Tinh chế protein dung hợp SUMO INTERLEUKIN 11 người tái tổ hợp được biểu hiện trong chủng ESCHERICHIA COLI

Trong đó, nghiên cứu tinh chế protein dung hợp SUMO Interleukin-11 người tái tổ hợp được biểu hiện trong Escherichia coli là một trong những nội dung quan trọng đối với nghiên cứu sản xu

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

    

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TINH CHẾ PROTEIN DUNG HỢP SUMO INTERLEUKIN-11 NGƯỜI TÁI TỔ HỢP ĐƯỢC BIỂU HIỆN TRONG CHỦNG

ESCHERICHIA COLI

Cán bộ hướng dẫn : TS Lê Thị Thu Hồng Sinh viên thực hiện : Phùng Thị Trang Lớp : 11-04

Hà Nội - 2015

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin được bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến những người đã hướng dẫn, giúp đỡ tận tình em hoàn thành luận văn này:

TS Lê Thị Thu Hồng, phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh học

đã hướng dẫn và hỗ trợ tận tình, truyền đạt kiến thức, nhưng kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp Nội dung của khóa luận này là một phần nội dung của đề tài khoa học công nghệ cấp nhà nước “Nghiên cứu sản xuất Interleukin-3 và Interleukin-11 tái tổ hợp chất lượng cao dùng trong y học (điều trị)” do GS.TS Trương Nam Hai làm chủ nhiệm

Với những tình cảm chân thành, em cũng xin được cảm ơn sự hướng dẫn và giúp đỡ của toàn thể cán bộ phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh học, đặc biệt ThS Dương Thu Hương, NCS Nguyễn Thị Quý và KS Đặng Thị Ngọc

Hà, những người đã hướng dẫn, hỗ trợ và chỉ bảo nhiệt tình về chuyên môn và kĩ năng trong suốt quá trình em hoàn thành khóa luận

Em cũng xin được bày tỏ sự biết ơn đối với các thầy cô giáo trong Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại Học Mở Hà Nội đã truyền đạt cho em những kiến thức quý báu và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt bốn năm học tập tại trường

Lời cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn cha mẹ, những người thân trong gia đình, những bạn bè thân thiết, những người đã giúp đỡ, ủng hộ em trong suốt thời gian học tập và làm việc vừa qua

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2015

Sinh viên

Phùng Thị Trang

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH MỤC CÁC BẢNG iv

DANH MỤC CÁC HÌNH v

MỞ ĐẦU 1

PHẦN 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Interleukin 11 3

1.1.1 Giới thiệu chung 3

1.1.2 Đặc tính phân tử và cấu trúc của Interleukin 11 3

1.1.3 Vai trò và ứng dụng của IL-11 5

1.1.4 Tình hình nghiên cứu trong nước 6

1.2 Hệ biểu hiện E coli 6

1.2.1 Chủng biểu hiện E coli 8

1.2.2 Vector biểu hiện trong E coli 9

1.2.3 Kỹ thuật cải thiện sự biểu hiện protein tái tổ hợp 10

1.3 Các kỹ thuật tinh chế protein 12

1.3.1 Kỹ thuật tinh chế protein bằng tủa muối 12

1.3.2 Kỹ thuật tinh chế protein bằng sắc ký ái lực 13

1.3.3 Kỹ thuật tinh chế protein bằng sắc ký trao đổi ion 15

1.3.4 Kỹ thuật tinh chế protein bằng sắc lý lọc gel 15

PHẦN 2 VẬT LIỆU, VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 17

2.1.1 Các chủng vi sinh vật và plasmid 17

2.1.2 Hóa chất và enzyme 17

2.1.3 Các môi trường và dung dịch 17

2.2 Phương pháp nghiên cứu 19

2.2.1 Biến nạp ADN plasmid vào tế bào E coli tái tổ hợp bằng sốc nhiệt 19

2.2.2 Cảm ứng biểu hiện protein tái tổ hợp 20

2.2.3 Phương pháp siêu âm phá tế bào E coli tái tổ hợp 21

2.2.4 Phương pháp tinh chế bằng sắc kí ái lực 22

2.2.5 Phương pháp tinh chế bằng tủa phân đoạn (NH4)2SO4. 22

2.2.6 Điện di protein trên gel Polyacrylamide 23

2.2.7 Phương pháp lai Western blot 24

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

3.1 Biểu hiện SUMO_IL-11 trong chủng E coli Rosetta2 26

3.1.1 Tạo chủng E coli Rosetta2 mang vector biểu hiện pESUMO_il-11 26

3.1.2 Biểu hiện SUMO_IL-11 tái tổ hợp trong chủng E coli R2 27

3.2 Tách chiết SUMO_IL-11 tái tổ hợp từ tế bào E coli 30

3.3 Tinh sạch protein tái tổ hợp SUMO_IL-11 33

3.3.1 Tinh sạch protein tái tổ hợp SUMO_IL-11 bằng sắc ký ái lực 33

3.3.2 Tiếp tục tinh sạch SUMO_IL-11 bằng tủa phân đoạn muối (NH4)2SO4 40

PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42

4.1 Kết luận 42

4.2 Kiến nghị 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Axit deoxyribo nucleic

APS Amonium persulphate

Amp Ampicillin

Bp Base pair

EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid

E coli Escherichia coli

TEMED N, N, N’, N’ – tetramethyl ethylendiamine

dNTP 2’ – deoxyribonucleoside – 5’triphosphate

IL-11 Interleukin-11

IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

kDa Kilo Dalton

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulphate-PolyAcrylamid Gel Electrophoresis

OD Optical density

PBS Phosphate buffer saline

LB Môi trường Luria-Bertani

LBA Môi trường LB có bổ sung Amp

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 Một số chủng E coli thường được sử dụng nhất để biểu hiện protein ngoại

lai và những đặc điểm chính của chúng [12] 9

Bảng 2 Thành phần gel điện di biến tính SDS-PAGE 18

DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1 Mô phỏng cấu trúc không gian của IL-11 4

Hình 2: Đĩa biến nạp vector pESUMO_il-11vào tế bào E coli R2 26 Hình 3 SDS-PAGE kiểm tra kết quả biểu hiện SUMO_IL-11 trong tế bào E coli

