Nghiên cứu quy trình tách chiết hoạt chất sinh học INDOLE 3 CARBINOL từ một số loại rau họ cải ở việt nam

Việt Nam có tiềm năng sản xuất tạo nguồn nguyên liệu rau cải các loại dồi dào cho sản xuất hoạt chất Indole-3-carbinol, nhưng chúng ta còn thiếu những công nghệ phù hợp để tách chiết và

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TỪ MỘT SỐ LOẠI RAU HỌ CẢI Ở VIỆT NAM

Giáo viên hướng dẫn : TS Nguyễn Tất Thắng Sinh viên thực hiện : Phan Mạnh Tiến

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan toàn bộ kết quả trong khóa luận là do tôi trực tiếp thực hiện Các số liệu và kết quả được công bố trong khóa luận là hoàn toàn trung thực, chính xác và chưa được công bố ở bất kỳ công trình nào khác

Hà N ội, ngày 3 tháng 5 năm 2015 Sinh viên

Phan Mạnh Tiến

LỜI CẢM ƠN

Trước hết tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Tất Thắng- Viện cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch, cùng các Anh Chị, cán bộ ở Viện cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch là những người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài cũng như hoàn thành luận văn này

Tôi xin cảm ơn sự quan tâm, giúp đỡ của các thầy cô trong khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại Học Mở Hà Nội là những người thầy đã ân cần chỉ bảo cho tôi những bước đi đầu tiên trên con đường nghiên cứu khoa học và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Qua đây tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới gia đình, bạn bè, các anh chị cùng làm việc trong Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại Học Mở Hà Nội, đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Hà N ội, ngày 3 tháng 5 năm 2015

Phan Mạnh Tiến

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH ẢNH viii

PHẦN I: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích 2

1.3 Yêu cầu 2

1.4 Đối tượng nghiên cứu 2

1.5 Đóng góp mới của đề tài 2

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng hoạt chất sinh học Indole-3-carbinol trên thế giới 3

2.1.1 Cấu trúc hóa học và tính chất hóa lý 3

2.1.2 Phân bố trong tự nhiên 3

2.1.3 Tính chất dược lý có lợi cho sức khỏe của Indole-3-carbinol 4

2.1.4 Các sản phẩm Indole-3-carbinol thương mại và ứng dụng 5

2.1.5 Các phương pháp xác định Indole-3-carbinol 7

2.1.6 Tình hình nghiên cứu công nghệ tách chiết, thu nhận hoạt chất sinh học Indole-3-carbinol 8

2.2 Tình hình nghiên cứu về công nghệ tách chiết hợp chất sinh học ở Việt Nam11 2.3 Giới thiệu một số loại rau họ cải ở Việt Nam 13

2.3.1 Rau súp lơ xanh (Brassica oleraceae var italic Plenck) 14

2.3.2 Rau cải xanh (Brassica juncea) 15

2.3.3 Rau cải bắp (Brassica oleracea var Capitaca) 15

PHẦN III: VẬT LIỆU,NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

3.1 Vật liệu nghiên cứu 17

3.1.1 Vật liệu nghiên cứu 17

3.1.3 Dụng cụ 17

3.1.4 Hóa chất 17

3.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 17

3.3 Nội dung nghiên cứu 18

3.4 Phương pháp nghiên cứu 18

3.4.1 Sơ đồ quy trình công nghệ tách chiết hoạt chất sinh học Indole-3-carbinol18 3.5 Phương pháp bố trí thí nghiệm 20

3.5.1.Nghiên cứu lựa chọn rau nguyên liệu 20

3.5.2.Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố (loại dung môi, tỉ lệ dung môi/nguyên liệu, số lần trích ly) đến hiệu suất trích ly Indole-3-carbinol 20

3.5.3.Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố (pH môi trường, nhiệt độ, thời gian, tốc độ khuấy trộn) đến hiệu suất chuyển hóa glucosinolate thành Indole-3-carbinol 21

3.6 Phương pháp phân tích 22

3.6.1 Phương pháp thu nhận dịch chứa glucosinolate từ các mẫu rau nguyên liệu khô 22

3.6.2.Phương pháp thu nhận dịch chứa glucosinolate từ các mẫu rau nguyên liệu tươi 23

3.6.3 Phương pháp thu nhận dịch chiết chứa Indole-3-carbinol 23

3.6.4 Phương pháp sắc ký lớp mỏng 24

3.6.5 Xác định hiệu suất trích ly 24

3.6.6 Xác định hiệu suất chuyển hóa 24

3.6.7 Xác định hàm lượng glucobrassicin 24

3.6.8 Phương pháp xử lý số liệu 24

PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

4.1 Nghiên cứu lựa chọn rau nguyên liệu thích hợp cho tách chiết hoạt chất sinh học với hàm lượng cao 25

4.1.1 Ảnh hưởng của thời gian thu hoạch rau mầm cải ngọt đến hiệu suất trích ly Indole-3-carbinol 25

4.1.2.Ảnh hưởng của thời gian thu hoạch rau mầm cải bắp đến hiệu suất trích ly Indole-3-carbinol 26

4.1.3.Ảnh hưởng của thời gian thu hoạch rau mầm súp lơ đến hiệu suất trích ly Indole-3-carbinol 27

