NGHIÊN cứu ỨNG DỤNG và PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ cấp THÀNH PHỐ

cho đề tài số tháng quy đổi Nguyễn Hữu Sáu -Bệnh viện Daliễu Trungương Bộ môn da liễu-Trường đại học Y Hà nội Chủ nhiệm đề tài, xây dựngthuyết minh, các quy trình, tiêuchuẩn xét nghiệm

THUYẾT MINH ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ

I THÔNG TIN CHUNG V Ề ĐỀ TÀI ĐỀ ĐỀ TÀI TÀI

6 Tổng kinh phí thực hiện: 950 triệu đồng, trong đó:

- Từ ngân sách sự nghiệp khoa học : 950 triệu đồng

- Từ nguồn tự có của tổ chức : triệu đồng

7 Phương thức khoán chi

 Khoán đến sản phẩm cuối cùng

 Khoán từng phần, trong đó:

- Kinh phí không khoán : triệu đồng

8 Chủ nhiệm đề tài

Họ và tên: NGUYỄN HỮU SÁU

Ngày, tháng, năm sinh: 04/01/1965 Giới tính: Nam

Học hàm, học vị / Trình độ chuyên môn: Phó giáo sư, Tiến sỹ

Chức danh khoa học: Giảng viên chính

Chức vụ: Phó giám đốc Bệnh viện Da liễu Trung ương

Phó chủ nhiệm Bộ môn Da liễu Trường Đại học Y Hà Nội

Điện thoại: Tổ chức: 04.38521185; Nhà riêng:; Mobile: 0936767866

Fax: 04.38522665 E-mail: nguyenhuusau@yahoo.com

B1-2a-TMĐTCN-HN

Tên tổ chức đang công tác: Bệnh viện Da liễu Trung ương

Địa chỉ tổ chức: Số 15A Phương Mai, Đống Đa, Hà Nội

Địa chỉ nhà riêng: Số 25/2 tổ 80 ngõ 69B Hoàng Văn Thái, Thanh Xuân, Hà Nội

9 Thư ký đề tài

Họ và Tên: TRẦN CẨM VÂN

Ngày, tháng, năm sinh: 07/07/1980 Giới tính: Nữ

Học hàm, học vị: Thạc sỹ, Bác sỹ

Chức danh khoa học: Giảng viên kiêm nhiệm Bộ môn Da liễu ĐHYHN

Chức vụ: Phó trưởng khoa và Phụ trách phòng xét nghiệm Nấm – Ký sinh trùng bệnhviện Da liễu TW

Điện thoại: Tổ chức: 04.38521185 Nhà riêng:04.3461404 Mobile: 0936.903.003Fax: 04.38522665 E-mail: camvanvy@yahoo.com

Tên tổ chức đang công tác: Bệnh viện Da liễu Trung ương

Địa chỉ tổ chức: Số 15A Phương Mai, Đống Đa, Hà Nội

Địa chỉ nhà riêng: Số 9 ngõ 267 Lĩnh Nam, Hoàng Mai, Hà Nội

10 Tổ chức chủ trì đề tài

Tên tổ chức: Bệnh viện Da liễu Trung ương

Điện thoại: 04.35764000 - 04.38521179 Fax : 04.35761649 - 04.38522665E-mail: nidv@nidv.vn Website: http://nidv.vn

Địa chỉ: Số 15A Phương Mai, Đống Đa, Hà Nội

Họ và tên thủ trưởng tổ chức: NGUYỄN VĂN THƯỜNG

Số tài khoản: 301 01 058 01 13 Mã số quan hệ ngân sách:

Tại: Kho bạc nhà nước quận Hai Bà Trưng

11 Các tổ chức phối hợp chính thực hiện đề tài

Tổ chức 1: Bệnh Viện Nhiệt Đới Trung ương

Cơ quan chủ quản: Bộ Y tế

Địa chỉ: Số 78, Đường Giải Phóng, Hai Bà Trưng, Hà Nội

Email: contact@bvnhietdoitw.vn Website:

Họ và tên Thủ trưởng tổ chức: PGS.TS Nguyễn Văn Kính - Giám đốc Bệnh viện

Tổ chức 2: Bệnh viện Da liễu Hà Nội

Địa chỉ: Số 79B – Nguyễn Khuyến –Văn Miếu – Đống Đa - Hà Nội

Email: bvdl@hanoi.gov.vn Wedsite: http://benhviendalieuhanoi.com

Họ và tên Thủ trưởng: BS Nguyễn Quốc Hưng

12 Các cá nhân thực hiện đề tài

Nội dung, công việc chính tham gia

Thời gian làm việc

cho đề tài

(số tháng quy đổi)

Nguyễn Hữu Sáu

-Bệnh viện Daliễu Trungương

Bộ môn da liễu-Trường đại học

Y Hà nội

Chủ nhiệm đề tài, xây dựngthuyết minh, các quy trình, tiêuchuẩn xét nghiệm soi trực tiếp,nuôi cấy và định loại vi nấm

Chủ trì các hội thảo khoa học,xây dựng báo cáo tóm tắt vàbáo cáo tổng kết đề tài

Bộ môn da liễu-Trường đại học

Y Hà nội

Tham gia phân tích số liệu, xâydựng các quy trình, tiêu chuẩnxét nghiệm soi trực tiếp, nuôi cấy

và định loại vi nấm Tham giahội thảo khoa học

4

3 TS Lê Văn Duyệt

Bệnh việnbệnh Nhiệt đớiTrung ương

Thực hiện kỹ thuật PCR, đinhloại vi nấm Malassezia.spp Phântích kết quả xét nghiệm

Tham gia phân tích số liệu,

6 ThS Trần Cẩm Vân Bệnh viện Da

liễu Trungương

Thư ký đề tài, tham gia xâydựng thuyết minh, thực hiện kỹthuật soi trực tiếp, nuôi cấyđịnh loại vi nấm, phân tích và

xử lý số liệu Tham gia xâydựng các quy trình, tiêu chuẩn

9

xét nghiệm soi trực tiếp, nuôicấy và định loại vi nấm, xâydựng báo cáo tổng kết, báo cáotóm tắt, tổ chức hội thảo khoahọc

