Khóa luận Kiểm tra một số chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm chế biến sẵn

Song để phân biệt hai vấn đề này thông thường dựa vào các khái niệm như sau: - Ngộ độc thực phẩm là các biểu hiện bệnh xuất hiện sau khi tiêu thụ thực phẩm có chứa số lượng lớn vi sinh v

MỤC LỤC

Trang

Lời cam đoan i

Mục lục ii

Danh mục các từ viết tắt v

Danh mục các bảng vi

Danh mục các hình vii

CHƯƠNG 1 : MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 1

1.3 Nội dung 1

1.4 Phạm vi nghiên cứu 2

CHƯƠNG 2 : TỔNG QUAN 3

2.1 Khái quát về ngộ độc thực phẩm 3

2.1.1 Các tác nhân gây ngộ độc 4

2.1.2 Tác hại 6

2.2 Tình hình ngộ độc thực phẩm trên Thế Giới và Việt Nam 7

2.3 Giới thiệu một số vi sinh vật hiện diện trong thực phẩm chế biến 9

2.3.1 Tổng số vi sinh vật hiếu khí 9

2.3.2 Coliforms 9

2.3.3 Escherichia coli 13

2.3.4 Tổng nấm men, nấm mốc 18

CHƯƠNG 3 : PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VI SINH VẬT GÂY BỆNH TRONG THỰC PHẨM CHẾ BIẾN SẴN 22

3.1 Thời gian thực hiện khóa luận 22

3.2 Vật liệu 22

3.2.1 Hóa chất – môi trường 22

3.2.2 Dụng cụ 22

3.2.3 Thiết bị 23

3.3 Phương pháp thu, bảo quản và chuẩn bị mẫu thực phẩm 23

3.3.1 Phương pháp thu mẫu và bảo quản mẫu thực phẩm 24

3.4 Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí 27

3.4.1 Phương pháp đổ đĩa 27

3.5 Định lượng tổng số Coliforms 31

3.5.1 Phương pháp đổ đĩa 31

3.5.2 Phương pháp MPN 35

3.6 Xác định E.coli trong thực phẩm 38

3.6.1 Định tính E.coli trong thực phẩm 38

3.6.2 Định lượng E.coli trong thực phẩm bằng phương pháp đếm khuẩn lạc .42 3.6.3 Định lượng E.coli trong thực phẩm bằng phương pháp MPN 45

3.6.4 Xác đinh E.coli trong thực phẩm bằng phương pháp ELISA 48

3.7 Xác định tổng nấm men, nấm mốc trong thực phẩm 51

3.7.1 Nguyên tắc 51

3.7.2 Ý nghĩa 52

3.7.3 Môi trường và hóa chất 52

3.7.4 Quy trình phân tích định tính nấm mốc 52

3.7.5 Quy trình định lượng tổng nấm men nấm mốc 53

CHƯƠNG 4 : ĐÁNH GIÁ VÀ THẢO LUẬN 56

4.1 Đánh giá và thảo luận về kiểm nghiệm tổng vi sinh vật hiếu khí 56

4.2 Đánh giá và thảo luận về kiểm nghiệm Coliforms 56

4.3 Đánh giá và thảo luận về kiemr nghiệm E.coli 57

4.3.1 Kiểm nghiệm theo phương pháp định tính, phương pháp MPN và phương pháp đếm khuẩn lạc 57

4.3.2 Kiểm nghiệm theo phương pháp ELISA 58

4.3.3 Thảo luận về khả năng sinh Indol trong nghiệp pháp IMViC phát hiện E.coli 59

4.3.4 Thảo luận về thử nghiệm Merthy Red trong nghiệp pháp IMViC

phát hiện E.coli 62

4.3.5 Thảo luận về thử nghiệm Voges – Prokauer trong nghiệp pháp IMViC phát hiện E.coli 63

4.3.6 Thảo luận về thử nghiệm citrate trong nghiệp pháp IMViC phát hiện E.coli 65

4.4 Đánh giá và thảo luận về kiểm nghiệm tổng nấm men, nấm mốc 67

4.4.1 Quy trình phân tích định tính nấm mốc 67

4.4.2 Quy trình phân tích định lượng tổng nấm men, nấm mốc 67

CHƯƠNG 5 : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 69

5.1 Kết luận 69

5.2 Kiến nghị 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

 BGBL : Brilliant Green Bile Lactose broth

 BPW : Buffer Pepton Water

 CFU : Colony Forming Unit

 DG18 : Dichloran Glycerol Agar

 DRBC: Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar

 EC : Escherichia coli Broth

 EMB : Eosine Methylene Blue Agar

 E.coli : Escherichia coli

 EIA : Enzyme Immuno Assay

 ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent Assay

 LSB : Lauryl Sulphate Broth

 LST : Lactose Trypton Laurl Sulphate Broth

 MPN : Most Probable Number

 MR : Methyl red

 PCA : Plate Count Agar

 SPW : Saline 4eptone Water

 TSA : Tryptone Soya Agar

 VP : Voges – Proskauer

 VRB : Violet Red Bile Agar

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Báo cáo thống kê tình hình ngộ độc thực phẩm từ năm 2000 – 2008 8

Bảng 2.2: Tỷ lệ phần trăm vi khuẩn giảm trước và sau khi rửa của rau ngổ và lá mơ 12

Bảng 2.3 : Chỉ tiêu Coliforms trong thực phẩm 12

Bảng 2.4 : Giới hạn cho phép Coliforms trong thực phẩm 13

Bảng 3.1: Ghi nhận kết quả thử nghiệm sinh hoá 41

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Trang

Hình 2.1: Vi khuẩn lên men lactose 11

Hình 2.2 : Coliforms chịu nhiệt lên men đường lactose 11

Hình 2.3 : Escherichia coli 13

Hình 2.4: Khuẩn lạc và tế bào nấm men 20

Hình 2.5: Khuẩn lạc và hệ sợi nấm mốc 20

Hình 3.1 : Pha loãng mẫu 26

Hình 3.2 Phương pháp thực hiện đổ đĩa phân tích tổng vi sinh hiếu khí 29

Hình 3.3 : Tổng số vi sinh vật hiếu khí 30

Hình 3.4: Khuẩn lạc Coliforms 33

Hình 3.5 Phương pháp đổ đĩa phân tích tổng số Coliforms 34

Hình 3.6 Khẳng định Coliforms 34

Hình 3.7 : Khẳng định Coliforms 37

Hình 3.8: Kết quả khẳng định coliform trên môi trường BGBL 37

Hình 3.9 : Khuẩn lạc E.coli trên môi trường EMB 40

Hình 3.10: Nghiệm pháp IMViC 41

Hình 3.11: Dạng bánh kẹp gồm kháng thể bắt – kháng nguyên – thể tiếp hợp chứa kháng thể 50

Hình 3.12: Tổng quát quá trình phát hiện E.coli bằng phương pháp ELISA 51

Hình 4.1: Indol + và Indol - 61

Hình 4.2 : Thử nghiệm MR 63

CHƯƠNG 1 : MỞ ĐẦU1.1 Đặt vấn đề

Trong thời đại đất nước phát triển và hội nhập như ngày nay, cuộc sống của conngười ngày càng được nâng cao và nhu cầu về ăn uống càng phải được cải thiện Tuynhiên, cuộc sống của họ ngày càng bận rộn và hối hả, nên thời gian dành cho việc tựnấu nướng cho các bữa ăn trong gia đình ngày càng hạn chế, vì thế những suất ănnhanh, cơm tiệm, các thức ăn chế biến sẵn là giải pháp mà rất nhiều người lựa chọn Từ

đó cho các thực phẩm được chế biến sẵn đóng vai trò quan trọng trong xã hội, vừa đápứng nhu cầu nhanh gọn vừa tiết kiệm được thời gian Tuy nhiên, về mặt vệ sinh thìkhông có gì đảm bảo được Vì mọi người không thể kiểm soát quá trình chế biến và nếusản phẩm chế biến có vấn đề thực sự thì cũng không có cách nào nhận biết Từ đó dẫnđến một số vấn đề về sức khỏe ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình làm việc và thậm chícòn gây tử vong, đó là hậu quả của ngộ độc thực phẩm

Vấn đề kiểm soát mức độ vệ sinh an toàn thực phẩm ngày càng được quan tâmnhiều hơn Đánh giá mức độ vệ sinh an toàn thực phẩm không phải là một việc dễ dàng

mà cần phải có đủ khả năng chuyên môn về lý thuyết cũng như thực hành Để góp phầnđánh giá mức độ vệ sinh an toàn thực phẩm cũng như đưa ra những khuyến cáo cho

mọi người, tôi tiến hành thực hiện khóa luận “Kiểm tra một số chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm chế biến sẵn” Hy vọng sau đề tài tốt nghiệp này sẽ giúp tôi

hiểu rõ hơn về ngộ độc thực phẩm và góp phần phản ánh hiện trạng vệ sinh an toànthực phẩm của một số thực phẩm được chế biến sẵn

1.2 Mục tiêu của đề tài

 Đánh gía mức độ vệ sinh an toàn thực phẩm của một số loại thực phẩm được chếbiến sẵn

 Đưa ra một số đề nghị cho mọi người

1.3 Nội dung

 Phân tích và đánh giá dựa trên một số chỉ tiêu vi sinh: Tổng vi sinh vật hiếu khí;

Coliforms; Escherichia coli; Tổng nấm men,nấm mốc.

CHƯƠNG 2 : TỔNG QUAN2.1 Khái quát về ngộ độc thực phẩm

Hiện nay có rất nhiều vụ ngộ độc hay các bệnh gây ra do thực phẩm, mặc dù cócác luật về an toàn vệ sinh thực phẩm đã được ban hành và ngày càng chặt chẻ và được

sự quan tâm của công đồng

Cho đến nay vẫn còn có những cách hiểu và phân biệt không thống nhất về kháiniệm các bệnh gây ra do thực phẩm hay ngộ độc thực phẩm Song để phân biệt hai vấn

đề này thông thường dựa vào các khái niệm như sau:

- Ngộ độc thực phẩm là các biểu hiện bệnh xuất hiện sau khi tiêu thụ thực phẩm

có chứa số lượng lớn vi sinh vật, chúng nhân lên nhanh trong quá trình chế biến haybảo quản Các vi sinh vật có thể hiện diện một số lượng rất ít ban đầu trong thực phẩmhay nhiễm vào do sự tiếp xúc trong quá trình chế biến

- Các bệnh có nguồn gốc từ thực phẩm do tiêu thụ những thức ăn chứa các vi sinhvật hay sản phẩm của chúng, không phụ thuộc vào số lượng nhiều hay ít, do đó khôngphụ thuộc vào sự chế biến hay bảo quản

Triệu chứng của ngộ độc thực phẩm thường có các biểu hiện như tiêu chảy, chóngmặt, nôn mữa, đau nhức người, sốt, đau đầu Các biểu hiện bệnh lý này phụ thuộc vàotừng loài vi sinh vật gây nên Mức độ nguy hiểm và triệu chứng của bệnh có thể gâynên do độc tố của chúng tiết vào thực phẩm hay do chính tế bào của chúng gây nên Ngộ độc thực phẩm dùng để chỉ tất cả các bệnh gây ra bởi các mầm bệnh có trongthực phẩm Bệnh do ngộ độc thực phẩm được chia làm hai nhóm:

- Bệnh gây ra do chất độc

- Bệnh gây ra do nhiễm trùng

Bệnh gây ra do chất độc, có thể do vi sinh vật tạo ra hoặc do hóa chất trong quátrình sản xuất nguyên liệu thực phẩm tạo nên Các chất độc này có trong thực phẩmtrước khi người tiêu dùng ăn phải

Bệnh do nhiễm trùng là trong thực phẩm có vi khuẩn gây bệnh Vi khuẩn này vào

cơ thể người bằng con đường tiêu hóa và tác động đến cơ thể do sự hiện diện của nóhoặc do các chất độc của chúng tạo ra

2.1.1 Các tác nhân gây ngộ độc

Ngộ độc thực phẩm hay còn gọi là trúng độc thực phẩm là do ăn trúng thức ăn cóchứa độc tố, thường xảy ra một cách đột ngột và hàng loạt có những biểu hiện cấp tínhnhư nôn mửa, tiêu chảy

Thực phẩm rất dễ bị ô nhiễm bởi các tác nhân sinh học, các chất độc hại hóa học,

độc hại,vật lý Chúng có thể gây ngộ độc và nguy hiểm tới sức khỏe người tiêu dùng.

Có ba nguyên nhân chính gây ngộ độc hay gặp, đó là do hóa chất bảo quản thực phẩm(thuốc trừ sâu, hóa chất chống sâu mọt ), do hóa chất dùng trong trong chế biến thựcphẩm (ví dụ phẩm màu trong các loại bánh, xôi, rượu ) và do các vi sinh vật và tácnhân vật lý

 Các chất phụ gia sử dụng không đúng qui định: các chất tạo màu, tạo mùi, tạongọt, tăng độ kết dính, ổn định, chất bảo quản, chất chống ôxy hóa, chất tẩy rửa… vàcác hợp chất không mong muốn trong vật liệu bao gói, chứa đựng thực phẩm.

 Các chất độc hại tạo ra trong quá trình chế biến thịt hun khói, dầu mỡ bị cháykhét, các hợp chất tạo ra do phản ứng hóa học trong thực phẩm, sự sản sinh độc tố trongquá trình bảo quản, dự trữ bị nhiễm nấm mốc (độc tố vi nấm) hay biến chất ôi hỏng

 Các độc tố tự nhiên có sẵn trong thực phẩm như mầm khoai tây, sắn, đậu mèo,măng, nấm độc, cá nóc, cá cóc…

 Các chất gây dị ứng trong một số hải sản, nhộng tôm…

2.1.1.3 Các tác nhân sinh học

 Vi khuẩn có ở mọi nơi xung quanh chúng ta Phân nước thải, rác bụi, thực phẩm

tươi sống là ổ chứa của nhiều loại vi khuẩn gây bệnh Mặt khác, trong không khí vàngay ở trên cơ thể người (đặc biệt là ở bàn tay), ở miệng, ở đường hô hấp, đường tiêuhóa, bộ phận sinh dục, tiết niệu cũng có rất nhiều loaị vi khuẩn Thức ăn chín để ở nhiệt

độ bình thường là môi trường tốt cho vi khuẩn trong không khí xâm nhập và phát triểnrất nhanh, đặc biệt các thức ăn còn thừa sau các bữa ăn chỉ cần một vài giờ là số lượng

vi khuẩn có thể sinh sản đạt đến mức gây ngộ độc thực phẩm

 Nấm mốc thường gặp trong môi trường sống, nhất là ở trong các loại ngũ cốc,

quả hạt có dầu dự trữ trong điều kiện khí hậu nóng ẩm như ở nước ta Nấm mốc gây hưhỏng thực phẩm, một số loại còn sản sinh ra các độc tố nguy hiểm như Aflatoxin

Aflatoxin là độc tố vi nấm do nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus sản

sinh ra trong ngô, đậu và lạc, Aflatoxin là tác nhân có thể gây ung thư gan

 Ký sinh trùng thường gặp trong thực phẩm là giun sán Người ăn phải thịt có ấu

trùng sán dây trong thịt bò (sán dây bò), trong thịt lợn (thịt lợn gạo) chưa nấu chín, khivào cơ thể thì ấu trùng sẽ phát triển thành sán trưởng thành ký sinh ở đường tiêu hóa vàgây rối loạn tiêu hóa Khi ăn cá nước ngọt như cá diếc, cá rô, cá chép, cá trôi… có nangtrùng sán lá gan nhỏ chưa nấu chín thì nang trùng chuyển tới ống mật, lên gan và pháttriển ở gan thành sán trưởng thành gây tổn thương gan mật Nếu ăn phải tôm, cua có

nang trùng sán lá phổi chưa nấu chín hoặc uống nước có nang trùng thì chúng sẽ xuyênqua thành ruột và qua cơ hoành lên phổi, phát triển thành sán trưởng thành gây viêmphế quản, đau ngực, ho khạc ra máu nguy hiểm Bệnh do giun sán cũng bởi tập quán ănthịt tái, nem làm từ thịt sống, ăn tiết canh có ấu trùng gây nhiễm độc, dị ứng, sốt cao,liệt cơ hô hấp có thể dẫn đến tử vong.

2.1.2 Tác hại

Sự có mặt của các tác nhân này trong thực phẩm cho thấy thực phẩm có thể không

an toàn đối với người sử dụng Thực phẩm rất dễ bị ô nhiễm bởi các tác nhân sinh học,tác nhân hóa học, tác nhân vật lý có thể gây ngộ độc nguy hiểm và ảnh hưởng tới sứckhỏe người tiêu dùng Có 3 nguyên nhân chính gây ngộ độc hay gặp, đó là do hóa chấtbảo quản thực phẩm ( chất chống mối, kiến, sâu bọ…), do hóa chất dùng trong trongchế biến thực phẩm ( phẩm màu trong thực phẩm) và do các vi sinh vật và tác nhân vậtlý

Biểu hiện của tác hại do thực phẩm nhiễm bẩn:

- Nhiễm độc tiềm ẩn: là sự nhiễm các chất độc hại dưới ngưỡng có thể gây ra các triệuchứng cấp tính, bán cấp tính; có thể bị nhiễm liên tục hoặc không liên tục; có thể saumột thời gian không biết trước sẽ có: ung thư, các rối loạn chức năng không rõ nguyênnhân, vô sinh

- Bệnh mạn tính: là bệnh mắc phải, có biểu hiện phát bệnh lặp lại thường xuyên hoặctheo chu kỳ; có thể do di chứng của ngộ độc cấp hoặc do hậu quả của nhiễm độc tiềm

ẩn tới liều gây bệnh; có thể trở thành bệnh khó chữa hoặc không chữa khỏi

- Bệnh bán cấp tính (ngộ độc thức ăn): các rối loạn tiêu hóa hoặc thần kinh nhẹ, hoặccác triệu chứng cấp tính, có thể tự chữa khỏi hoặc tự khỏi

- Bệnh cấp tính (ngộ độc thức ăn): các triệu chứng trước đây tương đối điển hình vàbệnh nhân cần đến sự can thiệp của bác sĩ

+ Biểu hiện rối loạn tiêu hóa: nôn, ỉa chảy (gồm cả ỉa ra máu), đau bụng

+ Biểu hiện rối loạn thần kinh: rối loạn cảm giác, nhức đầu, mệt lả, hôn mê, liệt chi.+ Các rối loạn chức năng khác: thay đổi huyết áp, bí tiểu

- Thời gian lành bệnh (đến khi hết triệu chứng nhưng bệnh nhân chưa thể sinh hoạt và làm việc một các bình thường).

+ Với người mắc bệnh bán cấp và cấp tính : 02 ngày – 01 tháng

+ Với người mắc bệnh mạn tính: không khỏi hẳn và thỉnh thoảng tái phát

- Thời gian phục hồi sức khỏe (đã có thể sinh hoat và làm việc một cách bình thường):tuỳ theo nguyên nhân, tình trạng sức khỏe và độ tuổi, thường là:

+ Với người bình thường bị mắc bệnh bán cấp và cấp tính: 01 – 04 tuần với người lớn

và trẻ độ tuổi học đường: 01 tháng đến vài tháng với trẻ dưới 7 tuổi và người già.+ Với người mắc bệnh mạn tính bị tái phát: 01 – 02 tuần trong trường hợp bệnh tái phát

có thể chữa được; không xác định được trong trừơng hợp đã thành bệnh nặng

- Tử vong là hậu quả của ngộ độc cấp rất nặng, ngộ độc cấp không được cứ chữa kịpthời hoặc hậu quả của nhiễm độc tiềm ẩn kéo dài đã dẫn đến bệnh hiểm nghèo khôngcứu chữa được

2.2 Tình hình ngộ độc thực phẩm trên Thế Giới và Việt Nam

Ở các nước phát triển có tới 10% dân số bị ngộ độc thực phẩm và mắc bệnh truyềnqua thực phẩm mỗi năm; với các nước kém phát triển tỷ lệ này cao hơn nhiều Nhiềunước có quy định báo cáo nhưng chỉ đạt 1% số ca bị ngộ độc thực phẩm Ngộ độc thựcphẩm ở Mỹ chiếm 5% dân số/năm (>10 triệu người/năm), trung bình 175ca/100.000dân, mỗi năm chết 5.000 người; ở Anh : 190ca/100.000 dân; ở Nhật : 20-40 ca/100.000dân, ở Úc là 4,2 triệu ca/năm

Thực trạng vi phạm vệ sinh an toàn thực phẩm ở nước ta rất đáng báo động Ngộđộc thực phẩm cấp tính trong những năm qua vẫn có chiều hướng gia tăng cả về số vụ

và quy mô mắc Tỷ lệ mắc/100.000 dân trung bình từ năm 2001 – 2005 là 5,48 Cónhiều nguyên nhân gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm trong toàn quốc như thực phẩm ônhiễm, môi trường ô nhiễm; thực phẩm có độc; điều kiện sản xuất, chế biến thực phẩmkhông bảo đảm an toàn, nhận thức – hành vi đúng về phòng chống ngộ độc thực phẩmcủa cộng đồng còn nhiều hạn chế…

Ở Việt Nam, trung bình mỗi năm có 202,2 vụ ngộ độc thực phẩm xảy ra với5.525,1 người mắc và 55,2 người chết Số vụ ngộ độc xảy ra nhiều nhất là từ tháng 4 –

7 và tháng 9 – 11 Tỷ lệ mắc ngộ độc trung bình là 7,14/100.000 dân, tỷ lệ chết là0,06/100.000 dân/năm Hàng năm có khoảng ba triệu trường hợp nhiễm độc, gây thiệthại hơn 200 triệu USD Nguyên nhân chủ yếu gây ngộ độc thực phẩm là do vi sinh vật42,2%, do hoá chất 24,9%, do độc tố tự nhiên 25,2%

Trong những năm gần đây, khi nền kinh tế nước ta chuyển sang cơ chế thị trường,các loại thực phẩm chế biến sẵn ngày càng nhiều, đặc biệt là dịch vụ thức ăn nhanh vàthức ăn đường phố ngày càng phát triển Các dịch vụ này thuận tiện cho người tiêudùng nhưng cũng tiềm ẩn nhiều nguy cơ gây ngộ độc thực phẩm

Thống kê tình hình ngộ độc trong những năm gần đây cho thấy số vụ và mức độ

ngày càng gia tăng Cụ thể tình hình từ năm 2000-2008 trên địa bàn cả nước ( bảng 2.1) Bảng 2.1 Báo cáo thống kê tình hình ngộ độc thực phẩm từ năm 2000 – 2008

2.3.1 Tổng số vi sinh vật hiếu khí

2.3.1.1 Định nghĩa

Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trongđiều kiện có sự hiện diện của oxy (O2) phân tử Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diệntrong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm.

2.3.2 Coliforms

2.3.2.1 Giới thiệu

Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị: số lượng hiện diện của chúng

trong thực phẩm Được xem là vi sinh vật chỉ thị mức độ vệ sinh trong quá trình chếbiến, bảo quản, vận chuyển thực phẩm, nước uống hay trong các loại mẫu môi trườngdùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác

Đầu thập niên 1900 ( Cabelli, 1977), ông cho rằng sự vắng mặt của Coliforms như

là dấu hiệu cho thấy không xuất hiện bệnh do vi khuẩn gây nên, và sau khi sản xuất khíđốt với việc giới thiệu ống Durham ( Durham năm 1983) thì khái niệm về vi khuẩn

Coliforms và các vi khuẩn khác dạng coli được sử dụng ở nước Anh năm 1901.

Năm 1908 Bergey và Deehan xác định có 256 loài khác nhau của vi khuẩn

thấy sự khác biệt của các dạng vi khuẩn Coliform phân, các dạng vi khuẩn trong đất và

trung gian, và nó được sử dụng cho đến ngày hôm nay

2.3.2.3 Đặc điểm

Coliforms là những trực khuẩn gram âm, không sinh bào tử, có phản ứng oxidase

âm tính và thể hiện hoạt tính của β – galactosidase Vi khuẩn này có khả năng phát triểntrên môi trường có muối mật, hoặc các chất hoạt tính bề mặt khác có tính ức chế tương

tự, có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 37oC trong 24 – 48 giờ

Coliforms gồm bốn chi trong họ Enterrobacteriaceae: Escherichia coli, Klebsiella, Citrobacter và Enterobacter (Metcalf và Eddy,1991) Chúng thường có mặt trong đường ruột động vật có vú ( ví dụ: Escherichia coli phổ biến trong đất trên cơ thể

Coliforms chịu nhiệt có khả năng lên men đường lactose ở 44 – 45oC , nó bao gồm

Escherichia và loài Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter ( hình 2.2).

Coliforms chịu nhiệt từ nơi có nguồn nước giàu chất hữu cơ như nước thải công

nghiệp từ xác thực vật thối rữa hoặc đất

Bảng 2.2: Tỷ lệ phần trăm vi khuẩn giảm trước và sau khi rửa của rau ngổ và lá

37.0002.300

160.0004.800

16%

80%

Sự có mặt của Coliforms trong môi trường chứng tỏ môi trường đó nhiễm bẩn có nguồn gốc từ phân Ở Việt Nam đã có một số chỉ tiêu Coliforms trong thực phẩm (bảng

2.3) và giới hạn của chúng có trong thực phẩm ( bảng 2.4)

Bảng 2.3 : Chỉ tiêu Coliforms trong thực phẩm[10]

Bảng 2.4 : Giới hạn cho phép Coliforms trong thực phẩm[10]

2.3.3 Escherichia coli

2.3.3.1 Định nghĩa

Escherichia coli (thường được viết tắt là E coli)

là một trong những loài vi khuẩn chính ký sinh trong

đường ruột của động vật máu nóng (bao gồm chim và

động vật có vú) Vi khuẩn này cần thiết trong quá trình

tiêu hóa thức ăn và là thành phần của khuẩn lạc ruột

Sự có mặt của E.coli trong nước ngầm là một chỉ thị

thường gặp cho ô nhiễm phân E.coli thuộc họ vi

khuẩn Enterrobacteriaceae và thường được sử dụng

làm sinh vật mô hình cho các nghiên cứu về vi khuẩn( hình 2.3)

nên vi khuẩn này có tên Escherichia coli.

- Vi khuẩn do Escherich phát hiện trong tả lót của trẻ em được công bố với tên gọi

đầu tiên là Bacterium coli commune Bốn năm sau vi khuẩn này được giới chuyên môn đổi tên thành Escherich nhằm tri ân người có công khai phá.

- Năm 1895 người ta gọi bằng tên Bacillus coli.

- Năm 1896 gọi thành Bacterium coli.

- Năm 1991 vi khuẩn được thống nhất toàn cầu là Escherichia coli.

2.3.3.3 Hình thái, cấu trúc

Vi khuẩn thuộc loại trực khuẩn gram âm, di động bằng tiêm mao quanh tế bào,không tạo bào tử, loại có độc lực thì có capsul, loại không có độc lực không có capsul.Kích thước trung bình (0,5µ x 1-3µ) hai đầu tròn Một số dòng có lông bám (pili).

2.3.3.5 Đặc điểm nuôi cấy

E.coli là trực khuẩn hiếu khí tùy nghi, có thể sinh trưởng ở nhiệt độ từ 5-400C,nhiệt độ thích hợp là 370C trong 24 giờ, pH thích hợp là 7,3 - 7,4 nhưng có thể phát

triển ở pH từ 5,5 – 8 Vi khuẩn E.coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy

thông thường, một số chủng có thể phát triển được ở môi trường tổng hợp đơn giản

- Trên môi trường nước thịt: sau thời gian nuôi cấy ở 370C trong 24 giờ nuôi cấy,

vi khuẩn E.coli phát triển rất nhanh, môi trường rất đục, có cặn màu tro trắng nhạt lắng

xuống đáy, đôi khi hình thành màng mỏng xám nhạt trên bề mặt môi trường, môitrường có mùi hôi

- Trên môi trường thạch thường: ủ ở 370C trong 24 giờ vi khuẩn phát triển hìnhthành những khuẩn lạc tròn ướt, bóng láng, không trong suốt, màu tro nhạt, hơi lồiđường khính 2-3mm nếu nuối lâu hơn, khuẩn lạc chuyển màu gần như màu nâu nhạt

và mọc mộng ra Có thể quan sát thấy cả những khuẩn lạc dạng M (Mucoid) và dạng R(Rough)

- Trên môi trường thạch máu : sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C, vi khuẩn E.coli hình

thành khuẩn lạc to, ướt, lồi, viền không gọn, màu sang, kích thước từ 1-2 mm, có thể cóhoặc không có dung huyết tùy thuộc vào chủng

- Trên môi trường thạch peptone: sau 18 – 24 giờ ủ trong tủ ấm 370C, vi khuẩnmọc thành những khuẩn lạc tròn ướt, màu xám, kích thước trung bình, mặt khuẩn lạchơi lồi lên, có nếp nhăn và bề mặt láng bóng.

- Trên môi trường thạch MacConkey: sau khi nuôi cấy 24 giờ ở tủ ấm 370C, hìnhthành khuẩn lạc màu hồng, tròn nhỏ, hơi lồi, không nhầy, rìa gọn, không làm chuyểnmàu môi trường

- Trên môi trường Endo: sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C, vi khuẩn hình thành khuẩnlạc màu đỏ mận chính, có hoặc không có màu ánh kim

- Trên môi trường EMB: sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C, vi khuẩn hình thành khuẩnlạc màu tím đen có ánh kim

- Trên môi trường thạch Brilliant Green Agar: sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C vikhuẩn hình thành khuẩn lạc dạng S ( Smooth), màu vàng chanh

2.3.3.6 Đặc tính sinh hóa

Nhiệt độ thích hợp là 37 - 380C, pH: 7,2 – 7,4 Khuẩn lạc thay đổi theo môi trườngnuôi cấy: trong môi trường NA: khuẩn lạc tròn, ẩm ướt, mặt láng, có nếp nhăn Trongmôi trường EMB: khuẩn lạc có màu thâm tím hoặc đen Môi trường MacConkey:khuẩn lạc màu đỏ mận chín

Đặc tính lên men các loại đường E.coli gồm những trực khuẩn di động hoặc

không di động, có khả năng lên men sinh hơi các loại đường Glucoza, Fructoza,Galactoza, Lactoza, Maniton, Mannit, Levuloza, Xyloza Lên men không chắc chắn với

các loại đường Dulciton, Sacaroza, Lactose trong khi đó vi khuẩn Salmonella thì không

có đặc tính này, đây là đặc tính quan trọng để phân biệt vi khuẩn E.coli và Salmonella 2.3.3.7 Đặc điểm kháng nguyên và độc tố

E.coli gồm 4 loại kháng nguyên : O (kháng nguyên thân), H (kháng nguyên tiêu

mao),K ( kháng nguyên màng tế bào), F

- Kháng nguyên O ( kháng nguyên thân) là kháng nguyên của thành tế bào Cấu tạobởi lipopoly saccharit Đặt tính kháng nguyên O như sau:

 Chịu được nhiệt không bị hủy khi đun nóng 1000C trong 2 giờ

 Kháng cồn không bị hủy khi tiếp xúc với cồn 50%.

 Bị hủy bởi focmol 5%

 Có tính độc, chỉ cần 1/20mg đủ giết chết chuột trong 24 giờ

- Kháng nguyên H (kháng nguyên tiên mao) Được cấu tạo bởi protein và có các tínhchất sau:

 Không chịu nhiệt

 Bị hủy khi tiếp xúc với cồn 50%

 Bị hủy bởi các protease

 Không bị hủy bởi focmol 5%

- Kháng nguyên K( kháng nguyên màng tế bào) Loại này chỉ có ở một số loại vikhuẩn đường ruột được cấu tạo bởi Polysaccharit và Protein

- Kháng nguyên F ( kháng nguyên ) chức năng của kháng nguyên này là giúp vikhuẩn bám giữ vào giá thể ( màng nhày của đường tiêu hóa) hay còn gọi là bám dính.Đây là khả năng đặc biệt quan trọng, giúp vi khuẩn thực hiện bước đầu tiên của quátrình gây bệnh

Độc tố của E.coli gồm: nội độc tố gây tiêu chảy và ngoại độc tố gây tan huyết và

phù thủng

Độc tố của E.coli: loại E.coli có giáp mô gây ngộ độ mạnh hơn loại không có giáp

mô Nội độc tố đường ruột gồm 2 loại chịu nhiệt và không chịu nhiệt cả hai loại nàyđều gây tiêu chảy Loại chịu nhiệt ST ( Thermostable): gồm các lại STa, STa Loại

không chịu nhiệt LT (Thermolabiles): gồm các loại LT1,LT2 Những dòng E.coli sản

sinh độc tố (ETEC) gồm nhiều type huyết thanh khác nhau thường gặp nhất là các typeO6H16, O8H9, O78H2, O157

2.3.3.8 Cơ chế gây bệnh

Cơ chế gây ngộ độc: khi cơ thể bị nhiễm vi khuẩn với số lượng nhiều kèm theođộc tố của chúng

 Ngoại độc tố: phá huỷ thành niêm mạc, hấp thu qua đường bạch huyết gây hoại

tử và gây nhiễm độc thần kinh

 Nội độc tố: phá huỷ thành mạch máu, làm tăng huyết áp, gây ngộ độc thần kinh

và biểu hiện nhiều triệu chứng khác

E.coli bám dính nhờ các yếu tố bám dính được ký hiệu là F4, F5, F6 và F41.Yếu

tố bám dính thay đổi theo điều kiện môi trường và khả năng biến dị của từng serotyp

Chính yếu tố bám dính và độc tố tạo nên quá trình sinh bệnh của E.coli

E.coli là vi khuẩn môi trường, nơi nào cũng có Bình thường, vi khuẩn không gây

tác hại trên ký chủ (103 CFU/g phân) Khi mật số tăng lên cao (106- 109CFU/g phân)thì nó sẽ trở nên gây bệnh

Tính bám dính: Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể heo chủ yếu qua đường miệng Ở

dạ dày, nếu pH không quá acid, E.coli sẽ sinh sôi phát triển thuận lợi hơn Khi đến ruột, E.coli sẽ chống lại cơ chế rửa trôi bằng tính bám dính vào niêm mạc ruột và tác động

lên nhung mao ruột

Nhiễm trùng huyết: bằng tính xuyên mạch, E.coli xâm nhập vào máu, đi đến các

cơ quan nội tạng khác, tiết độc tố gây độc cho cơ thể, quan trọng nhất là làm viêm não,bại não

2.3.3.9 Triệu chứng

Có nhiều loại E.coli, nhưng phần lớn chúng có thể nói là vô hại Tuy nhiên, một

số E.coli có thể gây tiêu chảy, và loại phổ biến nhất trong nhóm E.coli có hại này là E.coli O157:H7 Ở vài bệnh nhân, vi khuẩn này có thể gây rối loạn máu và suy thận,

thậm chí dẫn đến tử vong

Tiêu chảy ra máu là triệu chứng chính của nhiễm E.coli Người bị nhiễm cũng có

thể cảm thấy đau thắt bao tử và nôn ói Triệu chứng thường bắt đầu 3 hay 4 ngày sau

khi bị phơi nhiễm vi khuẩn E.coli Phần lớn bệnh nhân hồi phục sau vài ngày hay một

tuần sau khi mắc bệnh Phần lớn bệnh nhân cũng chẳng cần đến bác sĩ vì họ không biết

mình bị nhiễm E.coli Ngoài ra, nhiều người bị nhiễm mà không có triệu chứng và cũng

không mắc bệnh

Khi bệnh nhân bị nhiễm E.coli nghiêm trọng (tức có thể làm rối loạn máu và suy

thận), một số triệu chứng sau đây thường được ghi nhận:

 Da trở nên xanh xao

 Cảm lạnh

 Có những vết thâm tím trên người

 Đi tiểu rất ít nước tiểu

2.3.3.10 Biện pháp phòng ngừa ngộ độc E.coli

E.coli gây tiêu chảy thường theo phân ra ngoài do đó dễ gây thành dịch Do đó cần

phải nấu chín kỹ thức ăn và kiểm tra nghiêm ngặt quy trình chế biến thực phẩm

và nấm mốc theo khái niệm đơn giản như sau: nấm mốc là vi nấm dạng sợi, sinh sảnbằng bào tử hay khuẩn ty; nấm men là những tế bào đơn tính phát triển theo kiểu nảychồi, thỉnh thoảng có thể tồn tại ở dạng khuẩn ty giả trong đó các tế bào kết nhau thànhchuổi Đơn vị hình thành khuẩn lạc của nấm mốc và nấm men là mầm để tạo nên mộtkhuẩn lạc khi nuôi cấy trong môi trường Mầm có thể là một bào tử, một tế bào hay mộtđoạn của khuẩn ty

Quá trình tăng trưởng của nấm men và nấm mốc phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố từmôi trường Hầu hết nấm mốc, nấm men đều thuộc nhóm vi sinh vật ưa mát, nhiệt độthích hợp cho sự phát triển của chúng trong khoảng 20 – 280C, một ít trong số này ưalạnh hay ưa nóng Nước hoạt tính cũng là nhân tố ảnh hưởng tất quan trọng đến tăngtrưởng Hầu hết các loại nấm men và nấm mốc phát triển tốt trong cơ chất có nước hoạttính khoảng 85% hay lơn hơn, một số ít loài có thể tăng trưởng trong cơ chất có nướchoạt tính thấp hơn khoảng 60 – 70% Nấm mốc và nấm men tăng trưởng ở vùng pH từ2-9, trong pH thích hợp nhất nằm trong khoảng 4 -6,5 Hầu hết nấm mốc, nấm men đều

thuộc nhóm hiếu khí bắt buộc, một số có thể phát triển trong điều kiện vi hiếu khí Một

số có thể tiếp nhận oxy nguyên tử từ cơ chất của chúng nhưng dù ở dạng nào oxy vẫn lànguyên tố cần thiết cho quá trình phát triển của nấm men và nấm mốc

Tất cả các loài nấm men và nấm mốc đều thuộc nhóm vi sinh vật dị dưỡng, chúngchỉ có khả năng nhận các chất dinh dưỡng ở dạng hòa tan Trong quá trình trao đổi chấtxảy ra ở tế bào chúng lại có khả năng chuyển hóa các chất hào tan thành các chất khônghòa tan thành lignocellulose Ngoài ra, chúng còn có thể tạo ra các chất độc, các chất

độc của chúng được gọi chung là độc tố vi nấm ( mycotoxins) Tiêu biểu có Aspegillus flavus, Aspegillus parasiticus, Aspegillus moninus, Penicillium italicum, Penicillium roquefortii, Penicillium cammenbertii, Penicillium digitatum Trong thực phẩm nấm

men và nấm mốc hiện diện có thể tăng trưởng làm thay đổi màu của thực phẩm, làmphát sinh mùi hay vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cơ cấu của thực phẩm, một số có thểtạo độc tố gây ngộ độc thực phẩm

Một số loại nấm men như: Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces liquefacien.

Nấm men sinh sản bằng cách nẩy chồi, nguồn chất có đường Hình dạng của chúng rất

đa dạng như hình cầu, hình trứng, hình oval (hình 2.4)

Hình 2.4: Khuẩn lạc và tế bào nấm men [11]

Nấm mốc sinh sản bằng bào tử hay đoạn sợi, có hệ sợi là sợi khí sinh ( sợi sinhsản), nhiệt độ thích hợp từ 28-320C, ẩm độ cơ chất là 60%, có nguồn chất là bội đường( hình 2.5)

Hình 2.5: Khuẩn lạc và hệ sợi nấm mốc [11]

Cách phân biệt nấm men, nấm mốc

 Nấm men là vi nấm dạng sợi, sinh sản bằng bào tử hoặc khuẩn ty

 Nấm mốc là những tế bào đơn tính phát triển theo kiểu nẩy chồi Thỉnh thoảng

có thể nhìn thấy các tế bào kết nối thành chuỗi

Đơn vị hình thành khuẩn lạc của nấm mốc và nấm men là mầm tạo nên một khuẩnlạc khi nuôi cấy trong môi trường Mầm có thể là một bào tử, một tế bào hay một đoạnkhuẩn ty Trong thực phẩm, nấm mốc và nấm men hiện diện có thể tăng trưởng làmthay đổi màu của thực phẩm, làm phát sinh mùi hay vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cơcấu của thực phẩm

CHƯƠNG 3 : PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VI SINH VẬT TRONG THỰC

PHẨM CHẾ BIẾN SẴN.

3.1 Thời gian thực hiện khóa luận

Ngày 09 tháng 05 năm 2011 đến ngày 26 tháng 06 năm 2011

3.2 Vật liệu

Mẫu thực phẩm chế biến sẵn

3.2.1 Hóa chất – môi trường

 Buffer Pepton Water (BPW)

 Plate Count Agar (PCA)

 Tryptone Soya Agar (TSA)

 Violet Red Bile Agar ( VRB)

 Brilliant Green Bile Lactose broth (BGBL)

 Eosine Methylene Blue Agar(EMB)

 Thuốc khử α- naphtol 5%

 KOH 40%

 Môi trường canh Escherichia coli Broth (EC)

 Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar ( DRBC)

 Môi trường canh LSB

 Đũa thủy tinh

 Túi nilon vô khuẩn

3.3 Phương pháp thu, bảo quản và chuẩn bị mẫu thực phẩm

3.3.1 Phương pháp thu mẫu và bảo quản mẫu thực phẩm

3.3.1.1 Thu và chứa mẫu

Kết quả thí nghiệm phụ thuộc rất nhiều vào phương pháp lấy mẫu và bảo quảnmẫu Kế hoạch lấy mẫu được áp dụng cho từng trường hợp cụ thể và được mang vềphòng thí nghiệm phản ánh đúng tình trạng mẫu cần phân tích

Dụng cụ thu mẫu thay đổi tùy loại sản phẩm Trường hợp thực phẩm đông lạnh,

có thể sử dụng các ống khoan tay vô trùng, dao đã được sát trùng để tách thành lượngmẫu cần thiết, sau đó dùng thìa, kéo… để cho mẫu vào trong dụng cụ chứa Lưu ý tránhthu các mảng băng

Trường hợp thực phẩm đã đóng gói thành nhiều mức, thực hiện thu mẫu bằngcách chọn lấy các gói lớn từ đó lấy ra các bao nhỏ hơn

Khối lượng tổng cần thu của mỗi mẫu thay đổi tùy thuộc số lượng các chỉ tiêu cầnphân tích nhưng ít nhất là khoảng 100 – 250g Mẫu cần đảm bảo tính đại diện để cóđược khối lượng mẫu cần thiết, cần thu gộp mẫu tại nhiều vị trí trên nguyên liệu haythành phẩm

Trường hợp mẫu phân tích là bán thành phẩm đang được chế biến, cần thực hiệnthu mẫu tại nhiều vị trí trong cùng một công đoạn Đối với các loại mẫu như thịt hay cá,nơi nhiễm vi sinh vật chủ yếu là bề mặt Do vậy, có thể sử dụng que bông vô trùng quétmột diện tích bề mặt nhất định hay cắt lát với bề dày 2 - 3mm để thu mẫu

Dụng cụ chứa mẫu thường là các bình nhựa có nắp bằng nhôm hay bằng chất dẻo,bao nylon chứa mẫu Tránh sử dụng các bình bằng thủy tinh để chứa mẫu vì dễ vỡ.

3.3.1.2 Vận chuyển và bảo quản mẫu

Mẫu sau khi thu được bảo quản một cách độc lập với nhau trong các thùng bảoquản mẫu được làm lạnh bằng các bao nước đá Nước đá phải không được tan chảytrong suốt quá trình vận chuyển mẫu về phòng thí nghiệm

Tại phòng thí nghiệm mẫu được chuyển vào trong tủ đông và được phân tích ngaykhi có thể Nếu không phân tích ngay, mẫu phải được bảo quản ở -20oC cho đến khiphân tích Trường hợp mẫu không thể bảo quản đông thì có thể được bảo quản trong tủlạnh ở 0 – 4oC nhưng không được quá 36 giờ Các loại thực phẩm như đồ hộp, thựcphẩm có độ ẩm thấp hay thực phẩm khó hư hỏng có thể được bảo quản ở nhiệt độphòng cho đến khi phân tích

3.3.1.3 Chuẩn bị mẫu

 Rã đông mẫu trước khi phân tích

Mẫu đông lạnh phải được giải đông trong điều kiện vô trùng trước khi được phântích Trường hợp phải phối trộn mẫu trước khi phân tích, mẫu phải được giải đông bêntrong các dụng chứa đã được sử dụng để thu mẫu và chuyển mẫu về phòng thí nghiệm,không chuyển mẫu sang dụng cụ chứa khác

Việc giải đông được thực hiện ở nhiệt độ 2 – 5oC trong khoảng 18 giờ Khi cầnthiết, có thể giải đông nhanh ở 45oC trong 15 phút Trường hợp này, cần liên tục lắcbình chứa mẫu để làm tăng tốc độ giải đông và làm đồng nhất nhiệt độ bên trong mẫu

 Cân mẫu

Cân chính xác một lượng mẫu xác định để tiến hành phân tích tùy theo yêu cầucủa chỉ tiêu phân tích với sai số cho phép là ±0,1g Lượng mẫu này được cho vào trongcác bình chứa bằng nhựa hay các bao nhựa vô trùng

Với kỹ thuật đếm khuẩn lạc các mẫu cần phân tích được pha loãng liên tiếp vàđược xác định một vài nồng độ pha loãng nhất định để cấy vào các môi trường thíchhợp kỹ thuật pha loãng thường qua các bước như sau:

 Dung dịch pha loãng mẫu: một số dung dịch dùng pha loãng có thể làm chết tếbào như nước muối nước cất.các dung dịch pha loãng sau khi lấy ra từ tủ lạnh khôngđược dùng ngay vì có thể gây sóc cho vi sinh vật làm cho vi sinh vật không thể pháttriển được

 Chuẩn bị các chuỗi pha loãng: bơm chính xác 9ml dung dịch pha loãng vào ốngnghiệm có nắp

Mẫu cần phân tích là mẫu thực phẩm thao tác tiến hành pha loãng như sau: cân25g mẫu thực phẩm cần phân tích cho vào túi dựng thêm vào túi 225ml dung dịch phaloãng ta được độ pha loãng 10 -1, hút 1ml mẫu 10 -1 cho vào ống nghiệm chứa 9ml dungdịch pha loãng lắc đều ta có 10-2 tương tự ta lấy 1ml 10-2 cho vào 9ml dung dịch phaloãng đã chuẩn bị sẵn ta có mẫu 10-3 Theo cách này ta làm cho đến khi có nồng độ phaloãng như mong muốn ( hình 3.1)

Pha loãng mẫu

Ống nuôi cấy ban đầu (ống gốc)

Hình 3.1 : Pha loãng mẫu [8]

 Đồng nhất mẫu

Do sự phân bố không đều của vi sinh vật bên trong mẫu nên mẫu cần được làmđồng nhất trước khi phân tích Việc đồng nhất các mẫu lỏng được thực hiện bằng cáchlắc kỹ trước khi phân tích Các mẫu rắn được lắc hay đảo trộn bằng các dụng cụ chuyêndùng, ví dụ như: thiết bị dập mẫu (Stomacher), trong điều kiện vô trùng

Sau khi mẫu được đồng nhất, tùy yêu cầu của chi tiêu phân tích, thực hiện thu mộtlượng xác định của mẫu để tiến hành phân tích Ví dụ, đối với các chỉ tiêu định lượng,lượng mẫu trích ra để phân tích là 10g, đối với các chỉ tiêu định tính, lượng mẫu trích ra

3.4.1.5 Thuyết minh quy trình

Chuẩn bị mẫu.

Cân chính xác 25g mẫu cho vào bao PE vô trùng Thêm vào 225ml môi trườngBPW đã hấp khử trùng để nguội Tiến hành đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu(stomacher) Thời gian dập mẫu tùy thuộc vào từng loại mẫu nhưng không quá 150

Cân 25g mẫu và 225ml môi trường BPW đồng nhất được độ pha loãng 10-1

Pha loãng mẫu trong nước muối sinh lý để được các độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4

Lật ngược đĩa ủ ở 30oC trong 72 giờ hoặc 37oC trong 48 giờ

Từ mỗi độ pha loãng hút 1ml mẫu cho vào đĩa petri đã vô trùng, đổ khoảng 15ml môi trường PCA đã hấp khử trùng và làm nguội đến 45oC Mỗi độ pha loãng làm

2 đĩa

Chọn các đĩa có số khuẩn lạc trong khoảng 25-250 để đếm

Tính toán kết quả tổng vi sinh vật hiếu khí trong mẫu

giây Tất cả các thao tác trên phải thực hiện trong điều kiện vô trùng Khi đó, ta sẽ đượcdung dịch pha loãng 10-1.

Dịch được pha loãng sẽ được pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùngpipetman hút 1ml từ độ pha loãng 10-1 cho vào 9ml nước muối sinh lý đã hấp khử trùng,đồng nhất ta đươc 10-2 Hút 1ml từ độ pha loãng 10-2 cho tiếp vào 9ml nước muối sinh

lý, đồng nhất ta được 10-3 Tiếp tục thực hiện tương tự để có được các độ pha loãng cầnthiết

Cấy mẫu

Chọn độ pha loãng từ 10-2 đến 10-4, dùng pipetman hút 1ml mỗi độ pha loãng chovào 2 đĩa petri đã khử trùng Tiếp tục đỗ khoảng 15ml môi trường PCA đã hấp khửtrùng để nguội khoảng 45oC, lắc đều bằng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược chiềukim đồng hồ từ 3-5 lần Đặt đĩa lên mặt phẳng ngang và chờ môi trường đặc lại, lậtngược đĩa ủ 30oC sau 72 giờ hoặc37oC trong 48 giờ (hình 3.2) Chọn tất cả đĩa có sốkhuẩn lạc từ 25-250 khuẩn lạc để đếm

Hình 3.2 Phương pháp thực hiện đổ đĩa phân tích tổng vi sinh hiếu khí [10]

Đĩa petri vô

§Hình 3.3 : Tổng số vi sinh vật hiếu khí [10]

