Luận văn Nghiên cứu ảnh hưởng của NaCl tới động thái tích lũy một số chất trao đổi, hoạt độ enzym chống oxy hóa ở mầm đậu tương

Trong điều kiện môi trường sinh thái biến đổi như hiện nay, một trong những vấn đề đang được quan tâm nhất là sự nóng lên của Trái Đất. Điều này sẽ dẫn đến hàng loạt vấn đề nghiêm trọng. Một trong những ảnh hưởng đó không thể không nhắc đến là hiện tượng mực nước biển dâng cao làm cho hàng ngàn ha đất đai bị nhiễm mặn.Địa hình nước ta có đường bờ biền dài 3260km, do đó, cũng như nhiều quốc gia giáp biển trên thế giới Việt Nam đang đứng trước nguy cơ xâm lấn của nước biển do hậu quả của biến đổi khí hậu (BĐKH) toàn cầu.Theo thống kê của tổ chức Nông lương Liên hợp quốc FAO, hằng năm diện tích đất nông nghiệp giảm mạnh do bị nhiễm mặn là 3% trên toàn thế giới, 6% ở Việt Nam và các nước Đông Nam Á khác 19. Sự xâm nhập của nước biển vào lục địa làm cho tính chất lý hóa của đất trồng bị biến đổi nghiêm trọng. Đất nhiễm mặn là nguyên nhân quan trọng làm giảm thế năng nước xung quanh vùng rễ của cây trồng làm cho cây trồng lấy nước khó khăn, nên thường không sinh trưởng và phát triển bình thường được.Vì vậy, việc nghiên cứu về giống cây trồng chịu mặn và biện pháp nâng cao khả năng chống chịu của cây trồng đang là chủ đề được nhiều nhà khoa học quan tâm. Một số nghiên cứu trên lúa, cải dầu, đậu tương, đậu xanh..., cho thấy prolin và glyxin betain có vai trò quan trọng trong việc điều hòa thẩm thấu, bảo vệ và làm giảm tác hại của các điều kiện nhiễm mặn đối với cây trồng 9 10 14 26 55 .Ngoài ra các tác nhân oxy hóa (ROS) như các gốc tự do superoxit anion (O2.), hydrogen peroxit (H2O2) và các gốc hydroxyl (.HO)… cũng được sinh ra trong suốt quá trình cây trồng gặp điều kiện nhiễm mặn; ROS có thể gây ảnh hưởng nghiêm trọng, làm phá vỡ sự trao đổi chất bình thường thông qua quá trình ôxy hoá các chất béo, protein và axit nucleic. Để chống lại ảnh hưởng xấu các tác nhân này, kết quả nghiên cứu của Karuppanapandian T., JC Moon, C. Kim, K. Manoharan, W. Kim (2011);S. Mutlu, Ö. Atici and B. Nalbantoglu (2009),… chỉ ra rằng thực vật đã hình thành các cơ chế bảo vệ khác nhau, trong đó chủ yếu dựa vào các enzym có hoạt tính phân huỷ các hợp chất oxy hoá như superoxit dismutaza (SOD) triệt tiêu gốc superoxit (O2.) hay catalaza (CAT), peroxidaza (POD), alkyl hydroperoxit, glutathion reductaza có tác dụng phân huỷ hydrogen peroxit (H2O2)... 36 57 58Các nhà khoa học đã chú ý đi sâu vào hướng tìm hiểu ảnh hưởng của muối đến các quá trình sinh lí, sự hình thành các chất có vai trò bảo vệ, tuy nhiên các nghiên cứu cho đến nay còn nhiều điều chưa làm rõ cơ chế ảnh hưởng của muối, động thái tích lũy và hoạt động của các chất chống oxy hóa ở hạt trong quá trình nảy mầm, một giai đoạn sinh trưởng rất mẫn cảm với stress môi trường.Trong cơ cấu cây trồng, đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)còn gọi là đậu nành, là một cây trồng cạn ngắn ngày có giá trị kinh tế cao là cây trồng đứng vị trí thứ tư trong các cây làm lương thực, thực phẩm sau lúa mì, lúa nước và ngô. Ở Việt Nam, đậu tương được gieo trồng tại 25 trong số 63 tỉnh thành cả nước, với khoảng 65% tại khác khu vực phía Bắc và 35% tại các khu vực phía Nam 70. Hạt đậu tương có thành phần dinh dưỡng cao, có khá nhiều loại vitamin... Phân tích thành phần sinh hoá cho thấy trong hạt đậu tương đang nảy mầm, ngoài hàm lượng vitamin C cao, còn có các thành phần khác như: vitamin PP, và nhiều chất khoáng khác như Ca, P, Fe v.v... Đậu tương có khả năng cung cấp năng lượng khá cao, khoảng 4700 calkg. Sản phẩm từ đậu tương được dùng làm thực phẩm cho con người, là một vị thuốc để chữa bệnh, làm thức ăn cho gia súc, nguyên liệu cho công nghiệp, hàng xuất khẩu 5. Đậu tương còn là cây có tác dụng cải tạo đất, tăng năng suất cây trồng khác do hoạt động cố định nitơ của vi khuẩn Rhizobium cộng sinh trên rễ cây.Với những giá trị dinh dưỡng, giá trị sử dụng và giá trị kinh tế của cây đậu tương; việc lựa chọn được giống đậu tương có khả năng chống chịu tốt và cho năng suất cao trên những vùng đất nhiễm mặn là hướng nghiên cứu đang được quan tâm chú ý.

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Nguyễn Văn Mã đã luôn tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp tôi

hoàn thành công trình nghiên cứu này

Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể các thầy, cô thuộc khoa Sinh - Kỹ thuật Nôngnghiệp, cán bộ của Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Khoa học và Chuyển giao Công nghệ -Trường ĐH Sư Phạm Hà Nội 2 đã giúp đỡ, đóng góp nhiều ý kiến quý báu và tạo điềukiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại trường

Tôi xin chân thành cảm ơn NCS Nguyễn Thị Thao - Trường Đại học Sư phạm

Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin gửi đến gia đình và bạn bè, những người đã luôn bên cạnh, ủng hộ vàđộng viên tôi trong suốt quá trình học tập cũng như nghiên cứu khoa học lời biết ơnchân thành và sâu sắc nhất

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2015

Tác giả

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trungthực và không trùng lặp với các đề tài khác Tôi cũng xin cam đoan mọi thôngtin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2015

BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BĐKH : Biến đổi khí hậu

ROS : Các tác nhân oxy hóa

SOD : Superoxit dismuataza

CAT : Catalaza

POD : Peroxidaze

MDSG : Mức độ suy giảm chất khô

M C L C ỤC LỤC ỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 3

2 Mục đích nghiên cứu 5

3 Nhiệm vụ nghiên cứu 5

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 5

5 Dự kiến đóng góp mới 6

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 7

1.1 Một số đặc điểm sinh trưởng của mầm đậu tương 7

1.2 Ảnh hưởng của nhiễm mặn đến sinh trưởng, phát triển và tính chống chịu mặn của thực vật 9

1.3 Tình hình nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiễm mặn và khả năng chịu mặn của đậu tương 15

1.4 Vai trò của prolin, glycin betain trong chống chịu stress ở thực vật 17

1.4.1 Vai trò của prolin trong chống chịu stress ở thực vật 17

1.4.2 Vai trò của glyxin betain trong chống chịu stress ở thực vật 19

1.5 Vai trò của enzym catalaza, peroxidaza, superoxit dismutaza trong chống chịu stress ở thực vật 21

1.5.1 Vai trò của enzym superoxit dismutaza trong chống chịu stress ở thực vật 23

1.5.2 Vai trò của enzym catalaza trong chống chịu stress ở thực vật 24

1.5.3 Vai trò của enzym peroxidaza trong chống chịu stress ở thực vật 25

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 Ảnh hưởng của NaCl tới động thái tích lũy prolin, glyxin betain ở mầm đậu tương 27

3.1.1 Ảnh hưởng của NaCl tới động thái tích lũy proline ở mầm đậu tương 27

3.1.2 Ảnh hưởng của NaCl tới động thái tích lũy glyxin betain ở mầm đậu tương 33

3.2 Ảnh hưởng của NaCl tới động thái hoạt độ enzym catalaza, peroxidaza, superoxit dismutaza ở mầm đậu tương 38

3.2.1 Ảnh hưởng của NaCl tới động thái hoạt độ enzym superoxit dismutaza ở

mầm đậu tương 38

3.2.2 Ảnh hưởng của NaCl tới động thái hoạt độ enzym catalaza ở mầm đậu tương ở mầm đậu tương trong 6 giờ đầu gây mặn (mg/g) 44

3.2.3 Ảnh hưởng của NaCl tới động thái hoạt độ enzym peroxidaza ở mầm đậu tương 47

3.3 Ảnh hưởng của NaCl tới sinh trưởng của mầm đậu tương 51

3.3.1 Ảnh hưởng của NaCl tới tỷ lệ nảy mầm của mầm đậu tương 51

3.3.2 Ảnh hưởng của NaCl tới khả năng sinh trưởng của mầm 54

KẾT LUẬN 61

DANH MỤC CÁC TÀI LIỆU THAM KHẢO 63

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của NaCl tới động thái tích lũy prolin ở mầm đậu tương trong

6 giờ đầu trong gây mặn (mg/g) 32Bảng 3.2 Ảnh hưởng của NaCl tới động thái tích lũy prolin ở mầm đậu tương trong