7 ThS Nguyễn Minh Thu

Bệnh viện Daliễu Trungương

Tham gia thực hiện kỹ thuật soitrực tiếp, nuôi cấy định loại vinấm, phân tích số liệu, đánh giákết quả

4

8 ThS Nguyễn Thị Tuyến

Bệnh viện Daliễu Trungương

Tham gia phân tích số liệu,

9 BSCK2 Trịnh Thị

Phượng

Bệnh viện Daliễu Trungương

Tham gia phân tích số liệu,

10 CN Ngụy Thị Hương

Bệnh viện Daliễu Trungương

Tham gia thực hiện kỹ thuật soitrực tiếp, nuôi cấy định loại vinấm, phân tích số liệu, đánh giákết quả

6

11 CN Trần Kim Chi

Bệnh viện Daliễu Trungương

Tham gia thực hiện kỹ thuật soitrực tiếp, nuôi cấy định loại vinấm, phân tích số liệu, đánh giákết quả

6

II M C TIÊU, N I DUNG KH&CN V PH ỤC TIÊU, NỘI DUNG KH&CN VÀ PHƯƠNG ÁN TỔ CHỨC THỰC HIỆN ĐỀ TÀI ỘI DUNG KH&CN VÀ PHƯƠNG ÁN TỔ CHỨC THỰC HIỆN ĐỀ TÀI À PHƯƠNG ÁN TỔ CHỨC THỰC HIỆN ĐỀ TÀI ƯƠNG ÁN TỔ CHỨC THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NG N T CH C TH C HI N ÁN TỔ CHỨC THỰC HIỆN ĐỀ TÀI Ổ CHỨC THỰC HIỆN ĐỀ TÀI ỨC THỰC HIỆN ĐỀ TÀI ỰC HIỆN ĐỀ TÀI ỆN ĐỀ TÀI ĐỀ TÀI À PHƯƠNG ÁN TỔ CHỨC THỰC HIỆN ĐỀ TÀI T I

13 Mục tiêu của đề tài

- Xác định các chủng Malassezia spp gây bệnh lang ben tại một số bệnh viện trên địa

bàn Hà Nội

- Xây dựng tiêu chuẩn và một số quy trình xét nghiệm soi trực tiếp tìm Malassezia spp.

trong chẩn đoán bệnh lang ben

- Đề xuất áp dụng quy trình và tiêu chuẩn xét nghiệm chẩn đoán nguyên nhân bệnhlang ben cho một số bệnh viện của Hà Nội

14 Tình trạng đề tài

 Mới  Kế tiếp hướng nghiên cứu của chính nhóm tác giả

 Kế tiếp hướng nghiên cứu của người khác

15 Tổng quan tình hình nghiên cứu, luận giải về mục tiêu và những nội dung nghiên cứu của đề tài

15.1 Đánh giá tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực của đề tài

Ngoài nước:

Lang ben là một bệnh nấm nông ở da tiến triển mạn tính, hay tái phát Bệnhthường gặp ở khắp nơi trên thế giới Theo một số nghiên cứu cho thấy ở những vùng khíhậu nhiệt đới nóng ẩm, số người mắc bệnh có thể chiếm 18% dân số Tuy bệnh khôngnguy hiểm đến sức khỏe nhưng ảnh hưởng nhiều đến chất lượng cuộc sống của ngườibệnh

Năm 1846 Eichsedt đã tìm ra Microsporum furfur là căn nguyên gây bệnh lang ben Thành phần các loài thuộc chi Malassezia đã nhiều lần thay đổi trong suốt hai thập

kỷ qua do đã có nhiều phát hiện mới trong quá trình nghiên cứu về loại nấm gây bệnh

này trên toàn thế giới Trong những năm đầu thập niên 1990 các chi Malassezia chỉ có ba loài, gồm có M furfur, M pachydermatis, và M sympodialis Năm 1996, bốn loài khác (M globosa, M obtusa, M restricta, và M slooffiae) đã được xác định thuộc chi

Malassezia bằng cách sử dụng các phân tích so sánh trình tự của DNA ribosom (rDNA)

[1] Từ năm 2002 bảy nhiều loài mới đã được mô tả, trên cơ sở dữ liệu phân tử: gồm có

M Dermatis, M equina, M japonica, M nana, M yamatoensis, M caprae, và M cuniculi [2-7] Như vậy, cho đến nay 14 loài Malassezia gây bệnh đã được xác định.

Sự khác nhau về chủng gây bệnh giữa các nước khác nhau đã tạo nên tính đa

dạng về sự phân bố loài nấm Malassezia Nhiều nghiên cứu đã công bố sự hiện diện của

các loài nấm trên ở nhiều vùng miền khác nhau trên thế giới Năm 2009, Kirsanty TI vàcộng sự xác định các chủng gây bệnh lang ben trên 98 bệnh nhân người Indonesia cho

thấy chủng gây bệnh nhiều nhấy là M furfur ( 42,9%) sau đó là M sympodialis ( 27,%

%), M globosa (13,3%) M restruca (2,2%) Nghiên cứu của Zhen Xie ở Trung quốc ghi

nhận 95,8% chủng gây bệnh lang ben là M globosa sau đó là M restrica (91,7%0, M.

sympodicalis (50%) Nghiên cứu của Elham Zeinali ở Iran cũng cho thấy chủng thưởng

gặp nhất là M globosa sau đó là M pachydermatis và M furfur.

