Nghiên cứu vai trò của thuốc bắc trong sự hình thành hệ vi sinh vật của bánh men truyền thống việt nam

Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học Formatted: Border: Bottom: Double solid lines, Auto, 0.5 pt Line width Formatted: Font: 4 pt Formatted: Font color: Black Formatted: Font c

Trang 1

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - -

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:

Nghiên cứu vai trò của thuốc bắc trong sự hình thành

hệ vi sinh vật của bánh men truyền thống Việt Nam

Hà Nội - 2015

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9

pt, Line spacing: 1.5 lines Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9

pt, Line spacing: 1.5 lines

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9 pt

Formatted: English (United States)

Formatted: Font: 14 pt

Trang 2

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong Khóa luận này là trung

thực

Tôi xin cam đoan, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Khóa luận này đã được

cám ơn và các thông tin trích dẫn trong Khóa luận này đã được ghi rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2015

Sinh viên

Nguyễn Thị Thu

pt, Line spacing: Multiple 1.2 li

Trang 3

ii

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu, em đã luôn nhận được rất nhiều

sự giúp đỡ, chỉ bảo, động viên của thầy cô, gia đình và bạn bè

Lời đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Vũ Nguyên Thành,

người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, tạo mọi điều kiện giúp em thực hiện khóa

luận này

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể cán bộ Trung tâm Vi sinh vật

Công nghiệp, Viện Công nghiệp Thực phẩm đã luôn nhiệt tình giúp đỡ, tạo mọi điều

kiện để em hoàn thành tốt công việc

Qua đây, em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô khoa công nghệ sinh học, Viện

Đại Học Mở Hà Nội đã tận tình dạy dỗ chúng em trong suốt 4 năm học qua

Cuối cùng, em xin dành lời cảm ơn chân thành đến gia đình, người thân, bạn

bè những người luôn động viên, khích lệ em trên con đường học tập, làm quen với

công tác nghiên cứu khoa học

Hà Nội, Ngày 20 tháng 5 năm 2015

Sinh viên

Nguyễn Thị Thu

Trang 4

iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

Formatted: English (United States) Formatted: Normal, Space Before: 0.9 pt, After: 0.9 pt

pt, Line spacing: Multiple 1.2 li Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9

pt, Line spacing: Multiple 1.2 li Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9 pt

Trang 5

iv

DANH MỤC BẢNG

Á

5

quốc gia Châu Á

8

Trang 6

v

DANH MỤC HÌNH

trường MT3

312

Trang 7

vi

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN iii

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH v

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Bánh men rượu và quá trình sản xuất rượu truyền thống Việt Nam 2

1.1.1 Bánh men rượu ở Việt Nam 2

1.1.2 Vai trò của bánh men trong quá trình lên men rượu 222

1.1.3 Quy trình sản xuất bánh men thuốc bắc 4

1.2 Hệ vi sinh vật trong bánh men 5

1.2.1 Nấm mốc 666

1.2.2 Nấm men 666

1.2.3 Vi khuẩn 777

1.3 Thuốc bắc trong sản xuất bánh men rượu 8

1.3.1 Các vị thuốc bắc thường sử dụng trong sản xuất bánh men 8

1.3.2 Vai trò của thuốc bắc trong sản xuất bánh men 9

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 101011

2.1 Nguyên liệu, dụng cụ, thiết bị, hóa chất 101011

2.1.1 Nguyên liệu 101011

2.1.2 Hóa chất 101011

2.1.3 Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm 111012

2.1.4 Môi trường 111112

2.2 Phương pháp nghiên cứu 121213

2.2.1 Phương pháp vi sinh 121213

2.2.2 Phương pháp phân tích 131315

2.2.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 161617

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 191920

3.1 Thành phần hệ vi sinh vật trong bánh men 191920

3.1.1 Bánh men thành phẩm 191920

3.1.2 Kết quả phân lập vi sinh vật trong các mẫu bánh men 212122

3.1.3 Các nhóm vi sinh vật phân lập từ bánh men 232324

Trang 8

vii

3.2 Ảnh hưởng của thuốc bắc tới chủng vi sinh vật 353536

3.2.1 Ảnh hưởng của thuốc bắc tới nấm mốc 353536

3.2.2 Ảnh hưởng của thuốc bắc tới nấm men 373738

3.2.3 Ảnh hưởng của thuốc bắc tới giả nấm men 383839

3.2.4 Ảnh hưởng của thuốc bắc tới vi khuẩn 393939

3.3 Kết quả lên men từ bánh men 393940

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 424243

Kết luận: 424243

Kiến nghị: 424243

TÀI LIỆU THAM KHẢO 434344

Trang 9

Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học

Formatted: Border: Bottom: (Double solid lines, Auto, 0.5 pt Line width)

Formatted: Font: 4 pt Formatted: Font color: Black

Formatted: Font color: Black Formatted: Space Before: 0 pt, After: 8 pt, Border: Top: (Double solid lines, Auto, 0.5 pt Line width)

Formatted: Font color: Black, Check spelling and grammar

Formatted: Font color: Black

MỞ ĐẦU

Từ rất lâu đồ uống có cồn đã gắn liền với đời sống của con người Có rất nhiều

loại đồ uống có cồn được sản xuất và tiêu thụ trên toàn thế giới như rượu, rượu

vang, bia và một số đồ uống có nồng độ cồn thấp khác Trong đó mỗi sản phẩm đều

mang đậm tính đặc trưng đóng vai trò to lớn trong đời sống văn hóa và tinh thần của

con người

Ở Việt Nam thưởng thức rượu là một nét văn hóa mang đậm bản sắc riêng của

từng vùng, từng dân tộc Rượu được sản xuất ở hầu hết các nơi ở nước ta với nhiều

vùng sản xuất rượu nổi tiếng như: Rượu làng Vân Hà (Bắc Giang), rượu Mẫu Sơn

(Lạng Sơn), rượu Bầu Đá (Bình Định), rượu Đế (Nam Bộ), rượu Kim Sơn (Ninh

Bình) v.v…Tùy thuộc vào thành phần và quy trình sản xuất mà rượu có nhiều tên

gọi khác nhau như rượu trắng, rượu gạo, rượu nếp, rượu cần… Không những thế

rượu truyền thống còn đóng góp vào việc phát triển kinh tế, đặc biệt kinh tế hộ gia

