Bài giảng các cơ chế điều hòa trao đổi chất ở vi sinh vật (Điều hòa sinh tổng hợp enzyme)

Sản xuất Glucoamylase và pectinase từ Aspergillus niger:Nấm mốc Aspergillus niger được giữ giống trên môi trường Czapekdox.Thành phần môi trường nuôi cấy thu nhận enzyme glucoamylase gồm: cám gạo 70%, bã sắn 5%, acid oleic 3%, nước cất và thành phần khoáng Czapek tạo độ ẩm 50%. Nuôi cấy trong 54 h ở nhiệt độ phòng 3.Thành phần môi trường nuôi cấy thu nhận enzyme pectinase gồm: cám gạo 65,5%, trấu 21,5%, bột cà rốt 11%, (NH4)2SO4 2%, độ ẩm 55%. Nuôi cấy trong 48h ở nhiệt độ phòng 1.Hòa tan môi trường qua nuôi trong nước cất hoặc dung dịch đệm thích hợp (VD. nước cất), tỉ lệ nước và môi trường là 3:1. Chiết lấy dịch lỏng qua vải lọc. Ly tâm dịch qua lọc 4000 vòngphút trong 10 phút. Thu dịch sau ly tâm ta được enzyme ở dạng hòa tan.

VI SINH THỰC PHẨM Food microbiology

Chapter 3:

Các cơ chế điều hòa trao đổi chất ở vi sinh vật

(Điều hòa sinh tổng hợp enzyme)

NGUỒN ENZYME

Enzyme từ vi sinh vật

• Amylase, protease: Aspergillus oryzae KC, A

oryzae 1476, Bacillus subtilis, …

• Pectinase: A awamori,

• Renin (chymosin): Renin từ VSV bền nhiệt hơn

(khó bất hoạt hơn), kém về hương vị và hiệu suất

đông Thể chủ: Aspergillus oryzae, Kluyveromyces

lactis

(TLTK: Công nghệ SX enzyme, protein và ứng dụng GS.TS Nguyễn Thị Hiền NXB GDVN, 2012.)

Nguyên tắc tuyển chọn vi sinh vật

Ở đâu có cơ chất thì ở đó có VSV phân giải cơ chất đó

• Tự nhiên: có ưu điểm là hệ gen ổn định Nhược điểm

là năng suất sinh học không cao, chưa thích nghi sản xuất quy mô công nghiệp

• Ngân hàng giống vi sinh vật (Trung tâm giữ giống)

Sàng tuyển enzyme mới

Giai đoạn 1:

• Tìm ý tưởng

• Xác định sự cần thiết ưu thế thương mại

• Đánh giá mức độ tiếp nhận của thị trường

• Đầu tư nghiên cứu

Giai đoạn 2:

• Xác định tính chất của enzyme: nhiệt độ, pH cho năng

suất tối ưu, độ ổn định, hằng số động học, khả năng bị ức chế.

• Cải tiến

QTCN lên men sản xuất enzyme

Lên men Tách chiết

Tách chiết Tinh sạch

Hoàn thiện

QTCN lên men sản xuất enzyme

• Tổng hợp enzyme

• Thu nhận

• Tinh sạch

• Tạo chế phẩm

Glucoamylase và pectinase từ Aspergillus

niger

• Nấm mốc Aspergillus niger được giữ giống trên môi trường

Czapek-dox.

• Thành phần môi trường nuôi cấy thu nhận enzyme

glucoamylase gồm: cám gạo 70%, trấu 22%, bã sắn 5%, acid oleic 3%, nước cất và thành phần khoáng Czapek-dox tạo độ

ẩm 50% Nuôi cấy trong 54h ở nhiệt độ phòng [3].

• Thành phần môi trường nuôi cấy thu nhận enzyme pectinase gồm: cám gạo 65,5%, trấu 21,5%, bột cà rốt 11%, (NH4)2SO4

2%, độ ẩm 55% Nuôi cấy trong 48h ở nhiệt độ phòng [1].

• Hòa tan môi trường qua nuôi trong nước cất hoặc dung dịch đệm thích hợp (VD nước cất), tỉ lệ nước cất và môi trường là 3:1 Chiết lấy dịch lỏng qua vải lọc Ly tâm dịch qua lọc 4000 vòng/phút trong 10 phút Thu dịch sau ly tâm ta được enzyme

ở dạng hòa tan.