Bình thường nấm Malassezia spp thuộc vi hệ trên da Nhiều nghiên cứu ghi nhận khoảng 70-90% vi nấm Malassezia spp hiện diện trên da người khỏe mạnh [2,5] Khi có

điều kiện thuận lợi chúng có thể gây bệnh Biểu hiện lâm sàng chủ yếu của bệnh lang ben

là những dát tăng sắc tố hoặc giảm sắc tố hình tròn đôi khi bầu dục và giới hạn rõ ràng,trên có vảy da mỏng ẩm Trường hợp nhiều tổn thương có thể liên kết lại với nhau thànhmảng rộng bờ vòng cung Vị trí tổn thương chủ yếu ở vùng da dầu như: ngực, lưng, vùngmặt cổ và gốc chi Nếu không được điều trị, thương tổn có thể lan tỏa toàn thân Khi thờitiết nóng ẩm, tổn thương có thể trở lên đỏ và ngứa

Chẩn đoán xác định bệnh chủ yếu dựa vào biểu hiện lâm sàng và xét nghiệm soitrực tiếp tìm vi nấm Với xét nghiệm này có thể xác định được mật độ và hình thái vinấm, nhưng không thể phân lập và định danh được vi nấm

Để định danh vi nấm, hiện nay trên thế giới có nhiều phương pháp được ứng dụngnhư nuôi cấy, miễm dịch, PCR

Vi nấm Malassezia rất khó mọc ở môi trường nuôi cấy thông thường, đòi hỏinhững môi trường nuôi cấy đặc biệt Tùy từng tác giả sử dụng nhiều môi trường cải tiếnvới sự thay đổi một số thành phần để đạt được kết quả nuôi cấy tốt nhất Nhìn chung haimôi trường được sử dụng nhiều là môi trường Sabouraud dextrose agar và môi trườngDixon’s agar cải tiến Để định danh vi nấm có thể sử dụng nhiều khóa phân loại khác nhau.Chaudhay R và cộng sự ở Ấn Độ sự dụng môi trường Sabouraud dextrose agar có chứacycloheximide với dầu olive và làm phản ứng catalase, test sử dụng Tween 20, 40, 60,

80… để xác định các chủng Malassezia gây bệnh lang ben Tuy nhiên, việc định loại bằng

các phản ứng lý hóa trên không thể phân lâp được tất cả các chủng Nhưng việc nuôi cấyđịnh danh nấm rất quan trọng và cần thiết Vì qua đó, có thể tiến hành làm kỹ thuật khángnấm đồ xác định mức độ nhạy cảm từng chủng nấm với thuốc kháng nấm nhằm lựa chọnkháng sinh thích hợp để điều trị, đặc biệt trong trường hợp bệnh dai dẳng mạn tính và táiphát

Bên cạnh đó, vấn đề miễn dịch tế bào và dịch thể trong bệnh lang ben được quan

tâm nghiên cứu Một số nghiên cứu chỉ ra rằng khi Malassezia gây bệnh làm tăng cường

hệ thống miễn dịch: tắng hoạt hóa hệ thống bổ thể, tế báo T nhớ, tế bào Langerhanthương bì Tuy nhiên, phụ thuộc nồng độ vi nấm và thời gian nhiễm bệnh [28]

Takahasi tiến hành tiêm một lượng nhỏ Malassezia vào màng bụng chuột bị khối u, sau một thời gian triệu chứng viêm nhiễm cải thiện Ông cho rằng vi nấm Malassezia kích

thích đại thực bào tạo Oxy trung gian đến ổ viêm [29].

Nghiên cứu khác ở một sô bệnh nhân bị bệnh mạn tính cho thấy giảm tỷ lệ tế bàoLympho B bằng chứng là Ig G và IgM sau điều trị gia tăng rõ rệt Hoạt động đại thực bào

và bạch cầu đa nhân cũng thay đổi trong trường hợp thương tổn lan rộng…[30]

Midgley tiến hành nghiên cứu sự biến đổi phức hợp miễn dịch kháng nguyên

-kháng thể giữa các loài Malassezia bằng kỹ thuât Elisa Ông nhân thấy sự biến đổi nồng

độ kháng thể phụ thuộc vào kháng nguyên tùy từng loài Malassezia [31] 32].

Trong những năm gần đây, hướng tiếp cận bằng kỹ thuật sinh học phân tử, cụ thể

là sử dụng các kỹ thuật PCR và giải trình tự gen đã tạo nên bước ngoặt lớn góp phần xác

định nhanh, chính xác các loài nấm thuộc chi Malassezia [16,17] Kỹ thuật đầu tiên được

đưa vào ứng dụng là kỹ thuật PCR – kết hợp với enzyme cắt giới hạn các đoạn đa hình(PCR-RFLP), đây là kỹ thuật đơn giản, đáng tin cậy và rất hiệu quả nhưng chi phí lại rất

rẻ, có thể ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán và xác định các loài nấm Malassezia đã

được Mirhendi và cộng sự sử dụng [18]

Đặc điểm của kỹ thuật này là sau khi sử dụng PCR để nhân dòng đoạn ADN thuộcgen 26S rDNA, sản phẩm PCR sau khi nhân dòng sẽ được cắt bằng enzyme giới hạn CfoI,các sản phẩm cắt sau đó được điện di trên gel agarose hoặc polyacrylamide để phân táchcác đoạn DNA đã được cắt Mỗi một loài sẽ có một đặc điểm về các đoạn 26S rDNA khácnhau, dựa trên các đặc điểm này sẽ nhận biết được một cách nhanh chóng và chính xác các

loài thuộc chi Malassezia, bao gồm; M furfur, M pachydermatis, M globosa, M obtuse,

M restricta, M slooffiae, M nana, M japonica, và M Yamatoensis Riêng M sympodialis và M Dermatis lại có cùng các đặc điểm cắt các đoạn đa hình giống nhau nên

không thể sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP để chẩn đoán [18-21] Để khắc phục nhược điểmnày, ngày nay nhiều kỹ thuật Sinh học phân tử hiện đại đã được sử dụng để định danh các

loài nấm thuộc chi Malassezia rất đơn giản và nhanh chóng như kỹ thuật Nested PCR sử

dụng hai cặp mồi đặc hiệu lồng vào nhau (còn gọi là PCR lồng) để làm tăng độ chính xáckhi phát hiện nhiều tác nhân cùng một lúc [22-24], hoặc kỹ thuật Realtime PCR có độ nhạy

và độ đặc hiệu cao hơn nhiều so với kỹ thuật PCR-RFLP cổ điển [25] Điểm nổi bật làtrong vài năm trở lại đây, kỹ thuật giải trình tự nucleotide đã được đưa vào ứng dụng, trởthành một công cụ vô cùng mạnh mẽ và hiệu quả trong định loại vi sinh vật, đặc biệt làtrong các trường hợp không thể thực hiện định danh được bằng các phương pháp thông

thường Đối với định loại Malassezia, việc giải trình tự các đoạn DNA thuộc đoạn internal

transcribed spacer vùng 1 và 2 (IST1 và 2) hay các gen chitin synthase (CHS2), và genRNA polymerase subunit 1 (RPB1) là những gen đích cho hiệu quả phân loại cực kỳ chính

xác và nhanh chóng [26-27]