đình ở nông thôn nước ta

Sản xuất rượu truyền thống thường sử dụng men giống dạng viên, bánh được

chuẩn bị ở điều kiện thủ công do một số hộ gia đình tự sản xuất Việc sản xuất bánh

men ở mỗi hộ gia đình, mỗi địa phương có sự khác nhau chính điều đó một phần

dẫn đến sự đa dạng giữa các dòng rượu của mỗi địa phương, mỗi gia đình Hiện

nay, với xu thế muốn bảo tồn và phát triển rượu lên men truyền thống các công ty

sản xuất rượu cũng bắt đầu chú trọng vào sử dụng bánh men trong quá trình sản

xuất rượu truyền thống trên quy mô công nghiệp Nhu cầu về bánh men và chất

lượng bánh men đặt ra nhiều thách thức cho các nhà sản xuất rượu truyền thống

muốn áp dụng trên quy mô công nghiệp

Thành phần chính của sản xuất bánh men là men giống khởi động, cơ chất giữ

và một số thuốc bắc, thảo mộc được bổ sung Việc sản xuất bánh men hiện nay chủ

yếu là việc truyền lại từ đời này sang đời khác của hộ gia đình vì vậy bánh men

mang tính chất địa phương và gia đình cao Với mong muốn hiểu rõ hơn về bánh

men góp phần bảo tồn lưu giữ bánh men truyền thống, đề tài: “Nghiên cứu vai trò

của thuốc bắc trong sự hình thành hệ vi sinh vật của bánh men truyền thống Việt

Nam” được thực hiện

Formatted: Font: 7 pt, English (United States) Formatted: Normal, Space Before: 0.9 pt, After: 0.9 pt

Trang 10

Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học Formatted: Border: Bottom: (Double solid

lines, Auto, 0.5 pt Line width) Formatted: Font: 4 pt

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Bánh men rượu và quá trình sản xuất rượu truyền thống Việt Nam

1.1.1 Bánh men rượu ở Việt Nam

Một số quốc gia Châu Á và Việt Nam có nhiều thế kỷ sản xuất rượu truyền

thống từ ngũ cốc Quá trình lên men được thực hiện bởi các giống khởi động với

nhiều tên gọi khác nhau như Bukhar, Murcha (Ấn Độ), Ragi (Indonesia), Budbod

(Philippines), Look-pang (Thái Lan) Các giống khởi động được chuẩn bị theo

nhiều cách khác nhau nhưng bản chất đó chính là quá trình nuôi cấy và bảo quản vi

sinh vật trên môi trường tinh bột sống ở trạng thái khô

Ở Việt Nam, bánh men rượu chủ yếu theo phương pháp thủ công truyền thống

đã có từ lâu đời, mỗi vùng sản xuất rượu có một bí quyết làm bánh men riêng Dựa

vào thành phần thuốc bắc hay thảo mộc bổ sung mà bánh men Việt Nam hiện nay

chia thành 2 nhóm chính men lá, men thuốc bắc

1.1.1.1 Men thuốc bắc

Ở Việt Nam, trong các loại bánh men thì bánh men thuốc bắc được sử dụng phổ

biến hơn cả Nguyên liệu để sản xuất bánh men gồm có bột gạo hoặc bột sắn, được

trộn với men giống và các vị thuốc bắc khác nhau Các thành phần này với liều

lượng khác nhau ở mỗi địa phương, ở từng gia đình và được xem là bí quyết gia

truyền Bột gạo, thuốc bắc, thảo mộc được nghiền nhỏ được trộn với giống khởi

động từ một lô trước đó, được định hình tròn nhỏ hoặc dẹt phẳng, ủ 30ºC trong

khoảng một tuần Trong thời gian này hệ vi sinh vật phát triển và bánh men bị mất

nước Các bánh men này có thể bảo quản được ở nhiệt độ thường mà không làm

giảm khả năng sống của vi sinh vật trong ít nhất sáu tháng [22]

1.1.1.2 Men lá

Men lá thường được sử dụng ở các vùng núi cao Người dân dùng các lá cây có sẵn

ở miền núi thay cho các vị thuốc bắc Lá sử dụng thường là các loại có nhiều tinh

dầu, có mùi thơm Tùy thuộc vào từng địa phương mà có các bài lá khác nhau Mùi

vị của rượu thành phẩm phụ thuộc rất nhiều vào các loại lá, vào tỷ lệ sử dụng chúng

trong bánh men Để làm men lá người K’Ho Tây Nguyên sử dụng một thân cây “

đòng” và nước triết cây “ me-kà-zut” trộn với bột gạo [3]

“đòngˮ và nước chiết cây “me-kà-zutˮ trộn với bột gạo [3]

1.1.2 Vai trò của bánh men trong quá trình lên men rượu

1.1.2.1 Quá trình sản xuất rượu truyền thống từ bánh men

Tùy thuộc vào nguồn nguyên liệu sử dụng, quy trình, công nghệ chưng cất và

quy mô sản xuất có thể thay đổi nhưng nhìn chung quá trình sản xuất rượu truyền

thống ở Việt Nam có thể tóm tắt như sau [2, 3, 8, 10]:

Formatted: Font: 6 pt, English (United States) Formatted: Normal, Space Before: 0.9 pt, After: 0.9 pt

Formatted: Indent: First line: 0", Space Before: 0.9 pt, After: 0.9 pt

Formatted: Indent: First line: 0", Right: 0", Space Before: 0.9 pt, After: 0.9 pt

Formatted: Normal, None, Space Before: 0.9

pt, After: 0.9 pt Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9 pt

Trang 11

Quá trình đường hóa: Từ các nguyên liệu như gạo, ngô, sắn được nấu chín,

sau đó được tãi nguội, khi nhiệt độ khoảng 37°C, tiến hành rắc men, ủ đống trên

nong nia qua đêm Mục đích của quá trình này là giúp cho nấm mốc và nấm men

sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym đường hóa tinh bột Tiếp đến khối ủ được dàn

mỏng đến độ dày khoảng 15-20 cm trong thúng nót nilon, phía trên phủ một lớp

mỏng lá chuối sạch Khi khối cơm ủ trở nên mềm và ngọt quá trình đường hóa kết

thúc

Quá trình lên men: Đường được tạo ra trong quá trình đường hóa được lên men

tạo rượu Trong sản xuất rượu làng nghề, hiện nay vẫn tồn tại hai phương pháp lên

men đó là: lên men rắn và lên men lỏng

Ở miền xuôi, quá trình lên men thường được thực hiện theo công nghệ lên men

lỏng Gạo, sắn sau khi đã mền và ngọt, toàn bộ khối cơm ủ được chuyển vào chum

sành, nước mưa được đưa thêm vào theo tỉ lệ 1:1, lên men ở 28-30°C trong 3-5 ngày

