Khảo sát điều kiện nuôi cấy và sinh bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis

Xuất phát từ vấn đề này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtils, tìm hiểu điều kiện nuôi cấy thích hợp và xử lí bào tử để sản xuất chế phẩm sinh h

Khảo sát điều kiện nuôi cấy và sinh bào tử

vi khuẩn Bacillus subtilis

Mô tả tài liệu:

Việt nam là một nước nông nghiệp có nghành chăn nuôi rất phát triển và có đóng góp rất lớn vào sự phát triển kinh tế của đất nước Vì vậy, vấn đề nâng cao năng suất, chất lượng sản phẩm và cải thiện môi trường chăn nuôi rất được quan tâm ở nước ta hiện nay Xuất phát từ vấn đề này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtils, tìm hiểu điều kiện nuôi cấy thích hợp và xử lí bào tử để sản xuất chế phẩm sinh học nhằm cung cấp những thông tin để chọn lựa những điều kiện nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis thích hợp, từ đó sản xuất chế phẩm sinh học cung cấp cho nghành chăn nuôi

Phần 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Hiện nay, các loại chế phẩm sinh học từ vi sinh vật đã và đang được sử dụng

ngày càng phổ biến Đặc biệt là các chế phẩm từ vi khuẩn Bacillus subtilis

Nước ta là một nước nông nghiệp, ngành chăn nuôi rất phát triển Với mục đích

tăng năng suất chất lượng sản phẩm chăn nuôi, bảo vệ sức khoẻ người tiêu dùng, bảo

vệ môi trường sống không bị ô nhiễm bởi các loại hoá chất độc hại và đặc biệt là nhằm

hạn chế dần việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi, chế phẩm sinh học là một giải pháp tối ưu để thực hiện mục đích này Vì vậy, các nhà chăn nuôi đã rất chú ý đến vấn

đề sử dụng chế phẩm sinh học

Chế phẩm sinh học chứa các vi sinh vật sống có lợi, người ta chọn lọc các vi

sinh vật có lợi có tính đối kháng cao để đưa vào đường ruột tạo sự cân bằng có lợi cho

hệ vi sinh vật đường ruột, khôi phục lại hoạt động bình thường, ức chế vi sinh vật có hại cho vật nuôi Ngoài ra, chế phẩm sinh học còn cải thiện lượng thức ăn ăn vào và khả năng tiêu hoá, cung cấp chất dinh dưỡng…

Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn trên dưới sự hướng dẫn của TS Nguyễn Ngọc

Hải, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “ Khảo sát điều kiện nuôi cấy và sinh bào

tử vi khuẩn Bacillus subtilis”

1.2 Mục đích – Yêu cầu

Mục đích

Tìm hiểu điều kiện: nhiệt độ, thời gian, pH, môi trường nuôi cấy thích hợp và

nhiệt độ, pH xử lý bào tử để ứng dụng sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học

Yêu cầu

Khảo sát đặc điểm của Bacillus subtilis: về hình thái khuẩn lạc, tế bào vi

khuẩn…

Tìm điều kiện: nhiệt độ, pH, môi trường và thời gian nuôi cấy thích hợp.

Tìm điều kiên: nhiệt độ, pH xử lý tạo bào tử.

Phần 2 TỔNG

QUAN

2.1 Đại cương về vi khuẩn Bacillus subtilis

2.1.1 Lịch sử phát triển

Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên trong phân ngựa (1941) bởi Tổ chức

y học Nazi của Đức Lúc đầu, chủ yếu được sử dụng để phòng bệnh lị cho các bệnh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi

Việc sử dụng để điều trị bệnh phải đợi đến những năm 1949 - 1957 khi Henry,

Albot và các cộng sự tách được các chủng thuần khiết của Bacillus subtilis Từ đó,

“subtilistherapie” có nghĩa là thuốc subtilin ra đời trị các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy do rối loạn tiêu hoá

Ngày nay, vi khuẩn Bacillus subtilis trở nên phổ biến và được sử dụng rộng rãi

trong chăn nuôi, y học, thực phẩm…

2.1.2 Đặc điểm phân loại

Theo khoá phân loại của Bergey, vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc

Bộ: Eubacteriales

Họ: Bacillaceae

Giống: Bacillus

Loài: Bacillus subtilis

2.1.3 Đặc điểm phân bố

Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc ở đường ruột, chúng được phân bố hầu hết trong tự nhiên như: cỏ khô, bụi, đất nước…

Phần lớn chúng tồn tại ở trong đất, thông thường đất trồng trọt chứa khoảng

10 - 100 triệu CFU/g Đất nghèo dinh dưỡng ở sa mạc, đất hoang thì Bacillus subtilis rất hiếm

Nước và bùn ở cửa sông cũng như nước biển có sự tồn tại của bào tử và tế bào

sinh dưỡng Bacillus subtilis (Vũ Thị Thứ, 1996)

2.1.4 Đặc điểm hình thái

Bacillus subtilis là vi khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, G+, kích thước 0,5 - 0,8 µm x 1,8 –

3 µm, đứng thành chuỗi ngắn hoặc đơn lẻ, di động, 8 - 12 lông

Sinh bào tử nhỏ hơn vi khuẩn và nằm giữa tế bào, kích thước từ 0,8 - 1,8 µm

Phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt bào tử, không kháng acid, có khả năng

chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ…(Tô Minh Châu, 2000)

2.1.5 Đặc điểm nuôi cấy

Điều kiện phát triển: hiếu khí, nhiệt độ tối ưu 37oC

Nhu cầu O2: Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí nhưng có khả năng phát triển trong môi trường thiếu oxy

Độ pH: Bacillus subtilis thích hợp nhất với pH = 7,0 – 7,4

Môi trường thạch đĩa TSA: khuẩn lạc có dạng hình tròn, rìa răng cưa không đều,

có tâm sẩm màu, phát triển chậm, màu vàng xám, đường kính 3 - 5mm Sau 1- 4 ngày

bề mặt nhăn nheo màu hơi sẩm

Môi trường thạch nghiêng TSA: dễ mọc, tạo thành màu xám, rìa gợn sóng

Môi trường canh TSB: Bacillus subtilis phát triển làm đục môi trường, tạo màng nhăn, lắng cặn kết lại như vẩn mây ở đáy, khó tan đều khi lắc lên

Dinh dưỡng cần các nguyên tố C, H, O, N và các nguyên tố khác

2.1.6 Đặc điểm sinh hoá

Lên men không sinh hơi các loại đường: glucose, maltose, manitol, saccharose,

xylose, arabinosse

Indol (-), nitrate (-), VP (+), H2S (-), NH3 (+), catalase (+), amylase (+), casein

(+), citrate (+), di động (+), hiếu khí (+)

Dung huyết: một số dòng gây dung huyết ở dạng trên thạch máu ngựa và thỏ do tác động của hemolysine

2.1.7 Cấu trúc kháng nguyên

Bacillus subtilis có kháng nguyên H và O, cấu trúc kháng nguyên dạng D và L -

acid glutamic

Sản sinh kháng sinh subtilin và bacitracin có tác dụng ức chế vi khuẩn G+ và G- Bệnh học: đa số chủng Bacillus subtilis không gây bệnh

2.1.8 Tính chất đối kháng của Bacillus subtilis với một số vi sinh vật gây bệnh

Do Bacillus subtilis là vi khuẩn bắt buộc đường ruột nên ngoài khả năng chịu đựng được acid dạ dày , các chất dịch tiêu hoá trong đường ruột Chúng còn có khả năng đấu tranh lại với các vi sinh vật gây bệnh ở đường ruột

Với các vi sinh vật gây bệnh

Môi trường nuôi cấy nấm bệnh có sự hiện diện của Bacillus subtilis với một số

lượng lớn sẽ gây ra sự cạnh tranh dinh dưỡng, cạnh trạnh không gian sống giữa vi khuẩn và nấm

Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn (trong 24h) sẽ sử dụng phần lớn các chất dinh

dưỡng trong môi trường, đồng thời tạo ra kháng sinh subtilin nên sự sinh trưởng của nấm bị ức chế

