HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN LÊ HỒNG PHÚ NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM VI SINH VẬT TỔNG HỢP ENZYME PECTINASE, CELLULASE VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT CÀ PHÊ NHÂN THEO PHƯƠNG PHÁ
Trang 1ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
LÊ HỒNG PHÚ
NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM
VI SINH VẬT TỔNG HỢP ENZYME PECTINASE, CELLULASE VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT CÀ PHÊ NHÂN THEO
PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
TP.HCM - 2012
Trang 2ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
LÊ HỒNG PHÚ
NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM
VI SINH VẬT TỔNG HỢP ENZYME PECTINASE, CELLULASE VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT CÀ PHÊ NHÂN THEO
PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN
Chuyên ngành: Hóa Sinh
Mã số: 1.05.10
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS.TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG
TP HCM – 2012
Trang 3LỜI CẢM ƠN
Chân thành cảm ơn đến thầy:
PGS TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG
Người đã khơi gợi cho tôi những ý tưởng về đề tài và cũng là người hướng dẫn cho tôi thực hiện đề tài
Trân trọng cảm ơn cô
PGS TS ĐỒNG THỊ THANH THU
PGS TS PHẠM THỊ ÁNH HỒNG
là những giảng viên để tôi suốt đời học hỏi và đã hỗ trợ tôi rất nhiều về mặt tinh thần và học thuật
Trân trọng cảm ơn TS LÊ PHI NGA đã giúp đỡ và tạo điều kiện hết sức cho tôi hoàn thành đề tài
Tri ân ba suốt đời tận tụy vì sự tiến bộ của con, vô cùng cảm ơn mẹ với trái tim nhân hậu là nguồn động viên lớn lao trong con
Cảm ơn NGUYỄN THỊ KIM CHÂU, người luôn hết lòng ủng hộ và giúp đỡ lớn lao
để tôi hoàn thành tốt luận án
Cảm ơn tất cả những thành viên trong nhóm dự án nghiên cứu sản xuất cà phê chất lượng cao nhằm mục đích xuất khẩu
1 Nguyễn Thảo Nguyên
2 Đỗ Đại Nghĩa
3 Nguyễn Thị Minh Trinh
4 Nguyễn Hữu Thái
5 Ngô Tiến Hiễn Vinh
6 Lê Thị Lệ
7 Phạm Mỹ Vẹn
8 Nguyễn Thị Kim Châu
9 Nguyễn Thị Ngà
10 Cao Hoàng Tấn
11 Nguyễn Văn Hân
12 Nguyễn Thị Bảo Anh
13 Nguyễn Thị Cẩm Vân
14 Võ Ngọc Thanh
Đã nỗ lực cùng tôi vượt qua nhiều khó khăn và hỗ trợ tôi hoàn tất những nội dung nghiên cứu của luận án
Và cuối cùng cho tôi được cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa và đồng nghiệp tại Khoa CNSH ĐH Quốc Tế nơi tôi đang công tác đã giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi hoàn thành luận án
Tác giả luận án
Lê Hồng Phú
Trang 4I
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu
và kết quả trong Luận án này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác
Tác giả Luận án
Trang 5II
MỤC LỤC
Lời cam đoan I Mục lục II Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt VI Danh mục các bảng VII Danh mục các hình IX
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1- TỔNG QUAN 7
1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÀ PHÊ 7
1.1.1 Sơ lược lịch sử phát triển cây cà phê ở Việt Nam 7
1.1.2 Giá trị kinh tế của cà phê 7
1.1.3 Tình hình sản xuất cà phê 8
1.1.4 Tầm quan trọng của ngành chế biến cà phê ở Việt Nam 8
1.1.5 Những vấn đề kỹ thuật cần nghiên cứu trong chế biến cà phê 8