ái lực 34

Hình 9 SDS-PAGE kiểm tra kết quả tinh sạch SUMO_IL-11 bằng sắc ký ái lực sử

dụng đệm đưa mẫu lên cột chứa 20 mM PBS, 300 mM NaCl 35

Hình 10 SDS-PAGE kiểm tra kết quả tinh sạch SUMO_IL-11 bằng sắc ký ái lực

sử dụng đệm đưa mẫu lên cột chứa 50 mM PBS, 500 mM NaCl 36

Hình 11 SDS-PAGE kiểm tra kết quả tinh sạch SUMO_IL-11 bằng sắc ký ái lực

MỞ ĐẦU

Các yếu tố tăng trưởng tạo máu có vai trò điều khiển và điều hòa quá trình tạo tế bào máu Chúng tham gia vào quá trình tăng sinh và biệt hóa, từ các tế bào tiền thân trong tủy xương đến khi hình thành các tế bào máu trưởng thành Với vai trò như vậy, các yếu tố tăng trưởng này rất hữu ích để ứng dụng trong hỗ trợ và điều trị các bệnh về máu Trong những năm gần đây, các bệnh về máu nói chung và đặc biệt là các bệnh của hệ thống tạo máu có xu hướng gia tăng mạnh mẽ Do đó, việc nghiên cứu vai trò cũng như khả năng ứng dụng của các yếu tố này trong hỗ trợ điều trị bệnh ngày càng được quan tâm

Interleukin-11 người có bản chất là protein được biết tới như một cytokine tạo máu Nó là yếu tố sinh trưởng đối với các tế bào nguồn của u tương bào, tế bào tạo máu tiềm năng, nguyên mẫu tiểu cầu, đại thực bào Sau đó, nó còn được biết có vai trò ức chế chứng phát phì với tiền tế bào mỡ Chính vì vậy, IL-11 còn có tên gọi khác là yếu tố ức chế chứng phát phì (AGIF) Ngoài ra, các nghiên cứu về tế bào học và mô học đã chỉ ra rằng IL-11 còn có hoạt tính bảo vệ và hồi phục màng nhày của hệ tiêu hóa Như vậy, nó có tác động như là tác nhân điều biến miễn dịch hay tham gia vào các hoạt động trao đổi chất trong xương

Công nghệ sinh học đang ngày càng phát triển, trong đó công nghệ DNA tái

tổ hợp có thể giúp tạo ra các sản phẩm ứng dụng trong điều trị IL-11 người tái tổ hợp (rhIL-11) là một trong số ít sản phẩm IL được cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ cấp phép cho sử dụng để điều trị trên người Tên thương mại được cấp phép cho loại rhIL-11 là NEUMEGA của công ty Wyeth và được chỉ định cho mục đích cảm ứng sinh tiểu cầu để bảo vệ bệnh nhân trước và sau hóa trị liệu Sinh phẩm này được cung cấp bởi một số hãng dược phẩm như Pfizer, Biocompare, Millipore…

Hiện nay, ở nước ta vẫn chưa sản xuất được IL-11 Các sản phẩm IL-11 đều phải nhập khẩu với chi phí rất đắt đỏ, do đó khó khăn trong việc chi trả kinh phí đối với nhiều đối tượng bệnh nhân Vì vậy, để chủ động nguồn nguyên liệu trong nước

và giảm giá thành sản phẩm IL-11, Viện Công nghệ sinh học đang được nhà nước đầu tư cho chủ trì đề tài “Nghiên cứu sản xuất Interleukin-3 và Interleukin-11 tái tổ

hợp chất lượng cao dùng trong y học (điều trị)” Trong đó, nghiên cứu tinh chế protein dung hợp SUMO Interleukin-11 người tái tổ hợp được biểu hiện trong

Escherichia coli là một trong những nội dung quan trọng đối với nghiên cứu sản xuất IL-11 tái tổ hợp trong hỗ trợ điều trị các bệnh về máu Tôi đã được hướng dẫn

thực hiện nội dung này cho khóa luận tốt nghiệp với tên đề tài khóa luận “Tinh chế

protein dung hợp SUMO Interleukin-11 người tái tổ hợp được biểu hiện trong

chủng Escherichia coli” Các thí nghiệm được tiến hành tại Phòng Kỹ thuật di

truyền – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp từ tháng 6 năm 2014 đến tháng 6 năm

2015

Mục tiêu của đề tài là tinh chế thành công protein dung hợp SUMO_IL-11

người tái tổ hợp trong tế bào vi khuẩn E coli, tạo cơ sở cho việc nghiên cứu sản

xuất IL-11 tái tổ hợp trong hỗ trợ điều trị các bệnh về máu

PHẦN 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Interleukin 11

1.1.1 Giới thiệu chung

Nhóm Interleukin – IL với chức năng điều hòa các phản ứng miễn dịch phức tạp bao gồm sự tăng sinh, trưởng thành, di chuyển và bám dính của tế bào Chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình biệt hoạt và hoạt hóa các tế bào miễn dịch, như các tế bào trong phản ứng viêm Khi được tạo ra, IL di chuyển ngay đến tế bào đích và bám vào các thụ thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào Sự tương tác này tạo nên một chuỗi các tín hiệu bên trong tế bào đích giúp thay đổi trạng thái tế bào

IL được xác định đầu tiên vào năm 1970, hiện nay đã phát hiện ra được 37 loại IL khác nhau [1] Nhóm này bao gồm IL-1 có chức năng hoạt hóa tế bào T; IL-

2 kích thích sự tăng sinh tế bào T được hoạt hóa bởi kháng nguyên và tế bào B; IFNγ hoạt hóa đại thực bào; còn IL-3, IL-11 thì có vai trò trong việc hoạt hóa quá trình tạo máu

IL-11 là một dạng cytokine, được tách triết đầu tiên vào năm 1990 từ tủy xương tế bào mô đệm Nó là một nhân tố quan trọng trong quá trình tạo máu, đặc biệt là sự kích thích sự trưởng thành của megakaryocyte [2] Ngoài ra nó còn được biết tới như một yếu tố hòa tan với sự tham gia của chất cảm ứng IL-1α trên dòng tế bào đệm tủy xương, PU-34 IL-11 giúp quá trình nuôi cấy tế bào [3] và giúp kích thích sự tăng trưởng của tế bào trong tủy xương và sự trưởng thành của tiểu cầu (một loại tế bào giúp cho máu đông lại sau chấn thương đã xảy ra)[4]

