phải phù hợp với từng xét nghiệm, tất cả đều phải vô khuẩn, khô.Cần phải lưu ý khi sử dụng các chất chống đông cho phù hợp

1.2.5 Yếu tố ảnh hưởng ở giai đoạn xét nghiệm

Trong giai đoạn này có các bước tiến hành xét nghiệm có thể dẫn đếnsai số như: Lấy bệnh phẩm, lấy thuốc thử, trộn, đo màu, tính kếtquả………

Ở mỗi bước trong quá trình tiến hành xét nghiệm đều có thể có các sai

số không thể tránh khỏi mặc dù người làm kỹ thuật đã rất thận trọng do cácsai số kỹ thuật

 Sai số bất ngờ (Random error)

Là sai số khó tránh và xảy ra một cách ngẫu nhiên có thể nguyênnhân tới từ việc thuốc thử hỏng, dụng cụ thiết bị không còn chính xác, máy cótrục trặc, thao tác của người làm xét nghiệm chưa thuần thục

 Sai số hệ thống (Systematic error)

Nguyên nhân có thể do: Chất lượng thuốc thử xấu, kỹ thuật xétnghiệm không đặc hiệu, hóa chất chẩn sai hoặc không chĩnh xác

 Sai số bất thường (Gross error):

Là sai số thô bạo thường xảy ra do không thực hiện đúng quy trình,nhầm lẫn thuốc thử, dụng cụ

1.2.6 Yếu tố ảnh hưởng ở giai đoạn sau xét nghiệm

Giai đoạn này chủ yếu là sử dụng kết quả và vận dụng kết quả xétnghiệm vào thực tế lâm sàng

Phương pháp nội kiểm tra chất lượng xét nghiệm [19].

Do có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng xét nghiệm nên việckiểm tra chất lượng xét nghiệm của phòng xét nghiệm là công việc cực cầnthiết Việc kiểm tra này nhằm mục đích:

- Đánh giá những kết quả xét nghiệm thực hiện ở mỗi phòng xét nghiệm.

- Đảm bảo tính tin cậy của các xét nghiệm

- Giúp cho mỗi phòng xét nghiệm tự đánh giá giá trị của kỹ thuật xétnghiệm cùng sự hoạt động có hiệu quả của phòng xét nghiệm của mình

- Đánh giá tay nghề của mỗi cán bộ làm xét nghiệm

- So sánh kết quả xét nghiệm của phòng mình với kết quả xét nghiệmcủa phòng khác áp dụng cùng loại kỹ thuật

Chương trình nội kiểm tra chất lượng xét nghiệm bao gồm:

- Kiểm tra độ chính xác (Precision)

- Kiểm tra độ xác thực (Accuracy)

Một kết quả xét nghiệm được coi là có độ tin cậy khi mà nó có đủ cảhai thông số là độ chính xác và độ xác thực:

Tin cậy = Chính xác + Xác thựcQua các thông số thống kê ta có thể xác định được độ tin cậy của chấtlượng xét nghiệm

1.2.7 Kiểm tra độ chính xác

Khái niệm

Độ chính xác là kết quả xét nghiệm thu được phân tán ít so với trị sốtrung bình (x) Độ chính xác tương ứng với khoảng cách giữa kết quả xétnghiệm riêng lẻ với trị số trung bình Sự phân tán của các kết quả xét nghiệmthu được càng nhỏ thì độ chính xác càng cao và đồ thị hình chuông hẹp.Ngược lại, sự phân tán của các xét nghiệm càng lớn thì độ chính xác càngthấp và đồ thị hình chuông sẽ trở nên dẹt

Các thông số thống kê dùng để kiểm tra độ chính xác gồm có:

- Sự phân phối chuẩn – Đường cong Gauss

- Trị số trung bình (x)

- Phương sai (Vaviance)

- Độ lệch chuẩn (SD – standard deviation)

- Hệ số phân tán (CV – coefficient of variation)

1.2.8 Kiểm tra độ xác thực.

Mỗi chất trong mẫu thử đều có trị số thực của nó, việc xác định trị sốthực của mỗi thành phần trong một mẫu huyết thanh hay mẫu chuẩn đều hếtsức khó khăn Những kết quả có trị số gần đến thực là những trị số có độ xácthực cao Mục đích của kiểm tra độ xác thực của xét nghiệm là phát hiện vàloại bỏ những sai số hệ thống có thể xảy ra trong quá trình làm xét nghiệm.Một phương pháp xét nghiệm thu được kết quả đúng khi kết quả xấp xỉbằng trị số thực của nó

Các tình huốn trong kiểm tra chất lượng xét nghiệm có thể gặp giốngnhư bắn bia

Trị số thực là khái niệm lý tưởng rất khó thực hiện được trên thực tế màchỉ có giá trị số thực theo quy ước Người ta phải lặp lại nhiều lần trên cùngmẫu và kết quả cũng lặp lại nhiều lần được coi là trị số thực

1.3 Đông khô mẫu huyết thanh xét nghiệm.