Trong nước:

Tại Việt Nam năm 2012 - 2013, Nhóm nghiên cứu tại Bệnh viện Da liễu Trung

ương đã tiến hành khảo sát sự hiện diện của Malassezia trong một số bệnh da như: Viêm

da dầu, Viêm da cơ địa, chàm khô Nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm Malassezia spp…

trong một số bệnh da trên tổng số bệnh nấm da dương tính là: Lang ben (1,48%), Viêm dadầu (0,37%), Viêm da cơ địa (0,28%) Tuy tỷ lệ trên chưa cao nhưng phần nào đã phản ánh:

vi nấm Malassezia spp có thể là căn nguyên hoặc có vai trò quan trọng trong căn sinh bệnh

học một số bệnh da Nghiên cứu cũng cho thấy ở vùng da bệnh nhiều hơn gấp 3 lần so với

vùng da lành trong cả 3 bệnh da trên Tuy rằng Malassezia spp tồn tại vi hệ trên da

người bình thường nhưng với số lượng và mật độ rất ít hay chỉ tồn tại thoáng qua màkhông gây bệnh Khi có điều kiện thuận lợi, chúng trở thành tác nhân gây bệnh và khi đómật độ tập trung vùng da bệnh với số lượng và mật độ rất lớn

Gần đây, Bệnh viện Da liễu Trung ương đã nghiên cứu nuôi cấy Malassezia spp.

thành công trên môi trường cải tiến Đây là cơ sở quan trọng giúp cho việc nuôi cấy định loài

Malassezia gây bệnh và xác định mức độ nhạy cảm với các thuốc điều trị hiện nay ở nước ta.

Cho đến hiện nay ở nước ta, chưa có nghiên cứu nào về tình hình nhiễm

Malassezia spp và sự phân bố các chủng gây bệnh Nghiên cứu sự phân bố và tình hình

nhiễm Malassezia spp không chỉ có ý nghĩa về mặt dịch tễ học mà còn là cơ sở khoa học

cho các thầy thuốc thực hành điều trị hiệu quả bệnh lang ben Việc điều trị khỏi và phòngtránh khả năng tái phát phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó sự đáp ứng điều trị của các

chủng Malassezia spp khác nhau ảnh hưởng rất lớn đến kết quả điều trị và phòng tái

phát

15.2 Luận giải về việc đặt ra mục tiêu và những nội dung cần nghiên cứu của đề tài

Cho đến nay, việc chẩn đoán lang ben ở hầu hết các phòng xét nghiệm vi sinhtrên toàn quốc hoàn toàn dựa vào lâm sàng và xét nghiệm soi trực tiếp tìm vi nấm sửdụng dung dịch KOH 10% Việc lấy bệnh phẩm ở hầu hết các cơ sở xét nghiệm đều sửdụng kỹ thuật cạo vảy da nên kết quả chỉ có tính chất định tính nhằm xác định sự có mặthoặc không của vi nấm mà không đánh giá đúng được mật độ vi nấm tập trung trên vitrường nên khó phân biệt được nấm thuộc vi hệ và nấm gây bệnh Nhất là một số bệnh da

được cho là có liên quan đến vi nấm Malassezia spp Do vậy việc áp dụng kỹ thuật lấy

bệnh phẩn bằng băng dính nhằm đánh giá chính xác hơn mật độ vi nấm tại tổn thương làrất cần thiết và có ý nghĩa quan trọng

Tại phòng xét nghiệm vi nấm Bệnh viện Da liễu Trung ương, chúng tôi đã tiến hànhcải tiến phương pháp soi trực tiếp tìm nấm từ cách thức lấy bệnh phẩm bằng băng keo trongđến cách thức nhuộm với công thức pha mới NaOH 20% có kết hợp Blue Black ink, tỷ lệ

(2:1) Kết quả bước đầu đã giúp nhận định hình thái, số lượng, mật độ Malassezia spp.

nhanh chóng, rõ ràng và hạn chế bỏ sót Cần phải có nghiên cứu đánh giá cụ thể giá trịcủa phương pháp này

Việc định danh các loài Malassezia spp gây bệnh và xác định tỷ lệ phân bố của

chúng theo một số đặc điểm lâm sàng cũng như đáp ứng điều trị là công việc quan trọng đốivới không riêng gì các nhà cận lâm sàng mà còn rất cần thiết với các nhà lâm sàng học.Trước

kia, việc nuôi cấy định loại Malassezia spp luôn gặp nhiều khó khăn Chúng không mọc

ở môi trường nuôi cấy thông thường mà đòi hỏi môi trường đặc biệt với nhiệt độ phù hợp

và phải theo dõi trong thời gian dài vì nấm mọc rất chậm và yếu Một số nghiên cứu trên

thế giới tiến hành nuôi cấy và thông thường phải sau 10 ngày vi nấm Malassezia spp.

mới phát triển và sau đó mất 3-4 ngày để định danh Vậy khẳng định tên tuổi của loài

Malassezia spp phải mất trung bình 2 tuần.