1.1.2 Đặc tính phân tử và cấu trúc của Interleukin 11

Trong cơ thể người, gen hoàn chỉnh mã hóa cho IL-11 có kích thước khoảng

7 kb, định vị trên cánh dài của nhiễm sắc thể số 19, tại vị trí 19q13.3-q13.4 Gen này chứa 5 vùng exon và 4 vùng intron [3] Một điểm khá đặc biệt là mặc dù IL-11

nằm trong họ của IL-6 nhưng trình tự DNA của gen il-11 lại không có sự tương

đồng ở cấp độ nucleotide [4]

IL-11 gắn vào thụ thể IL-11R thông qua việc hình thành một phức hợp

hexameric gồm hai phân tử il-11 và 130gp [6] Cảm ứng IL-11 biểu hiện mRNA có

thể được phát hiện trong các nguyên bào sợi, tế bào biểu mô, sụn, synoviocytes, tế bào sừng, tế bào nội mô, tế bào tạo xương và các tế bào khối u nhất định và các dòng tế bào [5]

IL-11 là một phân tử protein có mức độ ổn định cao trước điều kiện nhiệt độ mặc dù trong cấu trúc không tồn tại amino acid cystein nào Dạng tiền thân của protein IL-11 bao gồm 199 amino acid [2] Đoạn peptide tín hiệu gồm 21 amino acid sẽ được loại bỏ sau dịch mã để tạo nên dạng IL-11 trưởng thành có hoạt tính với 178 amino acid Mức độ tương đồng của IL-11 ở người với thỏ là 88%, với linh trưởng khác là 94% Các vị trí amino acid 59 (methionine), 42 (lysine) và 99 (lysine) là các vị trí cốt yếu để thụ thể có thể gắn kết với protein Cấu trúc không gian của IL-11 được mô phỏng cũng gồm 4 chuỗi xoắn A, B, C, D (hình 1) Tuy nhiên, không có vị trí nào của asparagine để hình thành cấu trúc glycosil hóa hay sự biến đổi sau dịch mã với sự gắn thêm của chuỗi carbonhydrate Hơn nữa, với thành phần amino acid gồm proline (12%), leucine (23%) và các amino acid tích điện dương khác (14%) làm điểm đẳng điện của protein có giá trị khác với các cytokine khác (pI = 11,7)

Hình 1 Mô phỏng cấu trúc không gian của IL-11

Trong cơ thể, IL-11 có thể được tiết ra bởi nhiều loại tế bào ở các mô khác nhau Về mức độ tiết cơ bản của IL-11 được phát hiện ở các tế bào như nguyên bào

sợi, tế bào biểu mô phổi, tế bào sụn, tế bào dịch khớp, tế bào sừng, tế bào nội mô, nguyên bào xương, một số dòng tế bào ung thư và một số tế bào khác

1.1.3 Vai trò và ứng dụng của IL-11

Với IL-11, đã có nhiều nghiên cứu không chỉ áp dụng sản phẩm này vào trong điều trị bệnh mà còn áp dụng vào trong nghiên cứu cơ bản để sáng tỏ các cơ chế hay những con đường tác dụng của IL trong cơ thể Những hướng nghiên cứu

ấy được tiến hành trên cả invitro và in vivo

Trong in vitro, các nghiên cứu đã chứng minh được rằng, sinh phẩm IL-11 có

thể tác động lên nhiều dạng tế bào khác nhau, bao gồm như các tế bào tạo máu, tế bào gan, tế bào mỡ, đại thực bào, tế bào biểu mô ruột, tế bào khối u, tế bào tạo xương và tế bào hủy xương [5] IL-11 có thể tác động kích thích sản xuất các protein pha cấp gan như IL-6 mà không ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp albumin; IL-11 có thể làm giảm bớt các sản phẩm trung gian tiền viêm do hoạt hóa lipopolysaccharide; IL-11 ức chế sự tổng hợp của IL-12 từ đại thực bào [6]; IL-11 làm giảm tốc độ sinh trưởng của dòng tế bào biểu mô ruột IEC-6 …

Trong nghiên cứu dược phẩm in vivo, dạng cytokine tạo máu này đã được

thử nghiệm trên nhiều mô hình hóa trị liệu hay mô hình ghép tủy xương nhằm xác định khả năng ứng dụng như là một yếu tố kích thích tạo tiểu cầu [7] Các kết quả thu được khi thử nghiệm trên chuột và khỉ đều khả quan về khả năng kích thích tạo tiểu cầu của IL-11 Chính vì vậy, năm 1997, sản phẩm Neumega đã được cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ (US Food and Drug Administration - FDA) cấp phép cho sử dụng để kiểm soát bệnh thiếu hụt tiểu cầu và giảm bớt nhu cầu về tiểu cầu trong quá trình truyền máu sau khi hóa trị liệu ức chế tủy đối với những bệnh nhân bị u tủy ác tính - những người có nguy cơ cao về sự thiếu hụt tiểu cầu [8] Hơn nữa, những nghiên cứu gần đây nhất còn xác nhận, IL-11 cũng có hiệu quả khi điều trị riêng rẽ hay hiệp đồng với G-CSF trên bệnh nhân bị bệnh máu trắng và các bệnh ung thư liên quan đến các tế bào máu

Cùng liên quan đến hệ tế bào tạo máu của cơ thể, nhiều công trình nghiên cứu còn cho rằng IL-3 và IL-11 còn có thể sử dụng phối hợp để tạo hiệu quả tốt nhất trong điều trị Nghiên cứu khi sử dụng đồng thời hai loại IL này trên chuột đã

chiếu xạ cho thấy, việc kết hợp điều trị bổ sung IL-3 với IL-11 làm khả năng sống sót của chuột tăng lên 97% khi so với lô chuột đối chứng [9] Hơn nữa bằng việc kiểm tra lượng bạch cầu, hồng cầu và tiểu cầu trong máu đã cho thấy, việc sử dụng phối hợp hai loại IL-3 và IL-11 còn giúp tăng cường khả năng hồi phục các loại tế bào trong máu Nghiên cứu khác còn xác định rằng, IL-11 được sự hiệp đồng từ IL-

3 có thể thúc đẩy trực tiếp quá trình phát triển nguyên mẫu tiểu cầu từ tế bào nguồn

ở giai đoạn sớm, trong điều kiện môi trường nuôi cấy [10]