4.2 Nghiên cứu lựa chọn phương pháp tách chiết 28

4.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố (loại dung môi, tỉ lệ dung môi/nguyên liệu, số lần trích li,…) đến hàm lượng Indole-3-carbinol tạo thành và hiệu suất trích ly Indole-3-carbinol 28

4.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố (pH môi trường, nhiệt độ, thời gian, tốc độ khuấy trộn,…) đến hiệu suất trích ly Indole-3-carbinol 31

4.3 Xây dựng quy trình tách chiết, thu nhận Indole-3-carbinol quy mô phòng thí nghiệm 35

PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37

5.1 Kết luận 37

5.2 Kiến nghị 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

LLE Trích ly lỏng (Liquid - Liquid Extraction)

TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)

SPE Chiết pha rắn (Solid-Phase Extraction)

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần hóa học trong 100 gam rau súp lơ 14

Bảng 2.2 Thành phần hóa học trong 100 gam rau cải bắp 16

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của các loại dung môi đến hiệu suất trích ly Indole-3-carbinol 28

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi/nguyên liệu hàm lượng I3C tạo thành 30

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của số lần trích ly đến hiệu suất trích ly 30

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của pH môi trường đến hiệu suất chuyển hóa 31

glucosinolate thành Indole-3-carbinol 31

Bảng 4.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hiệu suất chuyển hóa 32

GLS thành Indole-3-carbinol 32

Bảng 4.6 Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hiệu suất chuyển hóa GLS 33

thành Indole-3-carbinol 33

Bảng 4.7 Ảnh hưởng của tốc độ khuấy trộn đến hàm lượng Indole-3-carbinol 34

tạo thành 34

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 2.1 Cơ chế hình thành Indole-3-carbinol 4 Hình 2.2 Rau súp lơ xanh 14 Hình 2.3.Rau cải xanh 15 Hình 4.1 Ảnh hưởng của thời gian thu hoạch đến hàm lượng glucosinolate trong rau mầm cải ngọt 25 Hình 4.2 Ảnh hưởng của thời gian thu hoạch đến hàm lượng glucosinolate trong mầm rau cải bắp 26 Hình 4.3 Ảnh hưởng của thời gian thu hoạch đến hàm lượng glucosinolate trong mầm rau súp lơ 27 Hình 4.4 Sắc ký đồ dịch chiết I3C từ rau mầm cải bắp 29 Hình 4.5 Sắc ký đồ dịch chiết I3C từ cải bắp trưởng thành 29 Hình 4.6 Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hiệu suất chuyển hóa GLS thành I3C ở rau mầm cải bắp 33 Hình 4.7 Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hiệu suất chuyển hóa GLS thành I3C ở cải bắp trưởng thành 33

PHẦN I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Indole-3-carbinole (I3C) là một sản phẩm thủy phân từ glucobrassicin glucosinolate có trong nhiều loại vật liệu nguồn gốc thực vật bao gồm các thành

viên của họ rau thập tự (Cruciferae) và đặc biệt là thành viên của chi cải bắp (Brassica), bất cứ khi nào chúng bị nghiền nát hoặc nấu chín Môi trường axit của ruột rất dễ dàng biến đổi I3C thành một loạt các hợp chất indolic đa thơm có rất nhiều các hiệu ứng sinh lý quan trọng sau khi ăn những thực phẩm này

Các hợp chất ngăn ngừa ung thư được coi là quan trọng nhất vì tính chất cảm ứng enzyme và ức chế gây đột biến, gây ung thư và đặc biệt là tính chống lại một loạt các tác nhân gây ung thư Tại thời điểm hiện nay, có vẻ như I3C có tiềm năng lớn như là một chất chống ung thư dự phòng tự nhiên chống lại khối u phổ biến nhất định, đặc biệt là khi mà chế độ ăn hiện đại đang ngày càng thiếu các chất hoạt chất sinh học có lợi cho sức khỏe có nguồn gốc từ thực vật

Việc sản xuất Indole-3-carbinol theo phương pháp tổng hợp hóa học không những tốn kém và tốn thời gian, mà còn đỏi hỏi phải có một số chất có độc tính cao

và sản phẩm phản ứng cuối cùng đòi hỏi kĩ thuật tinh chế phức tạp Những khó khăn này đã hạn chế việc sản xuất và sử dụng Indole-3-carbinol tổng hợp hóa học trong công nghiệp thực phẩm và y dược Do đó hoạt chất sinh học này đến nay vẫn chủ yếu được sản xuất từ nguồn nguyên liệu là các loại rau họ cải

Việt Nam có tiềm năng sản xuất tạo nguồn nguyên liệu rau cải các loại dồi dào cho sản xuất hoạt chất Indole-3-carbinol, nhưng chúng ta còn thiếu những công nghệ phù hợp để tách chiết và thu nhận hoạt chất này, vì vậy việc nghiên cứu quy trình công nghệ tách chiết hoạt chất sinh học Indole-3-carbinol là một đề tài cấp thiết và có tính ứng dụng cao

Xuất phát từ vấn đề nêu trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu quy trình tách chi ết hoạt chất sinh học Indole-3-carbinol từ một số loại rau họ cải ở