Với đồng loại

Các chuyên gia tại Đại Học Havard, Mỹ cho biết: khi chất dinh dưỡng bắt đầu

cạn kiệt, các vi sinh vật đối phó bằng cách chuyển sang tình trạng “ngủ đông”, hay nghỉ ngơi trong một thời gian dài Bacillus subtilis thực hiện điều đó bằng cách tạo ra bào tử, có thể duy trì trạng thái sống tiềm tàng trong nhiều năm, thậm chí hàng thế kỉ Tuy nhiên trong thí nghiệm của mình, nhóm nghiên cứu nhận thấy ở giai đoạn rất sớm của sự hình thành bào tử, một vài tế bào Bacillus đã tạo ra kháng sinh để giết chết những tế bào vi khuẩn ở bên cạnh chưa bắt đầu quá trình này Chất kháng sinh sẽ phá

vỡ màng tế bào vi khuẩn bị tấn công, giải phóng chất dinh dưỡng và được tế bào đang hình thành bào tử tiêu thụ

Theo các nhà nghiên cứu trên, quá trình tạo bào tử tiêu tốn một lượng lớn năng

lượng, phải mất vài giờ và khi đã bắt đầu thì không thể đảo ngược Do đó, vi khuẩn sẽ

cố gắng tránh thời điểm đó càng lâu càng tốt

Đặc biệt, khi dinh dưỡng trong môi trường đã cạn kiệt, vi khuẩn sẽ tiêu diệt

những kẻ xung quanh để hút chất dinh dưỡng và kéo dài thời kì chờ đợi này, cho đến khi phải chuyển sang sống tiềm sinh (Nguyễn Thị Công Dung, 2004)

2.2 Bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis

Bào tử là một hình thức tiềm sinh của vi khuẩn, nó giúp cho vi khuẩn vượt qua

những điều kiện bất lợi như: môi trường nghèo dinh dưỡng, nhiệt độ, pH không thích hợp, môi trường tích luỹ nhiều sản phẩm trao đổi chất bất lợi… Mỗi vi khuẩn chỉ tạo được một bào tử Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử sẽ nảy mầm để trở về dạng tế bào sinh dưỡng

2.2.1 Sự hình thành bào tử

Một trong những đặc điểm quan trọng của Bacillus subtilis là khả năng tạo bào tử trong những điều kiện nhất định Bacillus subtilis có khả năng hình thành bào tử trong chu trình phát triển tự nhiên hoặc khi vi khuẩn gặp điều kiện bất lợi (dinh dưỡng trong môi trường bị kiệt quệ, nhiệt độ…) (Tô Minh Châu, 2000)

Quá trình hình thành bào tử gồm các bước

1 Hình thành vách ngăn

2 Sự tạo tiền bào tử

3 Tạo lớp vỏ bào tử

4 Sự tổng hợp các lớp vỏ bào tử

5 Sự giải phóng bào tử

Lúc đầu lớp nguyên sinh chất trong tế bào được sử dụng Tế bào chất và nhân tập trung tại một vị trí nhất định trong tế bào Tế bào chất tiếp tục cô đặc và tạo thành tiền bào tử (prospore) Tiền bào tử dần được bao bọc bởi các lớp màng Tiền bào tử phát triển và trở thành bào tử

Khi bào tử trưởng thành, tế bào sinh dưỡng phân giải và bào tử được giải phóng

ra khỏi tế bào mẹ Khi gặp điều kiện thuận lợi thì bào tử hút nước và bị trương ra Sau

đó vỏ của chúng bị phá huỷ và bào tử nảy mầm phát triển thành tế bào mới Mỗi tế bào

sinh dưỡng chỉ tạo ra một bào tử (Lê Đỗ Mai Phương, 2004)

2.2.2.Cấu tạo của bào tử

Bào tử là một khối nguyên sinh chất đặc, có chứa các thành phần hoá học cơ bản như ở tế bào sinh dưỡng nhưng có một vài điểm khác về tỉ lệ giữa các thành phần và

có thêm một số thành phần mới Phía ngoài của nguyên sinh chất được bao bọc bởi nhiều lớp màng