1.2 TRÁI CÀ PHÊ 10
1.2.1 Cấu tạo trái cà phê 10
1.2 2 Thành phần hóa học 11
1.2.2.1 Thành phần hóa học của vỏ quả 11
1.2.2.2 Thành phần hóa học của lớp nhớt 12
1.3 NHÂN CÀ PHÊ 12
1.3.1 Thành phần hóa học của nhân cà phê 12
1.3.1.1 Carbohydrates 13
1.3.1.2 Hợp chất chứa nitơ 14
1.3.1.3 Acid chlorogenic 17
1.3.1.4 Hương thơm cà phê 18
1.3.1.5 Acid carboxylic 19
1.3.1.6 Các chất khoáng 20
1.3.2 Tính chất vật lý 20
1.4 PECTIN 21
1.4.1 Cấu tạo pectin 21
1.4.2 Tính chất của pectin 22
1.4.2.1 Tính chất làm đông đặc 22
1.4.2.2 Tính tạo gel của pectin 22
1.4.2.3 Tính nhớt của dung dịch pectin 22
1.4.2.4 Pectin ở trái cà phê 23
1.4.3 Ứng dụng 23
1.5 CELLULOSE 23
1.5.1 Cấu tạo 23
1.5.2 Tính chất 24
1.5.3 Ứng dụng 25
1.5.4 Cellulose ở trái cà phê 25
1.6 GIỚI THIỆU CHUNG ENZYME PECTINASE VÀ CELLULASE 25
Trang 6III
1.6.1 Pectinase 26
1.6.1.1 Phân loại và cơ chế tác động 26
1.6.1.2 Ứng dụng 27
1.6.1.3 Hệ vi sinh vật có khả năng tổng hợp enzyme pectinase 27
1.6.2 Cellulase 27
1.6.2.1 Phân loại và cơ chế tác dụng 27
1.6.2.2 Ứng dụng 29
1.6.2.3 Hệ vi sinh vật có khả năng tổng hợp enzyme cellulase 30
1.7 GIỚI THIỆU VI SINH VẬT SINH PECTINASE VÀ CELLULASE ĐƯỢC NGHIÊN CỨU TRONG LUẬN ÁN VÀ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH DANH VSV 30
1.7.1 Tổng quan chung về vi sinh vật 30
1.7.2 Phương pháp định danh vi sinh vật 31
1.8 CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA VIỆC TÁCH VỎ VÀ LÊN MEN CÀ PHÊ 32
1.8.1 Giới thiệu về tách vỏ cà phê 32
1.8.1.1 Sơ lược nghiên cứu tách vỏ cà phê trên thế giới 32
1.8.1.2 Sơ lược nghiên cứu tách vỏ cà phê trong nước 32
1.8.2 Giới thiệu về lên men cà phê 33
1.8.2.1 Sơ lược lên men cà phê trên thế giới 34
1.8.2.2 Sơ lược lên men cà phê trong nước 38
1.8.3 Tăng năng suất tách vỏ và lớp nhớt của cà phê tươi 39
1.8.4 Nâng cao hiệu suất trích ly cà phê bột 39
1.8.5 Cải thiện chất lượng cảm quan cà phê 39
CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41
2.1 VẬT LIỆU 41
2.1.1 Nhân cà phê 41
2.1.1.1 Giống 41
2.1.1.2 Nguồn gốc 41
2.1.2 Nguồn vi sinh vật nghiên cứu 41
2.1.2.1 Nấm sợi 41
2.1.2.2 Nấm men 41
2.1.2.3 Vi khuẩn 41
2.1.3 Môi trường sử dụng 41
2.1.3.1 Môi trường phân lập và nuôi cấy nấm sợi, nấm men và vi khuẩn 41
2.1.3.1 Môi trường phân lập và nuôi cấy nấm sợi, nấm men và vi khuẩn 41
2.1.3.2 Môi trường nhân giống 42
2.1.3.3 Môi trường giữ giống 42
2.1.4 Hóa chất 42
2.1.4.1 Hóa chất sử dụng cho môi trường 42
2.1.4.2 Hóa chất sử dụng cho phương pháp xác định hoạt tính enzyme 42
2.1.4.3 Hóa chất sử dụng cho các phương pháp xác định thành phần 43
2.1.5 Thiết bị - dụng cụ 43
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 44
2.2.1 Phương pháp vi sinh vật 44
Trang 7IV
2.2.1.1 Phương pháp phân lập giống vi sinh vật từ nhân cà phê 44
2.2.1.2 Phương pháp cấy chuyền và giữ giống (trong điều kiện vô trùng) 44
2.2.1.3 Phương pháp nhân giống 44
2.2.1.4 Phương pháp lên men 44
2.2.1.5 Phương pháp đếm tế bào vi sinh vật trong chế phẩm 45
2.2.2 Phương pháp hóa lý 45
2.2.2.1 Phương pháp xác định độ ẩm 45
2.2.2.2 Phương pháp trích chất hòa tan 46
2.2.2.3 Phương pháp nghiền 46
2.2.2.4 Phương pháp rây 46
2.2.2.5 Phương pháp ngâm 46
2.2.3 Phương pháp hóa sinh 47
