Tài liệu thông tin về sắc kí lỏng

Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất của chúng tính bị hấp phụ, tính tan, ….. Cơ sở của phương pháp sắc kí:dựa v

Sắc kí là một họ các kĩ thuật hoá học phân tích dùng để tách các chất trong một hỗn

hợp

Bao gồm: hỗn hợp chứa chất cần phân tích trong”pha động” di chuyển qua “pha tĩnh” Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan, …) Trong hệ thống sắc ký chỉ có các phân tử pha động mới chuyển động dọc theo hệ sắc ký Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh Trong quá trình chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ, phản hấp phụ Hệ quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyện động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu hơn pha này Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc ký

Cơ sở của phương pháp sắc kí:dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa 2 pha động và tĩnh

Phân loại: sắc kí khí( Gas Chromatography- GC) và sắc kí lỏng (liquid

Chromatography)

SẮC KÍ LỎNG

Khái niệm:

- Quá trình tách dựa vào tính chất hóa học, vật lý và hóa lý của các chất

- Dựa trên 2 quá trình: hấp phụ và giải hấp phụ

- Xảy ra liên tục giữa 2 pha:

Pha tĩnh: chất rắn hoặc lỏng

Pha động: chất lỏng (1 chất hoặc hỗn hợp nhiều chất)

Pha động: hòa tan và di chuyển chất phân tích

Pha tĩnh: giữ chất phân tích

SKL chia thành 2 nhóm

- SK lỏng áp suất thường (sắc ký cổ điển)

- SK lỏng áp suất cao (SKL hiệu năng cao: HPLC)

(High Performance Liquid Chromatography)

Phân loại sắc kí:

Dựa theo cơ chế chia tách sắc kí, người ta chia thành các loại như sau:

1-Sắc kí hấp phụ: Quá trình sắc kí dựa trên sự mạnh yếu khác nhau của pha tĩnh đối với chat61tan và sự rửa giải(phản hấp phụ) của pha động để kéo chất tan ra khỏi cột

Sự tách hỗn hợp phụ thuộc vào tính động học của chất hấp phụ Có 2 loại hấp phụ:

3-SK trao đổi ion (IE-HPLC)

4 – SK ray phân tử- SK gel (IG- HPLC)

Hoặc dựa vào trạng thái pha tĩnh, người ta chia làm 2 loại:

(Liquid – liquid chromatography)

Pha tĩnh: Lỏng

(Liquid – solid

chromatography)

Pha tĩnh: Rắn

Sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC):

KN: Sắc kí lỏng hiệu năng cao là 1 phương pháp chia tach1trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc chất lng3 phủ lên trên 1 chất mang rắn, hay 1 chất mang đã được biến dổi bằng phương pháp hóa học voi71cac1 nhóm chức hữu cơ.Quá trình sắc kí lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố,trao đổi Ion hay phân loại theo kích cỡ (rây phân tử)

Trong đó:

1 Bình chứa dung môi pha động

2 Bộ phận tiêm mẫu

3 Cột sắc kí( pha tĩnh)

4 Detector(nhận tín hiệu)

5 Hệ thống máy tính gắn phần mềm nhận tín hiệu và xử lí dữ liệu, điều khiển hệ thống HPLC, in dữ liệu

Ngoài ra có 1 số hệ thống sắc kí lỏng còn có bộ phận khử mùi đặt ngay trước bơm cao

áp có tác dụng nhằm loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại tron dung môi pha động, các bọt nhỏ đó sẽ gây ảnh hưởng cho ra kêt quả phân tích sai

BÌNH CHỨA DUNG MÔI PHA ĐÔNG:

-hiện tại máy HPLC thường có 4 đầu dung môi vào đầu bơm cao áp cho phape1 chúng ta sử dụng cúng 1 lần 4 đường dung môi Tuy nhiên, theo kinh nghiệm

ta chỉ sử dụng tối đa la 2 và 3 đường

BƠM CAO ÁP(hệ thống cung cấp dung môi)

- Bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc kí, bơm phải tạo được

áp suất cao khoảng 250-500 atm và phải tạo dòng liên tục.Máy sắc kí lỏng hiện nay thường có áp suất tối đa 412Bar( 1atm=0,98 Bar) Tốc độ dòng 0,1-9,999 ml/phút

- Điểu khiển tốc độ dòng, áp suất của pha động theo thong số đã được cài đặt

BỘ PHẬN TIÊM MẪU:

Đưa mẫu vào cột theo phương pháp không ngừng dòng chảy

Có 2 cách đưa mẫu vào cột; bằng tiêm mẫu thủ công và tiêm mẫu tự động

(autosample)

Cột sắc kí (Column)

- Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao

- Yếu tố quyết định quá trình tách sắc ký

- Thường làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột khoảng 10-25 cm, đường kính 2-5mm

ĐẦU DÒ (detector)

- Thiết bị phát hiện chất phân tích khi chúng ra khỏi cột (định tính và định lượng)

- Có nhiều loại khác nhau tùy mục đích phân tích: UV-VIS, huỳnh quang, độ dẫn, điện hóa,khối phổ

HỆ THỐNG GHI NHẬN VÀ XỬ LÍ TÍN HIỆU:

- Thu thập và xử lý kết quả do Detector truyền sang

- Recorder, Computer + printer, software

Các quá trình tách trong sắc ký lỏng

- Quá trình quan trọng nhất trong phương pháp sắc ký

- Những cân bằng động xảy ra giữa pha tĩnh và pha động trong cột sắc ký

- Là sự vận chuyển và phân bố liên tục của chất PT từ đầu cột đến cuối cột

- Chất phân tích luôn phân bố giữa 2 pha, trong đó pha động luôn chảy qua cột tách với một tốc độ nhất định hoặc gradient

