Thiết kế vector biểu hiện và biểu hiện gen xylan beta xylanase trong e coli sử dụng vectorpET 32a(+)

Tuy nhiên, gần đây cùng với sự phát mẽ của khoa học công nghệ, ngày càng nhiều chủng vi sinh vật có khả năng sinh xylanase được phát hiện và nghiên cứu sâu.. Cấu trúc hóa học của xylan X

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

-*** -

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆ

t kế vecrtor biểu hiện và biểu hi beta-xylanase trong E coli sử d

vectorpET 32a(+)”

áo viên hướng dẫn:TS Đỗ Thị Huyền Sinh viên thực hiện: Hoàng Thị Hương p: CNSH – 11-02

Hà Nội, 2015

ỆP

u hiện gen dụng

Hoàng Thị Hương

LỜI CẢM ƠN

Tr ước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS Đỗ Thị

Huy ền, Phòng Kĩ Thuật di truyền – Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa

h ọc và Công nghệ Việt Nam, đã tận tình hướng dẫn, dìu dắt tôi trong suốt quá trình

hoàn thi ện luận văn này

Tôi xin chân thành c ảm ơn các thầy cô giáo Khoa Công Nghệ Sinh Học – Trường

Vi ện Đại học Mở Hà Nội đã giảng dạy, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và

th ực hiện luận văn

Tôi xin g ửi lời cảm ơn tới toàn thể các anh, các chị làm việc và học tập tại Phòng

K ỹ thuật di truyền – Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ chỉ bảo tôi tận tình trong

su ốt thời gian thực hiện luận văn

Cu ối cùng tôi xin gửi tới gia đình, bạn bè và đồng nghiệp lòng biết ơn sâu sắc vì sự

quan tâm, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành

lu ận văn

Sinh viên thực hiện

Hoàng Thị Hương

Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học

Hoàng Thị Hương

MỤC LỤC

MỤC LỤC

NHỮNG TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC HÌNH VẼ

MỞ ĐẦU 1

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Đại cương về xylanase 2

1.1.1 Phân loại xylanase 3

1.1.2 Cấu trúc của xylanase 4

1.1.3 Cơ chế xúc tác của xylanase 5

1.1.4 Đặc tính của xylanase 7

1.1.5 Nguồn xylanase 9

1.1.6 Ứng dụng của xylanase 10

1.2 Biểu hiện gen 13

1.2.1 Hệ biểu hiện E coli 13

1.2.2 Chủng biểu hiện E coli BL21 15

1.2.3 Vector biểu hiện pET 32a(+) 16

PHẦN II.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Vật liệu 18

Hoàng Thị Hương

2.1.1 Nguồn gen, chủngvisinhvậtvà plasmid 18

2.1.2 Hóa chất và enzyme 18

2.1.3 Máy móc và thiết bị 18

2.1.4 Các môi trường và dung dịch 18

2.2 Phươngphápnghiêncứu 19

2.2.1 Khuếch đại in vitro DNA bằng phản ứng trùng hợp polymerase (PCR) 19 2.2.2 Phản ứng nối gen ngoại lai vào plasmid 19

2.2.3 Phương pháp xử lý DNA plasmid bằng enzyme cắt hạn chế 19

2.2.4 Phương pháp điện di trên gel agarose 19

2.2.5 Tinh chế DNA bằng QIAGEN được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất 20

2.2.6 Phương pháp biến nạp DNA plasmid vào tế bào E.coli bắng phương pháp sốc nhiệt 20

2.2.7 Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ tế bào E coli 20

2.2.8 Phương pháp điện di trên gel polyacrymide – SDS 20

2.2.9 Cảm ứng, biểu hiện protein ngoại lai 21

PHẦN III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 22

3.1 Thiết kế vector biểu hiện pET32a(+) mang gen xbx 23

3.1.1.Khuếch đại gen xbx bằng kĩ thuật PCR 23

3.1.2 Cắt sản phẩm PCR gen xbxvà pET32a(+)bằng NcoI+XhoI 24

3.1.3 Nối ghép gen xbx vào vector biểu hiện pET 32a(+) 25

Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học

Hoàng Thị Hương

3.1.4 Cắt kiểm tra pET32-xbx bằng XhoI+XbaI 27

3.2 Biểu hiện gen xbx trong E coli BL21 28

TÀI LIỆU THAM KHẢO 32

PHỤ LỤC 37

E coli Escherichia coli

Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học

Hoàng Thị Hương

DANH MỤCHÌNH VẼ

Hình 1 Cấu trúc hóa học của xylan 2

Hình 2 Cấu trúc bậc 3 của xylanase GH10 từ S lividans 4

Hình 3 Cấu trúc bậc 3 của xylanase GH11 từ S paucimobilis 5

Hình 4 Cơ chế phản ứng thủy phân của xylan bởi xylanase của Bacillus circulans 7

Hình 5 Các enzyme cần thiết phân cắt hoàn toàn xylan 8

Hình 6 Bản đồ vector pET32a(+) 17

Hình 7 Sơ đồ thí nghiệm 23

Hình 8 Phân tích sản phẩm nhân gen xbx bằng kĩ thuật PCR 24

Hình 9 Phân tích sản phẩm nhân gen xbx bằng kĩ thuật PCR trên gel agarose 0,8% 25

