ẢNH HƯỞNG của THỜI GIAN ủ NOÃN TRƯỚC ICSI đến kết QUẢ THỤ TINH và CHẤT LƯỢNG PHÔI TRONG THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM

BVPSTƯ : Bệnh viện Phụ sản Trung ươngBTĐN : Buồng trứng đa nang CCs : Corona cells: Tế bào vành tia CLG : Centrally located granular: Đám hạt ở trung tâm bào tươngCOC : Cumulus Oocyte Co

ĐẶNG THU HẰNG

ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN Ủ NOÃN TRƯỚC ICSI ĐẾN KẾT QUẢ THỤ TINH VÀ CHẤT LƯỢNG PHÔI TRONG THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC

HÀ NỘI - 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

ĐẶNG THU HẰNG

ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN Ủ NOÃN TRƯỚC ICSI ĐẾN KẾT QUẢ THỤ TINH VÀ CHẤT LƯỢNG PHÔI TRONG THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM

Chuyên ngành: Mô - Phôi thai học

Mã số: 60720102

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa hoc:

1 PGS TS Nguyễn Khang Sơn

2 TS Hồ Sỹ Hùng

HÀ NỘI - 2015

BVPSTƯ : Bệnh viện Phụ sản Trung ương

BTĐN : Buồng trứng đa nang

CCs : Corona cells: Tế bào vành tia

CLG : Centrally located granular: Đám hạt ở trung tâm bào tươngCOC : Cumulus Oocyte Complex: Phức hợp tế bào noãn

FSH : Follicle-stimulating Hormone: Hormone kích thích nang noãnGCs : Granulosa cells: Tế bào hạt

GnRH : Gonadotropin Releasing Hormone

(Hormone giải phóng gonadotropin)

Gran : Granularity: Độ mịn của bào tương

GV : Germinal Vesicle: Nang mầm

GVBD : Germinal Vesicle Break Down: Nang mầm tiêu biến

hCG : Human Chorionic Gonadotropin: Hormone rau thai ngườiICM : Inner Cell Mass: Khối tế bào nội phôi

ICSI : Intra-cytoplasmic Sperm Injection:

(Tiêm tinh trùng vào bào tương noãn)

Incls : Inclusion hay refractile body: Thể vùi

IVF : In-vitro Fertillization: Thụ tinh trong ống nghiệm

KTBT : Kích thích buồng trứng

LH : Luteinizing Hormone: Hormone hoàng thể hóa

LNMTC : Lạc nội mạc tử cung

MI : Metaphase I: Kỳ giữa giảm phân I

MII : Metaphase II: Kỳ giữa giảm phân II

NP : Non – progressive Motility: Di động không tiến tới

NPB : Nucleolar Precursor Body: Thể hạt nhân

NST : Nhiễm sắc thể

PB : Polar Body: Thể cực

PM : Post mature: Quá trưởng thành

PN : Pro Nuclear: Tiền nhân

PR : Progressive motility: Di động tiến tới

PVP : Polyvinyl Pyrolidone

PVS : Perivitelline Space: Khoang quanh noãn

SER : Smooth Endoplasmic Reticulum: Lưới nội bào

TE : Trophectoderm: Nguyên bào lá nuôi

TTTON : Thụ tinh trong ống nghiệm

VS : Vô sinh

VAC : Vacuole: Không bào

ZP : Zona pellucida: Màng trong suốt

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 SỰ PHÁT TRIỂN CỦA NOÃN NGƯỜI 3

1.1.1 Sự hình thành của noãn 4

1.1.2 Sự trưởng thành của noãn 5

1.3 THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM 7

1.3.1 Định nghĩa 7

1.3.2 Các bước tiến hành trong TTTON 7

1.4 ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG NOÃN 9

1.4.1 Đánh giá phức hợp tế bào noãn 9

1.4.2 Đánh giá chất lượng noãn 10

1.5 ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ TTTON 16

1.5.1 Đánh giá hợp tử 16

1.5.2 Đánh giá phôi giai đoạn phân chia ngày 2 -3 19

1.6 KỸ THUẬT TIÊM TINH TRÙNG VÀO BÀO TƯƠNG NOÃN 19

1.6.1 Sự ra đời của kỹ thuật ICSI 19

1.6.2 Chỉ định các trường hợp tiêm tinh trùng vào bào tương noãn 20

1.6.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả ICSI 21

1.6.4 Các nghiên cứu về thời gian ủ trứng trước ICSI 22

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 25

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn 25

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 25

2.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 26

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 26

2.2.2 Cỡ mẫu nghiên cứu 26

2.2.3 Quy trình thực hiện 26

2.3 CÁC CHỈ SỐ, BIẾN SỐ NGHIÊN CỨU 33

2.4 HẠN CHẾ SAI SỐ TRONG NGHIÊN CỨU 33

2.5 CÁC TIÊU CHUẨN CỦA NGHIÊN CỨU 34

2.5.1 Các chỉ số tinh dịch đồ bình thường 34

2.5.2 Đánh giá chất lượng của noãn 34

2.5.3 Đánh giá hợp tử 36

2.5.4 Đánh giá chất lượng phôi 36

2.5 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 37

2.6 ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU 37

Chương 3: DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 38

3.1 ĐẶC ĐIỂM CỦA ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 38

3.2 KẾT QUẢ THỤ TINH VÀ CHẤT LƯỢNG PHÔI CỦA HAI NHÓM NGHIÊN CỨU 41

3.2.1 Kết quả thụ tinh 41

3.2.2 Chất lượng phôi 41

Chương 4: DỰ KIẾN BÀN LUẬN 42

DỰ KIẾN KẾT LUẬN 43

DỰ KIẾN KIẾN NGHỊ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Bảng 2.1 Tiêu chuẩn đánh giá tinh dịch đồ 34