2.2.3.1 Các phương pháp xác định hoạt tính enzyme cellulase, pectinase 47
2.2.3.2 Các phương pháp xác định thành phần chủ yếu trong cà phê 52
2.2.4 Phương pháp định danh vi sinh vật 60
2.2.4.1 Phương pháp định danh nấm sợi 60
2.2.4.2 Phương pháp định danh vi khuẩn và nấm men 61
2.2.5 Cách bố trí thí nghiệm 62
Thí nghiệm 1: Khảo sát thành phần pectin và cellulose trong lớp nhớt và thành phần hóa học chủ yếu trong nhân cà phê 65
Thí nghiệm 2: Phân lập và định danh các chủng vi sinh vật từ vỏ, nhân cà phê 65
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh vật có hoạt tính pectinase và cellulase 66
Thí nghiệm 4: Nghiên cứu quá trình tách vỏ cà phê 71
Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ứng dụng các chế phẩm trong lên men nhằm nâng
cao hiệu suất trích chất hòa tan và chất lượng cà phê 73
Thí nghiệm 6: Lên men cà phê theo cách kết hợp chế phẩm 75
Thí nghiệm 7: Kiểm tra độc tố aflatoxin, hàm lượng caffeine phẩm 75
Thí nghiệm 8: Đánh giá cảm quan 76
Thí nghiệm 9: Thử nghiệm lên men kết hợp các chế phẩm tốt nhất từ nấm sợi, nấm men và vi khuẩn 76
2.2.6 Phương pháp đánh giá cảm quan 76
2.2.7 Phương pháp xử lý số liệu 79
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 80
3.1 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CHỦ YẾU CÓ TRONG CÀ PHÊ 80
3.1.1 Thành phần pectin và cellulose trong lớp nhớt 80
3.1.2 Thành phần hóa học chủ yếu có trong nhân cà phê 80
3.2 PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG VI SINH VẬT 82
3.2.1 Phân lập và định danh các chủng nấm sợi trên vỏ, nhân cà phê 82
3.2.2 Phân lập và định danh các chủng nấm men và vi khuẩn trên vỏ, nhân cà phê 86
3.3 NGHIÊN CỨU TẠO CÁC CHẾ PHẨM VSV 89
Trang 8V
3.3.1 Nghiên cứu điều kiện tạo chế phẩm có hoạt tính pectinase cao 89
3.3.1.1 Xác định môi trường tối ưu cho sinh tổng hợp enzyme pectinase 89
3.3.1.2 Xác định độ ẩm tối ưu cho sinh tổng hợp enzyme pectinase 94
3.3.1.3 Xác định thời gian tối ưu cho sinh tổng hợp enzyme pectinase của các chủng nấm sợi 96
3.3.1.4 Xác định nồng độ đường ( o Brix ) của dung dịch malt đến sự sinh tổng hợp enzyme pectinase 101
3.3.1.5 Xác định pH ban đầu dung dịch malt đến khả năng sinh tổng hợp enzyme pectinase 103
43.3.1.6 Ảnh hưởng của lượng muối (NH 4 ) 2 SO 4 bổ sung đến khả năng sinh tổng hợp enzyme pectinase 105
3.3.1.7 Xác định nhiệt độ nuôi đến khả năng sinh tổng hợp enzyme pectinase 107
3.3.1.8 Tổng kết quy trình tạo chế phẩm có hoạt tính pectinase cao 109
3.3.2 Nghiên cứu điều kiện tạo chế phẩm có hoạt tính cellulase cao 110
3.3.2.1 Xác định môi trường tối ưu cho sinh tổng hợp enzyme cellulase 110
3.3.2.2 Xác định độ ẩm tối ưu cho sinh tổng hợp enzyme cellulase 114
3.3.2.3 Xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi đến quá trình sinh tổng hợp cellulase của các chủng vi sinh vật 116
3.3.2.4 Tổng kết q uy trình tạo chế phẩm có hoạt tính cellulase cao 120
3.4 KHẢO SÁT CHẤT LƯỢNG CHẾ PHẨM THEO THỜI GIAN BẢO QUẢN 121
3.4.1 Số lượng tế bào vsv thay đổi theo thời gian bảo quản 122
3.4.2 Khảo sát hoạt tính enzyme pectinase thay đổi theo thời gian bảo quản 123
3.4.3 Khảo sát hoạt tính enzyme cellulase thay đổi theo thời gian bảo quản 124