Hình 11 Kết quả điện di tách chiết các dòng mang vector pET32-xbx 26

Hình 12 Sơ đồ vị trí cắt của 2 enzyme giới hạn XhoI và XbaI 27

Hình 13 Ảnh điện di sản phẩm cắt pET32-xbx các dòng bằng enzyme giới hạn XhoI và XbaI trên gel agarose 0,8% 28

Hình 14 Kết quả điện di kiểm tra protein tổng số được biểu hiện ở các dòng tế bào mang pET32-xbx 29

Hình 15 Điện di dịch tế bào sau khi siêu âm để kiểm tra sự biểu hiện ở pha tan của protein xbx trong các dòng tế bào DE3-pET32a-xbx khác nhau 30

Hoàng Thị Hương 1

MỞ ĐẦU

Xylanase là enzyme được nhiều nhà khoa học quan tâm Enzyme này có khả năng thủy phân hiệu quả các xylan – là thành phần chủ yếu của hemicellulose trong thành tế bào thực vật

Trước đây, việc nghiên cứu xylanase chủ yếu được tiến hành trên đối tượng nấm sợi Tuy nhiên, gần đây cùng với sự phát mẽ của khoa học công nghệ, ngày càng nhiều chủng vi sinh vật có khả năng sinh xylanase được phát hiện và nghiên cứu sâu Đồng thời, các lĩnh vực liên quan đến enzyme xylanase và ứng dụng của loại enzyme này ở vi khuẩn được các nhà khoa học ngày càng quan tâm hơn

Do nhu cầu sử dụng xylanase trong nhiều lĩnh vực ngày càng tăng, đặc biệt nhu cầu enzyme có hoạt tính mạnh, phân cắt nhanh để đưa vào ứng dụng trong công nghiệp vẫn đang thiếu Với mục đích tìm ra những loại xylanase có đặc tính tốt hơn,

chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu biểu hiện và biểu hiện gen xbxs mã hóa

xylan-beta-xylanase trong E coli sử dụng vector pET-32a(+)”nhằm thu được

xylanase tái tổ hợp có tính tốt để có thể ứng dụng thực tiễn Đề tài được thực hiện tại Phòng Kĩ thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

MỤC TIÊU

- Thiết kế thành công vector pET 32a(+) mang gen xbxs

- Biểu hiện thành công xylanase trongE.coli BL21

Viện Đại học Mở Hà Nộ

Hoàng Thị Hương

PH 1.1 Đại cương về xylanase

Xylanse có tên gọ

xylanase;β-D-xylanase;endo

xylanohydrolase; β-1,4-xylan xylannohydrolase

Tên hệ thống: 4- β

Xylanase là enzyme quan tr

Xylanase thủy phân xylan b

Hình Xylan là thành ph

ội Khoa Công ngh

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU xylanase

ọi khác là:β-xylanase; endo-1,4-β-xylanase; endoendo-β-1,4-xylan 4-xylanohydrolase;

xylan xylannohydrolase

β-D-xylan xylannohydrolase

Xylanase là enzyme quan trọng nhất tham gia thủy phân xylan

y phân xylan bằng cách cắt đứt các liên kết β-1,4-glycosid

Hình 1 Cấu trúc hóa học của xylan Xylan là thành phần chính cấu tạo nên hemicellulose của thành t

ợp chất polysaccharide quan trọng nhất trong t

u tìm thấy trong cấu trúc thứ cấp của thành tế bào thlignin và các hợp chất polysaccharide khác[41].Xylan c

ng polysaccharide phổ biến nhất trong các loài thực vật thông th

ng lượng khô trong sinh khối thực vật nhiệt đ

i, xylan ít phổ biến hơn và chiếm khoảng 8% tổ

i Khoa Công nghệ sinh học

2

xylanase; xylanohydrolase; 1,4-β-xylan

endo-1,4-β-D-y phân xendo-1,4-β-D-ylan[8, 20] glycoside

a thành tế bào thực

t trong tự nhiên [24, bào thực vật và tạo Xylan cũng là một

t thông thường,

t đới Với cây gỗ ổng trọng lượng

Hoàng Thị Hương 3

Sự phân hủy sinh học bộ khung cấu tạo nên xylan phụ thuộc chủ yếu vào hai lớp enzyme: endo-1,4-β-xylanase(EC 2.1.8), lớp enzyme này thủy phân liên kết 1,4-β-glucoside nối với xylose và β-xylosidase (1,4-β-D-xylan xylaohydrolase; EC 3.2.1.37), lớp enzyme này thủy phân xylobise và xylooligosaccharid ngắn nhờ hoạt động của enzyme endo-xylanase Các enzyme loại mạch nhánh chẳng hạn như α- glucoronidase và α-L-arabinifuranosidase và các esterase chẳng hạn như acetylxylan esterase và ferulyl và p-coumaroyl esterase sẽ loại bỏ mạch nhánh acetyl và mạch nhánh phenol [14] Ở cây gỗ rắn xylan có công thức O-acetyl-4-O-methylglucuron-oxylan Arabino-4-O-methylglucuroxylan tìm thấy trong cây gỗ mềm và arabinoxylan rất điển hình trong cây cỏ và thực vật bình thường khác [14]