Khái quát về đông khô.

Đông khô là quá trình khiến sản phẩm đóng thành thể rắn , rồi qua xử lýchân không thăng hoa (sublimes) thành dạng hơi rồi ngưng tụ thành nước và

thải ra ngoài, sản phẩm trở thành dạng khô [25].

Quy trình đông khô được tiến hành tại bộ môn Mô – Phôi học trườngĐại học Y Hà Nội theo hai bước sau đây:

- Bước 1: Đông lạnh huyết thanh ở -750C trong 12 giờ

- Bước 2: Đông khô huyết thanh ở -450C và áp suất chân không đạt 0,04mbar Sử dụng máy LY3-TTE/DM8 của Hà Lan

Thời gian đông khô của các lọ 10 ml huyết thanh là khoảng 2 tới 3 ngày.Sản phẩm cuối cùng thu được sau quá trình đông khô có tỷ lệ ngậmnước <5%

Với phương pháp này các cấu trúc và đặc điểm của kháng nguyên sẽđược giữ ổn định làm cho việc bảo quản mẫu trở nên thuận lợi khi muốn lưugiữ trong thời gian lâu dài

Cách hoàn nguyên mẫu đông khô.

Với nguyên lý làm nước thăng hoa ngay ở trong trang thái đóng đá Giữlại các thành phần hữu hình nên việc hoàn nguyên mẫu huyết thanh đông khôcũng vô cùng đơn giản theo nguyên tắc: “bù lại lượng nước đã thăng hoatrong quá trình đông khô” để hoàn nguyên mẫu ban đầu

1.4 Cách tạo mẫu huyết thanh nội kiểm và đánh giá chất lượng mẫu huyết thanh.

Quy trình sản xuất huyết thanh nội kiểm tự tạo của chúng tôi được thựchiện theo hướng dẫn:

Hàng ngày thu thập các mẫu huyết thanh thừa trong phòng xét nghiệm(loại bỏ những mẫu huyết thanh vỡ hồng cầu, huyết thanh đục, tăngbilirubin ) Huyết thanh được tập trung vào các chai 2 – 3 lít bảo quản ở nhiệt

độ -800C, khi đủ số lượng cần thiết thì rã đông ở nhiệt độ phòng rồi trộn đều,khấy trong vòng một giờ và tránh sủi bọt Sau đó đem li tâm3000vòng/phút/30s hoặc lọc loại bỏ cục huyết rồi chia thành nhiều lọ nhỏ, vô

khuẩn chứa (5,10,20 ml) đậy kín, dán nhãn đề “huyết thanh kiểm tra, ngàylàm…” bảo quản ở -200C Khi tiến thành kiểm tra mỗi lần lấy ra một lọ kiểmtrađộ chính xác (khi dùng huyết thanh kiểm tra cần làm tan và trộn đều trướckhi làm kiểm tra) huyết thanh dùng để kiểm tra này có thể ổn định được từ 1tháng đến 1 năm tùy theo xét nghiệm (có thể cho thêm 10- 20 mg methiotalcho 100ml huyết thanh để chống nhiễm khuẩn) [30].

Để đánh giá chất lượng của mẫu huyết thanh nội kiểm chúng tôi sử dụng

ba phương pháp với mục đích kiểm tra chéo giữa các phương pháp lẫn nhaubao gồm:

- Tiêu chuẩn về giá trị lặp lại được chấp nhận dài hạn của tổ chứcCLIA[28]

- Sử dụng kiểm định gép cặp trong toán thống kê với giả thuyết đưa ra về

sự đồng nhất hay ổn định của mẫu

- Các quy tắc kiểm tra chất lượng xét nghiệm trong phòng thí nghiệmcủa Westgard đề ra [31]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Để định lượng và sản xuất mẫu huyết thanh chuẩn HBsAg dùng trongnội kiểm tra chất lượng xét nghiệm thì đối tượng nghiên cứu được chia ra làm

Nguồn mẫu: được lấy từ Bệnh viện Nhiệt đới Trung ương, Bệnh viện Daliễu Trung ương và Bệnh viện Đại học Y Hà Nội

2.1.1 Tiêu chuẩn chọn mẫu.

- Được lấy đúng thể tích, lấy vào ống không chứa chất chống đông

- Không có hiện tượng tan máu, đục, có váng nổi hay đông dây

- Thời gian lưu mẫu 3 ngày ở 2-8oC

- Thể tích huyết tương trong ống đạt từ 0,5 ml trở lên

2.1.2 Tiêu chuẩn loại bỏ mẫu.

Bất kỳ các mẫu nào có dấu hiệu bất thường, không đạt được các yêu cầu khi lấy mẫu thì đều phải loại bỏ như:

- Có tán huyết

- Có váng đục, đen do nhiễm trùng

- huyết thanh quá đục

- thể tích quá ít, không đủ để lưu trữ