3.4.4 Tổng kết khảo sát chất lượng chế phẩm theo thời gian bảo quản và sơ bộ hạch toán kinh tế 125
3.5 NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TÁCH VỎ CÀ PHÊ 125
3.5.1 Khảo sát ảnh hưởng lượng chế phẩm vsv đến khả năng tách vỏ cà phê tươi 126
3.5.2 Khảo sát ảnh hưởng thời gian xử lý đến khả năng tách vỏ cà phê tươi 128
3.5.3 Tổng kết nghiên cứu quá trình tách vỏ cà phê và công nghệ tách vỏ cà phê 129
3.6 KẾT QUẢ QUÁ TRÌNH LÊN MEN 129
3.6.1 Ảnh hưởng của thời gian ngâm và độ ẩm cà phê 130
3.6.2 Ảnh hưởng của độ ẩm cà phê đến khả năng chiết chất hòa tan trong nhân cà phê 130
3.6.2.1 Ảnh hưởng của độ ẩm cà phê đến khả năng chiết chất hòa tan trong Coffea arabica 131
3.6.2.2 Ảnh hưởng của độ ẩm cà phê đến khả năng chiết chất hòa tan trong Coffea robusta 131
3.6.2.3 Ảnh hưởng của độ ẩm cà phê đến khả năng chiết chất hòa tan trong Coffea chari 132
3.6.3 Ảnh hưởng của lượng chế phẩm vsv đến khả năng chiết chất hòa tan trong nhân cà phê 133
Trang 9VI
3.6.3.1 Ảnh hưởng của lượng chế phẩm vsv đến khả năng chiết chất
hòa tan trong Coffea arabica 133
3.6.3.2 Ảnh hưởng của lượng chế phẩm vsv đến khả năng chiết chất hòa tan trong Coffea robusta 135
3.6.3.3 Ảnh hưởng của lượng chế phẩm vsv đến khả năng chiết chất hòa tan trong Coffea chari 137
3.6.4 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng chiết chất hòa tan trong nhân cà phê 139
3.6.4.1 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng chiết chất hòa tan trong Coffea C arabica của các CPVSV từ nấm sợi 139
3.6.4.2 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng chiết chất hòa tan trong Coffea C C robusta của các CPVSV từ nấm sợi 141
3.6.4.3 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng chiết chất hòa tan trong Coffea chari của các CPVSV từ nấm sợi 143
3.6.5 Tổng kết nghiên cứu lên men nhân cà phê và quy trình lên men 145
3.6.6 Nghiên cứu đánh giá cảm quan cà phê 145
3.6.6.1 Đánh giá cảm quan cà phê C arabica 146
3.6.6.2 Đánh giá cảm quan cà phê C robusta 147
3.6.6.3 Đánh giá cảm quan cà phê C chari 147
3.6.7 Thử nghiệm lên men kết hợp các chế phẩm tốt nhất từ nấm sợi, nấm men và vi khuẩn 148
3.6.7.1 Khảo sát nồng độ chất tan bởi lên men kết hợp 149
3.6.7.2 Khảo sát hàm lượng caffeine giải phóng bởi lên men kết hợp 151
3.6.8 Quy trình tách vỏ và lên men cà phê bởi chế phẩm 153
3.6.8.1 Quy trình tách vỏ bởi chế phẩm vsv 153
3.6.8.2 Quy trình lên men cà phê bởi chế phẩm vsv 154
CHƯƠNG 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 157
DANH MỤC CÔNG TRÌNH 159
TÀI LIỆU THAM KHẢO 161
PHỤ LỤC 170
Trang 10VII
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CMC
Carboxymethyl-cellulose
Một dẫn xuất cellulose
CPVSV Chế phẩm vi sinh vật Chế phẩm vi sinh vật
CQA Caffeoxyl quinic acid Hợp chất thơm trong cà
phê
CT Canh trường Canh trường
DNS 3,5 - dinitrosalicylic acid Một chất thử cho xác định
đường khử
ĐC Đối chứng Đối chứng
MT Môi trường Môi trường
NL Nguyên liệu Nguyên liệu
PGA Potato glucose agar Môi trường giữ giống gồm
khoai tây, glucose và thạch PTN Phòng thí nghiệm Phòng thí nghiệm
TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam Tiêu chuẩn Việt Nam
TN Thí nghiệm Thí nghiệm
vsv Vi sinh vật Vi sinh vật