β-GALACTOSIDASE từ GALACTOSIDASE từ LACTOBACILLUS

ACIDOPHILUS

Thu sinh khối và thu enzyme beta-galactosidase thô

• Giống VK được hoạt hóa trong môi trường MRS lỏng

và được nuôi trong môi trường cảm ứng sinh

beta-galactosidase gồm: lactose (10 g/l), cao nấm men (60 g/l), cao thịt (10 g/l), Tween 80 (6 g/l), K2HPO4 (3 g/l), KH2PO4 (1 g/l), CH3COONa (3 g/l),

MgSO4.7H2O (0,5 g/l), MnSO4(0,15 g/l)

• Quá trình lên men thựcc hiện trong erlen 500 ml, ở

37oC, pH 6,0, tốc độ lắc 100 vòng/phút trong 50 giờ

• Kết thúc quá trình lên men, ly tâm canh trường 5000 vòng/phút trong 15 phút, ở 4oC thu nhận sinh khối

β-GALACTOSIDASE từ GALACTOSIDASE từ LACTOBACILLUS

ACIDOPHILUS

Thu sinh khối và thu enzyme beta-galactosidase thô

• Rửa sinh khối hai lần bằng dung dịch đệm sodium

phosphate 0,05M, pH 7,0 Bảo quản sinh khối ở

-20oC

• Beta-galactosidase được thu nhận bằng cách phá vỡ

tê bào vi khuẩn bằng phương pháp xử lý sóng siêu âm dịch huyền phù vi sinh vật 5% w/v trong đệm sodium phosphate pH 7,0, công suất siêu âm 396kW, thời

gian siêu âm 3,2 phút Dịch huyền phù sau khi xử lý sóng siêu âm được đem ly tâm ở 6000 vòng/phút,

4oC, 15 phút, để thu dịch enzyme thô

GIỐNG VI SINH VẬT

1.Yêu cầu về giống vi sinh vật trong CNLM

+ Cho năng suất cao, chất lượng tốt, ít sản phẩm phụ không mong muốn

+ Sử dụng nguyên liệu sẵn có, rẻ tiền

+ Thời gian lên men ngắn

+ Dễ tách sinh khối hay sản phẩm sau khi lên men

+ Vi sinh vật phải thuần chủng, không chứa vi sinh vật lạ, đặc biệt là không chứa bacteriophage ký

sinh.

+ Chủng vi sinh vật phải khỏe, phát triển nhanh.

+ Có khả năng chống chịu với điều kiện bất lợi của môi trường.

+ Dễ bảo quản và ổn định các đặc tính sinh lý, sinh hóa trong thời gian sử dụng

+ Có khả năng thay đổi các đặc tính bằng các kỹ thuật đột biến, kỹ thuật gen để không ngừng nâng cao chất lượng sản phẩm.

2 Nguồn giống vi sinh vật

2.1 Phân lập trong tự nhiên

Để phân lập được chủng vsv ta phải tiến hành làm giàu số lượng tế bào vsv đó trong môi trường và

điều kiện thuận lợi nhất đối với chúng và ức chế các chủng không mong muốn

Quy trình phân lập giống trong tự nhiên:

Thu mẫu Hòa loãng Cấy lên môi trường Nuôi

Thuần khiết Kiểm tra

Khi hòa loãng đối với vsv dễ chết trong nước cất và nước muối sinh lý thì dùng dung dịch pepton 0,1%

Đối với vsv yếm khi khi nuôi phải cho thêm chất khử, gắn paraffin hoặc nuôi trong môi trường không có oxy

2.2 Thu nhận từ trung tâm giữ giống

+ Mỹ: ABBOTT, ATCC, NRRL…

+ Canada: CANAD - 212

+ Nhật: FERM, HIR…

+ Úc: CC

+ Trung Quốc: IMASP

+ Việt Nam: Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật Việt Nam (Vietnam Type Culture Collection hay gọi tắt là VTCC)

3.Cải tạo giống vi sinh vật

*Ưu điểm:

+ Cho năng suất cao

+ Thời gian lên men ngắn ít tạo bọt trong khi lên men

+ Ít tạo sản phẩm phụ trong quá trình lên men

+ tạo đựoc nhiều sản phẩm quý mà chủng khác không có được như insulin, kháng nguyên Hbs (chống viêm gan B)

+ Khả năng chống chịu với điều kiện bất lợi của môi trường cao

3.Cải tạo giống vi sinh vật

*Nhược điểm:

-Yêu cầu kỹ thuật cao

- Trong quá trình sản xuất có thể xuất hiện hiện tượng hồi biến

* Phương pháp tạo giống mới

+ Đột biến nhân tạo

+ Tái tổ hợp gen: Biến nạp, tiếp hợp, tải nạp.