1.1.4 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ung thư đang là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong ở nước

ta hiện nay Các bệnh về máu nói chung và đặc biệt là các bệnh của hệ thống tạo máu ngày càng có xu hướng gia tăng mạnh mẽ Nguyên nhân gia tăng các bệnh về máu có thể do ô nhiễm môi trường, hóa chất, các loại virus, các chất độc từ thời chiến tranh, đặc biệt là chất độc da cam đang phát tán hậu quả Điều đáng lo ngại là bệnh thường được phát hiện hầu hết ở các bệnh nhân còn trẻ ở lứa tuổi lao động và gây tỉ lệ tử vong cao Có rất nhiều các loại cytokine như IL-2, IL-3, IL-4, IL-7, IL-

11 hiện đang được sử dụng trong điều trị ung thư bằng liệu pháp miễn dịch như ung thư biểu mô thận, ung thư da ác tính, ung thư máu

Hiện nay, Việt Nam đã bắt đầu nghiên cứu và sản xuất các chế phẩm có nguồn gốc tái tổ hợp Viện Công nghệ sinh học là một trong những đơn vị đi đầu trong lĩnh vực này Với kinh nghiệm nghiên cứu và sản xuất thành công IL-2 từ trước, Viện Công nghệ sinh học đã tiếp tục nghiên cứu sản xuất IL-3 và IL-11 dưới dạng tái tổ hợp Bên cạnh đó, một số công ty như công ty vắc xin và sinh phẩm số 1, công ty vắc xin và sinh phẩm Nha Trang (BioPharco), công ty Nanogen đã sản xuất thành công một số dược phẩm có nguồn gốc protein tái tổ hợp như interferon alpha 2a, interferon alpha 2b, interferon gamma 1b, reteplase, Filgrastim, insulin,… dùng trong điều trị một số bệnh về tim mạch, bệnh tiểu đường, viêm gan siêu vi, viêm gan C, một số bệnh ung thư

1.2 Hệ biểu hiện E coli

E coli là một vi khuẩn Gram âm, có dạng hình que với kích thước bộ gen là

4,6 Mb [11] E coli được sử dụng phổ biến trong việc biểu hiện các protein tái tổ

hợp [12] do có nhiều ưu điểm như: thao tác đơn giản, có khả năng tăng trưởng nhanh với mật độ tế bào cao trong các môi trường cơ chất không đắt tiền (cứ 20-30 phút lại nhân đôi một lần) và điều đặc biệt là chúng có khả năng thu nhận rất nhiều các yếu tố di truyền vận động từ môi trường ngoài như plasmid, phage [13] Các

yếu tố di truyền này có thể tồn tại và tái bản nhiều lần trong tế bào E coli Hơn nữa, những đặc điểm di truyền và sinh lý của E coli đã được nghiên cứu khá đầy

đủ Vì vậy, đã có nhiều loại vector và các chủng E coli đột biến có tính chất mong muốn, phù hợp để sử dụng cho mục đích tách dòng và biểu hiện gen

Nhiều nghiên cứu đã cho thấy, hiệu suất tổng hợp nhiều loại protein ngoại lai

trong tế bào E coli rất cao khi sử dụng các plasmid phù hợp Các plasmid được

chọn thường chứa vùng promoter mạnh, được điều khiển chặt chẽ trong quá trình tổng hợp protein ngoại lai Ngoài ra, các plasmid này phải có số lượng bản sao lớn

và tồn tại ổn định trong tế bào chủ Tính bền vững của plasmid không những phụ thuộc vào đặc tính di truyền của tế bào chủ, đặc tính sinh học của gen đích mà còn phụ thuộc vào các điều kiện nuôi cấy Như vậy, với việc sử dụng các plasmid phù

hợp, nhiều protein quan trọng đã được tổng hợp trong E coli một cách nhanh chóng

và thuận tiện

Bên cạnh những thuận lợi đã nêu, hệ biểu hiện E coli cũng có những hạn chế nhất định E coli không có khả năng sản xuất hiệu quả các loại protein có kích

thước quá lớn hoặc quá bé Khả năng tạo và tiết protein ra ngoài tế bào rất hạn chế,

E coli có thể methyl hoá một số nucleotid trong hệ gen, do đó gen ngoại lai cũng có thể bị methyl hoá gây ảnh hưởng đến quá trình biểu hiện gen Protein của sinh vật

nhân chuẩn biểu hiện trong E coli không được cải biến chính xác do khả năng hạn

chế trong việc hình thành các cầu disulfide cũng như các cải biến hậu dịch mã khác như phosphoryl hóa, glycosyl hóa…hoặc kết hợp với lipid để tạo lipoprotein [14]

Sự thuỷ phân protein ngoại lai cũng là một vấn đề đối với hệ biểu hiện E coli Mặt

khác, trong quá trình tiết, việc biểu hiện protein ở mức độ cao thường đi kèm với sự tạo thành các thể vùi làm mất đi cấu trúc và hoạt tính sinh học của protein Trong nhiều trường hợp protein có nguồn gốc từ sinh vật nhân chuẩn được tổng hợp trong

E coli thường không có hoạt tính sinh học hoặc có nhưng thiếu ổn định Hơn nữa, nhược điểm khi sử dụng hệ biểu hiện này đối với biểu hiện các protein trị liệu là sự

tích lũy của thành phần lipopolysaccharide (LPS), được biết đến là nội độc tố gây ra phản ứng phụ cho người và các động vật khi dùng Do đó, protein dùng cho mục đích trị liệu phải được tinh sạch lần nữa để loại độc tố [12]

1.2.1 Chủng biểu hiện E coli

Hiện nay, có nhiều chủng E coli đã được cải biến cho mục đích biểu hiện

gen và mỗi chủng ưu và nhược điểm khác nhau Tùy theo đặc tính protein muốn

biểu hiện trong vector nào mà chọn chủng E coli phù hợp với từng mục đích sử dụng Ví dụ chủng E coli BL21(DE3) là chủng biểu hiện protein tốt Chủng này bị