Trong sản xuất rượu truyền thống thời gian lên men thay đổi dài ngắn theo mùa trong

năm, mùa đông thời gian lên men thường kéo dài hơn mùa hè Nhược điểm của công

nghệ này là quá trình lên men diễn ra nhanh và mạnh, nhiệt độ lên men thường tăng

cao, do đó hương thơm kém, hàm lượng tạp chất và các chất không mong muốn khác

cao

Ở các vùng núi cao, với nguyên liệu dùng cho sản xuất rượu cổ truyền là ngô,

sắn thường tiến hành theo công nghệ lên men rắn Sau quá trình đường hóa ngô, sắn

trở nên ngọt và mềm Toàn bộ khối ngô được cho vào túi nilon buộc kín Quá trình

lên men diễn ra trong 7-10 ngày, sau đó đem chưng cất Ưu điểm của công nghệ này

là quá trình lên men chậm, rượu thơm hơn và ít tạp chất hơn Nhược điểm của nó là

thời gian lên men dài

Quá trình chưng cất: Hiện nay việc chưng cất rượu truyền thống đang tồn tại

hai công nghệ chưng cất đó là: Cất “ruột gà” và cất “thượng thủy” Rượu chưng cất

bằng công nghệ thượng thủy thường có chất lượng tốt hơn rượu chưng cất ruột gà

Sau quá trình chưng cất nồng độ cồn có thể đạt tới 50% v/v (khoảng 40%

w/v) Năng suất, hương vị và các thành phần chứa trong sản phẩm lên men tự nhiên

này dường như khó có thể dự đoán trước Điều này, tạo ra nét đặc trưng riêng mang

đậm tính thủ công truyền thống cho từng loại rượu khác nhau [24]

1.1.2.2 Vai trò của bánh men trong lên men rượu

Bánh men thực chất là một hỗn hợp các giống khởi động (Starter culture),

dùng cho quá trình sản xuất rượu Vai trò của bánh men trong quá trình lên men

chính là nhờ hệ vi sinh vật trong bánh men Trong đó nhóm nấm mốc và vi sinh vật

sinh ra enzyme amylase chuyển hóa tinh bột thành đường, nấm men biến đổi các

đường này thành rượu [20, 21, 23]

Trang 12

Giai đoạn đầu vi khuẩn phát triển hình thành các axit hữu cơ (axit hóa dịch

đường trước khi lên men) pH giảm xuống tạo điều kiện cho các loại nấm mốc phát

triển, nấm men cũng bắt đầu phát triển nhưng tốc độ chậm hơn nấm mốc [3] Quá

trình chuyển hóa tinh bột thành đường nhờ các loại nấm mốc như Rhizopus arrhizus

(=Amylomyces rouxii, Rhizopus oryzae), R microsporus, Mucor sp… tạo ra

amylase (α-amylase, glucoamylase) [4] Quá trình chuyển hóa đường thành rượu

chủ yếu nhờ nấm men Saccharomyces cerevisiae, một số loài khác như Pichia

anomala, Candida spp cũng có khả năng tham gia vào quá trình chuyển hóa này

[4]

1.1.3 Quy trình sản xuất bánh men thuốc bắc

Quá trình sản xuất bánh men là quá trình làm tăng sinh khối các vi sinh vật cần

cho sản xuất rượu và giữ chúng ở trạng thái nghỉ, dạng khô trên môi trường bột gạo

[8] Nguyên liệu chính dùng để sản xuất bánh men là bột gạo (chiếm 90-95%); còn

lại là các vị thuốc bắc và men cái Quy trình sản xuất bánh men được tóm tắt như

sau:

Gạo được vo sạch, ngâm 1-2 giờ, để ráo, xay thành bột Bột gạo được trộn với

bột các vị thuốc bắc và bột men giống (gọi là giống cái) lưu trữ từ các mẻ trước đó

theo tỷ lệ 5% men giống cho 1 kg bột gạo ẩm Hỗn hợp trên được trộn đều, bổ sung

nước đến hàm ẩm khoảng 50 ÷ 60% Nặn thành viên tròn, dẹt, có đường kính

khoảng 3 ÷ 5cm Xoa bột men cái sau đó đặt bánh men lên một lớp trấu mới trải

trên nong, mành sạch, tạo điều kiện thoáng khí Đậy bánh men bằng nong hoặc phủ

trên mặt bánh men bằng lớp rơm sạch, ủ ở nhiệt độ 30°C trong khoảng 2 ÷ 3 ngày

khi thấy bánh men phồng nở đều và xung quanh bánh men mọc lông tơ, xốp, nhẹ thì

để ra chỗ thoáng, mát Tiếp theo men được sấy tới độ ẩm khoảng 10-12% Men

thành phẩm được sâu thành chuỗi và bảo quản trên gác bếp Qua quá trình sấy, vi

sinh vật trong bánh men chuyển từ trạng thái hoạt động sang trạng thái nghỉ Chúng

sẽ nhanh chóng hoạt động trở lại trong điều kiện môi trường, nhiệt độ và độ ẩm

thích hợp, hệ nấm mốc và nấm men sẽ sinh tổng hợp enzyme đường hóa và rượu

hóa [4, 9]

Trang 13

Hình 1.1: Quy trình sản xuất bánh men rượu

1.2 Hệ vi sinh vật trong bánh men

Đã có nhiều nghiên cứu về các nhóm vi sinh vật trong giống khởi động dùng

cho lên men rượu ở một số quốc gia Châu Á Giống khởi động sử dụng cho quá

trình lên men rượu có hệ vi sinh vật khá đa dạng (Bảng 1.1) [12, 19, 22, 27, 28, 29]