Vi ệt Nam”

1.2 Mục đích

Nghiên cứu quy trình công nghệ tách chiết hoạt chất sinh học Indole-3-carbinol

từ một số loại rau họ cải ở Việt Nam

Indole-3-1.4 Đối tượng nghiên cứu

-Đối tượng nghiên cứu: Hoạt chất sinh học Indole-3-carbinol tách chiết từ một

số loại rau họ cải của Việt Nam: súp lơ xanh, cải xanh, cải bắp

- Địa điểm nghiên cứu: Tại Trung tâm nghiên cứu và kiểm tra chất lượng nông sản thực phẩm - Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch

1.5 Đóng góp mới của đề tài

- Về lý luận: Đề tài cung cấp cơ sở, số liệu khoa học về đặc tính, hàm lượng, kỹ thuật tách chiết, thu hồi với hàm lượng cao hoạt chất Indole-3-carbinol trong rau họ cải ở Việt Nam

- Về thực tiễn: Góp phần tạo ra được sản phẩm có tính hàng hóa, có khả năng chuyển giao công nghệ và áp dụng kết quả vào sản xuất Tạo ra giá trị mới cho ngành rau Việt Nam

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng hoạt chất sinh học Indole-3-carbinol trên thế giới

2.1.1 Cấu trúc hóa học và tính chất hóa lý

- Tên gọi

I3C, 3-Indolylcarbinol, 1H-Indole-3-methanol, 3-Hydroxymethyl Indole, 3 Hydroxymethyl Indole, I3C, Indole 3 Carbinol, 3-(hydroxymethyl), 3-(hydroxyméthyl), 3 (hydroxymethyl) Indole, 3 Indolylcarbinol, 3-Indolylmethanol,

3 Indolylmethanol, Indol-3-Carbinol, Indole, Indole 3 Carbinol, Indole-3-methanol, Indole-3-méthanol

- Cấu trúc

- Số đăng ký CAS:700-06-1

- Công thức hóa học: C9H9NO

- Khối lượng phân tử trung bình: 147.17

- Nhiệt độ chảy mềm: 96-99o

C

- Trạng thái vật lý: Bột màu trắng

- Tính chất: Hòa tan ít trong nước lạnh, tan nhiều trong nhiều dung môi hữu

cơ như ethanol, methanol, dimethyl sulfoxide (DMSO), chloroform,

2.1.2 Phân bố trong tự nhiên

Indole-3-carbinol là thành phần tự nhiên có trong những loại rau họ cải

(Brassica) như cảibắp, bông cải xanh, súp lơ, rau cải Brussels Nồng độ I3C và tiền chất (glucosinolate indolic) tập trung trong cải bắp Trung Quốc cao hơn so với trong cải mù tạt [18]

N

H

Myrosinase

I3C cũng có ảnh hưởng kháng ung thư đối với một số loại ung thư khác như trên mô gan và có thể giảm những khối u gây ra do benzolpyrene ở dạ dày [9] Trong một nghiên cứu khác cũng đã khảo sát ảnh hưởng của I3C đối với những tế bào ung thư tiền liệt tuyến Từ những kết quả thu được, các tác giả đã kết luận rằng I3C có thể ức chế được sự sinh trưởng của những tế bào ung thư tiền liệt tuyến PC-

3 bằng cách gây ra sự ngăn chặn chu trình tế bào G1 dẫn đến tiêu diệt và điều khiển

sự biểu hiện của gen liên quan đến tiêu diệt tế bào Những kết quả này cho thấy rằng I3C là một chất phòng và chữa bệnh hiệu quả đối với ung thư tiền liệt tuyến [10]

2.1.3.2 Tính chất đối kháng estrogen

I3C được cho là có hoạt tính đối kháng estrogen khi được bổ sung vào khẩu phần ăn hằng ngày Ví dụ ở cả nam và nữ được bổ sung 500mg I3C hằng ngày trong 1 tuần liên tục sẽ tăng xấp xỉ 50% hàm lượng estradiol 2-hydroxylation [11] I3C cũng làm tăng mức độ hoạt động của estradiol hydroxylation ở những con chuột cái [12] Trong một số cơ thể thì I3C làm giảm sự phát triển của kháng estrogen Chẳng hạn như, sử dụng I3C 50µM I3C trong thời gian dài (lên đến 6 tuần) sẽ ngăn chặn sự tăng nhanh của tế bào ung thư vú ở người do MCF7 gây ra bởi estradiol [13]

2.1.3.3 Tác dụng phòng chống vi khuẩn Helicobacter pylori

Các nhà khoa học trên thế giới đã xác định rằng tất cả các isothiocyanates làm từ glucosinolate trong các loại rau (đặc biệt là I3C) giúp bảo vệ sức khỏe của niêm mạc dạ dày bằng cách giúp ngăn ngừa phát triển quá mức của vi khuẩn

Helicobacter pylori hay vấn đề do phát triển quá mức của vi khuẩn này hay quá nhiều loại vi khuẩn này bám vào dạ dày Đặc biệt, mầm bông cải xanh xuất hiện có

tính chất hỗ trợ bảo vệ dạ dày trước sự tấn công của vi khuẩn Helicobacter pylori