Ngoài cùng của bào tử là một lớp màng, rất mỏng nhưng không thấm nước, cấu tạo chủ yếu là lipoprotein

Dưới lớp màng là vỏ, vỏ bào tử có nhiều lớp, bề mặt của các lớp này xù xì, thành phần hoá học là protein và có sự tham gia của keratin đây là những lớp có khả năng ngăn chặn sự thẩm thấu của nước và các chất hoà tan trong nước, chúng có tác dụng tăng cường khả năng bảo vệ bào tử trước các điều kiện bất lợi

Dưới lớp vỏ là lớp màng trong của bào tử và trong cùng là một khối tế bào chất đồng nhất Trong các bào tử tự do không tồn tại sự trao đổi chất, vì vậy có thể giữ ở trạng thái tiềm sinh trong nhiều năm (Lê Đỗ Mai Phương 2004)

Bào tử khác tế bào sinh dưỡng về cấu trúc, thành phần hoá học, tính chất sinh lí

2.2.3 Thành phần hoá học của bào tử

Các lớp bao và màng của bào tử có cấu tạo cơ bản là protein có chứa nhiều

glyxin, tyroxin và đặc biệt là cystein, ngoài ra còn có sự tham gia của keratin

Nguyên sinh chất của bào tử có chứa nhiễm sắc thể, ribosome và enzyme chuyển hoá ở trạng thái không hoạt động Khi bào tử nảy mầm thì những enzyme này bắt đầu hoạt động

Bào tử có chứa một lượng lớn canxi, magie và acid dipicolinic Acid này chiếm

từ 5- 12% khối lượng khô của bào tử (acid này không bao giờ có trong tế bào sinh dưỡng, nó được hình thành trong quá trình hình thành bào tử và mất đi khi nảy mầm) Lượng nước trong bào tử rất thấp và tồn tại ở dạng liên kết

2.2.4 Sự nảy mầm của bào tử (Nguyễn Lân Dũng và các cộng sự, 1998)

Quá trình chuyển bào tử từ trạng thái nghỉ sang tế bào sinh dưỡng của vi khuẩn

được gọi là quá trình nảy mầm của bào tử

Quá trình này gồm 3 giai đoạn: hoạt hoá, nảy mầm và sinh trưởng:

Hoạt hoá

Sau khi cho bào tử Bacillus subtilis tồn tại ở trạng thái nghỉ 7 ngày, ta xử lí ở

60o

C trong 5 phút có thể xúc tiến quá trình nảy mầm Sau khi xử lí nhiệt, ta chuyển

vào môi trường nuôi cấy thích hợp

Có một số hoá chất đặc biệt có thể xúc tiến quá trình nảy mầm của bào tử Ví dụ: L-alanine, Mn2+

, chất hoạt động bề mặt, glucose,… Cũng có những chất lại có tác

dụng ức chế quá trình nảy mầm: D-alanine, natri bicarbonate…

Nảy mầm

Protein có chứa nhiều cystein trong áo bào tử hoá xốp lên làm tăng tính thấm,

xúc tiến sự hoạt động của enzyme protease Khi đó lượng protein trong bào tử áo giảm xuống Các cation bên ngoài co thể xâm nhập vào lớp vỏ bào tử và làm trương lớp vỏ bào tử lên, sau đó làm tan ra và tiêu đi Khi đó, nước bên ngoài sẽ xâm nhập vào lớp lõi của bào tử, làm cho lõi trương to lên, các loại enzyme bắt đầu được hoạt hoá, bắt đầu quá trình tổng hợp thành tế bào

Trong quá trình nảy mầm các đặc tính chịu nhiệt, tính chiết quang…bắt đầu giảm dần; lượng dipicolinate-canxi, acid amin, polipeptide dần dần mất đi; bắt đầu việc tổng

hợp DNA, RNA và protein trong vỏ bào tử Bào tử chuyển thành tế bào sinh dưỡng Khi nảy mầm, bào tử có thể đâm ra theo phía cực hoặc đâm ngang Lúc đó thành

tế bào còn rất mỏng và chưa hoàn chỉnh, do đó nâng cao khả năng tiếp nhận thêm DNA ngoại lai để thực hiện quá trình biến nạp