Bảng 2.2 Tiêu chuẩn phân loại noãn 36

Bảng 3.1 Đặc điểm đối tượng nghiên cứu 38

Bảng 3.2 Tinh dịch đồ 38

Bảng 3.3 Số lượng và chất lượng phức hợp COC thu được sau chọc hút noãn 39 Bảng 3.4 Mức độ trưởng thành noãn 39

Bảng 3.5 Đặc điểm về hình dạng và kích thước của noãn 39

Bảng 3.6 Đặc điểm về hình thái noãn 40

Bảng 3.7 Kết quả thụ tinh 41

Bảng 3.8 Chất lượng phôi 41

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Sự phát triển của noãn 3

Hình 1.2 Quy trình thụ tinh ống nghiệm 8

Hình 1.3 Phức hợp tế bào noãn 10

Hình 1.4 Noãn ở các giai đoạn phát triển khác nhau 11

Hình 1.5 Hình dạng noãn 11

Hình 1.6 Độ mịn của bào tương 12

Hình 1.7 Không bào 13

Hình 1.8 Lưới nội bào 14

Hình 1.9 Thể vùi 14

Hình 1.10 Thể cực 15

Hình 1.11 Màng trong suốt 16

Hình 1.12 Hợp tử 16

Hình 1.13 Sơ đồ phân loại PN theo hệ thống Z-score 18

Hình 1.14 Đánh giá noãn thụ tinh theo hệ thống Z-score 19

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 27

Hình 2.2 Đĩa tách noãn 29

Hình 2.3 Đĩa test 30

Hình 2.4 Đĩa ICSI 30

ĐẶT VẤN ĐỀ

Vô sinh là một vấn đề mang tính thời sự hiện nay Các dữ liệu thu đượccho thấy khoảng 30-40% các trường hợp vô sinh do nguyên nhân nam giớiđơn thuần, 40% do nữ giới, 10% do nguyên nhân kết hợp cả nam và nữ và10% là không rõ nguyên nhân [1] Nhiều báo cáo trên thế giới cho thấy chấtlượng tinh trùng của nam giới ngày càng giảm

Hơn 30 năm qua, thụ tinh trong ống nghiệm (TTTON) đã gặt hái rấtnhiều thành công trong điều trị vô sinh Tuy nhiên, tỷ lệ thành công củaTTTON với nguyên nhân do chồng thấp hơn so với trường hợp tinh trùngchồng bình thường Nhiều cố gắng nhằm cải thiện tỷ lệ thụ tinh cho nhữngtrường hợp tinh trùng yếu đã được thử nghiệm Kỹ thuật tiêm tinh trùng vàobào tương noãn (ICSI) đã ra đời vào những năm đầu thập niên 90 Với kỹthuật này, các nhà khoa học có thể tạo ra phôi mà chỉ cần 1 trứng trưởngthành với duy nhất 1 tinh trùng được lựa chọn tốt nhất về mặt hình thái cũngnhư khả năng di động ICSI đã mang lại niềm hy vọng và cơ hội lớn cho cáccặp vợ chồng vô sinh mà nguyên nhân như chất lượng tinh trùng kém, thậmchí không xuất tinh được, kháng thể kháng tinh trùng, hoặc số lượng noãn ít,chất lượng kém, hay IVF thất bại mặc dù kết quả tinh dịch đồ bình thường.Cho đến nay kỹ thuật ICSI đã không ngừng được cải tiến và chiếm tỷ lệ caotrong các chu kỳ hỗ trợ sinh sản.

ICSI là kỹ thuật vi thao tác được thực hiện trong phòng nuôi cấy đãđược chuẩn hóa hoàn toàn tuy nhiên không có tiêu chuẩn chung về thời gian ủtrứng trước khi thực hiện kỹ thuật ICSI Trong kỹ thuật IVF cổ điển các nhànghiên cứu đã chứng minh được rằng thời gian ủ noãn từ 2-6 giờ trước khiIVF làm cải thiện kết quả thụ tinh và tỷ lệ có thai lâm sàng [2-5] Trên thếgiới, đã có 9 nghiên cứu tập trung vào ảnh hưởng của thời gian làm ICSI lên

kết quả thụ tinh ống nghiệm đã được xuất bản với những kết luận khônggiống nhau [6-14] Tại Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về vấn đề này đượcthực hiên Mặc dù các nghiên cứu đã chứng minh rằng thời gian ủ noãn trong

tủ cấy sau khi chọc hút trứng đến khi làm ICSI làm cải thiện tỷ lệ noãn trưởngthành [10,11], tỷ lệ thụ tinh [6,11,12], và chất lượng phôi [6,11] Thời giannày kéo dài 9-11h trước khi ICSI được cho là có ảnh hưởng xấu đến chấtlượng phôi [7] Tuy nhiên, một số nghiên cứu khác lại cho rằng không có sựkhác biệt về tỷ lệ thụ tinh [8,9] cũng như kết quả có thai [7,11]

Về lý thuyết, một số vấn đề có thể liên quan đến thời gian làm ICSI.Trong qui trình TTTON, trứng được chọc hút ra trước khi rụng trứng Theomột số báo cáo [15,16] trứng trước khi rụng không hoàn toàn trưởng thành mặc

dù đã xuất hiện thể cực đầu tiên, nó được gọi là bào tương chưa trưởng thành.Trong các chu kỳ kích thích buồng trứng thì sự trưởng thành của bào tươngkhông đồng đều với sự trưởng thành của nhân [17,18] Vì vậy thời gian ủtrứng trước khi ICSI có thể giúp bào tương trưởng thành từ đó có thể làm tăng

tỷ lệ thụ tinh, tỷ lệ phôi tốt cũng như tỷ lệ có thai lâm sàng Hơn nữa, Balakier

và các cộng sự [16] đã kết luận rằng noãn người không ngừng trưởng thành vàhoàn thiện khả năng hoạt hóa trong giai đoạn nghỉ ở MII Hiện nay các trungtâm hỗ trợ sinh sản trong nước thực hiện kỹ thuật ICSI tại các thời điểm khácnhau và chưa có bằng chứng cụ thể chứng minh thời điểm nào là tối ưu Chính

vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Ảnh hưởng của thời gian ủ trứng

trước ICSI đến kết quả thụ tinh và chất lượng phôi trong thụ tinh trong ống nghiệm” trên những bệnh nhân tại Trung tâm Hỗ trợ sinh sản Quốc gia –