Gần đây, phòng xét nghiệm nấm của Bệnh viện Da liễu Trung ương đã nuôi cấy

thành công vi nấm Malassezia spp theo quy trình có cải tiến Qua tiến hành kỹ thuật

chúng tôi nhận thấy có nhiều ưu điểm như: Thời gian mọc nhanh chỉ sau 2-3 ngày, rútngắn thời gian chờ đợi kết quả, hóa chất sẵn có trên thị trường Việc nuôi cấy định loạichủng nấm gây bệnh giúp cho chúng ta có thể tiến hành làm kháng nấm đồ để tìm thuốc

chống nấm thích hợp nhằm điều trị hiệu quả những bệnh lý do Malassezia spp gây ra,

đặc biệt quan trọng trong trường hợp bệnh tái phát nhiều lần hoặc điều trị thất bại

Kỹ thuật DNA sequencing là công trình được công bố bởi Maxam và Gilbert (1977).Tuy nhiên hơn 20 năm qua kỹ thuật này được cải tiến rất nhiều Đặc biệt với sự trợ giúp củacomputer, kỹ thuật huỳnh quang, tiến bộ của phương pháp PCR và kỹ thuật điện di, kỹ thuậtDNA sequencing trở thành công cụ rất có giá trị, làm nền tảng cho phân tích genome

Tuy hiện nay các kỹ thuật công nghệ sinh học rất phát triển nhưng dườngnhư việc ứng dụng các kỹ thuật này để định danh hay chẩn đoán bệnh do nấm

Malassezia spp gây bệnh nấm là rất hiếm, đặc biệt theo chúng tôi tìm hiểu thì chưa thấy

có tài liệu nào nói về kỹ thuật sinh học phân tử trong việc chẩn đoán để phát hiện nấm

Malassezia tại Việt Nam Việc xác định các chủng Malassezia spp gây bệnh lang ben tại

khu vực Hà Nội góp phần bổ sung vào việc đánh giá sự phân bổ của Malassezia spp gây

bệnh lang ben tại Việt Nam, giúp cho việc đưa ra phương pháp điều trị an toàn, hiệu quả

và kinh tế nhất, đặc biệt tránh tái phát và phù hợp với từng bệnh nhân nếu bị nhiễm mỗiloài vi nấm gây bệnh khác nhau

16 Liệt kê danh mục các công trình nghiên cứu, tài liệu có liên quan đến đề tài đã trích dẫn khi đánh giá tổng quan

1 Tajima M, Sugita T, Nishikawa A, et al (2008), “Molecular analysis of Malassezia

microflora in seborrheic dermatitis patients: comparison with other diseases andhealthy subjects” J Invest Dermatol 128(2): p.345-51.

2 Nguyễn Thị Xuân, Trần Cẩm Vân và cộng sự (2012), Khảo sát tình hình nhiễmMalassezia gây bệnh lang ben, viêm da dầu, viêm da cơ địa tại bệnh viện Da LiễuTrung ương, Đề tài cơ sở 2012, trang 65-67

3 Bulmer GS, Pu XM, Yi LX (2008) "Malassezia folliculitis in China".Mycopathologia Jun 2008;165(6):411-2

4 Johansson C, Sandstrom MH, Bartosik J, et al (2003).” Atopy patch test reactions

to Malassezia allergens differentiate subgroups of atopic dermatitis patients” Br JDermatol;148:479-88

5 Zaidi Z, Wahid Z, Cochinwala R, et al (2002) “Correlation of the density of yeastMalassezia with the clinical severity of seborrhoeic dermatitis” J Pak Med Assoc.52(11): p.504-6

6 Nguyễn Thị Đào (1987), “Tình hình các bệnh nấm và các chủng nấm gây bệnh ởmiền bắc Việt Nam (1972-1983)” Tóm tắt công trình nghiên cứu khoa học chọnlọc nghành Da liễu Việt Nam, tr 111-112

7 Gupta AK, Batra R, Bluhm R, et al (2004) “Skin diseases associated withMalassezia species” J Am Acad Dermatol Nov 2004;51(5):785-98

8 Shadzi S and Chadeganipour M (1996) “Isolation of opportunistic fungi frombronchoalveolar lavage of compromised host in Isfahan, Iran”, pp: 79-83

9 Eduardo Silva Lizama (1995) “Tinea versicolor”, Int J dermatol; 39: 611-7

10 Victor Silva, Cintia Di Tilia & Olga Fischman (1996) “Skin colonization byMalassezia furfur in heathy children up to 15 years old” Sao Paolo Brazil, p.132-145

11 Sanchez F Fajardo (2000) ”Malassezia globosa as the causative agent of pityriasisversicolor” British Journal of Dermatology; 143: 799

12 Silva.V, Fischman O, Zaor L (1996), “Important examen microscopi directcuntaneous diagnostic the Malassezia.spp” Revista Iberoamericana de Micologica; 13:90-92

13 GueÂho E, Boeckhout T, Ashbee HR et al.(1998) “The role of Malassezia species

in the ecology of human skin and as pathogens” Med Mycol 1998; 36 (Suppl 1):220-9

14 Tajima M1, Sugita T, et al (2008) “Molecular analysis of Malassezia microflora inseborrheic dermatitis patients: comparison with other diseases and healthysubjects” J Invest Dermatol 128(2):345-51 Epub 2007 Aug 2

15 Tarazooie B1, Kordbacheh P et al (2004) “Study of the distribution of Malasseziaspecies in patients with pityriasis versicolor and healthy individuals in Tehran,Iran” BMC Dermatol, 10.1186/1471-5945-4-5.

16 Ashbee, H.R., Update on the genus Malassezia Med Mycol, 2007 45(4): p 303

287-17 Giusiano, G.E., [Malassezia Current knowledge and study perspectives] RevArgent Microbiol, 2006 38(1): p 41-8

18 Mirhendi, H., et al., A simple PCR-RFLP method for identification anddifferentiation of 11 Malassezia species J Microbiol Methods, 2005 61(2): p 281-4

19 Gaitanis, G., et al., Identification of Malassezia species from patient skin scales byPCR-RFLP Clin Microbiol Infect, 2002 8(3): p 162-73

20 Guillot, J., et al., A single PCR-restriction endonuclease analysis for rapididentification of Malassezia species Lett Appl Microbiol, 2000 31(5): p 400-3

21 Jang, S.J., et al., The Investigation on the Distribution of Malassezia Yeasts on theNormal Korean Skin by 26S rDNA PCR-RFLP Ann Dermatol, 2009 21(1): p 18-26

22 Morishita, N., Y Sei, and T Sugita, Molecular analysis of malassezia microflorafrom patients with pityriasis versicolor Mycopathologia, 2006 161(2): p 61-5