- Trình bày chủ yếu ở dạng viên nang;

- Được trích ly chủ yếu từ cây bông cải xanh;

- Giá bán khá cao so với nhiều loại thực phẩm chức năng khác

2.1.4.2 Gi ới thiệu một số sản phẩm cụ thể

Hãng sản xuất: Vitacost Tên sản phẩm: Indole-3-carbinol Hộp: 120 viên nang

Giá bán: $18.95

Mô tả chủ yếu:

- Vitacost Indole-3-carbinol (I3C)

- Cao Broccoli 200 mg/ viên Hãng sản xuất: Solaray Tên sản phẩm: Indole-3-carbinol Hộp: 30 viên nén

Giá bán: $14.19

Mô tả chủ yếu: Indole-3-carbinol - 25 mg Hãng sản xuất: Provita Nutrition (Canada) Tên sản phẩm: Super Indole-3-carbinol Hộp: 30 viên nén

Giá bán: $22.99USD Mỗi viên chứa 200 mg I3C

Mô tả chủ yếu:

- Tiền mãn kinh, mãn kinh, dư thừa estrogen

- Rối loạn chức năng tuyến tiền liệt (viêm tuyến tiền liệt)

- Thể hiện có đặc tính chống ung thư

- Giúp bảo vệ chống lại tất cả các loại ung thư

2.1.5 Các phương pháp xác định Indole-3-carbinol

Do tầm quan trọng của hoạt chất này, các phương pháp khác nhau bao gồm sắc ký khí (GC), sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) đã được sử dụng để phân tích các sản phẩm phân giải từ glucosinolate indolic trong các loại rau họ cải [14,15] Tuy nhiên, phương pháp GC và GC/MS đòi hỏi một bước phương sai khó khăn mà không cung cấp kết quả chính xác một

phần do độ nhạy không cao Anderton et al đã báo cáo một quy trình phân tích để

phát hiện I3C trong huyết tương với HPLC kết hợp phát hiện bằng UV [16] Tuy nhiên, phương pháp này tốn thời gian hoặc sử dụng giao thức khai thác mất thời gian trong phát hiện các vết I3C trong mẫu rau họ cải

Một chiến lược chung để khắc phục nhược điểm này liên quan đến việc sử dụng các kỹ thuật phát hiện có tính chọn lọc cao và nhạy như phương pháp phát hiện huỳnh quang cùng với HPLC [17] Nghiên cứu của Lee và cs (2010) đã đi theo hướng này và thiết kế một phương pháp đơn giản, nhạy chính xác để xác định đồng thời I3C và I3A (Indole-3-acetonitrile) trong rau cải bắp bằng HPLC với đầu dò huỳnh quang [18] Cây cải bốn mươi ngày tuổi và bắp cải Trung Quốc sáu mươi ngày tuổi được sử dụng Các lá non (~20 g) sau khi cắt ngay lập tức chuyển đông lạnh trong nitơ lỏng, và đông khô Chất chuẩn I3C được mua từ Sigma Chemical Co (St Louis, MO) Mẫu (50 mg) được để cho tự phân giải với 10 mM đệm phosphat (pH 7,4) là 0,8 ml nhờ ủ ở 37oC trong 3 giờ có trộn lắc 500 rpm bằng thermomixer Sau khi tự phân giải, dịch thô được ly tâm ở 15.300 vòng tại 4oC trong 5 phút và phần nổi được chuyển tới một ống mới và sau đó làm khô trong một máy cô đặc ly tâm Phần còn lại được chiết hai lần với 500µL ethyl acetate Phần ethyl acetate được làm khô bằng khí nitơ và phần còn lại được hòa tan trong 1 ml ethanol Để loại bỏ các tạp chất và làm giàu hợp chất, chất chiết xuất thô được chuyển qua một màng lọc 0,22 mm (Teflon PTFE) trước khi tiến hành phân tích HPLC Đối với các phân tích định lượng, các chất chiết xuất đã được tách ra trên cột đối xứng RP18 (250 mm x 4,6 mm, 5 mm) sử dụng một hệ thống HPLC được trang bị detector huỳnh quang

Các hợp chất đã được phát hiện dựa trên λex/ λem tại 280/364 nm Các profile rửa giải thu được từ phân tích HPLC được tối ưu hóa về thời gian chạy và độ phân

giải sắc ký của I3C Cột nhiệt độ lò được đặt ở 40oC và 10µL phần được tiêm vào cột Pha động bao gồm acetonitrile - nước và chất tan được tách rửa bằng cách sử dụng tốc độ dòng chảy 1,0 ml / phút và một chương trình gradient ổn định bắt đầu

từ 15% acetonitrile tại 0 phút Điều này đã được thực hiện tới 60% acetonitrile trong

20 phút tiếp theo, tăng đến 65% acetonitrile từ 20 đến 40 phút, đạt 85% acetonitrile lúc cuối cùng của 65 phút Dung dịch gốc được chuẩn bị với 10 mg I3C được hòa tan và pha loãng đến 100 ml methanol có chứa 4-methoxy-indol (100µg/mL) Đường chuẩn cho I3C được chuẩn bị bằng cách pha loãng các dung dịch gốc với methanol có chứa 4-methoxy-indol với nồng độ sau: 0.015, 0.03, 0.06, 0.12, 0.25, 0.5 và 1.0µg/mL