Bệnh viện Phụ sản Trung Ương với mục tiêu:

So sánh kết quả thụ tinh và chất lượng phôi giữa một số khoảng thời gian ủ trứng trước ICSI trong thụ tinh trong ống nghiệm.

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 SỰ PHÁT TRIỂN CỦA NOÃN NGƯỜI

Sự phát triển của noãn là một từ dùng để diễn tả sự hình thành, sự lớnlên và sự trưởng thành của noãn

Hình 1.1 Sự phát triển của noãn

(nguồn: http://www.glowm.com)

1.1.1 Sự hình thành của noãn

Là quá trình diễn ra từ lúc bắt đầu hình thành noãn nguyên bào tới khihình thành noãn bào 1 Quá trình hình thành noãn kết thúc khi trẻ ra đời, saukhi kết thúc không một noãn nào được tạo thêm nữa, đây là điểm khác biệtvới quá trình tạo tinh trùng

Vào cuối tuần thứ 3 của thai nhi, các tế bào sinh dục nguyên thủy đượchình thành trên thành túi noãn hoàng, sau đó di cư theo mạc treo ruột lưngđến mầm tuyến sinh dục, trên đường đi nó nguyên phân liên tục tăng nhanh

về số lượng Tới tuần thứ 6, tế bào sinh dục nguyên thủy trở thành noãnnguyên bào, tiếp tục nguyên phân tích cực, một số noãn nguyên bào bắt đầubiệt hóa thành noãn bào 1 Ở buồng trứng thai 7 tháng, đại đa số noãn nguyênbào biến mất do thoái triển hoặc biệt hóa thành noãn bào 1 Khi trẻ ra đời,buồng trứng không còn noãn nguyên bào, chỉ có noãn bào 1

Từ tháng thứ 3- 5 của thai kỳ, noãn nguyên bào bắt đầu quá trìnhgiảm phân, nhưng dừng lại ở cuổi kỳ đầu của lần phân chia thứ nhất, tạothành noãn bào 1, còn gọi là noãn sơ cấp giai đoạn GV (Germinal Vesicle)chứa bộ NST 2n kép, màng nhân vẫn còn Từ khi sinh ra tới trước khi dậythì, buồng trứng bé gái chỉ chứa toàn noãn GV Tới khi có đỉnh LH đầu tiênlúc bắt đầu dậy thì, noãn bào 1 mới tiếp tục quá trình phân chia để tạothành noãn chín

Quá trình giảm phân trong noãn rất dài, gồm có hai pha (giẩm phân 1

và giảm phân 2) và có hai giai đoạn nghỉ Giai đoạn nghỉ thứ nhất từ 12 đến

50 năm, tùy thuộc vào từng noãn bào 1 Giai đoạn nghỉ thứ 2 từ khi hìnhthành noãn bào 2 đến khi noãn được thụ tinh [19], [20]

1.1.2 Sự trưởng thành của noãn

Cùng với sự phát triển của nang trứng, noãn bào 1 tăng trưởng về kíchthước, cho tới giai đoạn nang trứng có hốc điển hình, noãn bào 1 đạt kíchthước 120µm thì ngừng tăng trưởng Cơ sở cho sự tăng trưởng là hoạt độngtổng hợp tích cực ARN, protein của nhân, sự tích lũy các bào quan như: hạt

vỏ, ty thể, ribosome … nhằm chuẩn bị cho noãn có khả năng thụ tinh và sựphát triển làm tổ của phôi sau này

Sau khi có đỉnh LH, noãn bào 1 chứa trong nang trứng chín (nang deGraff) mới bắt đầu quá trình trưởng thành, bao gồm sự trưởng thành về nhân

và bào quan noãn Sự trưởng thành về nhân và bào quan phải diễn ra đồng bộmới đảm bảo khả năng thụ tinh của noãn, cũng như phát triển của phôi sau này

 Sự trưởng thành của nhân

Sự trưởng thành của nhân khởi động quá trình giảm phân tiếp tục củanoãn bào 1 Các sự kiện chính diễn ra trong quá trình trưởng thành của nhânbao gồm: sự vỡ màng nhân GV giải phóng bộ NST vào bào tương, tạo thànhthoi vô sắc, sự tập hợp và phân ly của NST, phân chia không đồng đều củabào tương

Noãn bào 1 hoàn thành lần phân chia thứ nhất của quá trình giảm phân,

bộ NST được chia đôi, kết quả sinh ra 2 tế bào chứa bộ NST đơn bội: 1 lớnchứa phần lớn bào tương và toàn bộ bào quan có chức năng sinh dục, 1 nhỏgọi là thể cực thứ nhất; noãn này được gọi là noãn bào 2 hay noãn MII Noãnbào 2 tiếp tục quá trình phân bào giảm nhiễm nhưng dừng lại ở biến kỳ 2 chođến khi được thụ tinh, quá trình giảm phân mới hoàn thành, giải phóng ra cựccầu thứ 2 [21], [22]