đột biến khuyết sản phẩm OmpT và lon nên hạn chế tối đa sự thủy phân không mong muốn của protein được tổng hợp [15] Đối với biểu hiện các protein ngoại lai

có nguồn gốc từ sinh vật nhân chuẩn, sử dụng các chủng có nguồn gốc từ BL21 (DE3) mang thêm tRNA để khắc phục vấn đề mã hiếm Các chủng như BL21 CodonPlus-RIL, BL21 CodonPlus-RP, BL21 Rosetta và những chủng khác được sử dụng để khắc phục trở ngại về mã hiếm tuy nhiên thành công cũng chỉ ở mức độ hạn chế [12] Các chủng này cung cấp tRNA cho các codon như AGG, AGA, AUA, CUA, CCC, GGA Những chủng này mang thêm các gen mã hoá các tRNA dưới sự kiểm soát của promoter nội tại của chính vật chủ Chủng Rosetta (DE3) pLysS có các gen mã hóa cho tRNA trên plasmid mang gen T7 lysozyme Bảng 1 liệt kê một

số chủng E coli thường dùng để biểu hiện protein ngoại lai

Bảng 1 Một số chủng E coli thường được sử dụng nhất để biểu hiện protein ngoại lai và

những đặc điểm chính của chúng [12]

Chủng vi khuẩn JM109 (DE3), có nguồn gốc từ JM109, có một bản copy gen

mã hóa cho T7 RNA polymerase Chủng JM109(DE3) được dùng để biểu hiện ở mức độ cao các gen nối vào vector xuôi chiều từ T7 promoter và nó chứa gen cảm ứng bởi IPTG để tổng hợp T7 RNA polymerase

Chủng vi khuẩn E coli SoluBL21 là chủng chủ BL21 được cải thiện đáng kể

tính hòa tan của protein biểu hiện trong hầu hết các trường hợp trong khi chủng gốc BL21 (DE3) hầu như không tạo ra protein hòa tan nào ngay cả ở hàm lượng thấp nhất

Chủng vi khuẩn Origami là chủng có nguồn gốc từ K-12 đã bị đột biến ở gen thioredoxin reductase (trxB) và gen glutathione reductase (gor), làm tăng đáng kể sự

tạo thành cầu disulfide trong tế bào chất của E coli Để làm giảm khả năng hình thành cầu disulfide giữa các phân tử, chủng chứa đột biến ở gen trxB và gor được

khuyến cáo chỉ dùng trong trường hợp biểu hiện protein đòi hỏi sự hình thành chính xác cầu disulfide

1.2.2 Vector biểu hiện trong E coli

Có hai loại vector biểu hiện là vector phiên mã (transcription vector) và vector biểu hiện dịch mã (translation vector) Vector phiên mã được sử dụng khi ADN được tạo dòng có chứa một codon khởi đầu ATG và một vị trí gắn ribosome của prokaryote (ribosome – binding site - RBS), còn trên vector dịch mã có chứa

một vị trí gắn của ribosome có ái lực cao và do đó ADN mục tiêu không cần thiết mang trình tự này nữa Điều này đặc biệt có ý nghĩa trong trường hợp phần đầu của gen mục tiêu phải được loại bỏ để cải thiện tính tan của protein mục tiêu Một lưu ý nữa khi lựa chọn sử dụng vector biểu hiện phiên mã hay dịch mã là nguồn gốc của ADN cần biểu hiện Các gen mục tiêu từ sinh vật nhân chuẩn thường được tạo dòng vào các vector dịch mã trong khi các gen từ sinh vật nhân sơ lại thường được tạo dòng vào các vector phiên mã Nguyên nhân là do các gen prokaryote thường có

một vị trí gắn của ribosome tương thích với bộ máy dịch mã của tế bào chủ E coli

trong khi các gen có nguồn gốc sinh vật nhân chuẩn thì không Việc biểu hiện các gen sinh vật nhân sơ có thể được cải thiện nhờ sử dụng các promoter và RBS được thiết kế

Vai trò của vector biểu hiện là: mang các gen ngoại lai mong muốn cho phép thực hiện sự phiên mã của các bản sao được tạo dòng và sự dịch mã các mRNA của

chúng trong E coli Những vector này được dùng để biểu hiện các gen của sinh vật nhân chuẩn trong E coli hoặc tăng hiệu suất các sản phẩm của gen ở sinh vật nhân

sơ [16]

Vector biểu hiện phải có đủ các cấu trúc cần thiết sau:

- Trình tự khởi đầu sao chép (ori) để có thể tạo ra nhiều bản sao trong tế bào vật chủ

- Các trình tự gen mã hóa chỉ thị chọn lọc (selectable marker) để đảm bảo duy trì vector trong tế bào

- Một promoter kiểm soát phiên mã (ví dụ: lac, trp hoặc tac) cho phép sản xuất một lượng lớn mRNA từ các gen được tạo dòng

- Các trình tự kiểm soát dịch mã như trình tự liên kết ribosome được bố trí thích hợp

và codon khởi đầu AUG

- Một polylinker để đưa gen ngoại lai vào trong một hướng chính xác với promoter

1.2.3 Kỹ thuật cải thiện sự biểu hiện protein tái tổ hợp

Không có một phương pháp để biểu hiện hiệu quả đối với tất cả các loại

protein ngoại lai trong E coli Một báo cáo cho biết chỉ 22,9 % protein biểu hiện

trong E coli dưới dạng hòa tan [17] Nhiều tiến bộ kỹ thuật đã cải thiện đáng kể sự biểu hiện protein tái tổ hợp trong E coli, bao gồm xây dựng các promoter mạnh

[18], biểu hiện đồng thời với các chaperone [19] và sử dụng các protein dung hợp Các protein dung hợp có tác dụng đáng kể trong tăng cường sự biểu hiện và độ hòa tan của protein tái tổ hợp Hệ thống dung hợp được đặc trưng bởi khả năng tăng cường sự biểu hiện của protein, giảm sự phân giải của protein tái tổ hợp, cải thiện

sự cuộn gập (folding), khả năng hòa tan, và làm đơn giản hóa việc tinh sạch và phát hiện Một loạt các cấu trúc đã được sử dụng để dung hợp, bao gồm protein kết gắn maltose (MBP), glutathione S-transferase (GST), thioredoxin (TRX), ubiquitin (UB) và SUMO [20], [21]

SUMO (small ubiquitin-related modifier) điều chỉnh cấu trúc và chức năng protein bằng cách thay đổi liên kết hóa trị của protein đích trong sinh vật nhân chuẩn [22] Con đường SUMO bảo tồn cao ở sinh vật nhân chuẩn và vắng mặt ở sinh vật nhân sơ Nấm men có một gen duy nhất (SMT3), trong khi 3 gen đã được

mô tả ở động vật có xương sống (SUMO-1, SUMO-2, và SUMO-3) [19] Ba loại SUMO ở người rất tương đồng với nhau Ở người, SUMO-1 có tới 50% trình tự nhận dạng với SUMO-2 và SUMO-3 [23], còn SUMO-2 và SUMO-3 giống nhau tới 87% [22] Mặc dù trình tự nhận dạng giữa SUMO và ubiquitin chỉ giống khoảng

18 %, cấu trúc không gian 3 chiều của chúng đều ở dạng hình cầu được đóng gói chặt chẽ với các nếp gấp beta (β- /beta sheet) quấn quanh một chuỗi xoắn alpha (α-/ alpha helix) [24]

Trong những năm gần đây, hệ thống dung hợp với SUMO để tạo điều kiện

biểu hiện có hiệu quả các protein tái tổ hợp trong E coli đã được mô tả [25] SUMO

trở thành công cụ sinh học có hiệu quả như một hệ thống dung hợp để tăng cường biểu hiện ở dạng hòa tan của protein và giảm sự kết tụ protein mà thường không đạt được bằng hệ thống biểu hiện thông thường [26], [27] SUMO đã được chứng minh tăng cường khả năng biểu hiện và độ hòa tan Ngoài ra, protease phân cắt protein dung hợp có độ đặc hiệu cao và tạo ra protein tự nhiên với đầu N trừ proline [28]

Sử dụng chiến lược dung hợp này, nhiều protein, ví dụ như protein của virus SARS [28], MMP13 [17], EGF [29] đã được biểu hiện và tinh sạch thành công

1.3 Các kỹ thuật tinh chế protein

Protein tinh khiết cần thiết cho nhiều ứng dụng, bao gồm cả nghiên cứu cấu

trúc và trong thử nghiệm sinh hóa in vitro Tinh chế protein liên quan đến việc tách

chiết protein từ các nguồn, dựa trên sự khác biệt về tính chất của các chất trong mẫu Mục đích của tinh sạch protein là để thu được số lượng lớn protein mong muốn mà chức năng không bị thay đổi, với chất tạp nhiễm ít nhất [30]

Phương pháp chiết xuất và tinh sạch protein phổ biến nhất là sắc ký Thuật ngữ sắc ký để chỉ các kỹ thuật phân tách và điều chế cho phép tách biệt các hợp phần khác nhau của mỗi hỗn hợp Phép phân tách sắc ký dựa vào sự di chuyển khác nhau trong một pha động của các chất hoà tan đã được gắn trên một pha tĩnh ở trạng thái rắn Các kỹ thuật thường được sử dụng cho tinh sạch protein mà không làm biến tính protein như là tủa bằng muối ammonium sulphate, bằng sắc ký như sắc ký

ái lực, sắc ký trao đổi ion, sắc ký lọc gel… [31]

1.3.1 Kỹ thuật tinh chế protein bằng tủa muối

Phương pháp đơn giản nhất cho việc tách chiết protein và các đại phân tử khác là sử dụng các phương pháp kết tủa đặc hiệu dựa vào tính chất của chính loại protein hay các đại phân tử đích Protein khác nhau kết tủa ở nồng độ muối khác nhau Khi nồng độ muối tăng, thì càng nhiều protein có thể phân tách [36]

Thông thường cần tiến hành giai đoạn kết tủa đầu tiên để làm giảm thể tích tổng số của dung dịch protein Các protein có thể được kết tủa đơn giản, tuần tự hoặc phối hợp, với ammonium sulphate, sodium sulphate, polyethyleneimine và polyallylamine, hoặc các dung môi hữu cơ như là isopropanol, ethanol và acetone [37]

Một dung dịch muối bão hòa hoặc tinh thể muối bột được thêm từ từ vào hỗn hợp protein để đưa lên các nồng độ muối trong hỗn hợp Ví dụ, nồng độ muối đạt 25% độ bão hòa khi 1 ml dung dịch muối bão hòa được thêm 3 ml dung dịch protein muối tự do; 50% cho 3 ml thêm; 75% trong 9 ml thêm; và như vậy các protein kết tủa được thu thập và phân loại theo nồng độ của dung dịch muối mà tại

đó nó được hình thành [38]

Phương pháp này có ưu điểm là đệm ổn định được thêm vào để duy trì các hoạt động protein tối đa Hiệu quả của việc phục hồi thông thường vào khoảng 30-90%, tùy thuộc vào các protein Các kết tinh của protein khi chuyển sang các dịch chiết ở nhiệt độ phòng có thể xảy ra ngay lập tức hoặc đôi khi có thể mất nhiều giờ Tuy nhiên, rất hiếm khi việc kết tinh không xảy ra Sự xuât hiện của các tinh thể tốt

có thể được phát hiện bằng mắt từ độ đục [38]

1.3.2 Kỹ thuật tinh chế protein bằng sắc ký ái lực

Nguyên tắc của phương pháp là dựa trên liên kết ái lực đặc hiệu giữa các phân tử với thụ thể được gắn kết trên một pha rắn Sau khi bắt cặp cố định với thụ thể trên pha rắn, đệm rửa sẽ được sử dụng để rửa các liên kết không đặc hiệu và giữ lại các phân tử đích

Khi cho một hỗn hợp có chứa protein cần làm sạch lên cột thì chỉ có protein quan tâm được giữ lại, tất cả các protein không tương tác được với phối tử (ligand)

sẽ bị rửa trôi ra khỏi cột Những protein bám sẽ bị giải hấp phụ bằng đệm chứa tác nhân có lực ion mạnh (ví dụ như imidazol 300 mM)

Để protein đích bám tốt lên chất giá thì hỗn hợp dịch protein phải được cân bằng trong dung dịch đệm gắn mẫu Sau đó, người ta tiến hành rửa cột vài lần bằng đệm gắn mẫu để rửa trôi những protein không bám Quá trình sắc ký thường được theo dõi thông qua độ hấp phụ bước sóng UV và bước rửa được hoàn tất khi độ hấp phụ bằng không Nếu nghi ngờ có protein bám không đặc hiệu lên cột thì đệm được

sử dụng có nồng độ ion cao hơn để rửa Sự tương tác giữa chất giá và protein đích

có thể là liên kết hydro, kỵ nước hay tương tác tĩnh điện Bước giải hấp phụ dựa trên đệm chứa chất gắn cạnh tranh đặc hiệu hoặc bằng thay đổi pH, dung môi phân cực hay tác nhân có lực ion đủ mạnh để làm yếu đi các liên kết trên [31] Để có kết quả tốt nhất, tiến hành sắc ký thường được thực hiện theo gradient nồng độ đệm [32]