Tóm lại, phương pháp HPLC sử dụng một detector huỳnh quang được mô tả

trong nghiên cứu của Lee et al đã được chứng minh là có hiệu quả cao để định

lượng I3C (I3A), các sản phẩm phân hủy glucosinolate trong rau cải bắp Phương pháp được đánh giá là nhạy và chính xác và đòi hỏi khối lượng mẫu thấp Vì vậy, việc phát hiện HPLC/huỳnh quang là nhanh, tuyến tính, lặp lại tốt, cụ thể, chính xác

và khả năng phân tích một số lượng lớn các mẫu mà không chuẩn bị mẫu phức tạp

2.1.6 Tình hình nghiên cứu công nghệ tách chiết, thu nhận hoạt chất sinh học Indole-3-carbinol

2.1.6.1 Trích ly b ằng dung môi

a) Trích ly lỏng-lỏng (LLE = Liquid - Liquid Extraction):

Độ tan của các hoạt chất bị chi phối bởi bản chất hóa học tự nhiên của chúng trong vật liệu thực vật, từ đơn giản đến các polymer cao phân tử Thực vật có thể chứa nhiều chất với hàm lượng khác nhau, trong đó có Indole-3-carbinol, các axit phenolic, phenylpropanoid, anthocyanin, tannin và một số hợp chất khác Các hợp chất có thể tương tác với các thành phần thực vật khác như carbonhydrate, protein

để hình thành các tổ hợp có độ hòa tan thấp Tương tự như vậy, độ hòa tan của các hợp chất Indole-3-carbinol bị ảnh hưởng bởi sự phân cực của dung môi Vì vậy, rất khó khăn để phát triển một quy trình khai thác thích hợp cho Indole-3-carbinol Các bước bổ sung cần được sử dụng để loại bỏ các hợp chất không mong muốn như như polyphenol, sáp, tecpen, chất béo và chlorophyll Trong bất kỳ trường hợp nào, LLE

vẫn được sử dụng như một bước tiền xử lý tiêu chuẩn cho chiết tách các hợp chất trong nước bởi vì nó là một phương pháp rẻ và dễ dàng

b) Chiết pha rắn (SPE = Solid-Phase Extraction):

Chiết pha rắn là một kỹ thuật ngày càng hữu ích, mặc dù chi phí các thiết bị cần thiết cho SPE là cao hơn so với LLE Tuy nhiên phương pháp này khắc phục được một số nhược điểm của phương pháp LLE như sự phân ly không hoàn toàn, hiệu suất thu hồi thấp, sử dụng nhiều dung môi độc hại với chi phí lớn Công nghệ này được sử dụng thường xuyên nhất để chuẩn bị các mẫu chất lỏng và chiết phân tích các chất bay hơi và bán bay hơi, nó cũng có thể sử dụng với chất rắn được tách trước khi chuyển vào dung môi

2.1.6.2 Công ngh ệ và thiết bị trích ly bằng dung môi có hỗ trợ bằng sóng siêu âm

a) Nguyên lý tác động của sóng siêu âm

Hiệu quả trích ly các hợp chất hòa tan tăng lên nhờ sự tạo thành các bọt khí trong dung môi khi sóng truyền qua Dưới tác dụng của sóng, các bọt khí bị kéo nén, sự tăng áp suất và nhiệt độ làm các bọt khí nổ vỡ, tạo nên hiện tượng “sốc sóng” Khi sự nổ vỡ của các bọt khí ở gần bề mặt pha rắn, xảy ra mất đối xứng sinh

ra các tia dung môi có tốc độ cao vào thành tế bào, do đó làm tăng sự xâm nhập của dung môi vào tế bào và làm tăng bề mặt tiếp xúc giữa pha rắn và lỏng Điều này làm tăng sự chuyển khối và phá vỡ cấu trúc tế bào Sự nổ vỡ của các bọt khí làm tăng sự thoát của các chất nội bào vào dung dịch Nguyên tắc phá vỡ cấu trúc tế bào bằng siêu âm dựa trên hiệu ứng lỗ hổng khí chuyển năng lượng âm thanh thành năng lượng cơ học dưới dạng sóng xung có áp lực khoảng vài nghìn atm (300MPa) Năng lượng này làm tan rã tế bào khi động năng của nó lớn hơn độ bền của màng tế bào Ngoài ra, gradient vận tốc rất lớn làm gia tăng quá trình phá vỡ và cắt đứt tế bào

Những tác dụng chính của siêu âm trong các quy trình chế biến:

-Tăng mạnh tính thẩm thấu của dung môi chiết suất

-Làm tăng diện tích tiếp xúc giữa hai pha bằng cách phân tán chúng thành những hạt nhỏ

-Tăng cường sự xáo trộn của hỗn hợp (thay cho kỹ thuật khuấy trộn)