1.1.1 Phân loại xylanase

Sự đa dạng của xylan dẫn đến sự đa dạng của enzyme xylanase[20] Dựa vào đặc điểm hóa lý, xylanase được phân thành 2 nhóm: một nhóm có phân tử lượng thấp (<30kDa) và pI acid, nhóm thứ hai có phân tử lượng cao (>30 kDa) và pI base.Mặc dù nhiều xylanase phù hợp trong những nhóm này nhưng số lượng các xylanase được mô tả trước đây đã gia tăng rất nhiều và hiện tại nhiều xylanase có những đặc tính trung gian được nhận biết không phù hợp với bất kỳ nhóm phân loại trên nào Từ 30 họ được xác định vào năm 1991, sự phân loại đã được cập nhật thường xuyên với những enzyme mới phù hợp và hiện tạicó trên 100 họ (GH1 tới GH106)[13] Hầu hết các họ bao gồm những enzyme với những đặc tính cơ chất giống nhau.Tuy nhiên, nhiều họ lại có nhiều đặc điểm khác nhau, enzyme hoạt động trên các carbonhydrate khác nhau Việc tìm kiếm những cấu trúc liên quan trong các họ khác nhau dẫn đến kết quả trong việc giới thiệu mức độ thứ bậc của sự phân loại được biết đến như là siêu họ hoặc quần hợp nhỏ

Dựa trên sự tương đồng về amino acid và cấu trúc không gian các xylanase thường được phân vào họ 10 (trước đây là F) và 11 (trước đây là G)[12] Hai họ này lần lượt bao gồm các xylanase của các nhóm phân tử lượng cao, pI thấp và phân tử lượng thấp, pI cao đã được đề cập trước đây; nhưng mỗi họ bao gồm nhiều xylanase

Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học

khác với những đặc điểm hóa lý khác biệt rộng rãi từ hai nhóm này[6,38].Xylanase thuộc hệ GH10 thuộc nhóm acid xylanase [42].Nhóm họ 10 bao gồm các enzyme thủy phân cellobiose (dẫn xuất của cellulose) (exocellulase) và endo-β-1,3-xylanase

so với xylanase (endo-β-1,4-xylanase) trong khi họ 11 là đơn tính chất, bao gồm các xylanase duy nhất.Xylanase thuộc hệ GH11 thuộc nhóm alkaline xylanase [42]

Một số lượng nhỏ các xylanase gần đây đã được xác định đặc điểm không xuất hiện sự tương tự phù hợp đối với họ 10 và 11 Thay vào đó, những xylanase này có những tương đồng đối với các enzyme thuộc họ cácenzyme thủy phân glycoside, họ 5, 7, 8 và 43 Theo đó, nhóm các họ chứa các xylanase nên được mở rộng để bao gồm những enzyme mới này [12]

1.1.2 Cấu trúc của xylanase

Hình 2.Cấu trúc bậc 3 của xylanase GH10 từ S lividans

Cấu trúc bậc 3 của endo-xylanase chủ yếu được sắp xếp từ các mảnh β Sự khác nhau trong hoạt động xúc tác của các endo-xylanase của họ 10 và 11 được cho

là do sự khác nhau trong cấu trúc bậc ba của chúng Cấu trúc bậc ba của xylanase họ 10 và 11 được xác định cho hàng loạt các enzym, từ cả vi khuẩn và nấm mốc

endo-Hoàng Thị Hương 5

Các thành viên họ xylanase 10 có cấu trúc α/β gấp cuộn tám lần và khối lượng phân tử xấp xỉ 48 kDa.Cấu trúc toàn thể xúc tác của xylanase họ 10 như là một cái thùng hình trụ được tạo thành từtám mảnh β Vị trí liên kết cơ chất của endo-xylanase họ 10 ở khe xúc tác không sâu như với endo-xylanase họ 11 Điều này, cùng với tính linh động hình thể lớn hơn có thể giải thích nguyên nhân của tính đặc trưng cơ chất thấp hơn của endo-xylanse họ10

Hình 3 Cấu trúc bậc 3 của xylanase GH11 từ S paucimobilis

Trong khi đó, họ xylanase 11 có cấu trúc mạch β gập hình bánh sandwich và

có khối lượng phân tử nhỏ hơn, vào khoảng 20 kDa, pI cao và thủy phân các liên kết glycoside với cơ chế xúc tác đổi chỗ hai lần[17, 19] Dựa trên cấu trúc toàn thể xúc tác từ các mảnh nếp gấp β tạo thành một vùng lõm với hai lớp xung quanh vị trí xúc tác Vũng lõm này được so sánh với lòng bàn tay và các ngón tay trong khi cái vòng giống như ngón cái của tay phải Cái vòng (loop) nhô ra thành vùng lõm và

giới hạn trong một phân tử isoleusin

1.1.3 Cơ chế xúc tác của xylanase

Hàng loạt các mô hình đã được đưa ra để giải thích cơ chế hoạt động của xylanase Xylanase thủy phân xylan Sự thủy phâncó thể là kết quả của sự duy trì hay nghịch chuyển của trung tâm anomeric của các monomer đường khử của

Viện Đại học Mở Hà Nộ

Hoàng Thị Hương

cacbonhydrat Sự dịch chuy

nhân ở cacbon bão hòa c

nghịch chuyển của cấu hình anomeric H

kiểu như cellulase và xylanase

chúng với sự duy trì của c

chuyển kép cho sự duy trì anomeric c

gồm các đặc điểm:

- Xúc tác axit với việc thêm m

- Một nhóm carboxyl của enzym

- Một liên kết trung gian c

cacbonhydrat này trong đ

lập với đường của cơ chấ

- Các tương tác không ph

ội Khoa Công ngh

ch chuyển glycosyl thường dẫn đến trong sự thay thcacbon bão hòa của trung tâm anomeric và diễn ra với s

u hình anomeric Hầu hết các enzym thủy phân polysaccharide cellulase và xylanase được biết đến với sự thủy phân các c

a cấu hình anomeric của C1 Có sự liên quan cduy trì anomeric của sản phẩm Cơ chế dịch chuy

c thêm một proton vào cơ chất

a enzym ở trạng thái hoạt động

t trung gian cộng hóa trị glycosyl xuất hiện gicacbonhydrat này trong đó cấu hình anomeric của đường tham gia liên k

ất

hải là cộng hóa trị được tạo ra với tỷ lệ tăng lên

i Khoa Công nghệ sinh học

n giữa enzym với

ng tham gia liên kết này đối

ăng lên[10]

Hoàng Thị Hương 7

Hình 4 Cơ chế phản ứng thủy phân của xylan bởi xylanase của

Bacillus circulans (A) Cấu trúc xylan xoắn là phù hợp với dạng lõm giữa Tyr 65 và Tyr 69 Glu

172 là tác nhân xúc tác axit/bazo và Glu 78 là ái nhân (B) Glycone liên kết với Glu 78.Chất trung gian này được giữ lại trong suốt phản ứng chuyển glycosyl (C) Nước chiếm chỗ của nucleophile (D) Sự tách và khuếch tán của glycone (xylobiose) cho phép sự di chuyển của enzym tới một vị trí mới trên cơ chất Xylanase của họ 11 biểu lộ một cơ chếendo và ngẫu nhiên hơn trong quá trình phân cắt Điều này là bởi

vì aglycone được giải phóng ở bước (B) và glycone ở bước (D) [22, 23].Leggio và các cộng sự đề xuất rằng cơ chế xúc tác của xylanase là:

- Xylanase nhận biết và liên kết với xylan

- Gốc xylosyl ở vị trí 1 bị làm biến dạng và được thả xuống hướng về phía gốc xúc tác, liên kết glycosidic bị cong và phá vỡ để tạo thành dạng liên kết cộng hóa trị enzym-cơ chất trung gian

- Chất trung gian bị tấn công bởi một phân tử nước hoạt động, tiếp theo đó cơ chế thủy phân glycosyl cổ điển tiếp tục diễn ra và sản phẩm được giải phóng [26]

1.1.4 Đặc tính của xylanase

Trong trung tâm hoạt động của xylanase, axit amin quyết định sự hoạt động của enzyme là axit glutamic [2] Sự thủy phân xylan đòi hỏi sự hỗ trợ hoạt động của các thành phần trong hệ thống enzyme xylanolytic

Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học

Hình 5 Các enzyme cần thiết phân cắt hoàn toàn xylan

1.1.4.1 Nhiệt độ hoạt động của xylanase

Mỗi enzyme đều có một khoảng nhiệt độ hoạt động nhất định Trong khoảng

đó sẽ có một điểm nhiệt độ mà ezyme hoạt động mạnh nhất,gọi là nhiệt độ tối ưu Thông thường nhiệt độ tố ưu của enzyme này không cố định mà phụ thuộc vào nguồn sinh tổng hợp xylanase, cơ chất, thời gian phản ứng, pH môi trường… Qua nghiên cứu cho thấy, nhiệt độ hoạt động tối ưu cho hầu hết xylanase của các họ vi khuẩn là 50-80oC, từ nấm là 35-50oC Nếu nhiệt độ nằm ngoài khoảng nhiệt độ thích nghi thì xylanase có thể bị biến tính tạm thời hoặc biến tính hoàn toàn, không thể phục hồi lại được.Mặc dù, hoạt tính xylanase cao nhất được xác định ở 80oC tuy nhiên nó vẫn duy trì hoạt tính xấp xỉ 70% ở 90oC [29]