Phương pháp sắc ký ái lực rất hiệu quả trong việc tinh sạch protein, cho phép thu được enzyme có độ sạch cao (hơn sắc ký trao đổi ion khoảng 10 lần) chỉ bằng một giai đoạn và trong một thời gian ngắn Các nhân tố như chất mang, phối tử,

phương pháp gắn kết phối tử cũng như các điều kiện rửa giải enzyme đều có vai trò quan trọng trong sắc ký ái lực

- Sắc ký ái lực His-tag:

Tinh sạch protein đích bằng sắc ký ái lực His-tag là kỹ thuật cho hỗn hợp protein tái tổ hợp đi qua một cột sắc ký có chứa một phối tử liên kết đặc hiệu với các protein mang một đuôi ái lực histidine

His-tag bao gồm 6 histidine, tag có thể được đặt ở nhóm amino cuối hoặc nhóm carboxyl cuối của protein nơi mà chức năng của protein ít bị suy giảm nhất, ở giữa sẽ là một vùng nhận biết của enzyme cắt giới hạn Protein biểu hiện dung hợp với his-tag có thể được tinh sạch và phát hiện dễ dàng nhờ khả năng liên kết của chuỗi histidine với một số ion kim loại bao gồm niken, coban và đồng trong điều kiện đệm thích hợp [33]

Khi đưa dịch chiết protein qua cột sắc ký, trong cột chứa các ion như Niken,

có khả năng liên kết chọn lọc với đuôi histidine, những protein his-tag sẽ được giữ lại, còn những protein không mang his-tag sẽ đi ra khỏi cột Nồng độ imidazol thấp trong bộ đệm gắn mẫu và đệm rửa giúp ngăn ngừa sự gắn kết không đặc hiệu của các protein nội sinh cũng có chứa cụm histidine

Rửa giải và thu hồi protein his-tag từ cột được thực hiện với nồng độ cao imidazol (thấp nhất là 200mM), pH thấp (ví dụ, 0.1M glycine-HCl, pH 2,5), hoặc dùng chất chelate mạnh (như EDTA) Imidazol là tác nhân rửa giải phổ biến nhất Lúc này, histidine sẽ được nhả ra khỏi cột Sử dụng enzyme đặc hiệu để cắt vùng nhận biết ở giữa, dẫn đến his-tag và protein đích tách nhau ra, cho qua cột sắc ký ái lực một lần nữa, lúc này các histidine không còn gắn protein sẽ được giữ lại trên cột, chỉ còn protein đích đi ra ngoài

Ưu điểm của his-tag là sự tinh sạch có thể thực hiện dưới điều kiện biến tính protein Phản ứng giữa histidine và ion kim loại không cần yêu cầu cấu trúc protein đặc biệt nào và sẽ xảy ra thậm chí có mặt các chất gây biến tính protein Đây là một phương pháp linh hoạt có thể được sử dụng để nhanh chóng làm sạch các protein

dung hợp với his-tag, kết quả làm giàu gấp 100 lần chỉ trong một bước tinh sạch [34] Độ tinh sạch của protein có thể đạt tới 95% [35]

1.3.3 Kỹ thuật tinh chế protein bằng sắc ký trao đổi ion

Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa trên lực trao đổi ion giữa các phân tử để tách chiết protein đích và dựa vào sự khác nhau về điện tích tổng số của các protein Hay nói cách khác, phương pháp này được dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi ion giữa protein được tan trong nước hoặc dung dịch đệm loãng và các tác nhân trao đổi ion Tác nhân (hay nguyên liệu) trao đổi ion có thể là chất nhựa có tích nhóm sinh ion hoặc là chất ionit

Cột trao đổi ion được gắn kết với các ion trái dấu để cân bằng điện tích, sau

đó các phân tử khác nhau trong dung dịch sẽ đổi chỗ với các ion trái dấu gắn trên cột và thay đổi tốc độ dòng chảy, áp lực và các điều kiện khác Các thành phần tích điện khác nhau sẽ lần lượt tách ra khỏi cột với các điều kiện khác nhau Từng thành

phần được định lượng riêng Cuối cùng, cột trao đổi ion được rửa và đưa về tình trạng ban đầu

Trong sắc ký trao đổi ion, các pha tĩnh lần đầu được cân bằng với một ion mạnh và đệm thấp Các mẫu protein sau đó được nạp vào pha tĩnh trong cùng đệm thấp, ion mạnh được sử dụng để cân bằng Các protein này được rửa trước khi rửa giải với một ion mạnh đệm cao hơn, hoặc trong một số trường hợp, một bộ đệm có

pH thay đổi Một số muối có hiệu quả để sử dụng trong sắc ký trao đổi ion hơn những chất khác, do khả năng tác động của chúng đối với ổn định protein [39]

1.3.4 Kỹ thuật tinh chế protein bằng sắc lý lọc gel

Dựa theo kích thước riêng biệt của mỗi loại protein mà sử dụng các gel lọc với kích thước lỗ thích hợp để tách protein đích Sắc ký lọc gel tách protein có kích thước từ lớn đến nhỏ Nói chung, các protein có kích thước lớn sẽ không đi vào những lỗ gel rửa giải và sẽ chỉ đi bên ngoài của hạt gel Protein nhỏ hơn sẽ liên tục thâm nhập vào các lỗ của gel Vì vậy, protein sẽ rửa giải theo thứ tự giảm kích

thước phân tử [40]