- Có tác dụng làm nóng cục bộ nên tăng tính hòa tan của dung môi

- Tăng tốc độ của các phản ứng hóa học

- Làm sạch và khử khí trong chất lỏng

- Khử hoạt động của các vi sinh vật và enzyme

- Tăng tốc độ các quá trình chiết suất

b) Thiết bị tạo siêu âm

Hiện nay trên thế giới đã chế tạo các thiết bị siêu âm công suất từ 40W đến 75W với dải tần số làm việc từ 20kHz đến 10MHz Ngày nay các thiết bị siêu âm công suất lớn hàng chục kW để trích ly các sản phẩm sinh học qui mô lớn như Hielscher Ultrasonics của Đức từ năm 1999 đến nay sản xuất các mô đun đầu phát loại 1kW, 2kW, 4kW và 16kW, ứng dụng trong sản xuất các chế phẩm sinh học như chiết suất dầu Biodiesel công suất từ 200 đến 750 lít/h sử dụng đầu phát siêu âm 1kW (UIP 1000), 20 đến 70m3/h sử dụng 6 đầu phát loại 16kW (6 x UIP16000) [19] Hãng thiết bị siêu âm Branson của Mỹ đã chế tạo thiết bị sản xuất dầu sinh học

sử dụng sóng siêu âm quy mô công nghiệp cung cấp dầu trực tiếp cho tiêu dùng

Ở Ấn Độ đã ứng dụng rộng rãi công nghệ siêu âm để chiết xuất các hợp chất

tự nhiên như actemisin, chè xanh, thực vật, nghệ vàng… và thực nghiệm so sánh với phương pháp thông thường Các kết quả cho thấy chiết suất bằng sóng siêu âm

có nhiều ưu điểm hơn so với phương pháp thông thường như: nhiệt độ thấp, số lần chiết suất ít hơn nên tiết kiệm được dung môi, đặc biệt giảm 6 đến 20 lần so với chiết suất thông thường, tỷ lệ thu hồi cao hơn 5 đến 20%

2.1.6.3 Công ngh ệ tách chiết Indole-3-carbinol

Sắc ký ngược dòng tốc độ cao (HCCC) là một kỹ thuật tách chiết rất linh hoạt mà không đòi hỏi pha tĩnh rắn Chỉ đơn giản là dựa trên các phân vùng của một mẫu giữa hai pha của một hệ thống dung môi trộn lẫn Chất chiết thực vật thô hoặc các thành phần bán tinh khiết có thể được tách phân đoạn với vô số mẫu khác nhau,

từ vài mg đến nhiều gram Hệ thống dung môi nước và không chứa nước đều được

sử dụng và phân tách các hợp chất phân cực khác nhau đều có thể Kỹ thuật này là

bổ sung cho phương pháp sắc ký khác và tương thích với các hệ thống gradient

Zou et al (2005) đề xuất qui trình tách phân đoạn một số glucosinolate, nhất

là Indole-3-carbinol và hợp chất progoitrin Quy trình có 3 bước, trong hai bước đầu

glucosinolate bằng methanol Công đoạn thứ hai là tách và làm sạch glucosinolate bằng cột sắc ký trên giá thể alumina support Chỉ ở công đoạn ba mới là tách pha ngược bằng octadecyl (C18) giá thể silica để thu nhận được progoitrin [21]

Renuka Devi và Berla Thangam (2010) đã đề xuất cách chuẩn bị mẫu bắp cải

đỏ để trích ly I3C [22] Nguyên liệu thực vật được đông khô và sau đó ngâm với 80% methanol (4ml/g trọng lượng tươi ban đầu) và chiết trong vòng 18 giờ trước khi lọc Nguyên liệu thực vật được tái chiết suất hai lần với 80% methanol lạnh, 4 giờ mỗi lần Dịch lọc được kết hợp, cô ở áp suất giảm, ở 30oC để sẵn sàng cho sắc

ký cột Lượng glucosinolate thô tổng số này được tinh chế bằng sử dụng cột silica với pha động là dung môi ethyl acetate

2.2 Tình hình nghiên cứu về công nghệ tách chiết hợp chất sinh học ở Việt Nam

Trong nước hiện nay chưa có cơ sở sản xuất nào ứng dụng công nghệ trích ly bằng sóng siêu âm cho tách chiết các hoạt chất sinh học từ rau họ cải Một số nghiên cứu mới chỉ sử dụng công nghệ truyền thống (tách chiết bằng Soxhlet có sử dụng dung môi) cho tách chiết hoạt chất sinh học của mầm rau họ cải chỉ ứng dụng

ở trong các phòng thí nghiệm

TS Nguyễn Đình Lục và cộng sự (2010), Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch trong quá trình “Nghiên cứu thiết kế, chế tạo thiết bị siêu

âm công suất 1,5KW và ứng dụng trong làm sạch, chiết suất các hợp chất tự nhiên

từ củ họ gừng”, bước đầu đã thiết kế mẫu thiết bị phát siêu âm (ultrasonic generator) có dải tần số 20 ÷ 40 kHz, công suất 1,5KW và ứng dụng trong chiết suất hợp chất Curcumin từ củ nghệ vàng với cường độ 75W/1, tần số 25kHz và làm tăng hiệu suất (10-20%) và thời gian chiết suất giảm 4-5 lần [4]