- Nếu ở nồng độ pha loãng cao

nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa

lớn hơn 250 Ví dụ: ở nồng độ 10-5 số

đếm được lớn hơn 250, kết quả được

ghi: >2,5x107 CFU/ml

- Nếu ở độ pha loãng thấp nhất,

số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa nhỏ

Trong đó: A: số tế bào vi khuẩn (khuẩn lạc ) trong 1g mẫu

N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn

ni: Số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i

V: Thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào môi trường

fi: Độ pha loãng tương ứng

Ví dụ: Trong 1 trường hợp phân tích 1g mẫu cụ thể nhận được kết quả như sau:

Kết quả: Nồng độ pha loãng 10-3 10-4 10-5

(cfu/g)

1 1

1 V f n i V i f i

n

N A

còn chứa muối mật ức chế vi khuẩn gram dương và chất chỉ thị pH như Neutral red,

crystal Trên môi trường này khuẩn lạc Coliforms có màu đỏ đến màu đỏ đậm, đường

kính > 0,5mm, xung quanh khuẩn lạc có vùng tủa của muối mật Việc khẳng định đượcthực hiện bằng cách nuôi cấy trên môi trường canh chọn lọc như BGBL

Mật độ Coliforms được tính dựa trên số lượng khuẩn lạc điển hình đếm được, tỷ lệ

khẳng định và độ pha loãng trước khi cấy vào đĩa

Để phát hiện được bộ phận tế bào Coliforms bị tổn thương hay bị giảm sức sống

do quá trình chế biến hay bảo quản thực phẩm, bộ phận này có thể không tăng trưởngđược trong môi trường chọn lọc, trước khi mẫu được cấy vào một môi trường khôngchọn lọc như TSA, trước khi bổ sung môi trường chọn lọc

3.5.1.3 Quy trình phân tích

) / ( 10 4 , 2 0001 , 0 1 1 001 , 0 1 2

26 246

3.5.1.4 Thuyết minh quy trình

Cân 25g mẫu và 225ml môi trường BPW đồng nhất 30 giây

Lấy 1ml mẫu trên cho vào 2 đĩa Petri trống đã vô trùng

Lật ngược đĩa và ủ ở nhiệt độ 37oC, trong 24 giờ

Đỗ khoảng 15ml môi trường VRB đã đun tan và làm nguội 45oC

Đỗ khoảng 5ml TSA tan chảy và làm nguội đến 45oC, lắc đều

Ủ ở nhiệt độ phòng 1-2 giờ

Hình 3.4: Khuẩn lạc Coliforms [8]

Cấy mẫu.

Dùng pipetman hút 1ml

mẫu cho vào đĩa petri trống

Đỗ khoảng 5ml môi trường

TSA đã hấp khử trùng để

nguôị 45oC, lắc đều để ở nhiệt

độ phòng 1-2 giờ Gai đoạn

này nhầm khôi phục các tế

bào bị tổn thương hay bị suy

yếu Làm trên 2 đĩa

Đỗ thêm 15ml môi

trường VRB (môi trường

VRB dùng nước cất đã hấp

khử trùng, đun sôi sau đó cho

môi trường vào, không hấp

khử trùng môi trường này) để

nguôị 45oC, lắc đều để đặc môi trường Giai đoạn này nhằm chọn lọc vi khuẩn

Coliforms.

Lật ngược đĩa ủ ở 37oC trong 24 giờ ( hình 3.5)

Đếm tất cả các khuẩn lạc trên cả hai đĩa Khuẩn lạc đặc trưng của Coliforms có

màu đỏ đến đỏ sậm, có quầng tủa muối mật, đường kính > 0.5mm ( hình 3.4)

Hình 3.5 Phương pháp đổ đĩa

phân tích tổng số Coliforms [11]

Thử nghiệm khẳng định.

Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy vào 5 ống môi trường BGBL, có ống Durham

Ủ 24 giờ, đếm các ống có sinh hơi tính tỉ lệ R ( hình 3.6)

TSA

ở 45oC 5 ml Dịch pha loãng 10-1

Hình 2.6 Khẳng định Coliforms

Ghi kết quả

Ghi kết quả: Số khuẩn lạc trên cả 2 đĩa

Số ống sinh hơi

Công thức tính Tổng số Coliforms (cfu/g).

Trong đó C: Tổng cố khuẩn lạc đặc trưng trên tổng số đĩa chọn đếm

N: lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ

V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa

f: độ pha loãng tương ứng

R = (Số khuẩn lạc sinh hơi trong BGBL) / (Số khuẩn lạc đã cấy)

Ghi nhận kết quả: Tổng số Coliforms phát hiện trong 25g mẫu

3.5.2 Phương pháp MPN

3.5.2.1 Nguyên tắc

Số lượng Coliforms trong mẫu thực phẩm chứa mật độ thấp của nhóm vi khuẩn

này có thể được xác định bằng phương pháp MPN (Most Probable Number) Phươngpháp này dựa vào nguyên tắc mẫu được pha loãng thành 1 dãy thập phân (2 nồng độnối tiếp nhau nhưng khác nhau 10 lần); 3 hoặc 5 mẫu có độ pha loãng thập phân liêntiếp được ủ trong ống nghiệm chứa môi trường thích hợp có 1 ống dẫn khí Durham.Mỗi nồng độ pha loãng được ủ từ 3 đến 5 ống lặp lại Theo dõi sự sinh hơi và đổi màu

để định tính sự hiện diện trong từng ống thử nghiệm; đây là các ống dương tính Ghinhận số ống nghiệm cho phản ứng dương tính ở mỗi nồng độ pha loãng và dựa vàobảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng hiện diện trong 1g (hoặc1ml) mẫu ban đầu

3.5.2.2 Quy trình thưc hiện

3.5.2.3 Thuyết minh quy trình

Cân chính xác 25g mẫu cho vào bao PE vô trùng Thêm vào 225ml môi trườngBPW đã hấp khử trùng để nguội Tiến hành đồng nhất mẫu bằng máy dậpmẫu(stomacher) Thời gian dập mẫu tùy thuộc vào từng loại mẫu nhưng không quá 150giây Tất cả các thao tác trên phải thực hiện trong điều kiện vô trùng Khi đó, ta sẽ đượcdung dịch pha loãng 10-1

Dịch được pha loãng sẽ được pha loãng đồng theo dãy thập phân bằng cách dùngpipetman hút 1ml từ độ pha loãng 10-1 cho vào 9ml nước muối sinh lý đã hấp khử trùng,đồng nhất ta đươc 10-2 Hút 1ml từ độ pha loãng 10-2 cho tiếp vào 9ml nước muối sinh

lý, đồng nhất ta được 10-3 Tiếp tục thực hiện tương tự để có được các độ pha loãng cầnthiết

Tuần tự cấy 1ml dịch mẫu đã pha loãng 10-1 vào 3 ống nghiệm giống nhau, mỗiống chứa 10ml canh LSB Thực hiện tương tự với dịch mẫu đã pha loãng 10-2 và 10-3

Cân 25g mẫu và 225ml môi trường BPW đồng nhất 30 giây

Lấy 1ml mẫu trên cho vào 3 ống chứa 10ml canh LSB

Ủ 38oC trong 48 giờ, ghi nhận số ống có hơi

Ủ ở 370C  10C trong 48 giờ, ghi nhận các ống sinh hơi (+)

Cấy chuyển dịch mẫu từ ống LSB (+) sang các ống chứa canh BGBL