6 ngày gây mặn (mg/g) 33

Bảng 3.3 .Ảnh hưởng của NaCl tới động thái tích lũy glyxin betain ở mầm đậutương trong 6 giờ đầu gây mặn (mg/g) 38Bảng 3.4 .Ảnh hưởng của NaCl tới động thái tích lũy glyxin betain ở mầm đậutương trong 6 ngày gây mặn (mg/g) 37Bảng 3.5 Ảnh hưởng của NaCl tới động thái tích lũy hoạt độ enzym SOD ở mầmđậu tương trong 6 giờ đầu gây mặn (U/g) 43Bảng 3.6 Ảnh hưởng của NaCl tới động thái tích lũy enzym SOD ở mầm đậu tươngtrong 6 ngày gây mặn (U/g) 45Bảng 3.7 Ảnh hưởng của NaCl tới động thái tích lũy CAT ở mầm đậu tương trong

6 giờ đầu gây mặn (mg/g) 48Bảng 3.8 .Ảnh hưởng của NaCl tới động thái tích lũy enzym catalaza ở mầm đậutương trong 6 ngày gây mặn (U/g) 48Bảng 3.9 Ảnh hưởng của NaCl tới động thái tích lũy enzym POD ở mầm đậu tươngtrong 6 giờ đầu gây mặn (U/g) 52Bảng 3.10 .Ảnh hưởng của NaCl tới động thái tích lũy enzym peroxidaza ở mầmđậu tương (U/g) 50Bảng 3.11 .Ảnh hưởng của NaCl đến tỷ lệ nảy mầm của đậu tương (%) 56Bảng 3.12 .Ảnh hưởng của các nồng độ NaCl đến khối lượng tươi của mầm đậutương (g) 59Bảng 3.13 .Ảnh hưởng của các nồng độ NaCl đến khối lượng tươi của mầm đậutương (g) 60Bảng 3.14 .Ảnh hưởng của các nồng độ NaCl đến chiều dài mầm của đậu tương(mm/mầm) 63

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Sơ đồ phản ứng chịu muối của thực vật 20

Hình 1.2 Công thức cấu tạo prolin 22

Hình 1.3 Vai trò sinh lý của prolin trong điều kiện stress 23

Hình 1.4 Công thức cấu tạo glyxin betain 25

Hình 1.5 Mô hình chống chịu stress ở thực vật của glyxin betain 26

Hình 3.1 Ảnh hưởng của các nồng độ NaCl đến tỷ lệ nảy mầm của đậu tương .58

Hình 3.2 .Biểu đồ ảnh hưởng của các nồng độ NaCl đến tỷ lệ phần trăm khối lượng tươi của mầm đậu tương so với mẫu đối chứng 60

Hình 3.3 Biểu đồ mức độ suy giảm tích lũy chất khô của mầm đậu tương dưới ảnh hưởng của các nồng độ NaCl 62

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Trong điều kiện môi trường sinh thái biến đổi như hiện nay, một trong nhữngvấn đề đang được quan tâm nhất là sự nóng lên của Trái Đất Điều này sẽ dẫn đếnhàng loạt vấn đề nghiêm trọng Một trong những ảnh hưởng đó không thể khôngnhắc đến là hiện tượng mực nước biển dâng cao làm cho hàng ngàn ha đất đai bịnhiễm mặn

Địa hình nước ta có đường bờ biền dài 3260km, do đó, cũng như nhiều quốcgia giáp biển trên thế giới Việt Nam đang đứng trước nguy cơ xâm lấn của nướcbiển do hậu quả của biến đổi khí hậu (BĐKH) toàn cầu.Theo thống kê của tổ chứcNông lương Liên hợp quốc FAO, hằng năm diện tích đất nông nghiệp giảm mạnh

do bị nhiễm mặn là 3% trên toàn thế giới, 6% ở Việt Nam và các nước Đông NamÁ khác [19] Sự xâm nhập của nước biển vào lục địa làm cho tính chất lý hóa củađất trồng bị biến đổi nghiêm trọng Đất nhiễm mặn là nguyên nhân quan trọnglàm giảm thế năng nước xung quanh vùng rễ của cây trồng làm cho cây trồng lấynước khó khăn, nên thường không sinh trưởng và phát triển bình thường được

Vì vậy, việc nghiên cứu về giống cây trồng chịu mặn và biện pháp nâng caokhả năng chống chịu của cây trồng đang là chủ đề được nhiều nhà khoa học quantâm Một số nghiên cứu trên lúa, cải dầu, đậu tương, đậu xanh , cho thấy prolin

và glyxin betain có vai trò quan trọng trong việc điều hòa thẩm thấu, bảo vệ vàlàm giảm tác hại của các điều kiện nhiễm mặn đối với cây trồng [9] [10] [14] [26][55] Ngoài ra các tác nhân oxy hóa (ROS) như các gốc tự do superoxit anion(O2.-), hydrogen peroxit (H2O2) và các gốc hydroxyl (.HO)… cũng được sinh ra

trong suốt quá trình cây trồng gặp điều kiện nhiễm mặn; ROS có thể gây ảnhhưởng nghiêm trọng, làm phá vỡ sự trao đổi chất bình thường thông qua quá trìnhôxy hoá các chất béo, protein và axit nucleic Để chống lại ảnh hưởng xấu các tácnhân này, kết quả nghiên cứu của Karuppanapandian T., J-C Moon, C Kim, K.Manoharan, W Kim (2011);S Mutlu, Ö Atici and B Nalbantoglu (2009),… chỉ

ra rằng thực vật đã hình thành các cơ chế bảo vệ khác nhau, trong đó chủ yếu dựa

vào các enzym có hoạt tính phân huỷ các hợp chất oxy hoá như superoxitdismutaza (SOD) triệt tiêu gốc superoxit (O2.-) hay catalaza (CAT), peroxidaza(POD), alkyl hydroperoxit, glutathion reductaza có tác dụng phân huỷ hydrogenperoxit (H2O2) [36] [57] [58]

Các nhà khoa học đã chú ý đi sâu vào hướng tìm hiểu ảnh hưởng của muốiđến các quá trình sinh lí, sự hình thành các chất có vai trò bảo vệ, tuy nhiên cácnghiên cứu cho đến nay còn nhiều điều chưa làm rõ cơ chế ảnh hưởng của muối,động thái tích lũy và hoạt động của các chất chống oxy hóa ở hạt trong quá trìnhnảy mầm, một giai đoạn sinh trưởng rất mẫn cảm với stress môi trường

Trong cơ cấu cây trồng, đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)còn gọi là đậu

nành, là một cây trồng cạn ngắn ngày có giá trị kinh tế cao là cây trồng đứng vị tríthứ tư trong các cây làm lương thực, thực phẩm sau lúa mì, lúa nước và ngô Ở ViệtNam, đậu tương được gieo trồng tại 25 trong số 63 tỉnh thành cả nước, với khoảng65% tại khác khu vực phía Bắc và 35% tại các khu vực phía Nam [70] Hạt đậutương có thành phần dinh dưỡng cao, có khá nhiều loại vitamin Phân tích thànhphần sinh hoá cho thấy trong hạt đậu tương đang nảy mầm, ngoài hàm lượngvitamin C cao, còn có các thành phần khác như: vitamin PP, và nhiều chất khoángkhác như Ca, P, Fe v.v Đậu tương có khả năng cung cấp năng lượng khá cao,khoảng 4700 cal/kg Sản phẩm từ đậu tương được dùng làm thực phẩm cho conngười, là một vị thuốc để chữa bệnh, làm thức ăn cho gia súc, nguyên liệu cho côngnghiệp, hàng xuất khẩu [5] Đậu tương còn là cây có tác dụng cải tạo đất, tăng năng

suất cây trồng khác do hoạt động cố định nitơ của vi khuẩn Rhizobium cộng sinh

trên rễ cây

Với những giá trị dinh dưỡng, giá trị sử dụng và giá trị kinh tế của cây đậutương; việc lựa chọn được giống đậu tương có khả năng chống chịu tốt và chonăng suất cao trên những vùng đất nhiễm mặn là hướng nghiên cứu đang đượcquan tâm chú ý

Chính vì những lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của NaCl tới động thái tích lũy một số chất trao đổi, hoạt độ enzym chống oxy hóa ở mầm đậu tương” Nghiên cứu về động thái tích lũymột số chất có khả

năng bảo vệ và động thái hoạt độ một số enzym chống oxy hóa ở đậu tương trongquá trình bị nhiễm mặn ở các nồng độ NaCl khác nhau trong suốt quá trình nảymầm của đậu tương Nghiên cứu này góp phần làm rõ vai trò của các chất chốngoxy hóa trong cơ chế chống chịu của thực vật; đặc biệt là ở giai đoạn nảy mầm củahạt, là một thời kỳ quan trọng trong phát triển cá thể của thực vật, giai đoạn tạo tiền

đề cho sự sinh trưởng, phát triển của chúng

2 Mục đích nghiên cứu

- Nghiên cứu về động thái tích lũymột số chất trao đổi và động thái hoạt độmột số enzym chống oxy hóa ở đậu tương trong quá trình bị nhiễm mặn ở các nồng

độ NaCl khác nhau trong suốt quá trình nảy mầm của đậu tương

- Góp phần làm rõ vai trò của các chất chống oxy hóa và các chất có vaitrò bảo vệ trong cơ chế chống chịu của thực vật; đặc biệt là ở giai đoạn nảy mầmcủa hạt

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Động thái hàm lượng một số chất trao đổi (prolin, glycin betain) của mầmđậu tương sinh trưởng trong quá trình gây mặn ở các nồng độ NaCl khác nhau

- Động thái hoạt độ một số enzym chống oxy hóa (catalaza, peroxidaza,/superoxit dismutaza) của mầm đậu tương sinh trưởng trong quá trình gây mặn ởcác nồng độ NaCl khác nhau

- Tỷ lệ nảy mầm của hạt trong điều kiện mặn

- Sự sinh trưởng của mầm: chiều dài mầm, khối lượng tươi, khối lượng khôcủa mầm đậu tương trong quá trình gây mặn ở các nồng độ NaCl khác nhau

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

4.1 Đối tượng nghiên cứu: Giống đậu tương ĐT22.