Năm 2011, Nguyễn Đức Tiến và cộng sự, Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch bước đầu đã nghiên cứu khảo sát trích ly hoạt chất sinh học từ nấm Linh chi, nấm Hương, nấm Đầu khỉ bằng công nghệ sóng siêu âm và bằng công nghệ Soxhlet thông thường Kết quả cho thấy tiềm năng phát triển công nghệ sóng siêu âm cho trích ly có nhiều tính ưu việt hơn, nhưng do điều kiện nghiên cứu và thời gian có hạn nên kết quả nghiên cứu mới chỉ là bước đầu [5]

Vũ Thị Hiền (2012) trong quá trình nghiên cứu một số chất kháng oxy hóa trong rau mầm họ cải, bước đầu đã cho kết quả: Đã xác định được hàm lượng Glucosinolate trong 6 giống rau mầm họ cải (cải bắp trắng, cải củ trắng, cải bẹ vàng, cải xanh, cải chíp, cải ngọt) khi tiến hành thu hoạch ở các thời điểm khác nhau Hàm lượng Glucosinolate trong 5 giống rau mầm (cải củ trắng, cải bẹ vàng, cải xanh, cải chíp, cải ngọt) đều đạt giá trị cao nhất tại ngày thứ 3 (hàm lượng Glucosinolate dao động từ 7,02 - 57,61µmol sinigrin/ g chất khô) và rau mầm từ hạt cải bắp trắng cho hàm lượng Glucosinolate đạt cao nhất tại ngày thứ 2 (57,61µmol sinigrin/ g chất khô) Kết quả nghiên cứu còn cho thấy rau mầm trồng từ hạt cải bắp trắng so với rau mầm trồng từ hạt cải củ trắng, hạt cải chíp, hạt cải bẹ vàng, hạt cải ngọt, hạt cải xanh đều có hàm lượng Glucosinolate và khả năng kháng oxy hóa cao [1]

TS Trần Hữu Thị và cộng sự (2009), Viện Nghiên cứu Thực phẩm chức năng (Hội Khoa học và công nghệ thực phẩm Việt Nam), khi “Nghiên cứu thăm dò hoạt chất Glucosinolate nhóm Indole-3-carbinol trong một số loài súp lơ xanh (Brassica sp., Họ cải - Brassicaceae) ở Việt Nam” bước đầu cho kết quả: đã tìm thấy trong những loại cải này chứa hoạt chất quý giá có nhiều tác dụng đối với sức khỏe con người Hai hoạt chất quan trọng chứa lưu huỳnh được tìm thấy là Sulforaphane và Indol-3-carbinol với một tỷ lệ tương đối [26]

Năm 2007, TS Trần Hữu Thị cùng cộng sự, Viện Nghiên cứu Thực phẩm chức năng (Hội Khoa học và công nghệ thực phẩm Việt Nam) đã tách chiết và thu nhận được nhóm hoạt chất có lưu huỳnh chiết suất từ một số loại rau họ cải có tác dụng chống các chất oxy hóa trong cơ thể thông qua việc làm giảm hàm lượng Peroxit và Peroxitlipit cho người nghiện thuốc lá Hàm lượng Peroxit trong nước tiểu ở ngày đầu là 6,90 mM/ mL/ min; ngày thứ 30 là 5,79 mM/ mL/ min Hàm lượng Peroxit trong huyết tương: ngày đầu là 3,10 mM/ mL/ min; ngày thứ 30 là 1,28 mM/ mL/ min Trong cả nước tiểu lẫn huyết tương giá trị Peroxitlipit giảm ½,

đó là một trong những chỉ tiêu cho thấy tác dụng chống oxy hóa thành công của dịch chiết cải hoa, chống lại những gốc tự do, làm tăng hàm lượng các chất chống oxy hóa trong cơ thể Trong tất cả những người nghiện thuốc lá được nghiên cứu số

Tripeptide glutathione trong nước tiểu: ngày đầu là 1,29 và tăng lên 2,96 mM/mL ở ngày thứ 30 Còn trong huyết tương ngày đầu là 2,37 và ngày thứ 30 là 5,72 mm/mL [27]

Các nhà Khoa học của Viện Nghiên cứu Thực phẩm chức năng (Hội Khoa học và công nghệ thực phẩm Việt Nam) bước đầu cũng đã tạo ra được một số chế phẩm như Sulcuvina, Sulfovina, Sulfocream từ rau mầm họ cải Sulcuvina có khoảng 20% Sulforaphane có tác dụng làm sạch đường tiêu hóa, hỗ trợ phòng

chống viêm loét dạ dày, tá tràng do nhiễm vi khuẩn H pylori, phòng ngừa ung thư

dạ dày, phòng chống ung thư tuyến tiền liệt, đặc biệt phòng chống việc thoái hóa hoàng điểm, rất tốt cho lứa tuổi trung niên Sulfovina có khoảng 10% Sulforaphane thiên về việc phòng chống ung thư tuyến tiền liệt, chống các tác động của bức xạ, đực biệt là tia cực tím đối với mắt, chống sự lão hóa hoàng điểm - nguyên nhân chủ yếu gây mù lòa ở người cao tuổi Sulfocream có 0,5% Sulforaphane là loại kem xoa (mỹ phẩm), không có tác dụng phụ, chống ung thư da,làm đẹp da