 Sự trưởng thành về bào tương

Các sự kiện diễn ra trong nhân trong quá trình giảm phân phụ thuộcvào tính toàn vẹn và sự thay đổi mạnh mẽ của khung xương tế bào(cytoskeleton) Trong quá trình phân bào, các ống siêu vi rời khỏi vỏ tế bào,ngắn lại tạo thành thoi vô sắc Thoi vô sắc tạo thành trong quá trình phânchia của noãn có hình thái khác so với thoi vô sắc hình thành trong các quátrình phân chia khác, nó không kéo tới đầu xa của tế bào- tạo thành sự định

vị lệch tâm của thoi vô sắc, kết quả dẫn đến sự phân chia không đồng đềucủa bào tương [21], [22]

Trong quá trình trưởng thành, các hạt vỏ (cortical granules) được tíchlũy, di chuyển đến dưới vỏ noãn bào, và ở tại vị trí này cho đến khi quá trìnhthụ tinh xảy ra Các hạt vỏ có vai trò quan trọng trong việc ngăn cản hiệntượng đa thụ tinh nhờ việc làm thay đổi cấu trúc màng trong suốt khi có mộttinh trùng xâm nhập được qua màng Sự di chuyển của các hạt vỏ là mộttrong các sự kiện lớn nhất của quá trình trưởng thành của noãn Một sốnghiên cứu chỉ ra việc phân tích độ phân tán của các hạt vỏ có thể đánh giáđược chất lượng noãn, ví dụ như những noãn có bất thường thoi vô sắc đềukhông thấy sự di chuyển cuả các hạt vỏ như những noãn MII bình thườngkhác [21], [23]

Hình thái, số lượng và kích thước các ty thể khác nhau qua các giaiđoạn phát triển của noãn Ty thể chứa DNA khác với DNA ở nhân, đồng thờisản xuất năng lượng cho hoạt động của tế bào Ở giai đoạn noãn GV, ty thể

có số lượng ít, nhỏ hơn các giai đoạn khác, và thường có hình tròn Ở noãn

trưởng thành, ty thể tăng số lượng, kéo dài, tập trung ở vùng trung tâm của tếbào [23]

Lưới nội bào trong tế bào cũng có sự biến đổi lớn Sự thay đổi về cấutrúc, kích thước và phân bố của hệ lưới nội bào có liên quan đến khả năng giảiphóng ion Canxi nhằm hoạt hóa noãn trong quá trình thụ tinh Noãn ở giaiđoạn GV chủ yếu chỉ quan sát thấy số lượng ít lưới nội bào có hình túi nhỏ,trong khi đến giai đoạn sau tăng về số lượng và hình thái, thấy cả những lướinội bào hình ống, lưới nội bào phồng lên ở vùng chu vi của noãn [23]

1.3 THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM

1.3.1 Định nghĩa

Thụ tinh trong ống nghiệm (IVF – In vitro fertilization): là chọc hútmột hay nhiều noãn đã trưởng thành từ buồng trứng, cho thụ tinh với tinhtrùng (đã được lọc rửa) trong ống nghiệm Sau khi noãn thụ tinh phát triểnthành phôi, chuyển phôi tốt vào buồng tử cung để phôi làm tổ và phát triểnthành thai nhi [24], [25]

1.3.2 Các bước tiến hành trong TTTON

Một chu kỳ TTTON bao gồm: Kích thích buồng trứng, chọc hút lấytrứng ra ngoài cho kết hợp với tinh trùng trong phòng thí nghiệm, nuôi cấythành phôi để chuyển trở lại vào buồng tử cung

Có 3 phác đồ kích thích buồng trứng thường được sử dụng: Phác đồdài, phác đồ ngắn và phác đồ sử dụng GnRH đối vận (GnRH antagonist)

Từ ngày thứ 8 - 13 của FSH, chỉ định cho thuốc phóng noãn (thường dùnghCG) khi siêu âm có ≥ 1 nang 18 mm hoặc ≥ 3 nang noãn kích thước ≥ 16 mm

Đánh giá thụ tinh được tiến hành 16 - 18h sau cấy với tinh trùng trong

kỹ thuật IVF cổ điển hoặc sau tiêm tinh trùng vào bào tương noãn Đánh giáthụ tinh bình thường khi thấy hai tiền nhân Sau khi đánh giá thụ tinh, phôi sẽđược nuôi cấy tiếp và theo dõi, đánh giá chất lượng phôi ở giai đoạn phôiphân chia sớm hoặc giai đoạn phôi nang

Đánh giá chất lượng phôi chủ yếu dựa vào hình thái và tốc độ phân chiacủa phôi Đánh giá hình thái phôi giai đoạn phân chia sớm (ngày 2, 3) dựavào các chỉ tiêu chính là số lượng phôi bào, độ đồng đều giữa các phôi bào và

tỷ lệ mảnh vỡ bào tương (fragment) Các chỉ tiêu phụ gồm có mật độ hạttrong bào tương - độ chiết quang, số lượng hạt nhân, tỷ lệ không bào trongphôi bào Đánh giá hình thái phôi nang dựa vào độ nở rộng của phôi, hình tháicủa khối tế bào nội phôi (ICM) và nguyên bào lá nuôi (TE).

Các phôi tốt nhất sẽ được chọn để chuyển phôi Chuyển 2 - 3 phôi ngày

3 hoặc chuyển 1 - 2 phôi ngày 5, số phôi còn lại được trữ lạnh

Định lượng βhCG huyết thanh sau chuyển phôi 14 ngày Nếu kết quả hCG huyết thanh sau chuyển phôi 14 ngày Nếu kết quả

≥ 25 UI/l là có thai sinh hóa

Siêu âm đầu dò âm đạo sau chuyển phôi 28 ngày Kết quả có thai lâmsàng khi siêu âm thấy túi ối và tim thai

1.4 ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG NOÃN

1.4.1 Đánh giá phức hợp tế bào noãn (COC - cumulus oocyte complex)

Ở các chu kỳ kích thích buồng trứng, phức hợp COC thường được thunhận sau 34 -38h tiêm thuốc phóng noãn, trạng thái điển hình của khối COCđược mô tả bởi lớp tế bào hạt và tế bào vành tia bao quanh một cách lỏng lẻo.Phần lớn khối COC nở rộng thường là trứng trưởng thành ở giai đoạn MII(metaphase II), tuy nhiên một số noãn thu được vẫn ở giai đoạn GV(Germinal Vesicle) hoặc MI (metaphase I) [26]

Theo đồng thuận của tổ chức Alpha – ESHRE, hiện nay chưa đủ cơ sở

để khẳng định mối tương quan giữa hình thái khối COC với khả năng pháttriển phôi, nhưng vẫn có thể sử dụng thang điểm nhị phân (0 hoặc 1) để đánhgiá Điểm số 1 cho phức hợp COC được xem là tốt khi lớp tế bào hạt (GCs –granulosa cells) và tế bào vành tia (CCs - corona cells) giãn rộng (AlphaScientist in Reproductive Medicine and ESHRE Special Interest Group ofEmbryology, 2011) [27] (Hình 1.3)

(a) COC trưởng thành với các tế

bào hạt và tế bào vành tia giãn

rộng PBI xuất hiện ở vị trí 1h.

(b) COC trưởng thành với các tế bào hạt và tế bào vành tia giãn rộng PBI chưa xuất hiện.

(c) COC chưa trưởng thành với các tế bào hạt và tế bào vành tia

nén chặt)

Hình 1.3 Phức hợp tế bào noãn

(Nguồn: Atlas of Human Embryology) [26]

1.4.2 Đánh giá chất lượng noãn

* Đặc điểm noãn trưởng thành [28], [29], [30]:

- Noãn trưởng thành cả về nhân và tế bào chất

- Hình cầu

- Kích thước 100 – 150 µm

- Màng trong suốt đồng nhất, đều màu, sáng trong

- Khoang quanh noãn nhỏ chỉ chứa thể cực thứ nhất

ở giai đoạn GV (germinal vesicle): trạng thái nhân vẫn còn ở dạng túi hìnhcầu có chứa 1 hạt nhân to Noãn MI: không có sự hiện diện của túi nhân (GV)

và chưa xuất hiện thể cực đầu tiên Noãn trưởng thành MII khi có thể cực đầutiên xuất hiện trong khoang quanh noãn (PVS).

Noãn GV với túi mầm Noãn MI Noãn MII với PBI ở 3h

Hình 1.4 Noãn ở các giai đoạn phát triển khác nhau

(Nguồn: Atlas of Human Embryology) [26]

- Trưởng thành tế bào chất: Noãn được xem là trưởng thành về tế bàochất thường sẽ không xuất hiện các bất thường trong bào tương noãn

* Hình dạng và kích thước noãn

- Hình dạng (Hình 1.5): Noãn bình thường có hình cầu Noãn có hìnhdạng bất thường như hình trứng (oval) hay bị kéo dài (elongtion), Ebner vàcộng sự (2008) cho biết không có mối tương quan nào giữa tỷ lệ thụ tinh cũng

như chất lương phôi với hình dạng bất thường của noãn [31].

Noãn MII hình dạng

bình thường

Noãn MII hình trứng vớiPVS bình thường

Noãn MII hình trứng vớiPVS bị kéo dài

Hình 1.5 Hình dạng noãn

(Nguồn: Atlas of Human Embryology)[26]

- Kích thước: Noãn khổng lồ (giant) có kích thước noãn khi đo cả màngzona từ 200µm Noãn khổng lồ là noãn có chứa thêm 1 bộ nhiễm sắc thể do

sự phân chia không đồng đều về tế bào chất trong quá trình nguyên phân củacác noãn nguyên bào Noãn khổng lồ cho kết hợp với tinh trùng cũng có khảnăng thụ tinh tạo hợp tử đa bội và phân chia thành phôi, thậm chí đạt đến giaiđoạn phôi nang Vì vậy, noãn khổng lồ được khuyến cáo không sử dụng đểtiêm ICSI [32]

* Chất lượng bào tương

- Độ mịn của bào tương (granularity) được đánh giá thông qua đám hạttập trung ở trung tâm bào tương (CLG – centrally located granular) về kíchthước, độ sâu, chia noãn thành 4 độ [33] (Hình 1.6)

Gran 1: Bào tương mịn và sáng màu (a)

Gran 2: Có hạt hơi thô và sáng màu (b)

Gran 3: Quầng hạt thô, sậm màu (c)

Gran 4: Quầng hạt thô chiếm từ ¾ diện tích bề mặt trở lên, tập trung ởvùng trung tâm noãn va các dạng bất thường khác (d)

Hình 1.6 Độ mịn của bào tương

(Nguồn: Atlas of Human Embryology) [26]

- Không bào (vacuole) (Hình 1.7): Không bào là một dạng thể vùi củabào tương có màng bao quanh, ở dạng túi hình cầu chứa đầy chất dịch cặn

bã Tỷ lệ thụ tinh ở noãn có không bảo giảm (40%) so với noãn bình thường(69.6%) trong ICSI [34] Khi noãn có 1 không bào lớn hay nhiều không bào

sẽ gây bất lợi cho noãn vì cấu trúc bộ xương tế bào không thể thực hiện chứcnăng, ví dụ như vi ống Các không bào lớn làm thay đổi vị trí thoi vô sắc so

với thể cực của noãn làm tăng nguy cơ gây tổn thương thoi vô sắc khi ICSI[35] Noãn không thụ tinh khi đường kính không bào trên 14 µm [36]