4.2 Phạm vi nghiên cứu

Phạm vi nghiên cứu: Động thái tích lũy 2 chất trao đổi (prolin, glycin betain),hoạt độ của 3 enzym chống oxy hóa (catalaza, peroxidaza, superoxit dismutaza)

5 Dự kiến đóng góp mới

- Vấn đề nghiên cứu sự tích lũy các chất chống oxy hóa đã được quan tâm

nghiên cứu ở nhiều nước trên thế giới nhưng ở Việt Nam còn ít được nghiên cứu.Nghiên cứu sâu về động thái tích lũy và hoạt độ của các chất chống oxy hóa ở giaiđoạn nảy mầm còn ít được chú ý cho đến nay Vì thế nghiên cứu này có thể gópphần làm rõ những vấn đề cơ bản để tiếp tục tìm hiểu cơ chế chống chịu stress nóichung và chịu mặn nói riêng.

Chương 1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Một số đặc điểm sinh trưởng của mầm đậu tương

Có rất nhiều định nghĩa về sự nảy mầm của hạt được được đưa ra TheoASOA 1981 “Sự nảy mầm là hoạt động tiếp tục sinh trưởng của phôi khi vỏ hạtthoái hoá và cây con nhú lên” Đây là định nghĩa tiếp tục sinh trưởng của hạt đã ngủnghỉ sau khi hình thành và phát triển Trong quá trình ngủ nghỉ của hạt không hoạtđộng trao đổi chất và năng lượng hoặc hoạt động này diễn ra rất thấp.

Đối với hạt đậu tương, sau khi trồng hạt ngấm nước rất nhanh trừ một vàigiống đặc biệt là loại hoang dại khả năng ngấm nước chậm hơn Trong điều kiệnthuận lợi, rễ xuất hiện sau khi trồng 1-2 ngày Rễ này gọi là rễ chính nó phát triểnnhanh xuống phía dưới, đến ngày thứ 3 - 4 rễ phụ bắt dầu xuất hiện Sau 4 - 5 ngày

lá mầm xuất hiện và đẩy lên khỏi mặt đất sự sinh trưởng mạnh của phần trên trụmầm dưới lúc đầu lá mầm có màu vàng nhạt, sau có màu xanh sau cùng chuyểnsang màu vàng và rụng xuống

Thực chất quá trình nảy mầm là quá trình biến đổi sinh lí, sinh hoá mạnh mẽdiễn ra trong hạt, chuẩn bị cho sự hình thành cây non

Sự nảy mầm bắt đầu bằng sự hấp thu nước nhờ cơ chế hút trương của hạt.Sau khi kết thúc sự ngủ nghỉ, trong hạt bắt đầu tăng tính thủy hóa của keo nguyênsinh chất, giảm tính ưa mỡ và độ nhớt của keo, dẫn đến những biến đổi sâu sắc vàđột ngột trong quá trình trao đổi chất trong hạt liên quan đến sự nảy mầm Đặctrưng nhất là tăng mạnh mẽ hoạt tính của các enzim thủy phân phân giảipolisaccarit, protein và các chất phức tạp khác thành các chất đơn giản dẫn đến thayđổi hoạt động thẩm thấu Các sản phẩm thủy phân này dùng làm nguyên liệu choquá trình hô hấp tăng lên mạnh mẽ của phôi hạt, vừa làm tăng áp suất thẩm thấutrong hạt giúp cho quá trình hút nước vào hạt nhanh chón [5] [19] [22]

Trong quá trình hạt nảy mầm diễn ra các quá trình [6] :

- Sự hoạt hóa nước hoặc trương nước

- Hình thành và hoạt hóa các enzym

- Động viên các chất dự trữ - tích lũy năng lượng

- Phôi bắt đầu sinh trưởng, rễ mầm phá rách vỏ hạt

- Sinh trưởng tiếp tục của cây mầm

Sự phân chia này chỉ mang tính tương đối, các giai đoạn không độc lập mà

có sự xen kẽ lẫn nhau, bù trừ cho nhau

Giai đoạn nảy mầm là giai đoạn đầu tiên trong quá trình sinh trưởng và pháttriển của cây đậu tương, do đó yêu cầu giai đoạn này phải có đủ nước, nhiệt độ vàoxy [5][6]:

- Yếu tố nước: Nước là yếu tố cơ bản của sự nảy mầm vì hạt muốn nảy mầmthì phải trải qua quá trình hút nước Nước cần thiết cho các enzim hoạt động, phá vỡ

vỏ hạt và vận chuyển các chất Hạt đậu tương hút nước 2 đến 5 lần trọng lượng khô,nhiều hơn so với các cây trồng khác, ví dụ như hạt ngô hút nước chỉ từ 1,5 đến 2 lầntrọng lượng khô

- Yếu tố nhiệt độ: Sự nảy mầm của hạt là tổ hợp của các quá trình baogồm nhiều phản ứng và pha khác nhau, một trong đó là nhiệt độ Nhiệt độ từ 15-

30oC là thích hợp nhất quá trình nảy mầm của hạt đậu tương Trong khoảng nhiệt

độ này, chỉ sau gieo 3-7 ngày là hạt đã nảy mầm Nếu nhiệt độ nhỏ hơn 10oC hạtnảy mầm kéo dài 12-15 ngày mới mọc Nếu cao trên 30oC hạt nảy mầm nhanhnhưng mầm yếu

- Yếu tố oxy: Khi hạt đã hấp thụ đủ nước, cường độ hô hấp của hạt tăngnhanh đặc biệt là hô hấp hiếu khí Do vậy cần nhiều oxy để các tế bào trong hạt hôhấp hiếu khí theo chu trình Crebs tạo ra nhiều sản phẩm là ATP, cung cấp cho quátrình tổng hợp các phân tử hữu cơ, đặc biệt là protein

Khi có đủ nước, oxy, nhiệt độ thì hạt sẽ hút nước trương lên, các menproteinaza, amyloaza v.v chứa trong hạt bắt đầu hoạt động chuyển các chất dự trữở dạng phức tạp sang đơn giản cung cấp cho quá trình hình thành các tế bào và cơquan bộ phận mới của phôi trong quá trình nảy mầm

1.2 Ảnh hưởng của nhiễm mặn đến sinh trưởng, phát triển và tính chống chịu mặn của thực vật

Đất nhiễm mặn

Dự báo đến cuối thế kỷ XXI, nhiệt độ trung bình sẽ tăng lên khoảng từ 2,0 4,5oC và mực nước biển toàn cầu sẽ tăng từ 0,18m - 0,59m do hậu quả của BĐKH

-Nước biển dâng dẫn đến sự xâm thực của nước mặn vào nội địa, ảnh hưởng trựctiếp đến nguồn nước ngầm, nước sinh hoạt cũng như nước và đất sản xuất nông -công nghiệp.Sử dụng bản đồ đất thế giới của FAO / UNESCO (1970-1980), FAOước tính rằng trên toàn cầu với tổng diện tích đất mặn là 397 triệu ha và đất kiềm là

434 triệu ha Trong số 230 triệu ha đất được tưới tiêu, 45 triệu ha (chiếm 19,5%) làđất bị nhiễm mặn; và trong số gần 1 triệu 500 ha của vùng đất nông nghiệp khô hạn,

32 triệu (chiếm 2,1%) là đất nhiễm mặn [69]

Ở Việt Nam đất bị nhiễm mặn có diện tích khoảng trên 1 triệu ha Tập trungchủ yếu ở đồng bằng sông Cửu Long, ở đây có hơn 700 ngàn ha đất mặn và nhiễmmặn, địa bàn bị mặn xâm nhập vào sâu trong nội đồng từ 30 - 40km Dự báo vàonăm 2030, khoảng 45% diện tích của khu vực đồng bằng sông Cửu Long sẽ bịnhiễm mặn cục bộ và gây thiệt hại mùa màng nghiêm trọng do lũ lụt và ngập úng.Nếu không có kế hoạch đối phó, phần lớn diện tích của đồng bằng sông Cửu Long

sẽ ngập trắng nhiều thời gian trong năm và thiệt hại ước tính sẽ là 17 tỷ USD Ngoài

ra, ở các tỉnh duyên hải miền Trung như Quảng Bình, Hà Tĩnh, Ninh Thuận… diệntích đất nhiễm mặncũng lên đến vài chục ngàn ha BĐKH còn kéo theo sự thay đổicủa thời tiết, ảnh hưởng trực tiếp đến cây trồng, sản xuất nông, lâm, công nghiệp vànuôi trồng, đánh bắt thủy - hải sản Đặc biệt là sự xuất hiện của dịch bệnh và khanhiếm về lương thực, nước ngọt

Đất mặn là đất chứa một lượng muối hòa tan trong nước ở vùng rễ cây làmthiệt hại đến sinh trưởng của cây trồng Mức độ gây hại tùy thuộc vào loài câytrồng, giống cây, thời gian sinh trưởng của cây, các yếu tố môi trường đi kèm Theođịnh nghĩa của hội khoa học Mĩ công bố thì đất mặn là đất có độ dẫn điện EC caohơn 4dS/m ở điều kiện nhiệt độ 25oC, pH nhỏ hơn 8,5 [1]

Mặn hóa là quá trình xâm nhiễm và tích tụ các muối và kim loại kiềm trongmôi trường đất, nước khi các môi trường thành phần này từ chỗ chưa bị mặn trởthành mặn Trong các loại muối thì NaCl là loại gây mặn điển hình nhất