Cho sephadex vào cột thủy tinh dài và cân bằng bằng dung dịch đệm có pH nhất định Sau đó cho dung dịch protein lên cột Khi lọc và chiết bằng dung môi thích hợp, các phân tử có trọng lượng phân tử nhỏ (ở đây là các muối) sẽ khuếch tán chậm chạp qua các lỗ nhỏ của các hạt Sephadex bị trương phồng, còn chất có trọng lượng phân tử lớn hơn (ở trường hợp này là protein enzyme) không có khả năng đi vào mà lách nhanh qua các hạt sephadex và sẽ được chiết nhanh ra khỏi cột Vì vậy, chất có trọng lượng phân tử cao hơn thoát ra khỏi cột gel trước so với chất có phân

tử lượng nhỏ

Trong lọc gel độ phân giải phụ thuộc vào chiều dài cột Vì vậy, một nhược điểm có liên quan đến khối lượng mẫu tối đa có thể được nạp vào Nếu lớn hơn khối lượng của mẫu nạp, càng có nhiều sự chồng chéo giữa các đỉnh tách Nói chung, quy mô mẫu có thể tải được giới hạn trong khoảng 3-5% tổng khối lượng cột

Như vậy, sắc ký lọc gel sử dụng tốt nhất cho các giai đoạn cuối cùng của một quá trình tinh sạch Lọc gel cũng có thể được sử dụng để loại bỏ muối ra khỏi mẫu,

do chúng có khả năng tách "nhỏ" từ các thành phần "lớn" [41]

PHẦN 2 VẬT LIỆU, VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Các chủng vi sinh vật và plasmid

- Chủng E coli Rosetta 2 của hãng Novagen (E coli R2), được sử dụng làm

chủng biểu hiện gen

- pESUMO_IL-11 là vector biểu hiện pE SUMOpro3 của hãng LifeSensors

mang gen il-11 đã được thiết kế bởi Phòng Kỹ thuật di truyền dùng để biểu hiện

SUMO_IL-11

2.1.2 Hóa chất và enzyme

Các hóa chất thông dụng như 2-Mercaptonethanol, Acetic acid, alcohol, Ammonium Persulfate (APS), Skimmed milk, Methanol, SDS, Acrylamide, Bis-Acrylamide, Tris-HCl, Glycine, Glucose, Glycerol, BactorTM agar, BactoTM pepton, BactoTM Yeast Extract đạt tiêu chuẩn phân tích có xuất xứ

Isoamyl-từ các hãng Merck và Sigma

2.1.3 Các môi trường và dung dịch

- Môi trường và dung dịch sử dụng trong biến nạp ADN plasmid vào tế bào

• Môi trường LB đặc: Môi trường LB lỏng có bổ sung thêm 1,5% agar

• Môi trường chọn lọc LB-Amp đặc: Môi trường LB đặc bổ sung ampicillin đến nồng độ cuối cùng là 100 µg/ml

• Dung dịch: CaCl2 0,1 M

- Các chất đệm sử dụng trong tinh sạch protein:

• Binding buffer ( pH=7,4 ), gồm 20 mM PBS, 150 mM NaCl, imidazole 10 mM

20 mM PBS, 300 mM NaCl, imidazole 10 mM

50 mM PBS, 500 mM NaCl, imidazole 10 mM

Pha 1 lít PBS 1x gồm:8 g NaCl; 0,2 g KCl; 1,44 g Na2HPO4; 0,2 g KH2PO4

• Washing buffer ( pH= 7,4), gồm 50 mM PBS, 500 mM NaCl, imidazole

100 mM và 50 mM PBS, 500 mM NaCl, imidazole 150 mM

• Elution buffer ( pH= 7,4), gồm 50 mM PBS, 500 mM NaCl, imidazole 400 mM

- Các dung dịch dùng trong điện di protein:

• Bis-acrylamide 30% : Cân 29,2 g acrylamide và 0,8 g Bis-acrylamide hòa tan trong 100 ml nước cất vô trùng, bảo quản ở 4ºC

• Đệm Tris pH=8,8: Tris 1,5 M ; SDS 0,2 % và dùng HCl để chỉnh pH đến 8,8

• Đệm Tris pH=6,8: Tris 0,5 M ; SDS 0,2 % và dùng HCl để chỉnh pH đến 6,8

• APS 10 % : cân 0,1 g Amonium persulphate hòa tan vào 1 ml nước

• TEMED : sử dụng dung dịch đậm đặc mua từ các công ty

• SDS 10 %

Bảng2 Thành phần gel điện di biến tính SDS-PAGE

• Đệm biến tính mẫu protein 6X (Sample Buffer 6X): Tris-HCl pH=8 (0,36 M); Glycerol (60%), SDS (12%); Bromophenol blue (0,06%); mecaptoethanol (3/10 v/v)

• Dung dịch nhuộm gel (Coomassie blue staining) (100 ml): Brilliant blue 0,025 g; Methanol: 40 ml; Axit axetic: 10 ml Bổ sung nước cất đến 100 ml

• Dung dịch tẩy rửa (Destaining): Methanol: 5 ml; Axit axetic: 7,5 ml, H2O: 87,5 ml

- Các dung dịch dùng trong Western blot:

• Blotting 10X (1 lít): Tris 30g; Glycine 144,13 g

• Dung dịch Blotting 1X (1 lít): blotting 10X 100 ml; Methanol 200 ml; H2O 700 ml

• Dung dịch TBS 1X (1 lít): Tris-HCl (1 M), pH=7,5: 25 ml; NaCl (5 M) 10 ml

• Dung dịch TTBS 1X: dung dịch TBS 1X có bổ sung 0,1% Tween-20

• Dung dịch sữa Skimmed milk 5%: 5 g bột Skimmed milk pha trong 100 ml TBS 1X

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Biến nạp ADN plasmid vào tế bào E coli tái tổ hợp bằng sốc nhiệt

- Cơ sở lý thuyết:

Sốc nhiệt là phương pháp thường dùng để biến nạp ADN plasmid vào tế bào

E coli Trước khi biến nạp, các tế bào E coli phải là các tế bào khả biến, tức là có

khả năng nhận ADN từ môi trường bên ngoài Dưới tác dụng của CaCl2 thành tế bào đang ở thời kì sinh trưởng trở nên xốp, tạo điều kiện cho ADN plasmid có thể chui qua các lỗ trên màng tế bào vào tế bào chất khi thay đổi nhiệt độ đột ngột

- Các bước tạo tế bào khả biến E coli [42]

• Cấy ria chủng từ -80oC ra 2 đĩa LB và LBA (100ug/ml) để lấy khuẩn lạc rời

Ủ qua đêm ở 37oC Trên LBA khuẩn lạc không mọc

 Nuôi cấy một khuẩn lạc từ đĩa LB vào 5ml LB trong bình tam giác, lắc 220 vòng/phút để qua đêm ở 37oC