- Hiệu quả của quá trình tách phụ thuộc rất nhiều vào tương tác giữa các chất trong pha tĩnh và pha động

- Mục đích chính của sắc ký là tách và định tính các chất trong hỗn hợp chất phức tạp

- Thời gian chất PT bị pha tĩnh lưu giữ (thời gian lưu) quyết định bởi:

Bản chất của pha tĩnh, cấu trúc và tính chất của chất PT

Bản chất và thành phần của pha động dùng để rửa giải chất PT ra khỏi cột sắc ký (pha tĩnh)

- Ghi lại toàn bộ quá trình tách sắc ký của hỗn hợp chất PT à sắc ký đồ gồm nhiều peak

- Đặc điểm của peak PT:

• Các peak có thể tách rời nhau hoàn toàn

• Chập nhau một phần

• Chập nhau hoàn toàn

4 Ưu điểm của phương pháp sắc ký

- Có thể phân tích đồng thời nhiều hợp chất

- Không cần làm bay hơi mẫu

- Độ phân giải cao nhờ quá trình tách trên cột

- Độ nhạy cao (ppm-ppb) nhờ đầu dò

- Thể tích mẫu phân tích nhỏ (1-100µL)

Mẫu PT đi qua cột: tồn tại đồng thời 3 thành phần:

- SP không chuyển động

- Chất PT vừa chuyển động từ đầu cột đến cuối cột, đồng thời phân bố lại giữa

SP và MP:

Bị SP hấp phụ, rồi rửa giải bởi MP

- MP: dung môi rửa giải và chuyển động

Tương tác với các chất, lôi kéo và mang chất PT ra khỏi cột

3 tương tác chính:

- Sự tương tác và cân bằng của chất PT với SP

- Sự tương tác và cân bằng của chất PT với MP

- Sự tương tác của SP và MP

Ftot = Fa + Fb + Fc

- Chất nào có lực tương tác lơn nhất sẽ bị giữ lại lâu trên cột

- Chất nào có F nhỏ à bị rửa giải đầu tiên

Ftot khác nhau nhiều thì quá trình tách tốt

Tổng của 3 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra khỏi cột trước tiên khi lực lưu giữ trên cột là nhỏ nhất và ngược lại

Đối với mỗi chất, sự lưu giữ được qui định bởi 3 lực Fa, Fb,Fc Trong đó Fa và Fb giữ vai trò quyết định, còn Fc là yếu tố ảnh hưởng không lớn ở đây, Fa là lực lưu giữ chất phân tích trên cột Fb là lực kéo của pha động đối với chất phân tích ra khỏi cột Như vậy, đối với các chất khác nhau thì Fa và Fb là khác nhau.Kết quả là các chất khác nhau sẽ si chuyển trong cột với tốc độ khác nhau và tách ra hỏi nhau khi ra khỏi cột

QUÁ TRÌNH TÁCH được thể hiện qua hình dưới đây

PHA ĐỘNG

Cột nhồi trong sắc kí pha thuận:silicagel trung tính

Pha tĩnh: Cột này là loại cột dùng để tách các chất không phân cực hay ít phân

cực.Trên bề mặt hoạt động của nó có chứa các nhóm OH phân cực ưa nước Cấu tạo cột như sau:

- Cột silica trên nền mạch carbon:

-Si-CH2CH2CH2CN

-Si-CH2CH2CH2NH2

-Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH)

+ Cột cyano: đa mục đích

+ Cột amino: phân tích đường

+ Cột diol: protein

- Dung môi chủ yếu: không phân cực

+ Hydrocarbon: hexan, pentan, octan

+ Aromatic hydrocarbon: benzen, toluen, xylen,…

+ Chloroform CHCl3

+ Methylene chloride CH2Cl2

- Dung môi phụ: phân cực hoặc hơi phân cực

+ Ethanol, methanol,…

Liên kết hydrogen và thời gian lưu

- Liên kết hydrogen

+ Mẫu phân tích có:

–COOH: nhóm carboxyl Liên kết hydrogen mạnh

–OH : nhóm hydroxyl

–NH2 : nhóm amino

+ Mẫu phân tích có nhóm tert-butyl hoặc các nhóm không phân cực lớn

à LK hydrogen sẽ yếu

Cột nhồi trong sắc ký pha đảo

Cột C18 (ODS) Bề mặt không phân cực

Cot C8 (octyl) hay ít phân cực (hay ky nuoc) Cột C4 (butyl)

Cột phenyl

à Xác định chất phân cực, không phân cực và ít phân cực

Thời gian lưu và liên kết kỵ nước

Dung môi trong HPLC pha đảo

- Dung môi phân cực:

Methanol (CH3OH: MEOH), acetonitrile (CH3CN: ACN)

- Dung dịch đệm

à Tối ưu hóa tỉ lệ dd đệm/ dung môi rất quan trọng để quá trình tách tốt

So sánh pha thường và pha đảo

Ứng dụng của HPLC:

Chủ yếu xác định các hợp chất hữu cơ khó bay hơi trong nhiều đối tượng khác nhau: + Amino acid

+ Acid hữu cơ

+ Thuốc trừ sâu

+ …

Sắc ký ion (Ion Chromatography) Ion Exchange

- Phân tích các hợp chất ion

- Có 2 loại cột:

+ Cột trao đổi cation

Strong cation exchange: (R-SO3-)

Weak cation exchange: (R-COO-)

+ Cột trao đổi anion:

Strong anion exchange: (R4N+)

Weak anion exchange: diethyl aminoethyl)

Pha động: thường là dung dịch đệm trong dung môi nước

Anion:

• Carbonat/bicarbonate (Na2CO3/NaHCO3)

• Tartaric acid/citric acid