*Dựa vào nguồn gốc, đặc điểm tích lũy muối, người ta chia quá trình mặnhóa này thành 3 loại:

- Ảnh hưởng của nước biển

- Quá trình mặn hóa lục địa

- Quá trình mặn hóa thứ sinh

Ảnh hưởng của nhiễm mặn đến sinh trưởng, phát triển của thực vật

Độ mặn là một trong những yếu tố môi trường tàn bạo nhất hạn chế năngsuất cây trồng bởi vì hầu hết các loại cây trồng nhạy cảm với độ mặn do nồng độcao của các muối trong đất

Đối với hầu hết cây trồng, tăng nguồn nước ngầm và tăng độ mặn có tácđộng tiêu cực đến sự tăng trưởng thực vật và sự nảy mầm hạt giống Như độ mặntrong đất tăng, thực vật ngày càng khó khăn trong việc tìmvàlấy nước từ đất Mức

độ muối cao có thể tạo ra sự mất cân bằng các chất dinh dưỡng trong đất và một sốmuối nhất địnhgây độc hại cho cây trồng Ngập úng thì gây ra nghèo khí đất, thiếuthốn oxy Hậu quả tức thời của độ mặn đến cây trồng không thích nghi với muốibao gồm các hiện tượng như rụng lá, cháy lá, chậm phát triển, hạt giống nảy mầmkém và chết cây [68]

Phản ứng chung nhất của thực vật đối với muối là làm giảm sinh trưởng.[33]Trong đất mặn, các thực vật kém chịu mặn ngừng sinh trưởng do các chức năngsinh lý bị kìm hãm Nồng độ muối càng cao thì kìm hãm sinh trưởng càng mạnh

Muối trong nước của đất có thể ức chế sự tăng trưởng thực vật vì hai lý do.Thứ nhất, sự hiện diện của muối trong dung dịch đất làm giảm khả năng lấy nướccủa cây trồng, và dẫn đến việc giảm tốc độ tăng trưởng Điều này được gọi là hiệuứng thẩm thấu hoặc thâm hụt nước của độ mặn Thứ hai, nếu quá nhiều lượng muốithâm nhập vào cây trong dòng hơi nước sẽ gây nên tổn thương cho các tế bào vậnchuyển trong lá và điều này có thể gây ra việc tiếp tục giảm tăng trưởng Điều nàyđược gọi là hiệu ứng riêng biệt về muối hoặc ion thặng dư muối Mặn làm tăng sựphân hủy diệp lục, ức chế quá trình tổng hợp sắc tố, giảm diện tích lá dẫn đến quátrình quang hợp giảm mạnh [49][54]

Trong điều kiện mặn hô hấp trong tế bào diễn ra mạnh, nhưng hiệu quả nănglượng thấp, phần lớn năng lượng của các quá trình phân huỷ đều thải ra dưới dạng

nhiệt làm cho tế bào thiếu ATP để hoạt động.[28] [34][48][59][62] Phân huỷ mạnh,tổng hợp lại yếu nên không bù đủ lượng vật chất do hô hấp phân huỷ, chất dự trữdần dần bị hao hụt, cây không sinh trưởng được, do vậy cây còi cọc, năng suất thấp.

Đất nhiễm mặn còn ảnh hưởng đến các hoạt động sinh lý của cây như:

- Việc dư thừa muối trong đất đã làm tăng áp suất thẩm thấu của dung dịchđất Cây lấy được nước và chất khoáng từ đất khi nồng độ muối tan trong đất nhỏhơn nồng độ dịch bào của rễ, tức áp suất thẩm thấu và sức hút nước của rễ cây phảilớn hơn áp suất thẩm thấu và sức hút nước của đất Nếu độ mặn của đất tăng caođến mức sức hút nước của đất vượt quá sức hút nước của rễ thì chẳng những câykhông lấy được nước trong đất mà còn mất nước vào đất gây nên hiện tượng hạnsinh lý Cây không hấp thu được nước nhưng quá trình thoát hơi nước của lá vẫndiễn ra bình thường làm mất cân bằng nước gây nên hạn sinh lý Việc tăng áp suấtthẩm thấu trong đất mặn quá mức là nguyên nhân quan trọng nhất gây hại cho câytrồng trên đất mặn Tỉ lệ nảy mầm của hạt cây họ Đậu nói chung, cây đậu tương nóiriêng giảm mạnh trong điều kiện thiếu nước [20] [46]

- Sự tổng hợp xytokinin bị ngừng vì rễ là cơ quan tổng hợp phytohocmonnày nên cây thiếu xytokinin, ảnh hưởng đến sinh trưởng của các cơ quan trên mặtđất [19] [22]

- Nồng độ gây độc của muối phá huỷ tính thấm của màng tế bào Điều đódẫn đến cây bị mặn mất khả năng kiểm tra nồng độ photpho vô cơ nội tế bào cũngnhư các chất trao đổi khác, kìm hãm sự vận chuyển tích cực của các chất đi quamàng của tế bào rễ cây cũng như các tế bào [19][22]

Sự hút khoáng của rễ cây bị ức chế nên cây thiếu chất khoáng Do thiếuphotpho nên quá trình photphoryl hoá bị kìm hãm và cây thiếu năng lượng

- Sự vận chuyển và phân bố các chất đồng hoá trong mạch libe bị kìm hãmnên các chất hữu cơ tích luỹ trong lá ảnh hưởng đến quá trình tích luỹ vào cơ quan

dự trữ [19][22]

- Mặn đã làm thay đổi hoạt động của enzim gây rối loạn trao đổi chất, đặcbiệt là trao đổi protein Mặn có thể làm chuyển hướng từ trao đổi CO2 của axit hữu

cơ sang tổng hợp axit amin nên cây bị mặn có khuynh hướng tích luỹ axit amin vàamit

- Khi thực vật tiếp xúc với stress muối, sẽ gây suy giảm trong việc vậnchuyển electron, và sau đó các tác nhân oxy hóa (ROS) sẽ được sản xuất ở cả 2 loại

tế bào đó là lục lạp và ty thể (Parvaiz và Satyawati, 2008) Việc sản xuất ROS cao,

và sự mất cân bằng trở nên nghiêm trọng hơn do muối và áp suất thẩm thấu có thểgây ra nhiều tác động bất lợi tới các tế bào thực vật, bao gồm sự tổn thương cấu trúcmàng và các bào quan, ức chế enzym, phân hủy sắc tố, lipid peroxy; sự tấn côngbừa bãi của các đại phân tử bao gồm cả axit nucleic, và cuối cùng có thể dẫn đếnchết tế bào [13]

Ngoài ra ion Na+ảnh hưởng khá lớn lên vi sinh vật có trong đất quanh rễ vàbên trong câybị ảnh hưởng Lipmen và Sharp (1912) tìm ra NaCl ở nồng độ dưới0,5%, gây ảnh hưởng đến quá trình cố định đạm của các vi khuẩn có nốt sần, còn

Na2SO4 thì thể hiện tính độc ở nồng độ 1,2% Greaves và Lund (1921) và Greaves(1912) thảo luận về ảnh hưởng của các cation và aninon lên hoạt động vi sinh vậttrong đất và trong mối liên quan với áp lực thẩm thấu của dung dịch Các muối banđầu trong đất mặn ở nồng độ thấp không độc, thật sự thì quá trình amon hóa vànitrat hóa có thể bị đồng hóa Nhưng ở giới hạn độc có một sự tương quan mật thiếtgiữa độc tính và áp suất thẩm thấu Ở áp suất thẩm thấu là 15atm quá trình amonhóa giảm xuống gần một nửa so với đất không mặn

Có thể dễ dàng nhận thấy, ảnh hưởng của đất nhiễm mặn lên sự sinh trưởng

và phát triển của thực vật là không nhỏ Mặn ảnh hưởng tiêu cực đến các giai đoạnphát triển của cây trồng; kìm hãm sự sinh trưởng, từ đó làm giảm năng suất, chấtlượng, sản lượng nông nghiệp Đặc biệt giai đoạn nảy mầm và trong các giai đoạnđầu của thời kỳ sinh trưởng hầu hết thực vật nhạy cảm với độ mặn của đất Các hạtnảy mầm bị ảnh hưởng mạnh bởi tác dụng thẩm thấu của các muối, làm tăng tỷ lệcây non bị chết và cây mọc không tốt [67]

Tính chống chịu mặn của thực vật

Khả năng chịu mặn (tính chống chịu mặn) của cây được hiểu là khả năng để

cây trồng có thể lớn lên, phát triển và sống hết vòng đời trong môi trường đất bịnhiễm mặn Các loại cây trồng khác nhau có khả năng chịu mặn cũng khác nhau.