2.3 Giới thiệu một số loại rau họ cải ở Việt Nam

Theo Cục Trồng trọt, diện tích trồng rau cả nước đến cuối năm 2012 đạt hơn 823.000ha, năng suất 17 tấn/ha, sản lượng khoảng 14 triệu tấn, trong đó diện tích rau miền Nam đạt 466.000ha, năng suất 17,8 tấn/ha, sản lượng 8,3 triệu tấn, diện tích rau miền Bắc ước đạt 357.000ha, năng suất 16 tấn/ha, sản lượng 5,7 triệu tấn Những năm gần đây đã hình thành được một số vùng trồng rau tập trung như:

- Vùng trồng cải bắp: Lâm Đồng, Hà Nội, Hải Phòng, Hải Dương, Hưng Yên

- Vùng trồng cà chua: Lâm Đồng, Hà Nội, Hải Phòng, Hưng Yên,…

Trong đó các loại rau họ cải như súp lơ xanh, cải xanh, cải bắp được trồng nhiều ở một số địa phương trong cả nước như Hà Nội, Vĩnh Phúc, Lào Cai, Lâm Đồng,…

2.3.1 Rau súp lơ xanh (Brassica oleraceae var italic Plenck)

Hình 2.2 Rau súp l ơ xanh

Súp lơ xanh là cây rau thuộc họ thập tự (họ cải) có nguồn gốc từ bờ biển Địa Trung Hải, là loại rau có giá trị dinh dưỡng cao, được trồng nhiều ở các quốc gia trên thế giới Bộ phận sử dụng làm thực phẩm ở súp lơ là toàn bộ phần hoa chưa nở Súp lơ được dùng để ăn sống, nấu canh, xào và muối chua, đóng hộp, trộn với các loại rau khác Thành phần chủ yếu trong súp lơ là nước 90,9%; protein 2,5%; gluxit 4,9% và các chất khoáng Canxi 26mg%; Photpho 51,0mg%; Sắt 1,4mg% cùng các vitamin B1 0,11mg%; B2 0,1mg%; PP 0,6mg%; vitamin C 70mg%; carotene 0,05mg% [24] Các giống súp lơ xanh hiện nay đang được trồng phổ biến ở nước ta bao gồm giống: Súp lơ xanh của Nhật Bản, súp lơ xanh B15 (nhập từ Hàn Quốc), F1 ROCK (BR2)…

Bảng 2.1 Thành phần hóa học trong 100 gam rau súp lơ

2.3.2 Rau cải xanh (Brassica juncea)

Hình 2.3.Rau c ải xanh

Cây cải xanh có thể dùng để nấu canh, luộc, xào và muối dưa, v.v Cây cải xanh được trồng rất phổ biến ở các vùng, trồng gần như quanh năm Các giống cải xanh ở nước ta gồm nhiều giống địa phương như: cải xanh lá vàng, cải xanh Thanh Mai, Vĩnh Tuy, Thừa Thiên Huế, cải xanh ngọt Cx1, cải ngọt số 4 và nhiều địa phương khác Qua nhiều năm thuần chủng nên rất dễ trồng và tự để giống tại địa

nhập nội từ Nhật Bản, Trung Quốc và một số giống địa phương ở Miền Bắc như giống: Sapa, CB26, F1 K.K.CROSS, CB1, F1 BC310,…

Bảng 2.2 Thành phần hóa học trong 100 gam rau cải bắp

PHẦN III: VẬT LIỆU,NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu nghiên cứu

3.1.1 Vật liệu nghiên cứu

- Rau mầm cải ngọt: giống CH305

- Rau mầm súp lơ xanh và rau trưởng thành thời kỳ hoa nụ: giống CH303

- Rau mầm cải bắp và rau cải bắp trưởng thành: giống KK-CROSS

3.1.2 Thiết bị

- Cân phân tích AR2140 với độ chính xác 0.001g

- Máy li tâm thường HERMILE Z2400K

- Máy cô quay chân không Rotavapor R-200

- Máy đo pH Mettler Toledo Seven Easy S20 (Độ chính xác 0,01)

- Tủ sấytự động ổn định nhiệt độ Memmert

- Tủ đông khô MODULYO – D

- Máy siêu âm Sonic vibra cell

- Các bình tam giác, ống đong,bình định mức

- Các ống thí nghiệm,đũa thủy tinh,giấy lọc,…

3.1.4 Hóa chất

- Hóa chất phân tích: Natri chlorua (NaCl), Natri sulfat khan (Na2SO4), Natri

hidroxit (NaOH), Axit clohydric (HCl)

- Các loại dung môi: Ethanol (C2H5OH) Methanol (CH3OH); Ethyl acetace

(C3H8O2); n Hexan (C6H14); Diclomethane (CH2Cl2)

- Các loại thuốc thử: Thuốc thử Mayer, Thuốc thử Bouchardat

- Các chất chuẩn: Chuẩn indole-3-carbinol

3.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian nghiên cứu:Nghiên cứu từ tháng 10/2014 đến tháng 05/2015

- Địa điểm nghiên cứu:Được thực hiện tại Trung tâm Nghiên cứu và kiểm tra chất lượng nông sản thực phẩm, Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch