Khả năng ức chế một số chủng nấm mốc trên quả cam canh của chế phẩm AXIT PHENYLLACTIC thu được từ quá trình lên men vi khuẩn LACTIC

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: KHẢ NĂNG ỨC CHẾ MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC TRÊN QUẢ CAM CANH CỦA CHẾ PHẨM AXIT PHENYLLACTIC THU ĐƯỢC TỪ QUÁ TRÌNH

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:

KHẢ NĂNG ỨC CHẾ MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC TRÊN QUẢ CAM CANH CỦA CHẾ PHẨM AXIT PHENYLLACTIC THU ĐƯỢC TỪ QUÁ

TRÌNH LÊN MEN VI KHUẨN LACTIC

Giáo viên hướng dẫn: ThS Bùi Kim Thúy

Sinh viên thực hiện : Nguyễn Phương Anh

Lớp : 11-04

Hà Nội - 2015

LỜI CẢM ƠN

Trước hết tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới ThS Bùi Kim

Thúy tại Bộ môn Vi sinh vật – Viện cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch đã tận tình hướng dẫn giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài cũng như hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể các thầy cô trong khoa Công nghệ sinh học Viện Đại học Mở Hà Nội đã ân cần chỉ bảo cho tôi trong những bước đi đầu tiên trên con đường nghiên cứu khoa học của mình và sự quan tâm, giúp đỡ dìu dắt tôi trong quá trình thực hiện hoàn thành đề tài

Qua đây tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến gia đình, bạn bè và các anh chị cùng nhóm thực tập đã luôn bên cạnh động viên tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2015

Sinh viên

Nguyễn Phương Anh

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là trung thực chưa hề được sử dụng và công bố ở bất kỳ nghiên cứu nào

Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận này đã được cảm ơn, và các thông tin được chú thích trong khóa luận này đã được ghi rõ nguồn gốc

Sinh Viên

Nguyễn Phương Anh

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG BIỂU

DANH MỤC HÌNH VẼ

DANH MỤC ĐỒ THỊ

MỞ ĐẦU 1

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu chung về cam canh 3

1.1.1 Đặc tính của cam canh 3

1.1.2 Giá trị dinh dưỡng của cam canh 3

1.1.4 Các loại nấm mốc thường xuất hiện trên cam canh sau thu hoạch 5

1.2 Tình hình bảo quản và một số phương pháp bảo quản cam hiện nay 7

1.2.1 Bảo quản bằng phương pháp bảo quản hóa học: 7

1.2.2 Bảo quản bằng phương pháp bảo quản vật lý: 7

1.2.3 Bảo quản bằng phương pháp bảo quản sinh học: 8

1.2.4 Bảo quản bằng khí điều chỉnh 9

1.3 Giới thiệu về axit phenyllactic ( PLA) 10

1.3.1 Cấu tạo, tính chất vật lý, hóa học của axit phenyllactic 10

1.3.3 Chủng vi khuẩn lactic sinh tổng hợp và cơ chế sinh tổng hợp của axit phenyllactic 11

1.4 Giới thiệu về chế phẩm màng từ sáp ong (Beeswax) 12

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Vật liệu, nguyên liệu 15

2.1.1 Đối tượng 15

2.1.2 Nguyên liệu 15

2.1.3 Hóa chất, thiết bị 15

2.1.4 Môi trường 16

2.2 Phương pháp nghiên cứu 16

2.2.1 Phương pháp nuôi cấy chủng nấm mốc 16

2.2.2 Phương pháp xác định mật độ bào tử nấm mốc 16

2.2.3 Phương pháp xác định hoạt tính kháng nấm mốc của PLA 17

2.2.4 Phương pháp xác định % ức chế nấm mốc của PLA 18

2.2.5 Phương pháp thử ức chế một số chủng nấm mốc của chế phẩm PLA trực tiếp trên cam canh 18

2.2.6 Phương pháp bảo quản cam canh bằng PLA kết hợp chế phẩm phủ màng từ sáp ong 19

2.2.6.1 Phương pháp xác định hàm lượng axit hữu cơ hòa tan (%) 20

2.2.6.2 Phương pháp xác định tổn thất khối lượng tự nhiên 21

2.2.6.3 Phương pháp xác định sự biến đổi độ cứng của quả 21

2.2.6.4 Phương pháp xác định hàm lượng vitamin C 21

2.2.6.5 Phương pháp xác định tỷ lệ thối hỏng của quả 22

2.2.6.6 Phương pháp đánh giá chất lượng cảm quan của quả 22

PHẦN 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 23

3.1 Khả năng ức chế một số chủng nấm mốc của chế phẩm PLA trên đĩa thạch 23 3.2 Khả năng ức chế một số chủng nấm mốc của chế phẩm PLA trực tiếp trên cam canh 27

3.3 Ảnh hưởng của PLA kết hợp chế phẩm phủ màng từ sáp ong đến các chỉ tiêu hóa sinh và cơ lý trong quá trình bảo quản cam canh 31

3.3.1 Ảnh hưởng của chế phẩm bảo quản đến hàm lượng axit hữu cơ hòa tan 31

3.3.2 Ảnh hưởng của chế phẩm bảo quản đến tổn thất khối lượng tự nhiên 32

3.3.3 Ảnh hưởng của chế phẩm bảo quản đến sự biến đổi độ cứng của quả 33

3.3.4 Ảnh hưởng của chế phẩm bảo quản đến hàm lượng vitamin C 34

3.3.5 Ảnh hưởng của chế phẩm bảo quản đến tỷ lệ thối hỏng tự nhiên 35

3.3.7 Ảnh hưởng của chế phẩm bảo quản đến chất lượng cảm quan 36

PHẦN 4 : KẾT LUẬN 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO 38

PHỤ LỤC………

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 3.1: Khả năng kháng Penicillium digitatum của PLA 23

Bảng 3.2: Đường kính vòng kháng nấm mốc P.digitatum của PLA 24

Bảng 3.3: Khả năng kháng Aspergillus aculeatus Iizuka của PLA 26

Bảng 3.4 : Sự phát triển của P.digitatum ở các công thức thí nghiệm 28

Bảng 3.5 : Sự phát triển của Aspergillus aculeatus Iizuka ở các công thức thí nghiệm Error! Bookmark not defined Bảng 3.6 : Đánh giá chất lượng cảm quan của cam canh sau 8 tuần bảo quản 36

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1.1: Hình ảnh Penicillium digitatum phân lập được trên cam canh 6

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của PLA 10

Hình 1.3: Cơ chế tổng hợp PLA 12

Hình1.4: Công thức cấu tạo Beeswax 13

Hình 3.1: Ảnh khả năng ức chế P.digitatum của PLA sau 5 ngày 24

Hình 3.2 : Đồ thị khả năng ức chế P.digitatum của PLA 25

Hình 3.3: Ảnh khả năng ức chế Aspergillus aculeatus Iizuka của PLA sau 5 ngày Hình 3.4: Cam canh đối chứng sau 9 ngày xử lý 30

Hình 3.5: Cam canh xử lý chế phẩm PLA 3% sau 9 ngày xử lý 30

DANH MỤC ĐỒ THỊ

Đồ thị 3.1: Sự biến đổi hàm lượng axit hữu cơ tổng số của cam canh trong quá trình bảo quản 32

Đồ thị 3.2: Tổn thất khối lượng tự nhiên của cam canh trong quá trình bảo quản 33

Đồ thị 3.3: Sự biến đổi độ cứng của cam canh trong quá trình bảo quản 34

Đồ thị 3.4: Sự biến đổi hàm lượng vitamin C của cam trong quá trình bảo quản 34

Đồ thị 3.5: Tỷ lệ thối hỏng của cam canh trong quá trình bảo quản 36

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU

MỞ ĐẦU Đặt vấn đề

Nước ta mang đặc điểm là nước nằm trong khu vực nhiệt đới trải dọc suốt từ Bắc vào Nam có một lượng lớn các loại trái cây phong phú Các loại trái cây có giá trị dinh dưỡng cao, không những được ưu chuộng tại thị trường trong nước mà còn

có giá trị xuất khẩu như: Cam canh, Chuối, Thanh Long, Xoài, Dứa, Mít… trong

đó nhóm quả có múi rất được quan tâm phát triển

Cam canh là một trong những loại quả được trồng rất phổ biến ở nước ta Hiện nay cam được trồng khắp nơi trong cả nước với diện tích tăng nhanh, trong đó vùng đồng bằng sông Cửu Long có diện tích trồng lớn nhất cả nước chiếm 60% chủ yếu ở 9 xã phía bắc thuộc huyện Hàm Yên tỉnh Tuyên Quang, hàng năm đạt sản lượng trên 20 nghìn tấn Đó là do cam canh có màu sắc tương đối “bắt mắt”, vị ngọt mát, hàm lượng dinh dưỡng cao Hàm lượng vitamin A của cam canh là 465µg hơn hẳn các loại trái cây khác như chuối (25µg), dứa (35µg), ổi (75µg)…Hàm lượng vitamin C của cam là 0,42mg cao hơn của chuối (0,14 mg), dứa (0,22mg), xoài (0,36mg) Theo viện nghiên cứu Nông học quốc gia Pháp uống nửa lít nước cam mỗi ngày có thể cải thiện áp lực máu và tái hoạt động của máu (khả năng giãn nở)

và có thể giúp ngăn chặn nguy cơ phát triển các bệnh tim mạch ở tuổi trưởng thành[35]

Tuy nhiên việc thu hoạch cam canh thường diễn ra trong khoảng thời gian theo mùa nhất định Do thời gian thu hoạch không dài nên lượng quả vào mùa thu hoạch thường tập trung với số lượng lớn, vượt qua nhu cầu tiêu thụ của thị trường Tổn thất nông sản thu hoạch ước tính trung bình trên thế giới khoảng 15%, và ở nước ta rất cao khoảng 25%

Đối với cam canh tổn thất sau thu hoạch hầu hết do vi sinh vật gây ra với một số bệnh điển hình như: bệnh nấm mốc, mốc xanh, bệnh thối cà chua, bệnh thối nâu Bệnh làm cho quả thối hỏng, ảnh hưởng đến việc bảo quản quả tươi

Trong công nghệ bảo quản nông sản tươi thì việc ức chế sự phát triển của các loại vi sinh vật gây hại đóng một vai trò rất quan trọng Việc kiểm soát vi sinh vật là rất cần thiết để giảm tổn thất sau thu hoạch ở nước ta Do đó việc nghiên cứu, sử dụng các chất bảo quản sinh học để bảo quản nông sản, thực phẩm đã thu hút được

sự chú ý, quan tâm của nhiều nhà khoa học Trong thời gian gần đây các nhà khoa học đã nghiên cứu và tìm ra một chất bảo quản sinh học mới có tiềm năng ứng dụng cao trong bảo quản nông sản thực phẩm có tên là axit phenyllactic (PLA) Về bản chất axit phenyllactic là một loại axit hữu cơ được sản sinh ra từ vi khuẩn lactic thông qua quá trình lên men và đã được chứng minh là có phổ kháng vi sinh vật khá rộng[33]

Tuy nhiên việc nghiên cứu và ứng dụng axit phenyllactic vẫn còn mới mẻ ở Việt Nam Trong khuôn khổ nghiên cứu đề tài cấp Nhà nước từ năm 2010 – 2013, Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sinh học sau thu hoạch đã sản xuất thành

công được chế phẩm axit phenyllactic từ chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum

C2 tuyển chọn được và bước đầu đã ứng dụng có hiệu quả trong việc bảo quản một

số sản phẩm, thực phẩm như: nước dứa, dứa cắt Kế thừa những kết qủa nghiên cứu

của đề tài chúng tôi tiếp tục nghiên cứu đề tài khóa luận tốt nghiệp với tiêu đề “Khả năng ức chế một số chủng nấm mốc trên quả cam canh của chế phẩm axit phenyllacic thu được từ quá trình lên men vi khuẩn Lactic”

Mục đích của đề tài:

Khảo sát khả năng ức chế trực tiếp một số chủng nấm mốc trên quả cam canh của chế phẩm axit phenyllactic trên quy mô phòng thí nghiệm và bước đầu ứng dụng chế phẩm PLA kết hợp với chế phẩm màng sáp ong để bảo quản quả cam canh

Nội dung chính của đề tài:

- Đánh giá khả năng ức chế của chế phẩm PLA đối với một số chủng nấm mốc trên môi trường thạch đĩa

- Đánh giá khả năng ức chế của chế phẩm PLA đối với một số chủng nấm mốc nuôi cấy trực tiếp trên quả cam canh

- Đánh giá khả năng bảo quản cam canh của chế phẩm PLA kết hợp với phủ màng

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về cam canh

1.1.1 Đặc tính của cam canh

Cam canh có tên đầy đủ là cam đường canh Đây là giống cam có vị ngọt đậm vỏ màu vàng đỏ, là giống được trồng lâu đời ở xã Vân Canh – Hoài Đức (Hà Tây)

Cam canh thuộc loại quả tươi cao cấp, có giá trị dinh dưỡng và giá trị sử dụng cao Cam canh quả hình cầu dẹt, chín màu đỏ, vỏ mọng, ruột màu vàng, ăn ngọt, thơm đặc trưng, cuống quả đầy và ít lõm Thịt quả mọng nước, ít hạt vách múi hơi dai, ít xơ bã, ngọt mát nếu là giống chín muộn, giống chín sớm có vị ngọt đậm Trọng lượng trung bình 80 gr – 120 gr/quả[33]