2.2.5 Sức đề kháng của bào tử

Bào tử có sức đề kháng cao đối với các yếu tố vật lý và hoá học như: nhiệt độ, tia cực tím, áp suất và chất sát trùng

Sỡ dĩ bào tử có sức đề kháng cao và sống lâu là do các yếu tố sau:

Nước trong bào tử phần lớn ở trạng thái liên kết, do đó không có khả năng làm biến tính protein khi tăng nhiệt độ

Do bào tử có khối lượng lớn ion Ca2+

và acid dipicolinic, protein của bào tử

kết hợp với dipicolinate canxi thành một phức chất có tính chất ổn định cao đối với nhiệt độ

Các enzyme và các hoạt chất sinh học khác chứa trong bào tử đều tồn tại dưới dạng không hoạt động, hạn chế sự trao đổi chất của bào tử đối với tế bào bên ngoài Với cấu trúc có nhiều màng bao bọc và tính ít thẩm thấu của các lớp màng làm cho các chất hoá học và chất sát trùng khó có thể tác động tới bào tử

2.3 Hệ vi sinh vật đường ruột và sự loạn khuẩn

2.3.1.Hệ vi sinh vật đường ruột

Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1987), ở ruột và dạ dày động vật khi mới sinh ra hoàn toàn không có vi khuẩn, sau vài giờ từ khi chúng sinh ra mới thấy có sự xuất hiện của một vài vi khuẩn và từ đó chúng bắt đầu sinh sản dần Sau đó một vài vi khuẩn khác

sẽ

theo thức ăn, nước uống vào đường tiêu hoá, sống và sinh sôi nảy nở ở đó, chúng sẽ biến đổi ít nhiều nhưng cơ bản chúng vẫn tồn tại cho đến khi con vật chết

Thành phần, số lượng của vi sinh vật đường tiêu hoá phụ thuộc vào tuổi tác của

gia súc, cách nuôi dưỡng, chăm sóc…ngoài ra còn có các điều kiện vật lí, hoá học của môi trường đường tiêu hóa

Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1970) và nhiều tác giả khác, có thể chia hệ vi sinh vật đường tiêu hoá ra làm 2 nhóm:

Nhóm vi sinh vật tuỳ nghi

Một số những vi sinh vật này là những vi sinh vật có hại, chúng thay đổi theo

điều kiện thức ăn, môi trường, đường tiêu hoá, khả năng đề kháng của cơ thể…như: Samonella, Klebsiella, E coli, Clostridium, Shigella, Staphylococus…

Đa số chúng thích nghi với môi trường pH trung tính đến kiềm Dưới những điều kiện môi trường thích hợp chúng phát triển, sản sinh độc tố xâm nhập phá vỡ tế bào đường ruột, gây tổn thương thành đường ruột nguy hại cho gia súc gia cầm

Nhóm vi sinh vật bắt buộc 

Đây là những vi sinh vật chịu được độ pH thấp, chúng phát triển tốt trong đường ruột của gia súc, gia cầm và định cư vĩnh viễn ở đó Đa số chúng có thể giúp cơ thể động vật tiêu hoá thức ăn tốt hơn nhờ vào hệ thống enzyme của chúng và giúp cơ thể phòng chống một số bệnh do vi sinh vật cơ hội gây ra

Nhóm vi sinh vật bắt buộc gồm có:

Vi khuẩn: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus,

Streptococus lactic (hiện nay gọi là Lactococus lactis), Bacillus subtilis,

Bifidobacterium, Cellulosemonas…

Nấm men: Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bouladii…

Nấm mốc: Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Mucor spp…

Protozoa: Entodinium, Diploinium…

Ngoài ra, người ta cũng chia hệ vi sinh vật đường ruột ra làm 3 nhóm dựa vào số lượng của chúng có trong đường ruột như