Mặn có thể làm thay đổi một số đặc tính của cây mà các đặc tính đó có thểcải thiện được cân bằng nước trong trường hợp đất mặn Chúng có lá ít và nhỏ,giảm số lượng khí khổng, tăng độ mọng nước, làm dày tầng cutin và sáp phủ trên

lá, giảm sự hình thành mô dẫn, lignin hoá rễ sớm Do sự sinh trưởng chậm củacác bộ phận trên mặt đất nên giảm tỷ lệ thân lá/rễ Tất cả các đặc điểm đó giúp chocây giảm sự dẫn nước và thoát hơi nước để duy trì sự cân bằng nước trong điềukiện đất mặn

Để có cơ chế đáp ứng hiệu quả đối với stress mặn, thực vật tự phát triển khảnăng cảm ứng các thành phần siêu thẩm thấu và ion Na+ của quá trình stress mặn.Hai phương thức cảm ứng trên đã chứng minh rằng cơ chế đáp ứng đối với muốiNaCl mang nhiều sự khác biệt so với cơ chế đáp ứng với stress thẩm thấu thuần túy.Nồng độ muối cao trong dung dịch đất sẽ tạo ra stress thẩm thấu ở vùng rễ Và vùng

rễ để chống chịu lại với việc ion muối bên trong tế bào quá cao sẽ tự điều chỉnh hạthấp bằng cách bơm trở lại môi trường nhờ sử dụng ATP.[13][65] Các thực vật chịumặn có khả năng tự điều chỉnh thẩm thấu để làm tăng áp suất thẩm thấu trong tế bàovượt quá áp suất thẩm thấu của đất Tốc độ và thời gian điều chỉnh thẩm thấu phụthuộc vào loài thực vật Tuỳ thuộc vào thực vật mà có các cách điều chỉnh thẩmthấu khác nhau

Trong những nghiên cứu gần đây,các chất bảo vệ ngoại sinh như các chấtbảo vệ thẩm thấu (proline, glycine betaine, trehalose, vv), hormon cây trồng (axitgibberellic, axit jasmonic, brassinosteroid, acid salicylic, vv), các chất chống oxyhóa (axit ascorbic, glutathione, tocopherol, vv), các phân tử tín hiệu (nitricoxit,hydrogen peroxide, vv), polyamine (spermidine, spermine, putrescine), các nguyên

tố vi lượng (selen, silic, vv) đã được tìm thấy có hiệu quả trong việc giảm nhẹ ảnhhưởng của muối gây ra thiệt hại trong cây trồng Những chất bảo vệ trên đã chothấy năng lực chống chịu dưới độ mặn của đất của thực vật rất rõ ràng Chúng cóvai trò quan trọng trong việc đảm bảo cân bằng thế thẩm thấu với không bào vừa

bảo vệ trực tiếp các phân tử protein và cấu trúc ribosom khỏi tác động của nồng độNa+ cao ở chất nguyên sinh [9] [10] [13] [14] [17] [26] [38] [41] [42] [44] [45][47] [51] [60]

Trong điều kiện bình thường, các gốc tự do luôn luôn có sự sản sinh trong cơthể thực vật Các gốc tự do nội sinh cũng rất cần thiết cho quá trình tổng hợp cũngnhư phân huỷ các chất trong chu trình chuyển hoá của tế bào Do gốc tự do có hoạttính sinh học rất mạnh, nên nếu tăng quá mức cho phép sẽ gây ra những tổn thương

tế bào làm phát sinh nhiều vấn đề phức tạp Chính vì thế mà trong cơ thể thực vậthình thành hệ thống chất chống oxy hoá (antioxidant) có vai trò khử các chất oxyhoá và gốc tự do gây độc hại đến tế bào Hệ thống giải độc này gồm các enzym và

cơ chế phi enzyme Ngoài các enzym chống oxy hóa, enzym thủy phân như amylase

và phosphatase cũng liên quan đến phản ứng stress [2][3][13][36][57][58]

Phản ứng của cây trồng đối với môi trường mặn rất phức tạp, là tổng hợp củanhiều yếu tố riêng lẻ Các nghiên cứu triển khai trên nhiều đối tượng thực vật đềuthống nhất răng dưới tác động của các điều kiện stress môi trường ở tế bào thực vậtxảy ra phản ứng không đặc trưng tương tự nhau: tăng tính thấm của màng sinh chất,tăng cường đi vào xytosol Ca+2 từ môi trường hay từ các bộ phận bên trong nhưkhông bào, lưới nội chất và ty thể, chuyển dịch pH tế bào về phía axit, tăng độ nhớtchất nguyên sinh kèm theo tăng tập trung sợi actin, tăng hấp thụ oxy, tăng sử dụngATP, tạo các gốc tự do đồng thời cũng sản sinh các chất chống oxy hóa, tăng bơmH+ ở màng sinh chất và màng nội chất, tăng hàm lượng prolin, tăng cường tổng hợpprotein stress, tăng tổng hợp etylen và ABA, giảm sinh trưởng và phân chia tế bào

Sơ đồ phản ứng chịu muối của thực vật được tác giả Nguyễn Văn Mã tổng hợp nhưsau: [13]

Hình 1.1 Sơ đồ phản ứng chịu muối của thực vật 1.3 Tình hình nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiễm mặn và khả năng chịu mặn của đậu tương

Việc nghiên cứu ảnh hưởng của nhiễm mặn và khả năng chịu mặn đã đượcnhiều nước trên thế giới và Việt Nam nghiên cứu ở nhiều loài cây khác nhau, trong

đó có đậu tương

Trong hầu hết các loại đất mặn, Na+ là một trong những cation gây độc hạilớn cho cây trồng nói chung và đậu tương nói riêng Zhu JK (2002) đã cho rằng khảnăng chịu mặn của cây trồng là một hiện tượng phức tạp có liên quan đến quá trìnhsinh hóa và sinh lý cũng như thay đổi hình thái học và phát triển [66]

Đậu tương là một loại cây trồng nhạy cảm với muối Trong đậu tương, stressmặn ức chế nảy mầm và tăng trưởng hạt giống, làm giảm những nốt sần trên rễ, vàlàm giảm tích lũy sinh khối và năng suất [7] [14] [16] [38] [42] [60] [67]

Với sự gia tăng độ mặn, tỷ lệ và phần trăm tích lũy protein, thời gian tích tụdầu, protein và hàm lượng dầu, protein mỗi hạt đậu tương giảm, nhưng tỷ lệ phần

trăm dầu tăng Tuy nhiên, năng suất dầu và protein mỗi cây giảm khi độ mặn tiếptục tăng lên [37].

Các nghiên cứu đều chỉ ra rằng, cây đậu tương chống chịu theo nhiều cơ chếkhác nhau và có sự tương quan giữa các cơ chế chống chịu riêng biệt và năng lựcchống chịu tổng thể của nó trong quá trình gặp nhiễm mặn

Cơ chế chống chịu stress muối trong đậu tương có thể được phân loại thànhbốn loại chính, bao gồm [60] :

(i) duy trì cân bằng ion nội môi;

(ii) điều chỉnh để đáp ứng với stress thẩm thấu;

(iii) phục hồi sự cân bằng oxy hóa;

(iv) các quá trình chuyển hóa và sự thích ứng của kết cấu

Sự khác biệt giữa khả năng chống chịu mặn được thể hiện bởi quỹ gen khácnhau và được xác định bởi hiệu suất của chúng trong việc điều phối các hệ thống đó

Về khả năng chịu mặn của đậu tương, trước hết phải nói đên cơ chế tích lũy

và duy trì nồng độ cao các chất hòa tan trong tế bào nhằm đảm bảo sự cạnh tranhnước với môi trường nhiễm muối và chống lại hiện tượng hạn sinh lý Vai trò của

bộ rễ và khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu của tế bào liên quan trực tiếp đếnquá trình nhiễm mặn, rễ phát triển mạnh làm gia tăng lượng nước trong chồi qua đólàm loãng nồng độ muối cũng là một cơ chế chống chịu mặn hiệu quả

Hiện nay, nghiên cứu sâu hơn về phản ứng của hạt giống đậu tương chịu mặntrong nảy mầm ở cả hai mức độ sinh lý và proteomic đã chỉ ra các protein như GPD,GST9, GST10, và protein PM36 trong hạt giống chín sinh lý được xác định là cóliên quan đến stress muối trong quá trình hạt đậu tương nảy mầm và có vai trò bảo

vệ trong chịu đựng stress muối [65]

Một cơ chế nổi bật của khả năng chịu mặn trong đậu tương là nâng cao khảnăng, các hoạt động chống lại và phá vỡ độc tính của các tác nhân oxy hóa do hệthống giải độc để nhằm khôi phục lại sự cân bằng oxy hóa và giảm thiểu thiệt hại tếbào do stress oxy hóa thứ cấp Hệ thống này gồm có hoạt động của các enzymechống oxy hóa (SOD, CAT, POD); các chất chống oxy hóa phi enzyme (acid

ascorbic (AsA), carotenoid (Car) và glutathione (GSH)) và đã được tìm thấy trong

lá và rễ cây đậu tương trong quá trình gặp stress muối [2] [3] [38] [42] [60]

Stress muối giảm tăng trưởng đậu tương và gây ra những thay đổi trong giảiphẫu học đặc điểm như tăng tổng hợp cutin trên tế bào gốc biểu bì và thay đổi trongcấu trúc mạch gỗ và sự hóa gỗ của chúng trong thân cây đậu tương, gây ra việc tăngnhanh chóng sự phát triển của xylem và các hợp chất phenolic trong thân đậu tương.Đây cũng là đại diện cho một cơ chế thích ứng trong việc chống áp lực stress mặn ởcây đậu tương [25]

Khi phân tích thành phần hóa sinh của các cây chịu mặn, các nghiên cứuđều cho rằng, khi cây trồng nói chung và đậu tương nói riêng gặp mặn có hiệntượng tăng lên về hoạt độ enzyme, hàm lượng ABA, hàm lượng proline, glycinebetain, nồng độ ion K+, các loại đường, axit hữu cơ, để bảo vệ cơ thể khỏi ảnhhưởng tiêu cực của mặn; và giảm tích lũy CO2, protein và axit nucleic [10] [16][38] [42][47] [60]

1.4 Vai trò của prolin, glycin betain trong chống chịu stress ở thực vật

1.4.1 Vai trò của prolin trong chống chịu stress ở thực vật

Prolin có công thức phân tử C5H9NO2,là một α- amino axit có khả năng hòatan mạnh trong nước, giữ nước và lấy nước cho tế bào Phân tử prolin có cấu trúcvòng (pirolidin), cấu trúc này tạo nên cho prolin một hình dáng vững chắc hơn cácaxit amin khác