Hiện tại cam canh đang được trồng nhiều ở Từ Liêm (Hà Nội), Văn Giang (Hưng Yên) Lục Ngạn, Lục Nam, Lạng Giang, Yên Thế, Hiệp Hoà (Bắc Giang) và một số địa phương miền Trung Các loại cam, chanh, quýt, bưới, phật thủ, chanh yên, quất cảnh đều thuộc họ cam Rutaceae, họ phụ cam quýt Arantoideae, chi Citrus

1.1.2 Giá trị dinh dưỡng của cam canh

Cam canh có vị ngọt đặc trưng, tính mát, có tác dụng giải khát, sinh tâm dịu, mát phổi tiêu đờm, thanh nhiệt, và lợi tiểu, cam canh cũng là một loại quả có múi thuộc chi Citrus [34] Cam canh cung cấp nhiều vitamin với hàm lượng cao như: hàm lượng vitamin C của cam canh khoảng 0,42mg cao hơn so với một số loại quả khác như chuối 0,14mg, dứa 0,22mg, xoài 0,36mg… Vitamin C có tác dụng chống lại bệnh thiếu máu ở người, tăng cường sức đề kháng cho cơ thể… Hàm lượng vitamin B1 của cam là 0,09mg cao hơn dứa 0,06mg, ổi 0,05mg, chuối 0,03mg…[34]

- Hàm lượng và thành phần đường trong quả cam canh (g/100g quả tươi) như sau:

Đường tổng số 8 Saccaroza 4

Trong thành phần thịt quả có 6-12% đường ( chủ yếu là Saccarose- đường mía)

Các axit hữu cơ tạo cho quả có mùi và vị đặc trưng hơn Axit hữu cơ cũng tham gia vào quá trình oxy hóa-khử trong quả và trong quá trình hô hấp Axit chính của chi Citrus là axit citric, các axit hữu cơ tạo cho quả có mùi và vị đặc trưng hơn Axit hữu cơ cũng tham gia vào quá trình oxy hóa – khử trong quả như gluxit và quá trình hô hấp Độ axit chung của cam canh (hàm lượng của các axit và muối axit tính theo axit chính của nguyên liệu) thường không quá 1% Độ axit không chỉ phụ thuộc vào từng loại quả mà còn theo giống, độ chín và nơi trồng…[34]

Cam canh ngoài việc dùng để ăn tươi có thể dùng làm mứt, nước giải khát hay chữa bệnh Công dụng của nguồn tinh dầu cất từ vỏ quả, lá, hoa được sử dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm

Như tất cả các loại trái cây khác, cam canh cũng có khả năng phòng ngừa ung thư đặc biệt là ung thư dạ dày và ung thư thanh quản vì trong cam canh giàu chất chống oxy hóa [34] Dịch ép múi cam ngoài có vị chua ngọt, mùi thơm, tính mát còn có các loại men tiêu hóa Nước ép cam dùng để chữa đái tháo đường, thiếu vitamin C [9]

1.1.3 Giá trị kinh tế của cam

Cam canh là loại cây ăn quả, có múi là cây lâu năm, chóng thu hoạch (thông thường sau 2 năm khi trồng đã có quả) và cho thu hoạch trong thời gian dài (25-30 năm) Tất cả các bộ phận của cây có múi đều mang lại giá trị kinh tế: lá, hoa, vỏ quả cung cấp tinh dầu, làm dược liệu, quả để ăn, cây làm cảnh Giá trị xuất khẩu cũng cao hơn chè, cà phê, dứa bình quân 20-30% trong khi đầu tư xây dựng cơ bản lại thấp hơn chè, cà phê 20-30% [7] Cam canh hiện nay là một trong số những loại quả đem lại hiệu quả kinh tế cao, 1 sào cam canh cho thu nhập từ 50- 60 triệu đồng/năm cao gấp nhiều lần so với các cây khác

Sản lượng cam canh ở nước ta có thời kỳ tăng lên nhưng cũng có thời kỳ giảm xuống do bị chi phối bởi điều kiện tự nhiên, dịch bệnh sâu hại Nhưng nhìn chung là có xu hướng tăng lên cả về diện tích và sản lượng với sự phong phú về chủng loại[36]

Tuy nhiên trong quá trình bảo quản và tiêu thụ quả tươi thường bị tổn thất do các vi sinh vật Nước ta có khí hậu nóng ẩm nên các loại vi sinh vật có điều kiện phát triển gây bệnh trên quả sau thu hoạch thường rất cao

1.1.4 Các loại nấm mốc thường xuất hiện trên cam canh sau thu hoạch

Trong cam canh thường chứa các chất dinh dưỡng như gluxit, axit hữu cơ, vitamin, chất khoáng và lượng nhỏ protein Thịt quả có nhiều dịch bào là một dung dịch nước có nhiều thức ăn rất hợp cho vi sinh vật sinh sống và phát triển

Trên bề mặt quả luôn tồn tại một lượng lớn các vi sinh vật khác nhau, số lượng và thành phần của hệ vi sinh vật trên quả thay đổi liên tục tùy theo từng loại quả, điều kiện địa lý, khí hậu, trạng thái sinh lý của quả Đại diện đặc trưng nhất của

hệ vi sinh vật trên bề mặt cam canh là bào tử nấm mốc, nấm men, vi khuẩn axetic,

vi khuẩn lactic…

Vi sinh vật là một trong những nguyên nhân quan trọng làm tổn thất thành phần dinh dưỡng và gây nên sự hư hỏng cam canh trong quá trình bảo quản Thường tồn tại 3 dạng hư hỏng quả dưới tác dụng của các loài vi sinh vật khác nhau

do nấm mốc, nấm men, vi khuẩn Vì quả có độ axit cao hơn nên nấm mốc là tác nhân gây hỏng quả đầu tiên sau khi độ axit giảm sau đó vi khuẩn xâm nhập và tiếp tục phân hủy quả[6]

Phần lớn các trường hợp hư hỏng quả là do nấm mốc, sự hư hỏng bắt đầu ở những quả dập nát và tiếp đến là những quả chín Thường những nấm mốc gây nên

sự hư hỏng này là nấm hoại sinh, còn có một số nấm ký sinh cơ hội thì gây nên hư hỏng và bệnh quả lúc chưa thu hoạch

Điển hình nhất là các loại nấm mốc như Penicillium digitatum, Penicillium

italicum, Aspergillus aculeatus Iizuka, Mucor, Collectotrichum … [28]

Bệnh mốc xanh (mốc lục và mốc lam) là bệnh rất phổ biến trên cam do 2 loai

nấm Penicillium italicum và Penicillium digitatum gây nên

Bệnh mốc lam (do nấm Penicillium italicum) bệnh hại quả sau khi thu hoạch

trong thời gian cất giữ Đầu tiên trên vỏ quả có các đốm nhỏ biến màu, hơi ướt Về sau vết bệnh lớn hơn, trên đó mọc các sợi nấm màu xanh lam, xung quanh có đường viền màu trắng, ngoài cũng là một lớp mô tế bào mọng nước, chỗ vết bệnh bị thối Bệnh có thể lây lan sang các quả khác rất nhanh

Bệnh mốc xanh lục do Penicillium digitatum gây nên, nấm xâm nhập qua các

vết xây xát trên vỏ quả trong khi thu hoạch và vận chuyển, phát triển mạnh trong điều kiện bảo quản nóng, ẩm, không thoáng gió[2]

* Penicillium italicum có sợi dài ngắn, mọc đứng lên từ sợi nấm và mọc nhánh, đầu tận cùng thì phát triển các bào tử, bào tử có hình trứng thuôn dài, hình cầu đến hình tròn có màu xanh lam nhạt riêng biệt, trong sinh khối có màu xanh lơ[32]

* Penicillium digitatum có sợi nấm phát triển bên trái, bào tử xuất hiện màu

xanh lục gắn trực tiếp trên các đài dài từ sợi nấm, bào tử được sản sinh trong những chuỗi hoặc đứng sát nhau, bào tử có màu xanh lá nhạt, hình tròn đến hình trứng,

thuôn dài, không vách có kích thước từ 4-7× 6-8µm [32] Penicillium sinh sản vô

tính với cọng bào tử hay đính bào tử, cọng bào tử có thể không phân nhánh, phân

nhánh bậc 1, 2 hay 3… Penicillium có đính bào tử mang màu xanh đặc trưng và

phát tán dễ dàng bởi gió và không khí [1]

Hình 1.1: Hình ảnh Penicillium digitatum phân lập được trên cam canh

Bệnh mốc xanh, mốc lục có đặc điểm chung là chỉ phá hoại ở quả Vết bệnh thường xuất hiện từ núm hoặc trên các vết thương xây xát Lúc đầu là một điểm tròn nhỏ, mọng nước màu vàng nâu, sau đó to dần, hơi lõm xuống, mô bị thối ủng [3]

* Aspergillus aculeatus Iizuka có hình dạng sợi, phân nhánh có vách ngăn (cấu tạo đa bào) màu đen ở một số vùng nhất định của khuẩn lạc, sinh sản theo cả 2

hình thức hữu tính và vô tính Có khả năng thích nghi với điều kiện thời tiết và môi trường khắc nghiệt Được xem là tác nhân gây bệnh trên quả và cây trồng [16]

Nấm ưa chuộng môi trường khí hậu ẩm, có một số loại nấm mốc thường thấy

ở những nơi có nhiệt độ cao Nấm mốc tồn tại trong các vườn quả dưới dạng chủ yếu là bào tử đính từ mùa này sang mùa khác Các bào tử này lơ lửng trong không khí và xâm nhập vào môi trường trong quả qua những vết xước nhỏ trên vỏ quả, dập

vỏ Mầm bệnh ở dạng bào tử nên nó cần dinh dưỡng để nảy mầm Vỏ quả chỉ cần một tổn thương rất nhỏ khi thu hoạch hay vận chuyển thì cũng làm tăng khả năng bị nhiễm trùng Để hạn chế tổn thất do vi sinh vật đặc biệt là nấm mốc gây ra trên cam canh sau thu hoạch cần áp dụng những biện pháp kiểm soát vi sinh vật thích hợp[3]

1.2 Tình hình bảo quản và một số phương pháp bảo quản cam hiện nay

Nguyên tắc chung của các phương pháp bảo quản đều nhằm ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật, hạn chế các biến đổi sinh lý, sinh hóa, đảm bảo giá trị dinh dưỡng, cảm quan học, hiện nay có nhiều phương pháp bảo quản được áp dụng thành công như bảo quản vật lý hay bảo quản bằng các biện pháp hóa học, sinh học

1.2.1 Bảo quản bằng phương pháp bảo quản hóa học

Chất hóa học thường được dùng để nhằm ngăn chặn tối đa sự hư hỏng của quả là chất diệt nấm như IMZ, TBZ và SOPP Các chất diệt nấm có nguồn gốc hóa học đã tạo ra những thành quả to lớn trong suốt thời gian dài trong việc bảo quản thực phẩm.Tuy nhiên các nhà nghiêm cứu cũng đã đưa ra nhiều nghiên cứu về hậu quả của chất diệt nấm có nguồn gốc hóa học Sử dụng thuốc diệt nấm hóa học gây ảnh hưởng không nhỏ đến môi trường, đặc biệt là tạo ra kháng thuốc ở vi sinh vật Hơn nữa, chất diệt nấm đồng thời có thể làm đầu độc và cằn cỗi hạt giống, có rất nhiều báo cáo cho biết các loại thuốc sử dụng đã tạo ra các chủng nấm kháng thuốc

với số lượng không nhỏ [22]

1.2.2 Bảo quản bằng phương pháp bảo quản vật lý

- Phương pháp chiếu tia UV (254nm) sẽ kích thích tạo ra phtoalexin và tiêu diệt mầm bệnh trên quả, lượng phtoalexin tạo ra phụ thuộc vào thời gian chiếu tia

UV Nhưng phương pháp chiếu tia UV có một số nhược điểm: giá thành cao, làm ảnh hưởng đến giá trị dinh dưỡng của quả, làm mềm quả,…[18]

- Phương pháp bảo quản bằng nhiệt độ cao kiểm soát vi sinh vật được áp dụng lần đầu tiên năm 1922 trên quả cam (Fawcett, 1922) Đến nay phương pháp xử

lý nhiệt được tiến hành trên nhiều loại rau quả nhiệt đới và cận nhiệt đới khác nhau

đã đem lại hiệu quả đáng kể trong việc kiểm soát tình trạng thối hỏng quả sau thu hoạch, phương pháp này đã được ứng dụng trên quy mô công nghiệp Một xu hướng cũng mang lại kết quả khả quan là kết hợp giữa nước nóng và nồng độ nhỏ của chất bảo vệ thực vật (nhỏ hơn 10 lần so với mức sử dụng thông thường của hóa chất đó) [18]

Tuy vậy việc sử dụng chất hóa học trong bảo quản thực phẩm đã nảy sinh những vấn đề như tính kháng thuốc của vi sinh vật tăng, chất hóa học dư thừa đọng lại trên quả làm ảnh hưởng nghiêm trọng tới người tiêu dùng, làm ô nhiễm môi trường Vì vậy, cần hạn chế hoặc loại bỏ việc dụng chất hóa học trong bảo quản thực phẩm

- Bảo quản lạnh: Bảo quản lạnh đang là phương pháp bảo quản phổ biến hiện

nay ở các nước phát triển Nhiệt độ thấp có thể hạn chế quá trình chuyển hóa tự thân rau quả và ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây thối hỏng, bên cạnh đó cùng với

độ ẩm không khí cao để tránh cho rau quả không bị mất nước nhanh Nhiệt độ tối thích cho bảo quản các loại quả có múi là 10-150C, tùy thuộc vào từng giống và nơi trồng, độ ẩm phù hợp nhất là 85-90% RH và có thể bảo quản trong thời gian 6-10 tuần Hầu hết cam bảo quản với thành phần khí 0-5% O2 và 15% CO2 ở 10C được

12 tuần, sau đó để được 1 tuần ở 210C sẽ duy trì được mùi vị tốt hơn và tạo chấm đen ít hơn so với bảo quản ở không khí bình thường [34]

Tuy nhiên có 2 nhược điểm đối với phương pháp này: Một là tổn thương lạnh thường xuất hiện chính đối với rau quả vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới khi nhiệt độ bảo quản dưới 10-150C trong thời gian dài Hai là phương pháp bảo quản lạnh còn

chưa phù hợp cho các nước nghèo do vốn đầu tư và chi phí năng lượng cao

1.2.3 Bảo quản bằng phương pháp bảo quản sinh học

Căn cứ vào sự cạnh tranh có trong tự nhiên của giới sinh vật, cụ thể là các vi sinh vật sống chung trong cùng một môi trường (xét trên diện hẹp) đó là các vi sinh vật sống trên bề mặt của quả Để tác động bằng tác nhân sinh học cần thiết phải có

đủ thông tin về hệ sinh thái địa phương đó và cơ chế ức chế của vi sinh vật định sử

dụng Vi sinh vật đối kháng được chọn căn cứ vào khả năng tác động trực tiếp của

nó đến các vi sinh vật ký sinh, và khả năng cạnh tranh với nguồn bệnh, cũng như khả năng kích thích cơ chế tự bảo vệ của vật chủ với nguồn lây nhiễm Để tăng cường hoạt tính sinh học, vi sinh vật đối kháng kết hợp với các chất kháng nấm tự nhiên như Chitosan…đã giúp cho các tế bào chủ khởi động bộ máy tự vệ của mình Điều kiện thành công trong việc sử dụng vi sinh vật đối kháng phụ thuộc vào các điều kiện môi trường đặc biệt quan trọng như nhiệt độ, độ ẩm có thể làm thay đổi cân bằng các phản ứng giữa tế bào chủ, nguồn bệnh và các vi sinh vật đối kháng phù hợp nhất Kính hiển vi điện tử có thể cho thấy hình ảnh rõ rệt số lượng loại các

tế bào vi sinh vật trên lá và quả, trên bề mặt lá và quả là nơi sinh sống của rất nhiều

vi sinh vật, những loại này nó tự dính chặt lên bề mặt của quả (Colour plate 11.7) chúng tạo ra một màng sinh học (Spur, 1994) Những màng này bao gồm polysaccharides (95%), sự có mặt của những vi sinh vật này ức chế sự phát triển của

vi sinh vật biểu sinh, bảo vệ quả khỏi tia tử ngoại (UV radian), khỏi sự hư hỏng, virus…[28]

Cơ chế tác động của vi sinh vật đối kháng thường liên quan đến tổng hợp các chất như: tạo chất kháng sinh, cạnh tranh dinh dưỡng, cạnh tranh chỗ ở, kích thích vào vật chủ tự bảo vệ hoặc là các phản ứng trực tiếp giữa vi sinh vật đối kháng với

vi sinh vật gây bệnh (Wilson và cộng sự, 1993)

1.2.4 Bảo quản bằng khí điều chỉnh

Theo Kader, yêu cầu và khuyến cáo về khí quyển cải biến và kiểm soát để tồn trữ các loại cam là: 5-10% CO2, 0-5% O2, nhiệt độ từ 5-100C, độ ẩm không khí 90-95% Khi đó có khả năng làm chậm quá trình già hóa và duy trì độ rắn của quả, tuy nhiên không làm giảm lượng thối hỏng, trên 15% CO2 sẽ gây mất mùi vị do sự tích lũy các sản phẩm lên men Tuy nhiên thị trường không chấp nhận tình trạng thối hỏng phát triển sau 6 - 8 tuần thậm chí khi quả đó được xử lý với thuốc diệt nấm trước khi bảo quản [19] Bảo quản cam bằng phương pháp MA với 3% O2 và 10% CO2 sẽ cho kết quả tốt nhất Tiến hành bao gói PE trong môi trường lạnh 10-

120C có thể bảo quản tới 2 tuần [17]

Một dạng khác của phương pháp này là kỹ thuật bao gói kín riêng từng quả

Kỹ thuật bao gói bằng túi chất dẻo dán kín rất có hiệu quả chống mất nước cho quả

Nhược điểm lớn nhất là rất dễ mắc nấm mốc gây thối hỏng, hô hấp yếm khí Ngoài

ra, giá thành thường cao và tạo ra chất thải cho môi trường

1.3 Giới thiệu về axit phenyllactic ( PLA)

1.3.1 Cấu tạo, tính chất vật lý, hóa học của axit phenyllactic

Axit phenyllactic (PLA) là một hợp chất kháng khuẩn mới, có tên khoa học

là (2S)- 2- hydroxyl- 3- phenyl- propanoic lactic acid là một loại axit hữu cơ thơm, thuộc nhóm chất bảo quản có nguồn gốc sinh học được sản xuất từ một số chủng vi sinh vật

PLA có công thức hóa học là: C9H10O3 trong phân tử có chứa vòng thơm, khối lượng phân tử 166 đvC, là chất dễ dàng hòa tan trong nước tạo thành dạng dung dịch, nhiệt độ tan chảy là 121- 1250C có thể bảo quản ở nhiệt độ 2-80C [8] PLA có 4 dạng chính, D-3-phenyllactic acid, L-3-phenyllactic acid, DL-3-phenyllacric acid và 4-hydroxyphenyllactic acid, trong đó DL-3-phenyllacric acid

và 4-hydroxyphenyllactic acid có hiệu quả kháng nấm, vi khuẩn tốt hơn nhiều

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của PLA

Với khả năng kháng khuẩn rộng PLA được sử dụng làm chất kháng vi sinh vật trong thực phẩm, sử dụng trong một số sản phẩm dược phẩm như thuốc chữa bệnh hay sản phẩm kem chống nhăn da [25], ảnh hưởng có lợi đến khả năng tăng trưởng của hệ thống miễn dịch

PLA đã được chứng minh có khả năng ức chế sinh trưởng và phát triển của một số loài vi khuẩn gram âm, gram dương, cùng nhiều nhiều loài nấm men, nấm mốc gây hại thực phẩm [13], [14], [21] PLA có tác dụng gậy ra những biến đổi

trong cấu trúc và hoạt động của vi khuẩn Listeria monocytogenes, cơ chế diệt khuẩn

này được lý giải như sau: khi có mặt PLA vi khuẩn tập hợp thành các khối, các

polysaccarit được tách ra, thành tế bào mất đi tính chất mềm dẻo, tính linh hoạt, tính bán thấm, làm cho tế bào trương nước, căng ra, cuối cùng các tế bào vi khuẩn bị vỡ

và tan rã [15]

Paola Lavermicocca cùng cộng sự đã nghiên cứu và chỉ ra rằng PLA được

sinh ra từ Lactobacillus plantarum có khả năng ức chế sinh trưởng và phát triển của

23 chủng nấm mốc thuộc 14 loài của 3 chi Aspergillus, Penicillium và Fusarium

đặc biệt có những loài sinh độc tố như Aspergillus ochraceus, Aspergillus flavus,

Penicillium roquefoti , Penicillium verrucosum và Penicillium citrium phân lập từ

các sản phẩm như bánh, bột, ngũ cốc Với liều lượng thấp hơn 7,5 mg/ml PLA có khả năng ức chế phần lớn sự phát triển của các chủng này [20] Dieuleveux và cộng

sự của ông cũng đã chỉ ra rằng PLA ở liều lượng 13 mg/ml có khả năng ức chế

Listeria monocytogenes và ở nồng độ 20 mg/ml ức chế một số vi khuẩn gây bệnh ở

người là Escherichia coli và Aeromonas hydrophila [12] Ngoài ra, PLA cũng có thể làm giảm số lượng vi khuẩn E.coli trong ruột già và tăng số lượng tế bào máu

miễn dịch có liên quan [5] Một số khảo sát cho thấy PLA hoàn toàn không gây độc hại cho con người, động vật cũng như môi trường sống xung quanh và PLA có mặt trong một số loại mật ong tự nhiên với hàm lượng tương đối cao[10]

1.3.3 Cơ chế sinh tổng hợp của axit phenyllactic

PLA được sinh bởi một số loài vi sinh vật trong đó chủ yếu thuộc loài

Lactobacillus như Lactobacillus plantarum 21B, Lactocbacillus sp SK007…

Quá trình sản xuất PLA được biết đến thông qua 2 con đường chính là hóa học và sinh học PLA được tổng hợp bằng con đường hóa học thông qua quá trình khử của kẽm và hydrocholric acid và azlactone [23], hoặc quá trình hydrogen hóa dưới sự xúc tác của Raney-N hoặc hợp kim của Pd-C Tuy nhiên, việc sản xuất PLA theo phương pháp này còn nhiều hạn chế như điều kiện tiến hành phản ứng phải tuân thủ một cách nghiêm ngặt và gây ảnh hưởng đến môi trường sống Bằng phương pháp này có thể sinh ra cả 2 dạng đồng phân là dạng D và dạng L

Ngược lại với con đường hóa học thì quá trình sinh tổng hợp PLA bằng con đường sinh học có nhiều ưu điểm hơn bởi nó là phương pháp an toàn thân thiện với môi trường và sản phẩm tạo ra không gây độc cho người sử dụng Ở quá trình này PLA được sản sinh ra bởi một số loài vi sinh vật thông qua quá trình lên men

1.4 Giới thiệu về chế phẩm màng từ sáp ong (Beeswax)

S ử dụng chế phẩm màng bảo quản quả

Kỹ thuật tạo màng phủ sinh học là phương pháp tạo ra một dịch lỏng dạng composite, colloid hoặc nhũ tương rồi phủ lên bề mặt của quả bằng cách phun, xoa, hay nhúng trực tiếp quả vào dịch màng lỏng khi dịch lỏng khô sẽ tạo ra một lớp màng mỏng gần như trong suốt trên bề mặt quả, do màng có tính bán thấm điều chỉnh sự trao đổi khí và thoát hơi nước nên quả được giữ lâu hơn về cả màu sắc lẫn chất lượng so với việc chỉ sử dụng hóa chất bảo quản

Chế phẩm màng được sử dụng là chế phẩm bao màng thành phần Beeswax 8% do phòng bảo quản Viện Cơ điện nông nghiệp và công nghệ sau thu hoạch sản xuất

Tính ch ất vật lý

- Sáp ong là một loại sáp thiên nhiên được sản xuất bởi những con ong mật thuộc chi Apis Sáp Ong được tiết ra từ các bộ phận bài tiết ở dưới bụng con ong mật Apis mellifica L, họ Ong - Apidae Ong mật dùng sáp để xây tổ, tổ của những con ong mật sau khi lấy hết mật được đem đun với nước, sáp sẽ chảy ra ta thu được sáp ong vàng (Cera flava) Đem phơi nắng, ta thu được sáp trắng (Cera alba) [30]

- Sáp là chất rắn vô định hình, có màu từ vàng đến hổ phách tùy thuộc vào nguồn gốc

- Sáp ong có độ hòa tan cao trong benzen, choloroform, toluene và trong những dung môi hữu cơ phân cực khác

- Nhiệt độ nóng chảy của chúng khoảng 62-650C Sáp ong tự nhiên dễ gãy khi gặp lạnh, ở nhiệt độ thường thì có độ dẻo [27]

Tính ch ất hóa học

Hình1.4: Công thức cấu tạo Beeswax

Sáp ong chủ yếu là các este của axit béo và rượu với độ dài chuỗi khác nhau

Nó có công thức hóa học tổng quát là C15H31COOC30H61 [29] thành phần cấu tạo chủ yếu là các myricyl palmilat, myricyl cerotat, các alcol myricylic, cerylic tự do, acid cerotic tự do và các thành phần hydrocarbon C26, C28, C32 Từ dãy carbua hydro

C28 đã phân lập được các hợp chất 9-methylheptacosan, 11-mehtylhepatacosan và 13-methylheptacosan, ngoài ra còn có hợp chất hydrocarbon có mạch nhánh Thành phần chủ yếu của sáp ong là Palmitomilixilic

Sáp ong dễ bị xà phòng hóa do trong thành phần của nó chứa các gốc axit béo tự do, hydroxylacid, diol…

O

Chính vì có thành phần hóa học như trên sáp ong có rất nhiều ứng dụng: sáp ong giúp bảo quản quả và thực phẩm rất tốt, không tan, rất trơn, không bị tác động

về mặt hóa học [4]; sáp ong được dùng nhiều trong các ngành công nghiệp như công nghiệp tĩnh điện, công nghiệp thực phẩm, giấy và cao su…dùng để chế sáp nến, vải dầu, giấy dầu [26]

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu, nguyên liệu

2.1.1 Đối tượng

- Đối tượng cam canh (mua tại chợ đầu mối Long Biên- Hà Nội) Yêu cầu với cam nguyên liệu chọn quả tươi, đồng đều màu sắc tươi, không có bất kỳ tổn thương nào trên bề mặt vỏ quả, còn nguyên cuống, không bị sứt hay dập

- Một số chủng nấm mốc: Penicillium digitatum, Aspergillus aculeatus

Iizuka… phân lập từ quả cam canh

2.1.3 Hóa chất, thiết bị

* Hóa chất:

Tween 80, Pepton, cao nấm men, CaCO3, K2HPO4.3H2O, (NH4)3C6H5O7,

CH3COONa, Nước chiết thịt, Khoai tây , MgSO4.7H2O, Agar, MnSO4.4H2O, KOH, Fucsin kiềm, NaOH, tinh thể Phenolphtalein, H3PO4, Glucose, cao thịt, MgCl2,

C4H9OH, axit phenylpyruvic, H2SO4, Etyl axetat, Ete, Cloroform, cồn 750, cồn 960, Butanol, Metanol, Ca(OH)2 0,1N, Etanol, NaHSO3, giấy đo pH…

* Thi ết bị:

Máy đo pH Ohaus (Thụy Điển), Cân phân tích Ohaus (Thụy Điển), Máy đông khô Edwards (Anh), Tủ lạnh sâu -200C (Nhật), Tủ nuôi cấy (Nhật Bản), Máy khuấy trộn Vontex RotoLab (OSI), Lò vi sóng (Trung Quốc), Tủ cấy vô trùng (Nhật), Máy lắc ổn nhiệt (Đức), Tủ sấy (Việt Nam), Nồi hấp khử trùng (Trung Quốc), Máy đo OD Merck (Trun Quốc), Máy lắc Gyrmax (Mỹ), Tủ cấy Box (Đức),

Tủ nuôi cấy Sanio (Nhật), Tủ mát 50C (Việt Nam), Tủ sấy Memmert (Trung Quốc), Pipetman các loại (Đức),…

Các dụng cụ dùng cho nuôi cấy vi sinh: Hộp petri, ống nghiệm, pipet, que cấy, đèn cồn, bình tam giác, ống đong, giấy lọc, giấy thấm…

2.1.4 Môi trường

Môi trường sử dụng là môi trường điển hình trong nghiên cứu nấm mốc PDA (Potato Dextro Agar) gồm những thành phần sau: Glucoza 20g, Khoai tây 200g, Nước cất 1 lít, điều chỉnh pH= 5.6-6 và thanh trùng ở 1210C/ 1atm trong 20 phút

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp nuôi cấy chủng nấm mốc

Các chủng nấm mốc được nuôi trong ống thạch nghiêng trên môi trường PDA trong thời gian 5-7 ngày ở nhiệt độ 260C (quan sát thấy nấm mọc tốt, bào tử

có màu đặc trưng)

2.2.2 Phương pháp xác định mật độ bào tử nấm mốc

10ml dung dịch Tween 80 với nồng độ 0.025% Hòa tan bào tử nấm trong 10ml dung dịch này rồi đổ vào bình tam giác loại 50ml Lắc đều bình cho đến khi hòa tan hết Tiến hành xác định mật độ bào tử nấm bằng phương pháp pha loãng hàng loạt rồi cấy trên đĩa thạch PDA, nuôi trong tủ ấm 25-270C, sau 3 ngày lấy ra đếm số khuẩn lạc Xác định mật độ bào tử nấm thu được (số khuẩn lạc có trong 1ml mẫu ban đầu) tính theo số khuẩn lạc đếm được từ các đĩa nuôi cấy theo các nồng độ pha loãng khác nhau

Chọn các đĩa có số đếm từ 25 đến 250 khuẩn lạc để tình kết quả, ta có:

Trường hợp 1: Chỉ có 1 hộp petri có số khuẩn lạc dao động trong khoảng 25-

250 (tất cả các hộp petri còn lại có số khuẩn lạc dao động nằm ngoài khoảng trên)

+ N : số khuẩn lạc có trong 1ml mẫu huyền phù ban đầu

+ C1, C2 : số khuẩn lạc đếm được trên 2 hộp petri ở độ pha loãng đã chọn + d : hệ số pha loãng đã chọn

Trường hợp 2: Chỉ có 1 độ pha loãng với 2 hộp petri có số khuẩn lạc dao động từ 25- 250 (tất cả các hộp petri còn lại có số khuẩn lạc dao động nằm ngoài khoảng trên)

N=

N=

+ N : số khuẩn lạc có trong 1ml mẫu huyền phù ban đầu

+ C1, C2 : số khuẩn lạc đếm được trên 2 hộp petri ở độ pha loãng đã chọn + d : hệ số pha loãng đã chọn

Trường hợp 3: Ở 2 độ pha loãng liên tiếp , các hộp petri có số khuẩn lạc dao động từ 25- 250 Khi đó, ta tính kết quả cho từng độ pha loãng:

Nếu kết quả thu được ở 2 độ pha loãng liên tiếp chênh lệch nhau 2 lần hoặc nhỏ hơn:

+ N : số khuẩn lạc có trong 1ml mẫu huyền phù ban đầu

+ C : số khuẩn lạc đếm được trên các hộp petri đã chọn

+ n1 , n2 : số hộp petri ở 2 độ pha loãng liên tiếp đã chọn

+ d : hệ số pha loãng mẫu

Nếu kết quả thu được ở 2 độ pha loãng liên tiếp chênh lệch nhau hơn 2 lần,

sử dụng độ pha loãng nhỏ hơn để tính kết quả

Trường hợp 4: tất cả các hộp petri đều có số khuẩn lạc nhỏ hơn 25 Khi đó, ta chọn hệ số pha loãng thấp nhất để tính kết quả

Trường hợp 5: tất cả các hộp petri đều có số khuẩn lạc lớn hơn 250 Khi đó,

ta sẽ chọn hệ số pha loãng cao nhất để tính kết quả

Trường hợp 6: không có khuẩn lạc nào mọc trên tất cả các hộp petri Khi đó,

ta ghi kết quả là có ít hơn 1×(1/d) khuẩn lạc, d là hệ số pha loãng thấp nhất

2.2.3 Phương pháp xác định hoạt tính kháng nấm mốc của PLA

M ục đích: đánh giá khả năng ức chế nấm mốc của chế phẩm PLA thông qua

vòng ức chế trên đĩa thạch

Nấu môi trường PDA đổ vào các hộp lồng, hút 10µl dịch bào tử nấm có mật

độ bào tử 104 bào tử/ ml trong ống nghiệm được chuẩn bị từ trước nhỏ vào các hộp lồng, trang đều, để khô Tiến hành đục 2 lỗ trên đĩa thạch có đường kính 11 mm cách đều nhau rồi đánh số thứ tự 1, 2 Pha loãng chế phẩm PLA ở các nồng độ khác nhau Nhỏ 200µl nước cất vào lỗ thạch số 1 và 200µl PLA đã pha loãng vào lỗ thạch số 2 Để nguyên hộp lồng trong khoảng 2-3 giờ rồi đem nuôi trong tủ ấm, sau 5-7 ngày quan sát đường kính vòng ức chế quanh lỗ thạch 2 ở từng hộp lồng

N=

2.2.4 Phương pháp xác định % ức chế nấm mốc của PLA

Nấu môi trường PDA lỏng đổ vào bình tam giác, mỗi bình 200ml Bổ sung PLA ở các nồng độ khác nhau vào môi trường trên (để lại 1 bình không bổ sung PLA làm đối chứng) Hút 50µl dịch nấm mốc có mật độ 104 bào tử/ml bổ sung vào các bình tam giác, nuôi cấy ở 250C trong 24 giờ Lấy 10µl dịch trong các bình tam giác trải đều trên các hộp lồng chứa môi trường PDA (mỗi nồng độ trải 3 đĩa) sau

Với mỗi phương pháp tiến hành ở trên ta thực hiện tương tự với 2 chủng nấm mốc đã chọn

2.2.5 Phương pháp thử ức chế một số chủng nấm mốc của chế phẩm PLA trực tiếp trên cam canh

Mục đích của phương pháp này để xác định nồng độ tối thiểu của chế phẩm

PLA trong việc kiểm soát 2 chủng nấm mốc Penicillium digitatum và Aspergillus

aculeatus Iizuka

- Cam nguyên liệu mua về rửa sạch bụi bẩn bên ngoài sau đó lau bằng cồn

700 để diệt khuẩn , xử lý 5-10 quả cho mỗi công thức

- Phân lô nguyên liệu vào từng khay, kích thước quả giữa các khay phải được chọn tương đối đồng đều

- Tiến hành đục lỗ trên quả cam: đục 4 lỗ xung quanh cuống của quả Dùng dụng cụ đục lỗ có đường kính 4mm đâm nhẹ vào 1 vị trí đã định sẵn trên quả, tạo ra

lỗ tròn ở lớp cùi của quả Không đục lỗ sâu quá vào trong dịch quả nhưng cũng không được nông quá vào tuyến tinh dầu trên vỏ quả Khoảng cách giữa các lỗ bằng nhau cùng nằm trên đường xích đạo của quả hoặc cùng nằm trên một đường tròn xung quanh cuống

- Cấy chủng: hút 20µl dịch nấm mốc nhỏ lần lượt vào các lỗ đã đục trên quả,

để khô tại chỗ tránh chảy dịch sau đó xếp vào các khay đặt trong tủ ấm nhiệt độ

25-270C, độ ẩm 80-85% trong 24 giờ

- Sau 24 giờ quả xử lý bằng cách nhúng vào chế phẩm PLA ở các nồng độ khác nhau (1%, 2%, 3%) Thuốc diệt nấm Carbenzim ở nồng độ thấp xử lý trên quả trong thí nghiệm làm công thức so sánh Quả sau khi xử lý đem bảo quản ở điều kiện thường (250C) Kiểm tra sự phát triển của nấm mốc ở các công thức sau 9 ngày

Kiểm tra hàng ngày các lỗ cấy chủng, đếm và ghi lại số lỗ mốc trên quả Tính phần trăm lỗ mốc từng ngày theo công thức:

- Cam canh nguyên liệu mua về rửa sạch bụi bẩn bên ngoài sau đó lau bằng khăn bông sạch để vệ sinh quả

- Phân lô nguyên liệu vào từng khay, khích thước quả giữa các khay phải được chọn tương đối đồng đều (mỗi công thức 6-7 quả)

Công thức Nồng độ chế phẩm Thời gian(phút)

- Cam canh sau khi được làm sạch để khô ta lần lượt nhúng cam vào chế phẩm bao màng (Beeswax) trong thời gian 10 phút (nhúng tất cả cùng một thời điểm như nhau)

- Sau 2 giờ cam nguyên liệu được bao màng, sau đó xử lý bằng cách nhúng vào chế phẩm PLA

- Một số khay nhúng nước cất làm công thức đối chứng Quả sau khi được

xử lý được đem bảo quản ở điều kiện thường (250C)

- Sau 7 ngày tiến hành kiểm tra sự thay đổi về các chỉ tiêu hóa sinh và cơ lý của dịch quả như: tổn thất khối lượng tự nhiên, hàm lượng axit hữu cơ hòa tan, độ cứng, hàm lượng vitamin C…

2.2.6.1 Ph ương pháp xác định hàm lượng axit hữu cơ hòa tan (%)

Tiến hành lấy mẫu ở 2-3 quả cam khác nhau trong cùng một công thức bóc

vỏ mỗi quả lấy từ 2-3 múi, cắt nhỏ vào khay sạch sau đó trộn đều Nghiền nhỏ 3-5g mẫu cho vào bình tam giác nhỏ 200ml bổ sung 50ml nước cất sau đó đun trong vòng 30 phút

Sau 30 phút để nguội lọc dịch quả qua giấy lọc loại bỏ bã tăng thể tích lên

V0 = 150 ml lắc đều Dùng pipet hút 25ml dịch quả trong cho vào bình tam giác 100ml tiến hành định mức, nhỏ vào bình tam giác 1-2 giọt phenolphtalein Từ buret, nhỏ dung dịch NaOH 0.1N vào và lắc đều bình nón cho tới khi dung dịch có màu hồng trong khoảng 30 giây thì dừng chuẩn độ Ghi số ml NaOH đã chuẩn độ (VNaOH) Làm 3 lần rồi lấy kết quả trung bình

Hàm lượng acid (%) có trong mẫu được tính theo công thức :

+ 0,0067 số gam acid tương ứng với 1ml NaOH 0,1N

+ m là khối lượng mẫu (g)

+ 25 số ml dịch rút ra chuẩn độ

00 (%)

2.2.6.2 Ph ương pháp xác định tổn thất khối lượng tự nhiên

Tổn thất khối lượng tự nhiên được xác định bằng cách cân khối lượng từng quả ở mỗi công thức trước khi bảo quản và sau mỗi lần theo dõi

Tổn thất khối lượng tự nhiên sẽ được tính theo công thức:

Trong đó:

+ X: tổn thất khối lượng tự nhiên ở mỗi lần theo dõi (%)

+ M1: Khối lượng quả trước bảo quản (gam)

+ M2: Khối lượng quả ở các lần theo dõi (gam)

2.2.6.3 Ph ương pháp xác định sự biến đổi độ cứng của quả

Độ cứng quả xác định bằng máy đo độ cứng cầm tay Fruit Pressure Tester của hãng Bertuzzi (Italy) Dựa trên nguyên lý đo độ lún (chiều sâu của đầu kim vào thịt quả) dưới một lực tác dụng bằng nhau, trong cùng một đơn vị thời gian

Độ cứng được tính theo công thức:

Trong đó:

+ X: là độ cứng của quả cam (kg/cm2)

+ F: số chỉ của máy đo

+ S: diện tích của mũi kim (cm2)

2.2.6.4 Ph ương pháp xác định hàm lượng vitamin C

Xác định hàm lượng vitamin C trong dịch quả theo tiêu chuẩn TCVN 2:1998 (ISO 6557/2:1984) Lấy 10ml dịch lọc trong cho vào bình tam giác 100ml

6427-→ thêm 10 giọt tinh bột 0,5% → Lắc nhẹ → Chuẩn độ bằng dung dịch I2 0,01N cho đến khi dung dịch bắt đầu xuất hiện màu xanh lam

Hàm lượng vitamin C trọng dịch quả được tính theo công thức:

100

1000 00088 ,

0

c v

V a

X =