1.1.4.2 pH hoạt động của xylanase

Cũng giống như nhiệt độ, mỗi enzyme đều có khoảng pH hoạt động thích hợp và một điểm pH hoạt động tối ưu pH môi trường ảnh hưởng rất lớn đến hoạt

độ enzyme vì nó ảnh hưởng đến độ bền và mức độ ion hóa cơ chất của enzyme

Xylanase sinh tổng hợp từ vi khuẩn thường hoạt động tối ưu ở pH từ 5,0 - 8,0, từ nấm men là pH 3,0 - 5,5 và bền ở dải pH từ 4,0 - 8,0 Giá trị pH tối ưu của xylanase vi khuẩn nhìn chung cao hơn so với pH tối ưu của xylanase từnấm.Trước

đó thì Ratto và các cộng sự đã công bố Bacillus circulans tổng hợp lên xylanase có

Một loại endo-xylanase với khối lượng phân tử là 55 kDa từ bột mì của cây

lúa mì châu Âu cũng đã được tinh chế [11]

1.1.5.2 Sinh tổng hợp xylanase từ vi khuẩn

Vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp nhiều các enzym sử dụng cho các quá trình công nghiệp trong đó có xylanase vì đặc tính bền nhiệt của nó Xylanase

thường được tổng hợp bởi một sốvi khuẩn như Streptomyces, Bacillus,

Trichoderma, Thermobacillus [42].Trong đó chi Bacillus và Streptomycesđược quan tâm nghiên cứu nhiều đặc biệt là chi Bacillus.Vi khuẩn thuộc chi Bacillus phân bố rộng rãi trong tự nhiên, đa dạng về sinh thái Các loài thuộc chi Bacillus đã,

đang và ngày càng trở thành những vi sinh vật quan trọng hàng đầu về mặt ứng dụng Các ứng dụng của chúng bao trùm hàng loạt lĩnh vực, từ sản xuất thực phẩm thủ công truyền thống đến công nghệ lên men hiện đại, đến sinh học phân tử, y-dược học chữa các bệnh hiểm nghèo, mỹ phẩm, xử lý môi trường ô nhiễm, thu hồi bạc kim loại từ các phế liệu Chính vì lẽ đó nên đã có ngày càng nhiều các nghiên

cứu sâu về chi Bacillus này cũng như mở rộng ứng dụng của chúng đối với đời sống

con người, trong đó có rất nhiều nghiên cứu công bố liên quan đến khả năng sinh xylanase của các chủng thuộc chi này [1].Một số loài sinh tổng hợp xylanase với

hoạt độ cao ở pH kiềm và nhiệt độ cao là Bacillus sp Ratto và các cộng sự đã công

bố Bacillus circulans tổng hợp lên xylanase có hoạt độ 400 U/ml Nó hoạt động tối

ưu ở pH 7 và 40% hoạt độ được duy trì ở pH 9,2[35]

1.1.5.3 Sinh tổng hợp xylanase từnấm

Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học

như bã dầu cọ, lõi ngô, vỏ lúa mì,…

Các enzym xylanase được sinh tổng hợp từ nấm thường có pH tối ưu thấp hơn so với các xylanase có nguồn gốc từ vi khuẩn Giá trị pH tối ưu của xylanase từ

nấm mốc thủy phân xylan thì thường dao động từ pH 3 đến 8 và ổn định ở pH 5

1.1.6 Ứng dụng của xylanase

1.1.6.1 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi

Enzyme được nghiên cứu bổ sung vào thức ăn cho vật nuôi từ những năm

1990 và ngày càng được phổ biến rộng rãi Hiện nay, mỗi năm người ta sản xuất khoảng 30 triệu tấn thức ăn gia súc có bổ sung chế phẩm enzyme, chiếm khoảng 5% trong tổng số 600 triệu tấn thức ăn gia súc được sản xuất Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng những hạt ngũ cốc kém chất lượng có chứa số lượng lớn các chất kháng dinh dưỡng.Vì vậy bổ sung các enzyme vào những thức ăn này cho hiệu quả rất rõ ràng Xylanase là một trong số các enzyme dùng cho chăn nuôi thu hút được nhiều sự quan tâm nghiên cứu Nhiều công trình đã chứng minh hiệu quả dinh dưỡng và kinh tế khi bổ sung xylanase đơn hoặc kết hợp với các enzyme thủy phân khác vào thức ăn vật nuôi Xylanase đã, đang và ngày càng được bổ sung nhiều hơn vào thức ăn chăn nuôi Việc bổ sung xylanase một cách độc lập hay kết hợp với các enzyme khác vào thức ăn làm tăng đáng kể khối lượng và giảm thiểu bệnh tật ở vật nuôi Xylanase có tác dụng phân giải xylan, một thành phần quan trọng của hemicellulose có nhiều trong thức ăn của vật nuôi, giải phóng đường xylose và xylooligosaccharide dẫn đến làm giảm độ nhớt của thức ăn, giúp cho vật nuôi tiêu