Bảng 1.1: Hệ vi sinh vật trong giống khởi động của các quốc gia Châu Á

Mucor spp., Rhizopus spp., Amylomyces spp., Candida spp., Saccharomyces spp., Saccharomycopsis spp., Torulopsis spp

Saccharomycopsis fibuligera

Saccharomyces cerevisiae , Pichia spp., Candida spp.,

Saccharomycopsis fibuligera

Ủ men Sấy khô

Bánh men thành phẩm

Gạo ngâm nước

Xay thành bột

Các vị thuốc bắc hoặc thuốc nam, men

giống, nước

Định hình bánh men Nhào bột

Trang 14

spp., Mucor spp., Pichia anomala

Mucor spp., Rhizopus spp., Aspergillus spp., Amylomyces spp., Penicillium spp., Candida spp., Saccharomyces spp., Saccharomycopsis spp., Pichia spp., Candida spp

Hệ vi sinh vật trong bánh men là sự kết hợp đa dạng của nấm và vi khuẩn

Thành phần nấm trong bánh men rất ít thay đổi Nó bao gồm các loài sinh amylase

(Rhizopus oryzae, R microsporus, Mucor spp., Saccharomycopsis fibuligera), các

loài sản sinh ethanol (Saccharomyces cerevisiae, Issatchenkia orientalis., Pichia

anomala, Candida tropicalis, P ranongensis, Clavispora lusitaniae) và các sinh vật

(cơ hội) tạp nhiễm (Xeromyces bisporus, Botryobasidium subcoronatum) Trong

bánh men các vi khuẩn thay đổi rất lớn về thành phần loài và bị chi phối bởi các vi

khuẩn lactic (LAB) Các LAB thường gặp nhất là Pediococcus pentosaceus,

Lactobacillus plantarum, L Brevis, Weissella confusa, và W paramesenteroides

Loài vi khuẩn Bacillus sản sinh amylase (Bacillus subtilis, B circulans, B

amyloliquefaciens, B sporothermodurans), vi khuẩn sinh acetic acid (Acetobacter

orientalis, A pasteurianus), và các vi khuẩn tạp nhiễm (Burkholderia ubonensis,

Ralstonia solanacearum, Pelomonas puraquae) [30] Theo A.C Lee và Y Fujio

[19] thì hệ vi sinh vật trong bánh men Việt Nam ngoài những loài trên còn có:

Mucor indicus, Mucor circinilloides và Hyphopichia burtonii, v.v

1.2.1 Nấm mốc

Trong bánh men thuốc bắc có nhiều loại nấm mốc phát triển thuộc nhóm

Rhizopus oryzae, R microsporus, Mucor spp Số loại nấm mốc phụ thuộc vào các

yếu tố như: nhiệt độ, nơi sản xuất bánh men….Nhưng trong đó Rhizopus và Mucor

thấy phát triển nhiều hơn cả [7]

1.2.1.1 Rhizopus

Rhizopus spp có màu trắng xám, rễ giả màu vàng, bọc bào tử hình cầu, bào

tử kín, phân nhánh Chúng phân bố rộng rãi trong đất, ngũ cốc, rau quả và có khả

năng sinh enzyme amylase, protease

1.2.1.2 Mucor

Mucor là loại nấm màu trắng, bọc bào tử hình cầu màu trắng hoặc nhạt màu,

có hệ sợi hình ống, dạng nhung hoặc len, không có thân bò (Stolon) cuống bọc bào

tử dựng đứng, luôn luôn tận cùng bằng bọc bào tử, đơn độc hoặc phân nhánh

1.2.2 Nấm men

Nấm men là nhóm vi sinh vật có cấu tạo đơn bào và nhân chuẩn (Eukaryote)

thường sinh sản bằng cách nẩy chồi Hình dạng nấm rất phong phú, phụ thuộc vào

giống loài, nó có dạng hình cầu, hình trứng, hình bầu dục… Đối với nấm men trong

Formatted: Font: 6 pt Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9 pt

Trang 15

quá trình hoạt động sống, chúng đồng hóa đường trong điều kiện yếm khí, thải ra

phức hệ các enzyme Đây là một trong những đặc trưng quan trọng của nấm men đã

được nhân dân ta ứng dụng từ lâu đời để sản xuất rượu bằng bánh men thuốc bắc

Trong mỗi gam bánh men có từ vài chục triệu đến vài trăm triệu tế bào nấm men

Gồm 2 chi khác nhau: Saccharomyces (chủ yếu là Saccharomyces cerevisiae) và

Saccharomycopsis (chủ yếu là Saccharomycopsis fibuligera) [2]

1.2.2.1 Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae có tế bào hình tròn hoặc ovan, kích thước khoảng 3

– 10 × 5 - 12 µl Là loài nấm men lên men nổi, kị khí không bắt buộc Sinh sản vô

tính theo kiểu nẩy chồi, phân đôi bào tử Trong điều kiện đầy đủ oxy, nấm men sinh

trưởng làm tăng sinh khối Trong điều kiện kị khí, chúng tiến hành lên men rượu

thu năng lượng, chuyển đường thành rượu Vì vậy trong giai đoạn đầu của quá trình

lên men người ta thường bổ sung oxy vào môi trường lên men để thúc đẩy sự sinh

trưởng của nấm men, tạo sinh khối Sacchromyces cerevisiae có khả năng lên men

nhiều loại đường khác nhau như glucose, saccharose, fructose, maltose Nhiệt độ

tối ưu cho chúng phát triển là 25 - 30˚C, nhiệt độ tối thiểu 2 - 3˚C Ở 40˚C thì

ngừng sinh trưởng và chết

1.2.2.2 Saccharomycopsis fibuligera

Saccharomycopsis là loại giả nấm men có khả năng sinh tổng hợp enzyme

amylase và glucoamylase Có tính chất tương tự như S cerevisiae, sinh sản dinh

dưỡng bằng nẩy chồi Tế bào có hình bầu dục nối tiếp nhau thành những dạng sợi

gọi là khuẩn ty

Theo những nghiên cứu gần đây, nấm men trong bánh men rượu gạo của Việt

Nam có thể phát triển trên môi trường có hàm lượng glucose tương đối cao, đặc biệt

các chủng nấm men trong bánh men thuốc bắc có khả năng chịu được thuốc sát

khi cần sử dụng thuốc sát trùng Quan trọng hơn hết là loài nấm men này có khả

năng lên men các loại nguyên liệu khác nhau như gạo, ngô, khoai, sắn Nồng độ

rượu trong dịch lên men là 10 -12% Nhiệt độ lên men thích hợp là từ 28 - 32ºC

1.2.3 Vi khuẩn

Trong bánh men thuốc bắc có nhiều loại vi khuẩn phát triển Nhưng chủ yếu là

vi khuẩn Lactobacillus spp Acerobacter spp., Bacillus ssp Hai nhóm đầu thường

làm chua môi trường Thời gian đầu quá trình lên men, quá trình này xảy ra có lợi

vì pH môi trường do chúng tạo ra sẽ thích hợp cho nấm men và nấm mốc phát triển

Tuy nhiên pH xuống quá thấp lại ảnh hưởng cho quá trình lên men Mặt khác trong

giai đoạn sau nếu dịch lên men có oxy thì vi khuẩn acetic sẽ oxy hóa rượu thành

acid acetic, làm giảm lượng cồn tạo thành, không có lợi Vi khuẩn nhóm Bacillus có

Trang 16

khả năng thủy phân tinh bột mạnh Trong một số nghiên cứu, người ta bổ sung vào

chế phẩm bánh men nhiều chủng giống vi khuẩn có khả năng chuyển hóa tinh bột

thành đường: B subtillis, B diastaticus…

1.3 Thuốc bắc trong sản xuất bánh men rượu

1.3.1 Các vị thuốc bắc thường sử dụng trong sản xuất bánh men

Việc sử dụng thuốc bắc cũng như các loại thảo dược khá phổ biến trong quá

trình sản xuất giống khởi động ở các nước châu Á (Bảng 1.2) [1, 13, 14, 16, 17, 18,

25, 26, 31, 32]

Bảng 1.2: Thuốc bắc, thảo dược sử dụng cho men khởi động của các quốc gia Châu Á

Cam thảo, Bạc hà, Nhục đậu khấu, Đinh hương,…

Trầu không, Mía, Cà (lá, quả), Gừng,…

Mía,…

Ở Việt Nam, với kinh nghiệm gia truyền, ở mỗi địa phương khác nhau, thậm

chí ở từng gia đình nhất định, số vị thuốc bắc trong một bài thuốc được dùng là rất

khác nhau Công thức nhiều vị nhất có tới 38 vị, công thức ít chỉ có 4 vị [9] Trong

quá trình làm bánh men các vị thuốc bắc được nghiền nhỏ trộn với bột gạo và men

cái Tỷ lệ thuốc bắc với bột gạo khá khác nhau giữa các bài thuốc Tỷ lệ thuốc bắc

thường sử dụng là 5 – 10% so với bột gạo, có bài thuốc tỷ lệ thuốc bắc vào khoảng 2 %

Một số bài thuốc bắc được sử dụng phổ biến trong sản xuất bánh men thuốc

bắc như sau [6, 9]

• Công thức bài thuốc 10 vị:

Formatted: Font: 6 pt Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9 pt

Formatted: Condensed by 0.3 pt Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9 pt

Trang 17

• Công thức bài thuốc 5 vị

1.3.2 Vai trò của thuốc bắc trong sản xuất bánh men

Theo những nghiên cứu trước đây, vai trò của các vị thuốc bắc trong bánh men

có thể chia làm 4 nhóm sau [1]:

Theo nghiên cứu của Nguyễn Văn Hiệu (1993) cho thấy trong bánh men thuốc

bắc nhờ có các vị thuốc với thành phần hợp lý mà chúng có hai vai trò chính là kích

thích sự phát triển của nấm men và ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây hại

[9] Theo nghiên cứu Ngô Thị Phương Dung (2004) “Tiểu Hồi” và “Đinh Hương”

là có tác dụng kích thích sự sinh trưởng của nấm mốc và nấm men [24] Mặt khác

các vị thuốc bắc đều có mùi thơm Các hợp chất thơm này có thể phản ứng với nhau

và với những hợp chất khác, tạo ra những hợp chất mới Kết quả tạo ra mùi vị đặc

trưng cho rượu cổ truyền

Formatted: Indent: First line: 0", Space Before: 0.9 pt, After: 0.9 pt

Trang 18

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu, dụng cụ, thiết bị, hóa chất

2.1.1 Nguyên liệu

- Các chủng vi sinh vật: các chủng chuẩn Aspergillus brasiliensis ATCC

16404, Candida albicans ATCC 10231, E coli ATCC 25922 trong bộ sưu tập giống

của Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp, Viện Công nghiệp thực phẩm

- Mẫu bánh men làng Vân, Bắc Giang

- Gạo Q5 xát rối, gạo Bắc Hương, trấu, nước: Yêu cầu gạo không ẩm mốc,

không có côn trùng, không mối mọt

- Các bài thuốc bắc: bài thuốc bắc 10 vị, 5 vị, các bài thuốc bắc tổng hợp:

+ Bài thuốc 10 vị (CT1):

+ Bài thuốc 5 vị (CT4):

+ Bài thuốc tổng hợp Kim Sơn, Ninh Bình (CT5)

+ Bài thuốc tổng hợp Chương Mỹ, Hà Nội (CT6)

2.1.2 Hóa chất

- Hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu đều là các hóa chất tinh khiết và

chuyên dụng Các hóa chất dùng cho sinh học phân tử phần lớn có nguồn gốc từ các

hãng: Sigma (Mỹ), Merck (Đức), Difco (Mỹ), Invitrogen (Mỹ), Fermentas (Đức),

Roth (Đức)

- Hóa chất dùng cho nuôi cấy: Peptone, Meat Extract, Yeast Extract,

D-Glucose, Polysorbate 80, Ammonium Citrate, Sodium Acetate, Magnesium Sulfate,

Manganese Sulfate, Dipotassium Phosphate, Agar, Malt, Chloramphenicol,

Amphotericin B Các hóa chất dùng cho nuôi cấy, phân tích có nguồn gốc từ Thụy

Điển, Việt Nam, Trung Quốc

Formatted: Indent: First line: 0.38", Space Before: 0.9 pt, After: 0.9 pt

Formatted: Indent: First line: 0.5", Space Before: 0.9 pt, After: 0.9 pt, Tab stops: Not at 0" + 1.87" + 3.25" + 4.33" + 4.93" Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9 pt

pt, Tab stops: 0", Right,Leader: … + Not at 1" + 2" + 2.18"