Hình 1.2 Công thức cấu tạo prolin

Prolin được tích lũy ở lá cây của nhiều loài thực vật, mô lá, mô phân sinhchóp rễ của thực vật, tích lũy trong hạt phấn bị làm khô, tích lũy ở chóp rễ đangsinh trưởng và những tế bào thực vật nuôi cấy trong môi trường huyền phù đã thíchnghi với điều kiện stress nước Prolin bảo vệ màng tế bào chống lại ảnh hưởng bất

lợi của sự tập trung cao các ion vô cơ và nhiệt độ Prolin được tích lũy khi cây gặpcác điều kiện bất lợi như mặn, hạn, nhiệt độ thấp hoặc cao, kim loại nặng, bị nhiễmbệnh, thiếu dinh dưỡng, ô nhiễm môi trường và tia UV [12]

Đã có nhiều công trình nghiên cứu trong nước và nước ngoài trên các đốitượng thực vật khác nhau, để tìm hiểu về cơ chế tổng hợp, chuyển hóa prolin… liênquan đến vai trò của nó trong chống chịu stress ở thực vật, trong đó có stress mặn.[8] [9] [10] [11] [13] [14] [16] [26] [38] [53]

Prolin thuộc nhóm các chất điều hòa thẩm thấu, do đó việc tích lũy prolinxảy ra nhanh chóng ngay sau khi thực vật bắt đầu gặp stress muối Và sự tích lũyban đầu này chính là một phản ứng với stress muối Ngoài vai trò của nó như là mộtchất điều chỉnh thẩm thấu của nội bào, prolin còn góp phần ổn định cấu trúc màng

tế bào, trực tiếp hay gián tiếp tác động tới các chất phân tử lớn, giúp chúng giữvững cấu trúc không gian và hoạt tính sinh học là nhờ sự ổn định môi trường thủyhóa nguyên vẹn của protit Prolin góp phần ổn định các gốc tự do, và đệm oxi hóakhử tế bào trong điều kiện stress Tác động chống oxy hóa của prolin được thể hiệnở điểm là chúng làm bất hoạt các nhóm hydroxyl và các hợp chất phản ứng mạnhkhác sinh ra trong khi cây gặp các stress gây kìm hãm vận chuyển điện tử trong lụclạp và ty thể Bên cạnh đó, prolin còn có vai trò quan trọng trong việc dập tắt oxysinglet (1O2) cùng với carotenoid ở lục lạp Nó cũng có chức năng như mộthydrotrope tương thích với protein; giảm toan tế bào chất, và duy trì tỷ lệNADP+/NADPH thích hợp giúp ổn định trạng thái oxy hóa khử và ngăn ngừa sự tổnthương bộ máy quang hợp, tương thích với sự trao đổi chất Ngoài ra, sự phá vỡnhanh chóng của prolin sau khi giảm nhẹ stress có thể cung cấp đầy đủ chất khử để

hỗ trợ oxy hóa ty lạp thể phosphoryl hóa và sinh ra ATP cho việc phục hồi khỏistress và sửa chữa thiệt hại stress gây ra Hơn nữa, proline được biết là tín hiệu phảnứng nhanh của gen đối với stress muối, trong đó có yếu tố phản ứng nhanh prolin(ví dụ như PRE, ACT CAT) trong tổ chức của chúng Prolin còn điều hòa pH tế bàochất, bảo vệ quá trình trao đổi chất của cây

Ở đậu tương, khi gặp tress mặn cũng đã có các phản ứng sinh hóa để bảo vệ

cơ thể, cụ thể là sự gia tăng tích lũy hàm lượng prolin và một số chất điều hòa thẩmthấu khác, nhằm làm giảm áp suất thẩm thấu ở không bào, giữ cân bằng thẩm thấutrong tế bào [10] [14] [38] [40]

Ngoài ra việc tăng hàm lượng prolin ở lá dưới ảnh hưởng của stress mặn cóthể được gây ra bởi các cảm ứng hoặc kích hoạt sự tổng hợp prolin từ glutamatehoặc giảm việc sử dụng của nó trong tổng hợp protein hoặc nâng cao trong việc tíchlũy protein Như vậy, prolin có thể chính là nguồn năng lượng và chuyển hóa nitơtrong stress ngay lập tức và tích lũy prolin dường như cung cấp năng lượng cho sựphát triển và tồn tại, từ đó cây đậu tương có thể chống chịu với hiện tượng nhiễmmặn.[38]

Như vậy vai trò sinh lý của prolin trong điều kiện stress được tổng kết vàtrình bày theo sơ đồ như sau: [13]

Hình 1.3 Vai trò sinh lý của prolin trong điều kiện stress

1.4.2 Vai trò của glyxin betain trong chống chịu stress ở thực vật

Glyxin betain có tên khoa học là 2-trimetyllamoni axetat, còn tên gọi trướcđây là trimetylglyxin, betain, oxynevrin Nó có công thức phân tử C5H11NO2, khốilượng phân tử 117,148g/mol

Hình 1.4 Công thức cấu tạo glyxin betain

Glyxin betain là một trong những chất tan tương thích (osmolyte), chúnghòa tan tốt trong nước, có vai trò duy trì sức trương nước, ổn định cấu trúc và chứcnăng của các đại phân tử (polyol, đường, axit amin, betain) Nó là một chất hữu cơtích trữ ở thực vật nhằm đáp ứng với những khắc nghiệt của môi trường nhưmặn, hạn hán, nhiệt độ khắc nghiệt, bức xạ UV… Nó có vai trò bảo vệ màng tếbào của lá, bảo vệ các thành phần bộ máy quang hợp, bảo vệ ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (Rubisco), quang hệ II và giảm tác hại củaROS ở nồng độ cao cao [13][44][52]

Chức năng bảo vệ của glyxin betain xuất hiện từ sự phù hợp với cấu trúcphân tử của nó Glyxin betain hoạt động trong cả cấu trúc bậc bốn của protein vàcấu trúc có trật tự cao của màng tế bào chống lại các tác động tiêu cực của

độ mặn cao và nhiệt độ khắc nghiệt [35]

Glyxin betain là sản phẩm quá trình oxy hóa của cholin trong một quá trìnhtổng hợp methionin Thực vật bậc cao tổng hợp glyxin betain trong lục lạp thôngqua con đường: Cholin  beatin aldehyt  glyxin betain [55] Bước đầu tiên đượcxúc tác bởi cholin monooxygennaza và bước thứ hai xúc tác bởi betain aldehytdehydrogenaza (BADH)

Thực vật tích lũy nhiều phân tử trọng lượng thấp chất hòa tan hữu cơ tươngthích như là một cơ chế thích nghi để giúp chúng chịu đựng áp lực khác nhau từ môitrường Các chất tan tương thích phổ biến nhất là glyxin betain, đường (mannitol,sorbitol, và trehalose), polyols, polyamine, và axit amin (prolin) Một điểm đặc biệt

đó là chúng không độc hại khi ở nồng độ

Như đối với stress mặn, tích lũy glyxin betain tương quan với mức độ chịumặn của cây trồng Việc cung cấp ngoại sinh của glyxin betain cũng làm tăng khảnăng chịu mặn của một số loài thực vật [41] Vai trò chính của tích lũy glyxin

betain trong cây dưới tác động của stress mặn không những đóng vai trò như mộtchất điều chỉnh áp suất thẩm thấu mà còn để tương tác với cả hai lĩnh vực ưa nước

và kỵ nước của các đại phân tử, chẳng hạn như các phức protein và enzyme, ổn địnhcấu trúc và hoạt động của chúng, và duy trì tính toàn vẹn của màng chống lại các táchại nghiêm trọng của muối, ngoài ra còn bảo vệ bộ máy quang hợp Và cũng có đềxuất cho rằng glyxin betain đóng vai trò làm giảm tác hại của ROS ở nồng độ caođược sinh ra trong những quá trình căng thẳng khác nhau [23] [44] [53]

Mô hình chống chịu stress ở thực vật của glyxin betain [13] :

Hình 1.5 Mô hình chống chịu stress ở thực vật của glyxin betain

Đối với đậu tương, cũng như các cây trồng khác, khi gặp các điều kiện bấtlợi của môi trường cũng có sự tích lũy glyxin betain nhằm chống lại tác hại của cácstress [10][14] [52]

1.5 Vai trò của enzym catalaza, peroxidaza, superoxit dismutaza trong chống chịu stress ở thực vật

Hiện nay, xu hướng nghiên cứu về gốc tự do và hệ thống chống oxy hoá ởthực vật đã được các nhà khoa học rất quan tâm chú ý

Trong cơ thể thực vật luôn tồn tại các tác nhân oxy hóa (ROS) và các chấtchống oxy hoá, hai quá trình này luôn có sự cân bằng với nhau

Gốc tự do nội sinh là cần thiết cho quá trình phân huỷ và tổng hợp các chấttrong chu trình chuyển hoá của cơ thể thực vật Phản ứng oxy hoá cơ chất để cungcấp năng lượng cho sự sống hoặc các dây truyền trao đổi electron giữa các hệ thống,

thường thông qua phản ứng gốc tự do Khi cần gốc tự do cũng là vũ khí tiêu diệt cácvật thể lạ xâm nhập Tuy nhiên gốc tự do nội sinh có một tỷ lệ nhất định thoát rakhỏi quá trình hữu ích cùng với gốc tự do lạ do tác động của môi trường, luôn tấncông quyết liệt và liên tục vào mọi cấu trúc của tế bào.

Do ảnh hưởng của biến đổi khí hậu, môi trường sinh thái hiện nay đang bịbiến đổi, tồn tại rất nhiều tác nhân bất lợi khác nhau gây ảnh hưởng không nhỏ đếnsinh trưởng, phát triển của thực vật Các tác nhân bất lợi như mặn, hạn, nhiệt độ quácao… làm cho quá trình cân bằng bị dịch chuyển theo hướng làm tăng các gốc tự do

và giảm các chất chống oxy hoá trong cơ thể thực vật Tất cả các nguyên nhân làmcho gốc tự do sinh ra ồ ạt, dẫn đến hệ thống tự bảo vệ không “thu dọn” hết, tất yếulàm phát sinh các rối loạn và tổn thương như rối loạn cấu trúc màng tế bào, giảmhoạt động enzym gắn với màng (trong và ngoài) làm thay đổi cấu trúc receptor bềmặt tế bào, biến đổi các cấu trúc acid nucleic, protein, bất hoạt các enzyme như:dehydrogenase, polymerase, adenylcyclase

Chất chống oxy hoá (antioxidant) là một trong những hệ thống nội sinh quantrọng có vai trò khử các chất oxy hoá và gốc tự do gây hại đến tế bào, đây là cơ chếphản ứng duy trì hiệu quả cân bằng nội bào Sự phòng chống stress oxy hóa củachúng tập trung chủ yếu vào 3 vấn đề: [13]

1, Giảm bớt sự hình thành các dạng oxy hoạt hóa (ROS)

2, Hoạt động của hệ thống chống oxy hóa

3, Sửa chữa và thải trừ các đại phân tử (lipit, protein, axit nucleic…) bị hưhại do oxy hóa

Hệ thống chống oxy hoá có ở hầu hết các tế bào của cơ thể sinh vật và thựcvật nói riêng Hệ thống này có bản chất enzym như CAT (catalaza), POD(peroxidaza), SOD (superoxide dismutaza), GPx (glutathione peroxidaza),… hoặckhông có bản chất enzym như polyphenol (vitamin E, flavonoid, caroten), selen,vitamin C, thiol (glutathione)

1.5.1 Vai trò của enzym superoxit dismutaza trong chống chịu stress ở thực vật

Superoxit dismutaza (SOD) là enzym được xác định bởi Mc Cord và

Fridovitch (1969) và là enzym chống oxy hoá có chứa kim loại thuộc lớpoxidoreductaza, điều hoà gốc superoxit anion (O2•-), chức năng của enzym SOD làxúc tác cho phản ứng dị ly xảy ra nhanh:

+ Cấu trúc của SOD: Hệ thống SOD được chia thành 3 nhóm chính là:

Cu/Zn-SOD (M = 30 – 33kDa) có trong tế bào chất, một số có trong lục lạp thực vậtbậc cao và giữa 2 màng của ty thể; Fe-SOD (M=36-48kDa) có trong lục lạp, ngoài

ra cũng có thông báo chúng có mặt trong peroxysom và ty thể, Mn-SOD 94kDa) có trong ty thể

(M=75-+ Lượng O2•- thường xuyên được sinh ra, tỷ lệ với cường độ hô hấp tế bào,trong ty thể có enzym Mn-SOD loại gốc O2•- này, nếu còn gốc nào thoát ra bàotương nó sẽ bị loại bỏ bởi enzym Cu-SOD và Zn-SOD, nhờ có các enzym này màgốc không đến được màng tế bào, vượt ra ngoài tế bào và vì vậy dịch ngoại bào hầunhư không có SOD Hoạt động của SOD bắt buộc phải phối hợp với các hoạt độngcủa catalaza và peroxidaza để tránh sự tích tụ H2O2.

Các nghiên cứu gần đây cho biết, enzym SOD thường hoạt động mạnh lêntrong những trường hợp stress oxy hóa do mặn, ánh sáng mạnh, hạn hán, ngập úng,chất diệt cỏ, nóng, thiếu oxy, kim loại nặng…[2] [3] [31] [32] [ 39] [43] [63]

Nhiều nghiên cứu đã cho thấy rằng SOD, POD, và CAT tăng lên đáng kể ởmột số thực vật khi chịu mặn Những phát hiện này cho thấy rằng một hệ thống chấtchống oxy hóa hiệu quả có bản chất là enzyme trong những thực vật đóng một vaitrò quan trọng trong việc giảm thiệt hại oxy hóa khi chúng chịu căng thẳng về muối.[32][33][40][48][50][63]

1.5.2 Vai trò của enzym catalaza trong chống chịu stress ở thực vật

Catalaza (CAT) là enzym xúc tác phản ứng phân huỷ H2O2 và chỉ hoạt độngkhi H2O2 ở nồng độ cao, catalaza không phân huỷ được peroxit hữu cơ và H2O2 vô

cơ ở nồng độ thấp vì chúng chỉ được hoạt hoá khi H2O2 ở nồng độ cao Catalaza cóthể chuyển hóa 44000 phân tử H2O2 trong một giây

2H2O2 2H2O + O2

CAT được tìm thấy ở tất cả các sinh vật nhân chuẩn hiếu khí Enzym này cómặt trong hầu hết các tế bào và các mô thực vật, có chủ yếu trong các ty thể vàperoxixom

CAT có khối lượng phân từ 220kDa, chứa 4 nhóm haematin chiếm 1,1% vàsắt chiếm 0,09% Protohaematin IX nhóm ngoại (prosthetic) của tất cả CAT đã biết,liên kết lỏng lẻo với protein và có thể cắt bởi axit axetic CAT có cấu trúc bậc 4 vàcũng gồm 4 tiểu đơn vị, mỗi tiểu đơn vị chứa một heme và ở một số cơ thể thì còn

có thêm một phân tử NADP+ , nó có vai trò bảo vệ enzym khỏi sự oxy hoá của chính

H2O2

Cơ chế xúc tác của catalaza gồm hai bước:

- Bước đầu tiên: một proton của H2O2 được chuyển từ nguyên tử oxy sangnguyên tử oxy kia (qua His-74) làm cho liên kết O-O dài ra và phân cực rồi cuốicùng bị đứt gãy Nguyên tử oxy bị đứt ra gắn với Fe tạo thành Fe4+ = O và một phân

tử nước được giải phóng

H2O2 + Fe3+ - E H2O + O = Fe4+ - E

- Bước tiếp theo diễn ra tương tự, Fe4+ = O tương tác với phân tử H2O2 thứhai để trở về dạng ban đầu Fe3+ - E đồng thời giải phóng thêm một phân tử nước vàmột phân tử oxy

H2O2 + Fe4+ - E H2O + Fe3+ - E + O2

CAT thuộc nhóm enzym giúp “làm sạch” hệ thống nội bào, hoạt độ enzymnày tăng lên khi cây gặp phải điều kiện bất lợi của môi trường Kết quả nghiêncứu hoạt độ enzym này ở nhiều loài thực vật như ngô, đậu tương, mướp đắng…trong điều kiện môi trường bất lợi khác nhau như mặn, kim loại nặng, từ trườngbiến đổi, hạn… đã là minh chứng cho điều đó [2] [3] [31] [32] [33] [39] [40] [43][48] [50] [63]

1.5.3 Vai trò của enzym peroxidaza trong chống chịu stress ở thực vật

Peroxidaza (POD) là một nhóm enzym khá lớn xúc tác các phản ứng oxy hoákhử các chất hữu cơ hay vô cơ với việc sử dụng H2O2 hay peroxit hữu cơ là chấtnhận điện tử Nó thuộc lớp oxidoreductase, phản ứng xảy ra theo phương trình sau[slcc – nvm]:

XH + H2O2 2X + 2H2O

2XH + ROOH 2X + H2O + ROH

(XH là cơ chất dạng khử, X là cơ chất dạng oxy hóa

Các chất có độc tính như gốc O2•- và •OH được phát hiện thấy trong tế bào vì

sự có mặt của O2 , chúng được loại trừ nhờ những enzym nội bào Đối với nhữnggốc O2•- được sinh ra từ O2 trong chuỗi vận chuyển điện tử sẽ bị SOD phân huỷ,nhưng lại tạo ra nhiều H2O2 mà nó cũng là các chất độc với các tế bào, vì vậy việcloại bỏ các H2O2 là rất cần thiết, đảm bảo hoạt động nội bào diễn ra bình thường

Peroxidaza sử dụng H2O2 như là một chất nhận điện tử xúc tác cho nhiều phản ứngoxy hoá khử khác nhau trong đó H2O2 bị khử thành H2O.

Cùng với CAT và SOD, POD là những enzym chống oxy hoá quan trọngtrong hệ thống sinh học Chúng có vai trò chính là giải độc tế bào bằng cáchchuyển hoá H2O2 thành H2O, ngoài ra POD còn tham gia vào những phản ứng sinhhoá quan trọng khác trong cơ thể thực vật như quá trình chuyển hoá và tổng hợplignin, sinh tổng hợp thành tế bào, sinh tổng hợp một số hormon như PG, thyroxyn,ethylen, tham gia vào quá trình trao đổi IAA, quá trình phân huỷ auxin Peroxidaza

có vai trò chống lại các tác nhân độc hại xâm nhiễm vào tế bào, mô và đáp ứng bảo

vệ với những tổn thương [31] [32] [33] [39] [40] [43] [48] [50] [63]

Hầu hết các POD có cùng cơ chế xúc tác phản ứng phân giải H2O2 và đượcthực hiện theo các bước sau:

- Tạo thành phức I hoạt động: Enzym + H2O2  Complex I

- Chuyển hoá phức hợp I thành phức hợp II hoạt động:

Complex I + XH2  Complex II + •XH

- Tái tạo enzyme bằng quá trình khử phức hợp II:

Complex II + XH2  Enzyme + •XH + 2 H2O

- Tạo thành sản phẩm:

•XH + •XH  Sản phẩm oxy hoá

Tính đặc hiệu cơ chất của enzym trong sự tạo thành phức hợp I rất cao Cácperoxyt như H2O2 , methyl hydrogen peroxyt, ethyl hydrogen peroxyt chỉ có thểtương tác với peroxidaza mới hình thành phức hợp cơ chất hoạt động (phức hợp I).Tính đặc hiệu của phức hợp cơ chất – enzym này đối với chất cho hydrogen ở giaiđoạn 2 và 3 là khá thấp, nên chúng có thể phản ứng với nhiều cơ chất hữu cơ (XH2)khác nhau như ferrocyanide, indophenol pherols, amino pherol, 4- aminoantipyren,cytocrom C và một số amino axit

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu: Giống đậu tương ĐT22 [75]

* Nguồn gốc:

Giống ĐT22 do trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ chọn tạo từ dòng đột biến của hạt lai (DT95 x ĐT12) và được Hội đồng Khoa học Công nghệ (Bộ NN&PTNT) công nhận là giống mới Quyết định số 219 QĐ/BNN- KHCN ngày 19/01/2006.