23 Lyakhovitsky, A., A Shemer, and B Amichai, Molecular analysis of Malasseziaspecies isolated from Israeli patients with pityriasis versicolor Int J Dermatol.52(2): p 231-3

24 Amaya, M., et al., Molecular analysis of Malassezia microflora in the lesional skin

of psoriasis patients J Dermatol, 2007 34(9): p 619-24

25 Takahata, Y., et al., Quantitative analysis of Malassezia in the scale of patients withpsoriasis using a real-time polymerase chain reaction assay Br J Dermatol, 2007.157(4): p 670-3

26 Makimura, K., et al., Species identification and strain typing of Malassezia speciesstock strains and clinical isolates based on the DNA sequences of nuclear ribosomalinternal transcribed spacer 1 regions J Med Microbiol, 2000 49(1): p 29-35

27 Sugita, T., et al., Sequence diversity of the intergenic spacer region of the rRNAgene of Malassezia globosa colonizing the skin of patients with atopic dermatitisand healthy individuals J Clin Microbiol, 2003 41(7): p 3022-7

28 Allen, H.B.,C.R Charles, and B.L.Johnson 1976 Hyperpigmented tineaversicolor Arch Dermatol 112:1110-1112

29 Marco A, Coelho, José Paulo Sampaio and Paula Foncalves (2013), Living andThriving on the Skin Malassezia Genomes Tell the Story mBio 4 (2), 1-3.

30 Sparker A.H, Stockes C.R, Gruffydd Jone T.J (1995): Experimental Microsporumcanis infection in cats: Correlation between immunological and clinicalobservations, J.Med Vet Mycol.33 (3), pp 177-84

31 Midgley, G 1989 The diversity of Pityrosporum (Malassezia) yeasts in vivo and invitro Mycopathologia 106:143-155

32 Midgley, G 1993 Morphological variation in Malassezia and its significance inpityriasis versicolor, P267-277

17 Nội dung nghiên cứu khoa học - triển khai thực nghiệm của đề tài và phương án thực hiện

Nội dung 1: Nghiên cứu tổng quan

1.1 Xây dựng thuyết minh đề tài

1.2 Tổng quan các công trình nghiên cứu có liên quan đến đề tài

Nội dung 2: Xây dựng tiêu chuẩn và quy trình xét nghiệm soi trực tiếp tìm

Malassezia spp trong chẩn đoán bệnh lang ben

2.1 Khám, sàng lọc, lựa chọn đối tượng nghiên cứu gồm 300 bệnh nhân lang ben và

200 người da khỏe mạnh

2.2 Lấy mẫu bệnh phẩm và xét nghiệm soi trực tiếp sử dụng dung dịch NaOH 20% + Blue

Black Ink để tìm Malassezia spp trên 150 bệnh nhân và 100 người da khỏe mạnh.

2.3 Lấy mẫu bệnh phẩm và xét nghiệm soi trực tiếp sử dụng dung dịch KOH 10% để

tìm Malassezia spp trên 150 bệnh nhân và 100 người da khỏe mạnh.

2.4 So sánh, đánh giá hiệu quả lấy mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật cạo vảy da và kỹthuật dán băng dính (thời gian lấy mẫu, mức độ khó lấy mẫu tùy theo độ tuổi, vị trívùng da lấy mẫu)

2.5 So sánh, đánh giá hiệu quả giữa việc sử dụng dung dịch NaOH 20% + Blue Black

Ink và sử dụng dung dịch KOH 10% tìm Malassezia spp (thời gian nhuộm, chất

2.8 Xây dựng quy trình xét nghiệm soi trực tiếp tìm Malassezia spp bằng NaOH 20%

+ Blue Black Ink trong chẩn đoán bệnh lang ben

2.9 Xây dựng bảng tiêu chuẩn xét nghiệm soi trực tiếp, đánh giá số lượng, hình thái vi

nấm Malassezia gây bệnh lang ben.

Nội dung 3: Xây dựng các quy trình nuôi cấy và định loại vi nấm Malassezia spp.

gây bệnh lang ben Đánh giá sự phân bố các chủng vi nấm Malassezia

spp gây bệnh lang ben tại một số bệnh viện trên địa bàn Hà Nội.

(giả thiết nghiên cứu: 80% bệnh phẩm xét nghiệm soi trực tiếp dương tính)

3.1 Pha chế các loại môi trường nuôi cấy

3.2 Quan sát thương tổn điển hình và lấy mẫu tiến hành nuôi cấy 240 bệnh phẩm củabệnh nhân lang ben và 160 bệnh phẩm của người da khỏe mạnh (theo dõi nhiệt độ,hình dạng, tốc độ phát triển vi nấm mọc, sự phát triển khuẩn lạc, có nhiễm nấm tạphoặc nấm hoại sinh không gây bệnh)

3.3 Định loại 240 mẫu nuôi cấy của bệnh nhân lang ben và 160 mẫu nuôi cấy củangười da khỏe mạnh

3.4 Xây dựng quy trình nuôi cấy và định loại vi nấm Malassezia spp.

3.5 Xác định chủng vi nấm Malassezia spp gây bệnh lang ben bằng kỹ thuật PCR và

giải trình tự gen trên 50 mẫu nuôi cấy của bệnh nhân lang ben và 50 mẫu nuôi cấycủa người da khỏe mạnh

3.6 Xây dựng quy trình định loại vi nấm Malassezia spp bằng PCR.

3.7 So sánh, đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của các kỹ thuật xác định chủng vi nấm

Malassezia.spp

3.8 Khảo sát, đánh giá mối liên quan giữa chủng vi nấm gây bệnh lang ben với đặcđiểm lâm sàng

3.9 Đánh giá sự phân bố các chủng vi nấm Malassezia spp gây bệnh lang ben tại một

số bệnh viện trên địa bàn Hà Nội

Nội dung 4: Chuyển giao, ứng dụng các quy trình và tiêu chuẩn xét nghiệm, chẩn

đoán nguyên nhân bệnh lang ben cho bệnh viện Da liễu Hà Nội

4.1 Khảo sát, đánh giá thực trạng hoạt động xét nghiệm tại bệnh viện Da liễu Hà Nội4.2 Tập huấn, hướng dẫn thực hành quy trình và tiêu chuẩn xét nghiệm, chẩn đoánnguyên nhân bệnh lang ben cho bệnh viện Da liễu Hà Nội