Trang 19

2.1.3 Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm

- Dụng cụ: Bình tam giác (100 -1000 ml), Que cấy (tre, thủy tinh), ống Falcon,

ống nghiệm, ống nút xoáy, bình Schott, ống đong, Eppendorf, pipet, đèn cồn, đĩa

Petri, đầu tip 200 µl, 1000µl, 5 ml, 10 ml

- Thiết bị: Box cấy (BioblockScientific, Pháp), cân điện tử (Precisa, Thụy

Điển), máy đo pH (Toledo, Anh), máy lắc ổn nhiệt (Eppendorf, Đức), máy ly tâm

cao tốc (Heraeus–Sepatech), nồi hấp thanh trùng (Himayatoko, Nhật), tủ lạnh giữ

giống (Electrolux, Thụy Điển), tủ nuôi cấy (Sanyo, Nhật), kính hiển vi quang học

(Eclipse E600, Nikon, Nhật), thiết bị bộ điện di ngang (Pharmacia Biotech, Gibco),

máy phá tế bào (Mini Beadbeater, Biospec Products), máy chụp ảnh gel (Olympus),

máy PCR (PE-GeneAmp PCR System 9700), máy soi gel (Syngene)

2.1.4 Môi trường

2.1.4.1 Môi trường phân lập

- Môi trường Matl 2°Bx có Chloramphenicol 100 mg/ l (MT1)

Thành phần : Malt 2%, Agar 1,5%, nước

Chuẩn bị: Cân các thành phần với tỷ lệ như trên Cho hỗn hợp vào bình Schott

sau đó bổ sung Chloramphenicol với tỷ lệ 100 mg Chloramphenicol/1000 ml môi

trường đem khử trùng ở 121°C trong 15 phút để môi trường nguội xuống 50- 60°C,

lắc đều và đổ ra đĩa Petri trong điều kiện vô trùng Bảo quản ở tủ mát sau khi môi

trường khô

- Môi trường MRS có Amphotericin B 5 mg/l (MT2)

Thành phần: Peptone 10,0 g, Meat Extract 10,0 g, Yeast Extract 5,0 g,

D-Glucose 20,0 g, Polysorbate 80 1,0 g, Ammonium Citrate 2,0 g, Sodium Acetate 5,0

g, Magnesium Sulfate 0,1 g, Manganese Sulfate 0,05 g, Dipotassium Phosphate 2,0

g, Agar 18,0 g, Nước 1000ml, pH = 6,5 ± 0,2

Chuẩn bị: Cân các thành phần với tỷ lệ như trên Cho hỗn hợp vào bình

ml môi trường, lắc đều và đổ ra đĩa Petri trong điều kiện vô trùng Bảo quản ở tủ

mát sau khi môi trường khô

2.4.1.2 Môi trường làm sạch và giữ giống

- Môi trường Matl 2°Bx không có Chloramphenicol (MT3)

Thành phần: Malt 2%, Agar 1,5%, nước

Chuẩn bị:

- Cân các thành phần, cho hỗn hợp vào bình Schoot rồi hấp khử trùng ở

121°C trong 15 phút sau đó để nguội môi trường xuống 70-80°C đổ ra đĩa Petri

trong điều kiện vô trùng

Trang 20

- Cân các thành phần, hòa tan agar sau đó dùng pipet hút 10 ml cho vào ống

nghiệm nút xoáy, rồi hấp khử trùng ở 121 °C trong 15 phút, sấy nhẹ môi trường cho

khô rồi bảo quản vào tủ mát

- Môi trường MRS không có Amphotericin B (MT4)

Thành phần: Peptone 10,0 g, Meat Extract 10,0 g, Yeast Extract 5,0 g,

D-Glucose 20,0 g, Polysorbate 80 1,0 g, Ammonium Citrate 2,0 g, Sodium Acetate 5,0

g, Magnesium Sulfate 0,1 g, Manganese Sulfate 0,05 g, Dipotassium Phosphate 2,0

g, Agar 18,0 g, nước 1000ml, pH = 6,5 ± 0,2

Chuẩn bị:

- Cân các thành phần, cho hỗn hợp vào bình Schoot rồi hấp khử trùng ở

121°C trong 15 phút sau đó để nguội môi trường xuống 70-80°C đổ ra đĩa Petri

trong điều kiện vô trùng

- Cân các thành phần, hòa tan agar sau đó dùng pipet hút 10 ml cho vào ống

nghiệm nút xoáy, rồi hấp khử trùng ở 121°C trong 15 phút, sấy nhẹ môi trường cho

khô rồi bảo quản vào tủ mát

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp vi sinh

2.2.1.1 Phương pháp phân lập

- Sau khi tạo thành bánh men thành phẩm ta tiến hành cấy chang trên môi

trường MT1, MT2 để xác định số lượng vi vi sinh vật có trong bánh men

- Tiến hành: Bánh men được nghiền nhỏ mịn sau đó lấy 3 g bánh men cho vào

27 ml dung dịch pha loãng NaCl 0,89%, vortex đều rồi pha loãng về các nồng độ

10-2, 10-3, 10-4, 10-5,10-6… Hút 0,1 ml dịch pha loãng rồi phân lập trên môi trường

MT1 đối với nấm men, giả men và nấm mốc, ủ ở 30°C, trên môi trường MT2 đối

với vi khuẩn, ủ vi hiếu khí ở 37°C

- Đếm số lượng khuẩn lạc vi sinh vật phát triển trong đĩa petri theo thời gian

(ngày thứ nhất có thể đếm được nấm mốc và giả men; ngày thứ 2 đếm nấm men và

vi khuẩn; ngày thứ 3 có thể phân biệt rõ các khuẩn lạc khác nhau và đếm lại) từ đó

tính ra số lượng tế bào trong 1 g mẫu bánh men theo công thức:

Trong đó:

- N: là tổng số CFU trong 1 g (ml) mẫu

- ∑C: là tổng khuẩn lạc đếm được trên 2 đĩa giữ lại từ 2 độ pha loãng liên

tiếp và trong đó ít nhất một đĩa có chứa tối thiểu 10 khuẩn lạc

- V: thể tích dịch nuôi cấy trên mỗi đĩa, tính bằng ml

- n1: số đĩa giữ lại ở nồng độ thứ nhất

- n2: số đĩa giữ lịa ở nồng độ thứ hai

Trang 21

- d: hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất được giữ lại

- Từ các đĩa phân lập tiến hành làm sạch trên các môi trường tương ứng Đối

với nấm mốc và nấm men, giả men thì cấy trên môi trường MT3, vi khuẩn thì cấy

trên môi trường MT4 Chọn những khuẩn lạc đặc trưng, riêng rẽ, cấy giữ giống vào

ống nghiệm thạch nghiêng

2.2.1.2 Phương pháp nhuộm Gram

Chuẩn bị hóa chất:

- Dung dịch Crystal Violet (tím violet): Hòa tan 2 g Crystal Violet với 20 ml

Ethanol 95% Sau đó bổ sung thêm 80 ml nước cất Bảo quản dung dịch trong 24 h,

lọc qua giấy lọc trước khi dùng Bảo quản trong lọ tối

- Dung dịch Iodine: Cân 1 g Iodine, 2 g Potassium Iodide (KI) hòa tan vào 300

ml nước cất Bảo quản trong lọ tối

- Dung dịch tẩy: Ethanol 95% (70%) và Acetone (30%)

- Dung dịch nhuộm Fuchsin: Hòa tan 0,2 g Fuchsin vào 100 ml nước cất

Chuẩn bị mẫu: Các mẫu cần nuôi cấy trong vòng 18 – 24 h

Quy trình nhuộm:

- Làm tiêu bản vết bôi Nhỏ một giọt nước lên trên lam kính, dùng đầu que cấy

lấy một ít sinh khối vi khuẩn, làm tan đều vào giọt nước

- Để khô tiêu bản tự nhiên hoặc hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn

- Nhỏ 1 giọt dung dịch tím violet lên vết bôi Để trong 1 phút

- Rửa nhẹ lam kính cho đến khi sạch tím violet

- Nhỏ 1 giọt dung dịch Iodine lên và để trong 1 phút

- Rửa lam kính cho sạch bằng nước, làm khô

- Nhỏ dung dịch tẩy lên vết bôi trong khoảng 15 – 30 giây

- Nhỏ dung dịch Fuchsin lên tiêu bản để 30 giây – 1 phút

- Rửa sạch lam kính và lau khô

- Soi kính ở độ phóng đại 100, có dầu

Kết quả:

- Vi khuẩn Gram dương: Nhuộm mầu tím, xanh tím

- Vi khuẩn Gram âm: Nhuộm mầu đỏ hoặc hồng

2.2.2 Phương pháp phân tích

2.2.2.1 Phương pháp xác định nồng độ cồn

Dịch sau lên men được ly tâm và đem cất cồn Sử dụng bộ cất cồn phòng thí

nghiệm Salleron Dujardin của Pháp Thiết bị này cho phép ta biết được độ cồn thu

được trong dịch sau quá trình lên men qua nhiệt độ sôi của dịch

Quá trình cất cồn được thực hiện như sau:

- Làm sạch bình bằng nước cất

Trang 22

- Đo nhiệt độ sôi của nước cất để xác định điểm 0 trên bảng

- Tráng bình cất bằng bằng dung dịch mẫu sau đó cho 30 ml mẫu vào bình

chứa mẫu Đun bằng đèn cồn và kiểm tra nhiệt kế trên thiết bị phân tích, ghi lại

nhiệt độ sôi của mẫu

- Dựa vào nhiệt độ sôi của mẫu để xác định độ cồn tương ứng bằng bảng quy đổi

2.2.2.2 Phương pháp xác định độ pH

Dùng máy đo pH Mettler Toledo

2.2.2.3 Phương pháp xác định nồng độ đường khử bằng DNS

Tiến hành: Chuẩn bị dãy pha loãng để thu được hàm lượng đường phù hợp

cho phương pháp đo mật độ quang học của dung dịch màu có khả năng hấp phụ ánh

sáng

- Cho vào các eppendorf 0,3 ml đương chuẩn, sử dụng nước cất làm mẫu

blank

- Bổ sung vào các eppendorf 0,6 ml DNS, mix đều Phản ứng màu ở 100°C

trong 5 phút, làm lạnh nhanh bằng nước đá

- Lấy 0,4 ml dịch phản ứng + 1,8 ml nước cất, mix đều

- Đo OD 540 nm

Xây dựng đường chuẩn glucose:

- Chuẩn bị dung dịch glucoza: đường D-glucose (EU-G7) được sấy 105°C

trong 2 h Cân 0,5 g glucose hoà với 40 ml nước cất trong cốc thuỷ tinh, sau đó định

mức đến 50 ml thu được dung dịch stock 10 mg/ml (bảo quản -20°C)

- Chuẩn bị dãy pha loãng: 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2

Đường chuẩn thu được có phương trình:

Từ giá trị OD thu được, dựa vào đường chuẩn và nồng độ pha loãng có thể xác

định được hàm lượng đường có trong mẫu phân tích theo công thức:

Trong đó:

D: hệ số pha loãng

a, b: hệ số phương trình đường chuẩn D-Glucose

2.2.2.4 Phương pháp đánh giá khác biệt di truyền vi sinh vật bằng

Trang 23

- Tách chiết DNA: Tế bào được nuôi trong MT3 đối với nấm mốc, nấm men

và giả nấm men, nuôi trong môi trường MT4 đối với vi khuẩn Lấy tất cả sinh khối

tế bào cho vào Eppendorf vô trùng và thêm 750 µl SSC 2× vào mỗi ống Lắc đều và

đun ở 100°C trong 10 phút Ly tâm 12000 rpm trong 1 phút Hút bỏ phần dịch và

tiến hành rửa tế bào 2 lần bằng nước cất vô trùng Qua mỗi lần rửa ly tâm 12000

rpm trong 1 phút, loại bỏ dịch nổi Thêm 100 µl nước cất vô trùng, 100 µl hạt thủy

tinh, 150 µl dung dịch phenol/chlorofom (tỷ lệ 1:1), đặt vào máy phá tế bào trong 1

phút Đem ly tâm ở 12000 rpm trong 10 phút Lấy phần dịch trong phía trên có

chứa DNA, sau đó DNA được giữ ở -20°C

- Tinh chế DNA: Do DNA còn chứa nhiều chất ức chế PCR nên trước khi

dùng DNA làm khuôn cho phản ứng PCR, chúng tôi tiến hành tinh chế DNA bằng

Silica bead DNA Gel extraction Kit Hút 50 µl dịch trong chứa DNA cho vào

Eppendorf vô trùng Bổ sung 150 µl dung dịch Binding buffer có chứa Silica Đem

ly tâm ở 12000 rpm trong 2 phút Hút bỏ dịch do DNA đã bám trên bề mặt các hạt

thủy tinh Rửa 3 lần bằng Washing buffer Sau đó phơi khô rồi bổ sung 15 µl nước

cất vô trùng dùng cho PCR Ly tâm 12000 rpm trong 1 phút, DNA ở phần dịch nổi

là DNA đã được tinh chế DNA sau khi tinh chế có thể dùng làm khuôn cho phản

Tiếp theo mẫu được nhân lên bởi 35 chu kì liên tiếp với các bước: biến tính ở

94°C trong vòng 1 phút, gắn mồi ở 52°C trong vòng 1 phút và kéo dài ở 72°C trong

vòng 2 phút

- Các sản phẩm sau khi chạy PCR được điện di trên gel agarose 1 % với dung

dịch đệm là 0,5 × TAE Để chuẩn bị gel điện di, agarose 1 % được làm tan trong đệm

TAE Đợi nhiệt độ gel hạ xuống 60 - 70°C, đổ gel vào phiến nhựa điện di (kích

thước tùy theo số lượng mẫu cần điện di) được đặt thăng bằng trên mặt phẳng nằm

Formatted: Space Before: 0 pt

Formatted: Condensed by 0.2 pt

Trang 24

ngang đã đặt sẵn lược Để gel đông lại ở nhiệt độ phòng, gỡ bỏ lược, đặt bản gel vào

buồng điện di ngang sao cho bản gel chìm hẳn trong dung dịch đệm TAE Dùng

micropipette nhỏ các sản phẩm sau PCR vào các giếng của bản gel Nhỏ 3-5 µl mẫu

cho mỗi giếng Điện di với hiệu điện thế 50 V trong 20 phút sau đó chuyển sang

100V trong 25 phút

- Bản gel sau khi điện di được ngâm trong dung dịch Ethidium Bromide 0,5

µg/ml pha trong nước cất (trong 30 phút), sau đó vớt bản gel ra và rửa bằng nước

cất để loại bỏ Ethidium Bromide bám không đặc hiệu Sau khi rửa, các băng DNA

được quan sát bằng máy soi gel (Syngene)

2.2.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm

2.2.3.1 Phương pháp làm bánh men

- Gạo ngâm 8 giờ sau đó xay thành bột nước và lọc hỗn hợp lấy bột gạo ẩm

khoảng 50 – 55% Sau đó bột gạo được nhào trộn đều với các thành phần men

giống gốc và thuốc bắc Ủ bột 30 phút sau đó định hình thành dạng viên có đường

kính 3-4 cm, dày 1-2 cm, đặt vào các khay có lót trấu sạch và ủ trong thời gian thích

Khi bánh men nở xốp thì tiến hành hong khô trong điều kiện nhiệt độ thường Bánh

men thành phẩm được bảo quản trong điều kiện khô để dùng cho các thí nghiệm

tiếp theo

- Quy trình làm bánh men được thực hiện theo sơ đồ sau:

Xay nước Lọc bột

Phối trộn thành phần

Th

Ủ bột nhào (30’) Nặn bánh, xếp khay Đậy kín, ủ men (30˚, 40h) Phơi men

Formatted: Space Before: 0 pt, Line spacing: Multiple 1.2 li

Formatted: Space Before: 0 pt

Formatted: Font: 12 pt

Trang 25

Hình 2.1: Quy trình làm bánh men

2.2.3.2 Phương pháp lên men rượu sử dụng bánh men

- Chuẩn bị: gạo + nước theo tỷ lệ 1:1 vào bình schoot ngâm 2 giờ rồi hấp chín

121°C trong 15 phút, để nguội môi trường xuống 30 - 35°C, làm tơi trong điều kiện

vô trùng

hóa nên để nắp bình thoáng khí

- Sau khi đường hóa, bổ sung nước RO vô trùng theo tỉ lệ 1 gạo: 2 nước Bịt

kín miệng bình tạo điều kiện yếm khí, lên men 30ºC, trong 4 ngày

- Sau khi kết thúc quá trình lên men, dịch lên men được ly tâm xác định độ

cồn, pH, hàm lượng đường sót

- Quy trình lên men rượu được thực hiện theo sơ đồ sau:

Hình 2.2: Quy trình lên men

2.2.2.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc bắc tới chủng vi sinh vật

Chuẩn bị: Sử dụng hai công thức thuốc bắc CT1 bổ sung bài thuốc bắc này

vào trong môi trường MT3, MT4 với tỉ lệ 5% thuốc bắc, để trong các bình riêng,

Gạo + Nước (tỉ lệ 1:1)

Ngâm 4h Hấp (121°C, 30’)

Trang 26

hấp khử trùng 121°C trong 15 phút, để nguội xuống 60°C đổ ra các đĩa petri đã

đánh dấu tên các môi trường

Tiến hành:

- Đối với nấm mốc cấy 3 chấm trên môi trường MT3 có bổ sung thuốc bắc và

theo dõi sự phát triển của sau 40 h nuôi ở 30°C

- Đối với nấm men, giả nấm men chang trên môi trường MT3 có bổ sung

thuốc bắc và đếm số lượng khuẩn lạc trên đĩa sau 40 h nuôi ở 30°C

số lượng khuẩn lạc trên đĩa sau 40 h nuôi vi hiếu khí ở 37°C

Định dạng
Số trang	53
Dung lượng	5,62 MB