VAC 1: noãn không có không bào (a)

VAC 2: noãn có 1 không bào nhỏ (5-10 µm) (b)

VAC 3: noãn có 1 không bào trung bình (10-14 µm) (c)

VAC 4: noãn có 1 không bào lớn (>14 µm) hay nhiều không bào nhỏhoặc trung bình (d)

Hình 1.7 Không bào

(Nguồn: Thomas ebner, 2008) [31]

- Lưới nội bào (SER – smooth endoplasmic reticulum) (Hình 1.8):Noãn bào có sự hiện diện của SER thường cho tỷ lệ thụ tinh thấp, đặc biệt là

tỷ lệ sảy thai rất cao, cũng như chết non và nhẹ cân nếu chuyển phôi có nguồn

gốc từ các noãn này [31] Hạn chế hoặc tránh chọn phôi chuyển có nguồn gốc

từ noãn mang SER [37]

SER 1: noãn không có SER (a)

SER 2: noãn có 1 SER nhỏ (b)

SER 3: noãn có nhiều hơn 1 SER hoặc 1 SER trung bình (c)

SER 4: noãn có nhiều SER trung bình hoặc 1 SER lớn (d)

Hình 1.8 Lưới nội bào

(Nguồn: Atlas of Human Embryology) [26]

- Thể vùi (inclusion hay refractile body) (Hình 1.9): Sự hiện diện của

thể vùi thường đi đôi với việc giảm tỷ lệ thụ tinh cũng như sự hình thành phát

triển của phôi [38] Thể vùi còn được gọi là thể khúc xạ, chứa chủ yếu các

lipid và các hạt vật chất dày đặc, có đường kính nhỏ (<10µm) Thể vùi ảnhhưởng xấu đến tỷ lệ thụ tinh, tỷ lệ phát triển của phôi [39]

Incls 1: Không hiện diện thể vùi trong bào tương (a)

Incls 2: Bào tương có 1 thể vùi nhỏ (≤ 2-3µm) (b)

Incls 3: Bào tương có 1 thể vùi to hoặc nhiều thể vùi nhỏ (>5µm) (c)

Incls 4: Bào tương có từ 2 thể vùi to trở lên và dạng phức tạp (mắt bò) (d)

* Khoang quanh noãn (PVS – Perivitelline Space: Theo Vutyavanich (2003),

Veeck (1999), Xia P (1997) và Hassan - Ali H (1998) thì noãn có khoảngkhông quang noãn rộng đi kèm với các thể hạt sẽ làm tỷ lệ thụ tinh giảm đáng

kể [40],[41],[38],[42].

PVS 1: bình thường, độ rộng vừa phải, không có hạt (a)

PVS 2: rộng ở 1 phần quanh noãn, không có hạt (b)

PVS 3: rộng hết toàn bộ chu vi quanh noãn (c)

PVS 4: rộng và xuất hiện hạt trong khoang PVS (d)

* Thể cực (PB – polar body) (Hình 1.10): Sự xuất hiện của thể cực thứ nhất ở

khoang quanh noãn là dấu hiệu cho thấy noãn trưởng thành về nhân Thể cựcthứ nhất là kết quả của sự phân chia không đồng đều về tế bào chất trong quátrình giảm phân tạo noãn Noãn có thể cực nhỏ hoặc dẹt có xu hương tạo phôitam bội vì phần nhiễm sắc thể có lẽ không được trục xuất ra ngoài mà bị giữlại trong tế bào chất trong quá trình giảm phân [40],[41] Thể cực phân mảnh

là một trong những biểu hiện noãn quá trưởng thành, thường có tỷ lệ thụ tinhthấp, chất lượng phôi và tỷ lệ làm tổ thấp [41]

PB 1: dạng tròn hoặc oval, bề mặt trơn láng (a)

PB 2: dạng tròn hoặc bầu dục, bề mặt nhăn (b)

PB 3: thể cực phân mảnh (c)

PB 4: to, bất thường, thoái hóa hoặc có nhiều hơn 2 thể cực (d)

(a) (b) (c) PB phân mảnh (d) PB to bất thường

Hình 1.10 Thể cực

(Nguồn: Atlas of Human Embryology)[26]

* Màng trong suốt ( ZP – Zona pellucia) (Hình 1.11)

* Đặc điểm noãn thụ tinh: noãn thường có hình cầu, với 2 thể cực và 2 tiền

nhân có mang bao riêng biệt, kích thước bằng nhau, nằm sát nhau ở vùngtrung tâm của noãn Mỗi tiền nhân có số lượng và kích thước của các thể hạtnhân tương đương nhau, sắp xếp thẳng hàng tại vùng giao nhau của màng 2

PN [33].(Hình 1.12)

Hình 1.12 Hợp tử

(Nguồn: IVFAS)

* Đánh giá số lượng tiền nhân (ProNuclear – PN)

- Không có tiền nhân: không thụ tinh hoặc noãn thụ tinh nhưng đãchuyển sang giai đoạn syngamy (màng của các tiền nhân biến mất, 2 tiềnnhân hòa vào nhau)

- Một tiền nhân:

+ Do nhân tinh trùng đã xâm nhập vào noãn nhưng không dược giải phóng.

+ Hoặc do noãn tự hoạt hóa, xuất hiện không đồng thời tiền nhân của

noãn và tinh trùng, sự hòa nhập tiền nhân của tinh trùng và tiền nhân của noãnvào một tiền nhân lớn

- Hai tiền nhân: noãn thụ tinh

- Ba hoặc nhiều tiền nhân: do nhiều tinh trùng xâm nhập hoặc do noãnhay tinh trùng là thể đa bội

* Đánh giá kích thước, vị trí của tiền nhân

- Bình thường: kích thước 2 tiền nhân bằng nhau, nằm đối diện, sátnhau ở giữa noãn

- Kích thước 2 tiền nhân không bằng nhau thường mang bất thường về

di truyền [43], các tiền nhân có kích thước quá khác biệt nhau mang bấtthường NST [44]

- Kích thước tiền nhân quá nhỏ hoặc bị phân mảnh: thường mang bấtthường NST hoặc phát triển chậm [27]

- Vị trí: tiền nhân không nằm đối diện có thể dẫn đến không syngamyhoặc bất thường trong quá trình thụ tinh Nếu tiền nhân nằm ở vùng ngoạibiên của noãn ở phần bán cầu không chứa thể cực thì được đánh giá là bấtthường [44]

Hình 1.13 Sơ đồ phân loại PN theo hệ thống Z-score

(Nguồn: Textbook of ART, 2009)

- Z1: Những hợp tử có 2PN có kích thước và số lượng các NPB tươngđương nhau (3-7 NPB), các NPB xếp thẳng hàng ở vùng tiếp giáp giữa 2 PN(Hình 1.14a)

- Z2: Những hợp tử có 2PN có kích thước và số lượng các NPB tươngđương nhau (3-7 NPB), nhưng các NPB không xếp thẳng hàng ở vùng tiếpgiáp giữa 2 PN mà phân bố rải rác trong mỗi PN (Hình 1.14b)

-Z3: Những hợp tử không đồng đều nhau về kích thước, số lượng củacác NPB ở mỗi PN hoặc các NPB ở mỗi PN không đồng thời xếp thẳng hàng

ở vùng tiếp giáp giữa 2 PN (Hình 1.14c)

- Z4: Những hợp tử bất thường, xuất hiện với 2 PN có kích thước khácbiệt nhau rõ rệt, 2 PN không tiến sát nhau (Hình 1.14d)

(a) Z1 (b) Z2 (c) Z3 (d) Z4

Hình 1.14 Đánh giá noãn thụ tinh theo hệ thống Z-score

(Nguồn: Đồng thuận đánh giá và phân loại noãn, phôi trong HTSS)[33]

1.5.2 Đánh giá phôi giai đoạn phân chia ngày 2 -3 (Early cleavage)

Hiện nay, có nhiều hệ thống đánh giá chất lượng phôi giai đoạn phâncắt Tuy nhiên, nguyên tắc chung để đánh giá chất lượng phôi giai đoạn phâncắt là dựa trên tốc độ phân chia của phôi, độ đồng đều của các phôi bào và tỷ

lệ mảnh vỡ bào tương là những chỉ tiêu chính Chỉ tiêu phụ như mật độ hạttrong bào tương, sự phân chia đồng bộ của phôi bào, tỷ lệ phôi bào đa nhân,

sự có mặt của không bào, lưới nội bào… cũng được xem xét

Phôi tốt là phôi có tốc độ phân chia phù hợp, các phôi bào đồng đều,

có ít hoặc không phân mảnh Cụ thể, các phôi tốt có 4 đến 6 phôi bào vàongày 2 và ít nhất 7 phôi bào vào ngày 3 sau thụ tinh, các phôi bào đồng đều,đơn nhân, tỷ lệ phân mảnh không quá 10% thể tích phôi Do đó, phôi thườngđược đánh giá vào thời điểm 42- 44 giờ (ngày 2) hoặc 66-68 giờ (ngày 3) sauICSI Phôi được phân loại thành các nhóm dựa trên các thông số về hình thái(số phôi bào, độ đồng đều giữa các phôi bào, tỷ lệ mảnh vỡ bào tương) vàothời điểm đánh giá

1.6 KỸ THUẬT TIÊM TINH TRÙNG VÀO BÀO TƯƠNG NOÃN

1.6.1 Sự ra đời của kỹ thuật ICSI

Kể từ khi Louis Brown – đứa bé đầu tiên từ kỹ thuật thụ tinh trong ốngnghiệm – ra đời năm 1978, các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản đã không ngừng pháttriển Tuy nhiên kỹ thuật IVF cổ điển còn một số mặt hạn chế như đòi hỏi

chất lượng tinh trùng của chồng phải tương đối tốt, bất thường nhẹ hay trungbình Do vậy, những bệnh nhân nam có chất lượng tinh trùng kém, rất kém,hoặc bất thường nặng hay thậm chí không có tinh trùng thì cơ hội có con gầnnhư không có Một loạt các kỹ thuật hỗ trợ thụ tinh đã được báo cáo, đầu tiên

là kỹ thuật vi thao tác phẫu tích một phần màn trong suốt (PZD – partial zonadissection), sau đó là kỹ thuật tiêm tinh trùng vào dưới màng trong suốt(SUZI – subzonal sperm injection) nhưng kết quả đều không khả quan vàngày nay không còn được thực hiện

Đến năm 1992, trường hợp đầu tiên ra đời từ kỹ thuật tiêm tinh trùngvào bào tương noãn (ICSI) được báo cáo đã mở ra một kỷ nguyên mới củađiều trị vô sinh Từ đó đến nay kỹ thuật này được áp dụng rộng rãi tại cáctrung tâm hỗ trợ sinh sản trên thế giới Chỉ định của kỹ thuật này cũng được

mở rộng nhiều [45], [46]

Theo báo cáo của Nyboe và cộng sự năm 2009, vào năm 2006, số chu

kỳ thực hiện ICSI chiếm trên 60% tổng chu kỳ hỗ trợ sinh sản của toàn bộchâu Âu [47] Hiện nay tại các trung tâm IVF lớn trên thế giới số chu kỳthực hiện ICSI chiếm tỷ lệ trên 70%, có những trung tâm thực hiện 100% kỹthuật ICSI [48]