+ Lựa chọn thường xuyên

4 Giữ giống vi sinh vật

*Ý nghĩa: Giữ được những đặc tính quý (không bị thoái hóa)

của vi sinh vật và bảo đảm cung cấp giống cho các quá

trình sản xuất

*Nhiệm vụ của việc giữ giống:

Sử dụng các kỹ thuật cần thiết để giữ cho vsv có tỷ lệ sống cao, các đặc tính di truyền không bị biến đổi và không bị tạp nhiễm

* Các phương pháp giữ giống:

+ Bảo quản trong môi trường thạch nghiêng và định kỳ cấy

chuyển:

Bảo quản trong tủ lạnh với hiệt độ 4 – 6 0 C, thời gian tối đa là 3 tháng

Ưu điểm: Đơn giản được sử dụng phổ biến

Nhược điểm: Thời gian bảo quản ngắn, tính chất của chủng dễ bị thay đổi qua những lần cấy chuyển

+ Giữ giống trong cát hoặc trong đất sét vô trùng

Đất và cát được xử lý để đạt đến độ mịn và vô trung tuyệt đối, sau đó trộn với vi sinh vật và đem bảo quan trong không gian kín.

Ngoài cát và đất sét người ta còn sử dụng các hạt ngũ cốc hoặc trên silicagen

Phương pháp bảo quản giống này chủ yếu áp dụn cho vsv sinh bào tử như nấm mốc hoặc xạ khuẩn

+Giữ gống bằng phương pháp lạnh đông

Nguyên tắc: Ức chế sự phát triển của vi sinh vật trong điều kiện lạnh sâu

(-25 75 0 C)

Các chất bảo quản: Glyxerin 15%

Dung dich glucoza hoặc lactoza 10%

+ Giữ giống bằng phương pháp lạnh khô:

Các chất bảo vệ:

Glutamate: 3%

Lactoza: 1,2% + pepton 1,2%

Saccharoza 8% + 5% sữa + 1,5% gelatin

Đây là phương pháp giữ giống tối ưu nhất, có thể giữ giống qua hàng chục năm với tỷ lện sống cao, không bị biến tính và chiếm ít diện tích bảo quản.

+ Giữ giống bằng ngân hàng gen

5 Nhân giống vi sinh vật

Trường hờp là tế bào sinh dưỡng: Cần phải tạo môi trường thích hợp để tăng số lượng tế bào trong một thời gian ngắn nhất Người

ta thương nhân giống trong môi trường dịch thể (nuôi cấy chìm)

Trường hợp là bào tử (đối với xạ khuẩn và nấm môc): Thường nhân giống trên môi trường bán rắn và thu bào tử bằng máy hút bụi hoặc chổi quét, sau đó bảo quản nơi sạch, mát…

* Giai đoạn phòng thí nghiệm

Đây chính là giai đoạn hoạt hóa giống

Cấy chuyển sang các ống môi trường dinh dưỡng vô trùng và nuôi chúng trong điều kiện phòng thí nghiệm

Giai đoạn ở xưởng

Giống được cấy chuyển một số lần từ môi trường ít sang môi trường nhiều (nhân giống cấp 1, 2, 3…) và kết quá trình nhân giống thì phải thu được tỷ lệ giống giao đọng từ 1-10% so với thể tích môi trường dinh dưỡng

Chú ý: Kết thúc khâu nhânh giống cần phải kiểm tra chất

lượng, số lượng giống trước khi cấy vào nồi lên men

Sơ đồ nuôi cấy giống.

1.Thùng gây men 150 l cấp 1 chứa 100 l dịch; 2.Thùng đường hóa

thêm và xử lý dich đường; 3 và 4 Hai thùng gây men cấp II có dung

tích bằng dung tích thùng đường hóa thêm và đều bằng 10% so với thùng lên men.

+ Nhân giống trong sản xuất