Nhóm hệ phổ chính: chiếm tổng số trên 90% số lượng vi sinh vật đường

ruột như: Bifidobacterium, Lactobacillus, Bacterioides…

Nhóm hệ phổ vệ tinh chiếm dưới 10% bao gồm: nấm men, Clostridium,

Proteus, Samonella…

Nhóm tuỳ nghi: chiếm 0,1% gồm: Clostridium, Samonella… 

(Tô Minh Châu, 2000)

Hai nhóm vi sinh vật trên luôn ở trạng thái cân bằng động và cũng là điều kiện

cần thiết bảo đảm cho sức khoẻ vật chủ Cũng có thể hai nhóm vi khuẩn khác nhau tranh chấp cùng một chất dinh dưỡng có khối lượng rất ít trong ống tiêu hoá Vi khuẩn nào đồng hoá chất dinh dưỡng này tốt thì sẽ loại trừ vi khuẩn kia

Một số vi khuẩn có thể làm thay đổi một số đặc điểm lí hoá của hệ thống tiêu hoá như: độ pH, tiềm năng oxy hoá khử, nồng độ các chất chuyển hoá làm cho một số vi sinh vật khác phát triển hoặc không phát triển được (Nguyễn Kiều Uyên Vi, 2004) 2.3.2 Vai trò của hệ vi sinh vật đường ruột

Giúp cho quá trình tiêu hoá tốt hơn nhờ vào hệ enzyme

Đa số các vi khuẩn có lợi trong đường ruột tham gia vào quá trình tiêu hoá, phân giải tinh bột, đường, đạm và chất xơ thành những sản phẩm dễ hấp thu hơn

Nhóm này gồm những vi sinh vật sinh một số enzyme có khả năng phân huỷ các chất trên: amylase, protease, glucanase, cellulase… gồm các vi khuẩn Lactic, Bacillus subtilis, Isotrichs, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger…

Theo Nguyễn Thị Vân Hương (1990), bổ sung chế phẩm Saccharomyces

boulardii vào khẩu phần gà thịt làm giảm được hệ số chuyển biến thức ăn trên 1 kg tăng trọng, làm tăng sức kháng bệnh của gà làm giảm tỉ lệ chết, từ đó góp phần làm tăng hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi

Đối với thú trưởng thành tiêu hoá chủ yếu nhờ enzyme thì sự xuất hiện của vi

sinh vật sản sinh enzyme cũng giúp thú tiêu hoá thức ăn tốt hơn So với enzyme tổng hợp, nguồn enzyme của các vi sinh vật tương đối lí tưởng, do có nhiều ưu điểm hơn so với các nguồn từ động vật và thực vật như:

Tốc độ sinh sản của vi sinh vật rất nhanh 

Nguồn nguyên liệu dễ nuôi cấy, dễ kiếm và rẻ tiền.

Các enzyme của vi sinh vật có hoạt tính cao 

Ngoài ra, có thể điều khiển các điều kiện tối ưu trong quá trình nuôi cấy để đạt

được hiệu quả cao trong sản xuất (Trần Thị Minh Chiến, 2002)

2.3.3 Sự loạn khuẩn

Từ loạn khuẩn được Nissle đưa ra vào năm 1916 Ông cho rằng các vi khuẩn có

trong ruột người và gia súc luôn ở thế quân bình để đảm bảo cho sự tiêu hoá bình thường của vật chủ

Thế quân bình này dựa vào 2 cơ chế:

(1) Cùng tranh giành chất dinh dưỡng nào đó cần cho sự sinh trưởng của

chúng

(2) Chúng có thể tiết ra chất có tính kháng đối với các vi khuẩn khác

Các nguyên nhân gây loạn khuẩn:

Theo Tô Minh Châu (2004) thì có 3 nguyên nhân:

Do kháng sinh có phổ rộng lâu ngày làm mất đi sự cân bằng của hệ vi sinh

vật đường ruột

Do yếu tố ngoại cảnh: thức ăn kém phẩm chất, thú bị stress, thay đổi thời

tiết, vệ sinh kém…

Do yếu tố sinh lý của thú con: Sức đề kháng của cơ thể còn yếu…