Một nghiên cứu với sự hợp nhất của thức ăn hằng ngày, dựa trên lúa mì hoặc lúa mạch đen, của những con gà giò đưa đến kết quả trong việc cải thiện lợi ích tăng trọng của gà con và hiệu quả chuyển hóa thức ăn của chúng[30] Những cải tiến tương tự cũng được cho những con heoăn thức ăn hằng ngày dựa trên lúa mì có bổ sung xylanase và phospholipase (Diebold et al, 2005)

1.1.6.2 Trong sản xuất rượu vang

Trong công nghiệp sản xuất rượu vang và nước ép việc ứng dụng xylanase cùng với pectinase tạo thuận lợi cho sự chiết và phân loại sản phẩm cuối cùng[16] Những enzyme có thể tham gia tính ổn định cơm thịt trái cây và giải phóng những tiền chất thơm Sản xuất rượu vang với chất thơm từ trái cây được gia tăng khi sử dụng xylanase từ chủng nấm men tái tổ hợp[4] Xylanase có thể được sử dụng trong công nghệ sản xuất bia để giảm độ nhớt và độ đục của bia [34]

1.1.6.3 Trong sản xuất bánh

Trong công nghiệp sản xuất bánh, xylanase cải thiện đặc tính bột để nâng cao tính linh hoạt của bột, tính năng chế biến, sự ổn định, khối lượng bánh và cấu trúc mảnh vụn rất nhỏ [4] Nhiều enzyme như protease, xylanase và cellulase nâng cao sức bền của mạng gluten và do đó nâng cao chất lượng sản phẩm bánh mì [18] Sự thủy phân pentosans bởi hemicellulases hoặc pentosanases ở mức tối ưu cải thiện các đặc tính của bột dẫn đến tính thống nhất hơn trong đặc tính chất lượng [4] Xylanase làm cho bột dung hòa hơn với các thông số chất lượng bột mì khác nhauvà biến đổi trong phương pháp chế biến; cũng làm cho bột mềm, dàn thành tấm

Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học

mỏng đặc biệt tăng đáng kể khối lượng bột nở trong bánh mì [4] Xylanase cùng với protease, lipase và α-amylase có hiệu quả đáng kể cho việc thu được khối lượng bánh mì nhiều hơn so với bánh mì không có enzyme thêm vào Các tác động tích cực của xylanase về khối lượng bánh mì là do tái phân phối của nước từ giai đoạn pentosan với chất gluten Các tác dụng cải thiện của pentosanases về khối lượng bánh mì có thể được liên kết với khả năng lưu giữ khí tốt hơn trong quá trình, có lẽ

do tác động của enzyme trong việc làm giảm độ nhớt của gel tinh bột và cho phép bột giãn nở hơn nữa trong lò[28]

Xylanase được khuyến khích để làm bánh kem xốp, cải thiện kết cấu, tính ngon miệng và tính thống nhất của các bánh xốp [34]

1.1.6.4 Trong tẩy trắng giấy và bột giấy

Trong công nghiệp giấy và bột giấy xylanase tạo thuận lợi cho việc tẩy trắng hóa học bột giấy, có tác động tốt đến môi trường và kinh tế [5, 39] Các xylanase không dịch chuyển trực tiếp thể màu dựa vào lignin nhưng thay vào đó phân rã mạng lưới xylan và tác dụng lên lignin còn lại Sự phân rã xylan-lignin hoặc tái kết tủa trong bề mặt của các sợi, cho phép sự tiết lignin hiệu quả hơn bằng các chất tẩy hóa học Việc tẩy trắng được gia tăng bởi xylanase đem đến sự tăng tiết kiệm 20-25% các chất hóa học dựa trên chlorine và giảm 15-20% trong việc sinh ra các hợp chất chlorine hữu cơ ô nhiễm từ sự phân rã lignin [5, 39] Việc giảm hàm lượng tác nhân tẩy trắng hóa học đòi hỏi đạt được độ trắng của giấy cần đạt tới đã đóng góp vào việc thay thế chlorine hợp thành bởi chlorine dioxide ô nhiễm ít hơn trong tẩy trắng liên tục chlorine thành tố tự do, hoặc thay thế hoàn toàn các hợp chất chlorine bằng các tác nhân thay thế như hydrogen peroxide và ozone trong việc tẩy trắng liên

tục chlorine tự do toàn phần

Hiệu suất tẩy trắng của các xylanase từ vi khuẩn và nấm khác nhau đang được phân tích Mặc dù nhiều enzyme được kiểm tra có hiệu quả cao như những phương tiện tẩy trắng nhưng những khác biệt đáng kể có thể xuất hiện phụ thuộc vào họ và những nét đặc trưng của mỗi enzyme riêng biệt [15, 21] Sự phản ứng lại đối với việc tẩy trắng bằng enzyme có thể ảnh hưởng bởi điều kiện tẩy trắng, những

Hoàng Thị Hương 13

mẫu gỗ có liên quan và phương pháp nghiền nhão[9, 27, 32] Hiện tại, nhiều xylanase có nguồn gốc từ vi khuẩn có sẵn trên thị trường và đang được sử dụng

thành công trong các phân xưởng sản xuất bột giấy [7]

Trong mối tương quan tới quá trình tẩy trắng, việc xử lý xylanase có thể làm giảm nhẹ các đặc tính của bột giấy tinh chế Trong một số trường hợp, các bột giấy được xử lý bằng enzyme đòi hỏi sự khuấy trộn lớn hơn, trong khi những tính chất

về độ mạnh của giấy không bị ảnh hưởng hoặc chỉ giảm nhẹ một chút [36] Sự gảm sút về nồng độ xylan bởi việc xử lý enzyme đã được trình bày nhằm làm giảm nhẹ

sự trở lại của việc già hóa,tăng độ sáng của bột giấy và giấy[33] Sự ứng dụng của xylanase trong công nghiệp giấy và bột giấy trong các giai đoạn khác của việc sản xuất đạt kết quả tốt Ứng dụng của các xylanase trong việc nghiền nhão cơ học, sự tháo nước bột giấy hoặc deinking của những sợi tái chế, hiện nay đang được đánh giá và có những kết quả hứa hẹn đạt được dẫn đến việc mở rộng sử dụng các xylanase trong ngành công nghiệp này và vị thế quan trọng càng gia tăng cho các

xylanase trên thị trường enzyme thế giới

1.2 Biểu hiện gen

1.2.1 Hệ biểu hiện E coli

E.colilàvi khuẩn gram âm Có các ưu điểm nổi bật thao tác trên vật liệu di truyền dễ, có thể biểu hiện các protein ngoại lai lên đến mức 50% protein tổng của

tế bào, biểu hiện nhanh ở một mức độ cao khi tốc độ tăng trưởng của tế bào đạt cao

và mật độ tế bào đủ lớn, môi trường nuôi cấy đơn giản và rẻ tiền và có khả năng định vị (location) protein mục tiêu Thêm vào đó có nhiều chủng chủ đột biến nhờ

đó có thể cải tiến việc biểu hiện protein tái tổ hợp và đươc sử dụng như một vật chủ hữu hiệu trong công nghệ tách dòng

Tuy nhiên vẫn có vài trở ngại khi sử dụng E.coli làm hệ biểu hiện như một số protein quan tâm được tạo ra trong E.coli không chứa methionine hoặc formyl

methionine ở tận cùng đầu N làm mất đi các tính chất quan trọng của phân tử

Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học

protein Mặt khác một số protein có nguồn gốc từ Eucaryote không thể biểu hiện tốt

trong E.coli

Vector dùng để biểu hiện gen ở E.coli được thiết kế đầy đủ, bao gồm các

nhân tố di truyền được sắp xếp hợp lý nhằm điều khiển tối ưu cả quá trình phiên

mã, dịch mã và tổng hợp nên protein từ gen ngoại lai Ngoài ra vector còn chứa gen

mã hóa cho protein vốn có chức năng là dấu hiệu chọn lọc thường là gen kháng chất kháng sinh Thêm nữa một trình tự không thể thiếu đối với plasmid tự sao chép là tâm sao chép vì nó quyết định số lượng bản coppy của plasmid trong một tế bào Và tạo điều kiện thuận lợi cho việc đưa các đoạn vào vector biểu hiện theo đúng chiều của promoter, trên vector luôn phải chứa vùng đa nối mang các trình tự của enzyme hạn chế

* Promter:

Vùng khởi đầu phiên mã là vùng có trình tự DNA đặc biệt, nhận biết bởi RNA polymerase Có nhiều loại promoter khác nhau được sử dụng biểu hiện gen ở

E.coli Nhìn chung, để biểu hiện gen cao, promoter phải có các đặc điểm:

- Phải là promoter mạnh, có khẳ năng tạo protein ngoại lai lớn hơn 10- 30% protein tổng số của tế bào

- Chỉ hoạt động ở mức độ thấp khi không có cảm ứng

- Được cảm ứng theo cách đơn giản nhưng có hiệu quả cao nhằm tạo lượng lớn protein mong muốn

Hiện nay promoter được sử dụng rộng rãi nhất là promoter bacteriophage T7, chúng có khẳ năng hoạt động rất mạnh trong tế bào E.coli khi có mặt T7 RNA

polymerase Đây là một enzyme hoạt động rất mạnh, có tốc độ kéo dài chuỗi nhanh

gấp 5 lần so với các RNA polymerase khác có nguồn gốc từ E.coli

* Vùng kết thúc phiên mã:

Qúa trình phiên mã được bắt đầu từ promoter, sau đó sợi mRNA kéo dài đến khi gặp một trình tự đặc hiệu thì dừng lại Trình tự đặc hiệu này chính là vùng kết thúc phiên mã

* Trình tự peptid tín hiệu:

Hoàng Thị Hương 15

Các protein ngoại lai được tổng hợp nhờ E.coli cần thiết phải được tiết ra

ngoài Để tiết được ra khỏi màng tế bào, các chuỗi poly peptide cần phải có trình tự peptid tín hiệu nằm ở tận cùng đầu N Chuỗi này gồm 3 vùng: vùng tận cùng đầu N, vùng tận cùng đầu C và vùng kị nước Do vậy trên vector biểu hiện người ta thường thiết kế sẵn chuỗi peptid tín hiệu nằm ngay sau vùng RBS (vị trí bám của riboxom)

* Tâm sao chép (Ori)

Tâm sao chép là vị trí đặc hiệu để khởi đầu sự sao chép DNA Nó cũng quyết định số lượng bản sao của plasmid trong tế bào

* Dấu chuẩn chọn lọc:

Để tiện cho việc nhân ra các tế bào có mang plasmid, thông thường người ta

sử dụng môi trường nuôi cấy mà ở đó chỉ có tế bào có tính trạng nhất định mới có thể sinh trưởng được Hiện nay việc đưa các đoạn gen kháng kháng sinh vào plasmid đang là cách phổ biến để phân biệt các tế bào đó

* Vùng đa nối:

Vùng đa nối bao gồm các trình tự enzyme hạn chế thông thường giúp cho quá trình đưa đoạn gen ngoại lai vào vector biểu hiện trở nên dễ dàng Hầu hết các trình tự của enzyme hạn chế đều được đặt theo khung đọc và nằm sau đoạn peptid tín hiệu

1.2.2 Chủng biểu hiện E coli BL21

Trong nghiên cứu biểu hiện đã sử dụng chủng chủ là E coliBL21(DE3), đây

là chủng chứa đột biến Ion protease (protease nội bào) và ompT protease (protease màng ngoài tế bào) Vì vậy, E coliBL21có ưu điểm là hạn chế sự phân cắt của

protease đối với protein ngoại lai, giúp cho protein ngoại lai tránh bị phân hủy và ổn định hơn sau khi tổng hợp Ngoài ra, DNA hệ gen của E coli BL21(DE3) có chứa

gen mã hóa cho T7 RNA polymerase, có nguồn gốc từ bacteriophage T7 Gen này

được đưa vào hệ gen của chủng E coli BL21(DE3) và đặt dưới sự điều khiển của promoter lac T7 RNA polymerase là enzyme hoạt động mạnh, có khả năng sao chép hoàn toàn bất kỳ trình tự DNA nào đặt dưới sự kiểm soát của T7 promoter

Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học

1.2.3 Vector biểu hiện pET 32a(+)

Để biểu hiện gene trong E coli vector biểu hiện có thể dùng là các plasmid, phage, cosmid Vector biểu hiện là một plasmid được thiết kế nhằm mục đích sản xuất protein với lượng lớn khi được kích thích bằng chất cảm ứng (lactose hoặc IPTG) Cấu trúc của vector pET32a(+) được biểu hiện trên hình 6

Vector này có khá nhiều ưu điểm vượt trội so với các hệ biểu hiện khác Đó là:

+Gen ngoại lai được điều khiển bởi promotor T7, là một promoter mạnh có tính đặc hiệu cao

+Phiên mã được điều khiển bởi lac operator, có cơ chế cảm ứng IPTG

+ Phía sau vùng đa nối có đoạn trình tự mã hóa cho 6 axit amin Histidin tích điện âm được gọi là đuôi His-tag Đuôi này giúp protein tái tổ hợp được giữ lại khi chúng được đưa qua cột sắc kí ái lực do lực hút tĩnh điện giữ phần điện tích âm của đuôi His-tag với điện tích dương của các cation có trong cột tinh sạch Các protein này sẽ được tách qua cột khi cho dung dịch đệm có pH thích hợp

+ Trên vector này có sẵn các điểm cắtXhoI, NcoI,XbaI nên sử dụng vector

này là một điều rất thuận lợi

+ Thioredoxin:giúp cho protein ngoại lai tránh bị phân cắt bởi protease và hình thành cấu trúc bậc 3 chính xác hơn

Hoàng Thị Hương

Hình Hình 6 Bản đồ vector pET32a(+)

17

Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học

PHẦN II.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vậtliệu

2.1.1 Nguồn gen, chủngvisinhvậtvà plasmid

* Nguồn gen: Plasmid pBlue-xbxs là nguồn mang gen do phòng Kỹ thuât di

truyền – viện Công nghệ sinh học thiết kế

* Chủngvisinhvật

-ChủngE coli DH 10b đượcsửdụnglàmchủngtáchdòng gen

- ChủngE coli BL 21 đượcsửdụng làmchủngbiểuhiện gen

Hoàng Thị Hương 19

- Các dung dịch dung trong điện di gel agarose (mục 3,phụ lục 1)

- Các dung dịch dung trong điện di trên gel polyacrylamid- SDS (mục 4,phụ lục 1)

Vị trí của DNA trong gel được xác định trực tiếp: các băng DNA trong gel được nhuộm ở nông độ thấp của thuốc nhuộm huỳnh quang ethdium bromide (EtBr) và các băng DNA bắt màu với thuốc nhuộm sẽ quan sát được dưới ánh sáng tia tử ngoại (UV) So sánh với thang chuẩn DNA có thể ước đoán được khối lượng phân tử các băng DNA