1.6.2 Chỉ định các trường hợp tiêm tinh trùng vào bào tương noãn

- Vô sinh do chồng: các trường hợp tinh trùng ít, tinh trùng bấtthường hay tinh trùng di động trong mẫu tinh trùng ít

- Tinh trùng lấy từ mào tinh, tinh hoàn

- Các trường hợp xuất tinh ngược dòng có thể lấy nước tiểu sau khixuất tinh, ly tâm để lọc lấy tinh trùng

- Các trường hợp chu kỳ IVF trước đó tỷ lệ thụ tinh thấp

- Các trường hợp vợ lớn tuổi

- Các trường hợp vô sinh không rõ nguyên nhân

1.6.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả ICSI

* Yếu tố chất lượng tinh trùng

Trong thời gian đầu phát triển, một nghiên cứu được thực hiện ở 996

chu kỳ bởi Nagy và cộng sự (1995) về mối liên quan giữa ba thông số cơ bảncủa tinh trùng (số lượng tinh trùng, khả năng di động và hình thái học của tinhtrùng) với kết quả của ICSI cho thấy rằng chỉ cần có sự hiện diện ít nhất mộttinh trùng di động thu được sau lọc rửa tinh trùng để đảm bảo thành công của

kỹ thuật ICSI [49]

Tuy nhiên, khi quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại x400, khó cóthể tiên đoán tinh trùng bình thường về cấu trúc di truyền hay không, bao gồmbất thường số lượng nhiễm sắc thể hay tổn thương ADN Chỉ định chính củaICSI là cho những trường hợp có bất thường tinh trùng nặng, với nhữngtrường hợp này, bất thường về hình dạng thường đi kèm với bất thường về ditruyền [50] Ngoài ra, Nars-Esfahani và cộng sự (2005) cũng cho thấy có mốiliên hệ giữa bất thường hình dạng tinh trùng và tỷ lệ ADN phân mảnh [51]

Do đó, việc lựa chọn được tinh trùng trưởng thành, có khả năng thụ tinh cao

và không bất thường về di truyền đóng vai trò quan trọng trong ICSI

* Chất lượng noãn

Tỷ lệ noãn trưởng thành thu được sau khi kích thích buồng trứng vàokhoảng 80% Tuy nhiên có khoảng 8-9% các chu kỳ có <50% noãn trưởngthành sau chọc hút Trong nghiên cứu của Palermo và cộng sự (2012) tác giả

đã chia làm 3 nhóm với tỷ lệ noãn trưởng thành giảm dần lần lượt là 67–99%,34–66%, 0–33% Kết quả là tỷ lệ thụ tinh thấp nhất ở nhóm 3 với tỷ lệ noãntrưởng thành là 0–33% [46] Kết quả nghiên cứu cho thấy rõ ràng tỷ lệ noãnchưa trưởng thành có tác động xấu đến kết quả của 1 chu kỳ ICSI

Noãn trưởng thành khi trưởng thành cả về nhân cũng như trưởng thành

về tế bào chất Trưởng thành về nhân khi có sự hiện diện của thể cực thứ nhất

trong khoang quanh noãn Sự trưởng thành về tế bào chất thường đi kèm vớiviệc không xuất hiện các hình thái bất thường trong bào tương noãn

1.6.4 Các nghiên cứu về thời gian ủ trứng trước ICSI

Từ 1998 đến 2012 đã có 9 nghiên cứu về thời gian ủ trứng trước ICSIđược xuất bản với những kết luận khác nhau

Các nghiên cứu cho thấy giai đoạn ủ noãn sau khi chọc hút đến khi làmICSI lên kết quả ICSI làm cải thiện tỷ lệ noãn trưởng thành [10], [11], tỷ lệthụ tinh [6], [11], [12], và chất lượng phôi [6], [11] Thời gian ủ noãn có thểlàm tăng tỷ lệ thụ tinh cũng như chất lượng phôi nhưng không nhất thiết phảităng số lượng noãn trưởng thành

Các nghiên cứu cũng đưa ra các khoảng thời gian ủ noãn tối ưu như 9h [7], 2-4h [11] và 5-6h [13], tuy nhiên chỉ có 2 nghiên cứu đưa ra chính xácthời gian mang lại kết quả tốt nhất sau 3h ủ noãn [12], [14]

1-Thời gian ủ noãn trước ICSI không nên vượt quá một giới hạn hợp lýnhất định Theo J.Y.Ho và cộng sự (2013) thời gian này dưới 2,5h sẽ làmgiảm tỷ lệ noãn trưởng thành [10] còn A Isiklar và cộng sự (2004) thấy nếutiến hành ICSI ngay sau khi chọc hút noãn sẽ làm giảm tỷ lệ noãn trưởngthành, tỷ lệ thụ tinh cũng như chất lượng phôi [11] Như vậy dựa trên nhữngkhoảng hay mốc thời gian của các nghiên cứu đưa ra thì noãn nên được ủtrong tủ cấy ít nhất là 2,5h từ sau khi chọc hút đến khi làm ICSI

Trong một số nghiên cứu, noãn được tiêm ICSI sau chọc hút lên đến11h [6], [7] hay thậm chí 12h [13] đã ảnh hưởng xấu đến kết quả ICSI.Nghiên cứu của K.Yanagida và cộng sự (1998) khi ủ noãn từ 9-11h sẽ làmgiảm chất lượng phôi, giảm tỷ lệ có thai [7], không những vậy còn làm giảm

tỷ lệ thụ tinh trong nghiên cứu của P Falcone (2008) với thời gian ủ noãn 12h Với những ảnh hưởng tiêu cực này, thời gian ủ noãn không nên vượt quá6h sau chọc hút