* Đặc điểm chính của giống:

- Thời gian sinh trưởng trung bình 85 - 90 ngày.

- Đặc điểm: Giống đậu tương ĐT22 có hoa màu trắng, hạt vàng, rốn nâu đậm, quả chín có màu nâu Khối lượng 1000 hạt: 155-160 g.

- Giống ĐT22 kháng bệnh phấn trắng.

- Năng suất 18 - 27 tạ/ha, tuỳ thuộc vào mùa vụ và điều kiện thâm canh

2.2 Phương pháp nghiên cứu

50 hạt/khayở các dung dịch muối với nồng độ là 0,3; 0,6; 0,9; 1,2; 1,5; 1,8%; mỗi khay ứng với một công thức thí nghiệm và gọi tên các mẫu thí nghiệm là M0,3; M0,6; M0,9; M1,2; M1,5; M1,8 Mỗi công thức thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

Hạt nảy mầm trong dung dịch muối NaCl đều phải được thường xuyên

bổ sung lượng dung dịch muối với nồng độ tương ứng ở các lô như nhau Mầm đậu tương được sử dụng để đo các chỉ tiêu nghiên cứu trong 6 ngày.

2.2.2 Phương pháp phân tích các chỉ tiêu

Các chỉ tiêu được xác định như sau:

- Ngày 1: xác định các chỉ tiêu nghiên cứu ở các nồng độ NaCl và đối chứng sau 2h, 4h và 6h gieo hạt.

- Ngày 2, 3, 4, 5, 6: xác định các chỉ tiêu nghiên cứu vào một giờ nhất định.

2.2.2.1 Xác định hàm lượng prolin bằng phương pháp so màu (theo Bates và CS) [15]

dung dịch ninhydrin, ủ trong nước nóng 100°C trong thời gian 1h sau đó ủ nước đá 5 phút.

3) Bổ sung vào bình phản ứng 4ml toluen, lắc đều Lấy phần dịch màu hồng ở trên đem đo OD520nm bằng máy đo quang phổ.

4) Hàm lượng prolin được xác định dựa vào đường chuẩn và tính toán theo công thức:

X: nồng độ prolin (ug/ml); V: thể tích dịch chiết ( = số ml toluen); df: hệ

số pha loãng (trong trường hợp này là 5); w: khối lượng mẫu.

Xây dựng đường chuẩn prolin: Y = 0,017X + 0,095 (R2=1)

Trong đó: X – nồng độ prolin (µg/ml); Y – giá trị OD tương ứng với nồng độ X

2.2.2.2 Xác định hàm lượng glycin betaine bằng phương pháp so màu (theo Grieve và Grattan, 1983) [5]

- Lọc thu dịch, bảo quản trong tủ đá để phân tích.

- Pha loãng dịch lọc bằng H2SO4 2N với tỉ lệ 1:1.

- Lấy 0,5ml dịch pha loãng cho vào ống nghiệm eppendorf 2ml đặt vào

hộp đá trong 60 phút.

- Sau đó bổ sung 0,2ml dung dịch kali tri-iot, đặt hốn hợp phản ứng này vào nhiệt đọ 0 – 4oC trong 16 giờ.

- Sau đó ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 15 phút ở 0oC.

- Hút phần dịch nổi (chú ý thao tác nhẹ nhàng) cho vào ống nghiệm, bổ sung 9ml 1,2-diclometan ( đã làm mát ở -100C), đảo đều trong khoảng 1-2 phút (luôn giữ hỗn hợp phản ứng ở 4oC ).

- Sau 2-2,5 giờ, bỏ lớp nước phía trên và xác định mật độ quang học của lớp chất hữu cơ phía dưới ở bước sóng 365nm.

- Hàm lượng của glycine betaine được tính toán từ đường chuẩn.

w : khối lượng mẫu (= 0,5g).

1000: hệ số chuyển đổi đơn vị µg/g sang mg/g mẫu.

2.2.2.3 Xác định hoạt độ enzyme superoxit dismustaza (SOD) bằng phương pháp so màu (Beauchamp CH, and Fridovich J ,1971) [30]

I) Hóa chất

1 Dung dịch đệm để chiết xuất

+ Đệm phosphate 50mM pH 7.0 : 100ml

+ 1% PVP : 1.0g

II Chiết enzym

0.50g lá được nghiền bằng cối và chày, thêm 4ml (2 x 2.0mL) dung dịch đệm để chiết xuất Các đồng chất sau đó được ly tâm ở 15.000 g trong 30 phút ở 4ºC

Thu dịch nổi xác định hoạt độ enzym SOD

III Xác định hoạt độ

Sau đó đưa ống thí nghiệm và ống đối chứng vào box cấy để chiếu UV trong

15 phút (có vải đen che kín box cấy để tạo hộp tối) để phản ứng xảy ra.

chuẩn độ với dung dịch KmnO4 [15]

- Dung dịch H2O2 0,1% (ml) : 10 Giữ ở 30oC trong 30 phút

Bình thí nghiệm Bình đối chứng

- Axit H2SO4 10% (ml) : 5

Chuẩn độ H2O2 dư thừa bằng KMnO4

0,1N cho đến khi xuất hiện màu hồng

bền (bền màu trong 30 giây).

- Axit H2SO4 10% (ml) : 5 Chuẩn độ H2O2 dư thừa bằng KMnO4

0,1N cho đến khi xuất hiện màu hồng bền ( bền màu trong 30 giây).

Tính hoạt độ enzym:

- Tính số mg H2O2 bị phân giải dưới tác dụng của enzym có trong a (g) mẫu:

a V

V B A X

2

1 7 , 1 ).

V1- Số ml dịch chiết enzym từ mẫu (= 10ml).

V2- Số ml dịch chiết enzym dùng cho phản ứng (= 10ml).

a - Khối lượng mẫu (g).

- Số đơn vị catalase trong 1g mẫu (số µmol H2O2 bị phân giải trong 1 phút):

30 034 , 0

= U/g)

Trong đó: 30- thời gian enzym tác dụng.

0,034- 1µmol đương lượng H2O2.

2.2.2.6 Xác định hoạt độ enzyme peroxidaza (POD) bằng phương pháp so màu [29]

Xác định bằng phương pháp đo máy quang phổ sử dụng Pyrogallol làm

cơ chất (theo BBI Solutions, Blaenavon AP 132 Analytical procedures

Peroxidase phân giải H2O2 thành H2O và O2, khi có mặt của chất cho hidro là pyrogallol Sự oxi hóa pyrogallol thành sản phẩm có màu vàng là purpurogallin có thể được đo quang phổ ở bước sóng 420nm với khoảng thời gian đặc hiệu (sử dụng phần mềm Kinetis, đo bằng máy UV-Vis 2450 (Shimadzu, Nhật Bản), đo trong 3 phút, 20 giây đọc kết quả một lần) Cường

độ sản phẩm tỉ lệ với hoạt độ enzym.

Thiết bị và vật liệu:

- 2M NaOH

- 0,1M đệm photphat pH 6,0

- 5,33% Pyrogallol

- Dung dịch H2O2: Pha 0,66ml H2O2 30% vào 50ml nước cất

- Dịch chiết enzym: Nghiền mẫu với 5ml đệm pH 6,0 Tiến hành ly tâm dịch nghiền 10000 vòng trong 15 phút ở 0oC Dịch trong phía trên là dịch chiết enzym thu được.

Cách tiến hành:

Đo ở bước sóng 420nm.

0,1M đệm photphat pH 6,0.

Trong đó: ∆E420nm/20s : giá trị đo được trong 20 giây.

Df : hệ số pha loãng (trong trường hợp này là 50)

12 : Độ hấp thụ của 1mg/ml dung dịch purpurogallin ở 420nm

Từ đó ta có công thức sau:

= ∆E420nm/20s 2,5.50

ml a

ml U

/

/

= U/gTrong đó: ∆E420nm/20s – giá trị đo được trong 20 giây.

a - Khối lượng g mẫu.

2.2.2.7 Xác định tỷ lệ nảy mầm và khả năng sinh trưởng của mầm ở các nồng độ muối khác nhau

* Xác định khả năng nảy mầm của các giống đậu tương ở các nồng độ muối khác nhau.

Đếm số hạt nảy mầm vào các ngày thứ 2, 4 và 6 sau khi gieo hạt

Những hạt nảy mầm là những hạt có chiều dài rễ mầm đạt từ 2mm trở lên, khả năng nảy mầm ở mẫu thí nghiệm so với mẫu đối chứng được tính theo công thức sau:

P = x 100

Trong đó:

P: Khả năng nảy mầm của hạt trong dung dịch muối so với đối chứng

(%);