4.3 Triển khai ứng dụng thử nghiệm các quy trình và tiêu chuẩn trong xét nghiệm,chẩn đoán nguyên nhân bệnh lang ben tại bệnh viện Da liễu Hà Nội

Nội dung 5: Tổng kết đánh giá

5.1 Xây dựng bản đề xuất áp dụng các quy trình và tiêu chuẩn xét nghiệm, chẩn đoánnguyên nhân bệnh lang ben cho một số bệnh viện của Hà Nội

5.2 Đánh giá kết quả ứng dụng thử nghiệm các quy trình và tiêu chuẩn trong xétnghiệm, chẩn đoán nguyên nhân bệnh lang ben tại bệnh viện Da liễu Hà Nội

5.3 Xây dựng bộ báo cáo tóm tắt, báo cáo tổng hợp kết quả thực hiện đề tài

18 Cách tiếp cận, phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật sử dụng

18.1 Cách tiếp cận:

Xuất phát từ thực tế cho thấy số lượng bệnh nhân mắc bệnh lang ben đến khám và

điều trị ngày một gia tăng Nguyên nhân của bệnh do Malassezia spp Tuy nhiên, mỗi vùng

đia lý khác nhau thì tỉ lệ gây bệnh giữa các chủng cũng khác nhau Việc chẩn đoán bệnhdựa vào lâm sàng và xét nghiệm soi tươi có tính chất định tính, không dựa và tiêu chẩn rõràng Nhiều trường hợp khó đánh giá được tình trạng gây bệnh thực sự hay vi hệ Do vậyviệc tối ưu hóa và tiêu chuẩn hóa xét nghiệm soi trực tiếp tìm vi nấm có ý nghĩa hết sứcquan trọng trong chẩn đoán bệnh lang ben nói riêng và đặc biệt có ý nghĩa đối với việc

chẩn đoán một số bệnh da được cho là có liên quan đến Malassezia spp Việc xác định tỉ lệ các chủng Malassezia spp gây bệnh lang ben ở khu vực Hà Nội có ý nghĩa khoa học và thực tiễn giúp cho các nghiên cứu tiếp theo về Malassezia spp gây bệnh ở khu vực Hà Nội

và nước ta, góp phần vào điều trị bệnh hiệu quả nhất và nâng cao chất lượng cuộc sống củangười

Sử dụng phương pháp quy nạp, sau khi quan sát, khám, chẩn đoán xác định, đánhgiá đặc điểm và mức độ tổn thương của từng bệnh nhân,nhóm nghiên cứu sẽ tiến hànhxét nghiệm soi trực tiếp, đánh giá và so sánh hiệu quả của các phương pháp lấy mẫu bệnhphẩm, nhuộm soi phát hiện vi nấm và xác định phương pháp cho kết quả đáng tin cậynhất để có thể xây dựng được các tiêu chẩn cụ thể chính xác để xác định khả năng gây

bệnh của vi nấm Đồng thời, nhóm nghiên cứu sẽ định loại các chủng nấm Malassezia

spp bằng nuôi cấy và PCR Kết quả thu được sẽ tổng hợp, phân tích, viết báo cáo,và xây

dựng các quy trùnh kỹ thuật soi tươi và nuôi cấy Malassezia spp

18.2 Phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật sử dụng

18.2.1 Đối tượng

- Bệnh nhân có biểu hiện lâm sàng bệnh lang ben và xét nghiệm có sự hiện diện của

Malassezia tiến hành tại Bệnh viện Da liễu Trung ương, Bệnh viện Da liễu Hà Nội,

Bệnh viện quân Y 103

- Người khỏe mạnh bình thường không mắc bệnh da bao gồm: Các học viên sau đạihọc và nhân viên bệnh viện không mắc bệnh da tại Bệnh viện Da liễu Trung ương

- Địa điểm: Bệnh viện Da liễu Trung ương, Bệnh viên Da liễu Hà Nội

- Thời gian nghiên cứu: tháng 4/2016 -12/ 2017

18.2.2 Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân

 Dát thay đổi màu sắc trắng ngà, nâu, hồng Có hiện tương tăng hoặc giảm sắc tố

 Vị trí chủ yếu: Da đầu, vùng mặt (rãnh mũi má, vùng trán, cằm, giữa hai cung

mày), nách, lưng, ngực.

 Soi đèn Wood có màu vàng xanh

 Cơ năng: kèm theo ngứa hoặc không

 Bệnh nhân không dùng thuốc trị nấm hoặc thuốc bong sừng bạt vẩy trước đó 5-7ngày

 Bệnh nhân đồng ý tham gia nghiên cứu

18.2.3 Tiêu chuẩn chọn nhóm người da khỏe mạnh

- Các bác sỹ lớp chuyên khoa định hướng, cao học Da liễu và nhân viên bệnh việnkhỏe mạnh, không có bệnh lý về da

- Soi đèn Wood không có tổn thương thay đổi màu sắc trên da

18.2.4 Phương pháp nghiên cứu: Mô tả, tiến cứu

18.2.5 Cỡ mẫu nghiên cứu

Cỡ mẫu nghiên cứu nhóm bệnh

n = Z2 1-α/2

2

)(

- ε: giá trị tương đối (=0,05)

Kết quả tính cỡ mẫu là n = 268 bệnh nhân Trên thực tế do một số lý do kháchquan và để đảm bảo cỡ mẫu nghiên cứu chúng tôi chọn 300 bệnh nhân

Cỡ mẫu nhóm người da khỏe mạnh

Nghiên cứu pilot của chúng tối về ban đầu khảo sát tình hình nhiễm Malassezia

trong một số bệnh da và vùng da lành của bệnh nhân cho thấy trên 446 người da lành có4,9% có >20 TB/VT còn dưới 20 TB/VT là 95,1%

Vậy ước tính cỡ mẫu theo công thức sau

n = Z2 1-α/2

2

)(

- ε: giá trị tương đối (=0,05)

- Kết quả tính cỡ mẫu là n = 200 người

- Hóa chất soi nhuộm:

 NaOH 20% kết hợp Blue Black Ink (1:2)

 Dung dịch KOH 10%

 Thuốc nhuộm Lactophenol blue

 Tiến hành

o Lấy bệnh phẩm, xử lý bệnh phẩm

- Đối chiếu tên, tuổi, chỉ đinh xét nghiệm và giải thích đông viên bệnh nhân hợp tác

- Sát khuẩn thương tổn bằng Ete

- Chọn thương tổn điển hình

- Lấy vẩy da: Tiến hành theo hai cách

 Dùng dao cùn cạo vảy vùng rìa thương tổn, lấy vảy da ẩm mỏng, không lấy vảytiết

 Lấy vẩy da bằng băng dính trong

- Xử lý bệnh phẩm: theo hai cách

 Dùng dung dịch NaOH 20% + Blue Black ink với tỷ lệ (2:1)

 Dung dịch KOH 10%

o Nhận định kết quả: Đánh giá mật độ và hình thái vi nấm/1cm2 ở vật kính 10 và 40

b Nuôi cấy, định loại nấm

 Vật liệu

- Tủ ấm nuôi cấy nấm

- Tủ an toàn sinh học bậc II

- Môi trường đặc biệt để nuôi cấy, phân loại:

 Sabouraud dextro agar + Bile Esculin Agar + Oliu oil SDA đơn thuần, Dixon

m- Catalase Cremophor EL Tween 20, 40, 60, 80

Tiến hành nuôi cấy

- Ghi trên ống thạch nghiêng mã số bệnh nhân, ngày giờ lấy bệnh phẩm

- Thời gian: 2-3 ngày Định kỳ quan sát sự phát triển khuẩn lạc

- Các phản ứng sinh hóa định danh Malassezia spp.

 Nhiệt độ ảnh hưởng tới sự phát triển nấm

 Khả năng đồng hóa Tween bằng phương pháp khuếch tán trên thạch

 Phản ứng Catalase và sự phân hủy Esculin

- Ngoài ra, để phân biệt M.furfur với các loài Malassezia khác chúng ta cần sử

dụng các kỹ thuật sinh hóa như: Cremophor EI làm nguồn chất béo cần thiết

c Kỹ thuật PCR và giải trình tự gen.

 Vật liệu:

- Vật liệu để lưu giữ, bảo quản chủng nấm (môi trường saboro có 20% glycerol)

- Vật liệu để tách DNA của vi khuẩn (kít thương mại Kít tách ADN của hãngQiagen: QiaAmp DNA Mini Kit (USA) và tuân thủ hướng dẫn của nhà sản xuất)

- Vật liệu để tiến hành phản ứng PCR:

 PCR master mix (Qiagen-Mỹ)

 Primer đặc hiệu cho vùng ITS1, ITS2, 5.8S rRNA, 18S rRNA, và 26S rRNA

 Agarose dùng trong điện di

 Gel red dùng để nhuộm gel

 TAE (Tris Acetate EDTA)

 PBS (Phosphate buffer Saline)

- Vật liệu cho giải trình tự gen:

 Big Dye® Terminator (Ready mix) v3.1 cycle sequencing Kit (ABI-USA)

 Big Dye®Terminator v1.1, v3.1 5X sequencing buffer (ABI-USA)

 Pop7 polymer (ABI-USA)

 Capillary 4x50 cm for 3130/3130xl system (ABI-USA)

 Primer (Sử dụng primer R hoặc F, hoặc cả 2 tùy từng trường hợp cụ thể)

 ADN khuôn (sản phẩm PCR đã tinh sạch)

- Hút 200 µl lysis buffer AL vào ống eppendorf 1,5 ml đã có sẵn 20 µl carrier RNA

và 20 µl proteinase K

- Cho 200 µl bệnh phẩm vào ống eppendorf có chứa hỗn hợp Buffer AL - carrier

- RNA - proteinase K Trộn đều bằng cách votex trong 15 giây

(Chú ý: Để đảm bảo cho quá trình ly giải đạt hiệu quả tối đa, quá trình votex phải

được làm cẩn thận)

- Ủ ở nhiệt độ 560C trong 10 phút

- Ly tâm nhẹ để đẩy những dung dịch bám ở nắp ống xuống phía dưới

- Bổ sung thêm 200 µl ethanol (96-100%), trộn đều bằng votex trong 15 giây Saukhi trộn, ly tâm nhẹ để đẩy lượng dung dịch nhỏ bám ở nắp ống xuống phía dưới

- Cẩn thận chuyển toàn bộ dung dịch ở bước 5 lên cột lọc (đã có ống hứng loại 2

ml ở dưới) Đóng nắp và ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 1 phút Loại bỏ ống hứng

có chứa dịch, chuyển cột lọc sang một ống hứng mới

- Mở nắp cột lọc cẩn thận, rửa bằng 500 µl Wash buffer AW1 Đóng nắp và ly tâm

ở 8000 vòng/phút trong 1 phút Loại bỏ ống hứng có chứa dịch, chuyển cột lọcsang một ống hứng mới

- Mở nắp cột lọc cẩn thận, rửa lại bằng 500 µl Wash buffer AW2 Đóng nắp và lytâm ở 14000 vòng/phút trong 3 phút Loại bỏ ống hứng có chứa dịch, chuyển cộtlọc sang một ống hứng mới

- Đặt cột lọc vào một ống hứng mới, ly tâm ở 14000 vòng/phút trong 1 phút

- Đặt cột lọc vào một ống eppendorf 1,5 ml mới và loại bỏ ống hứng có chứa dịch

Mở nắp cột lọc cẩn thận và cho 50 µl Elution buffer AE Đóng nắp và ủ ở nhiệt

độ phòng trong 1 phút Ly tâm ở 8000 vòng/ phút trong 1 phút

o Kỹ thuật PCR

- Theo qui trình của các nghiên cứu trước đây [21]

- Thành phần các chất tham gia phản ứng (được tối ưu trong điều kiện nghiên cứu)

 Nước cất