Tuy nhiên, với sự phát triển của khoa học, người ta có thể tổng hợp, bán tổng hợp các kháng sinh tự nhiên chloramphenicol; tổng hợp nhân tạo các chất có tính kháng sinh: sulfamid, quinol
Trang 1VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
- -
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CứU TÁCH CHIếT VÀ PHÂN TÍCH CấU TRÚC KHÁNG
SINH THU ĐƯợC Từ CHủNG Xạ KHUẩN STREPTOMYCES SP KCTC
0041BP SAU KHI ĐÃ ĐộT BIếN MấT GEN GER MIII
Giáo viên hướng dẫn :Th.s Nguyễn Thị Ngọc Anh Sinh viên thực hiên :Nguyễn Hoài Linh
Trang 2em trong su ốt quá trình thực tập và hoàn thành đề tài nghiên cứu của mình
Em xin chân thành c ảm ơn TS Tạ Thị Thu Thủy – Chủ nhiệm khoa Công Nghệ Sinh H ọc – Viện Đại Học Mở Hà Nội, cùng toàn thể các thầy cô giáo, anh chị kĩ thu ật viên các bạn sinh viên Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử đã luôn bên cạnh động viên, khích lệ, ủng hộ em trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu
B ước đầu tìm hiểu, thực hiện đề tài với vốn kiến thức còn hạn chế và nhiều bỡ
ng ỡ Mặc dù bản thân đã có nhiều cố gắng, nhưng không thể tránh khỏi những thi ếu sót nên em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của quý Thầy – Cô để bài khóa lu ận của em được đầy đủ và hoàn chỉnh hơn
Em xin chân thành c ảm ơn!
Hà N ội, ngày 20 tháng 5 năm 2015
Sinh viên
Nguy ễn Hoài Linh
Trang 3MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN i
MỤC LỤC ii
DANH MỤC CÁC HÌNH v
DANH MỤC CÁC BẢNG vi
MỞ ĐẦU 1
PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1 Tổng quan về kháng sinh 4
1.1.1 Lịch sử về kháng sinh 4
1.1.2 Định nghĩa về kháng sinh 4
1.1.3 Phân loại kháng sinh 5
1.1.4 Cơ chế tác dụng của kháng sinh 6
1.1.5 Các nghiên cứu gần đây về kháng sinh 7
1.2 Tổng quan về xạ khuẩn Streptomyces 9
1.2.1 Vai trò của xạ khuẩn trong tự nhiên 9
1.2.2 Giới thiệu về xạ khuẩn Streptomyces 10
1.2.3 Sự hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn 10
1.3 Xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP 11
1.3.1 Đặc điểm nuôi cấy 11
1.3.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 13
1.3.3 Khả năng kháng khuẩn với một số vi sinh vật kiểm định 13
1.3.4 Phân loại 13
1.4 Xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC0041 bp đã được đột biến GerMIII 13
1.5 Tổng quan về kháng sinh dyhidrochalcomycin 14
1.5.1 Cấu trúc của dyhidrochalcomycin 15
1.5.2 Vai trò và hoạt tính sinh học 15
1.5.3 Các nghiên cứu về dihydrochalcomycin 16
1.6 Đại cương về gen gerMIII (2-O-methyltransferase) 21
Trang 42.1 Vật liệu hóa chất và thiết bị 23
2.1.1 Vật liệu 23
2.1.2 Hóa chất 23
2.1.3 Môi trường nuôi cấy 24
2.1.4 Thiết bị 25
2.2 Phương pháp nghiên cứu 25
2.2.1 Phương pháp nuôi cấy chủng vi sinh vật 25
2.2.2 Phương pháp bảo quản giống 27
2.2.3 Phương pháp tách chiết kháng sinh thô bằng dung môi hữu cơ 27
2.2.4 Phương pháp thử hoạt tính kháng sinh bằng khoanh giấy lọc 29
2.2.5 Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography – TLC) 30
2.2.6 Phương pháp Prep – TLC (Prepare TLC) 31
2.2.7 Phương pháp sắc ký lỏng kết hợp khối phổ (Liquid Chromatography Mass) 33
2.2.8 Phương pháp ion hóa tia điện ESI (Electrophoresis Spray Ionization) 34
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35
3.1 Tách chiết kháng sinh thô bằng dung môi hữu cơ 35
3.2 Thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khoanh giấy lọc 36
3.3 Tthử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng TLC 38
3.4 Tinh sạch kháng sinh bằng Prep – TLC (Prepare-TLC) 40
3.5 Kết quả phân tích kháng sinh bằng phương pháp sắc ký lỏng kết hợp khối phổ (LC-Mass) và phương pháp ESI-Mass 41
3.6 Quy trình tách và thu nhận kháng sinh thô quy mô phòng thí nghiệm 43
3.7 Qui trình tinh sạch quy mô phòng thí nghiệm 45
PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 46
4.1 Kết Luận 46
4.2.Đề Xuất 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO 47
Trang 5ESI-Mass Electrophoresis Spray Ionization Mass
Trang 6Hình 1.5 Nhóm gen sinh tổng hợp dihyrochalcomycin phân lập từpGERI-5 cosmid 22Hình 3.1 Phân pha chiết dịch kháng sinh 35Hình 3.2 Sản phẩm kháng sinh của các chủng đã đột biến sau khi quay cô 36
Hình 3.3 Kết quả thử hoạt tính kháng sinh của các chủng Streptomyces sp
KCTC 0041BP đã đột biến 37
Hình 3.4 Kết quả kiểm tra chạy TLC của chủng Streptomyces sp KCTC
0041BP(W) và các chủng đột biến M3-1-10(10), M3-8-13(13) 38Hình 3.6 Kết quả thử hoạt tính kháng sinh sau khi tinh sạch 40 Hình 3.5 Kết quả thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp TLC với chủng
xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP ban đầu(W) và các chủng đột biến
M3-1-10(10), M3-8-13(13) 39Hình 3.7 Kết quả chạy TLC sau khi tách khỏi bột silicagel 41Hình 3.8A và hình 3.8B: Phân tích cấu trúc phân tử Dihydrochalcomycin bằng LC-Mass 42Hình 3.9A và hình 3.9B: Phân tích cấu trúc của dẫn xuất kháng sinh từ chủng đột biến gen GerMIII 43Hình 3.10 Sơ đồ quy trình thu nhận kháng sinh thô 44Hình 3.11 Sơ đồ quy trình tinh sạch quy mô phòng thí nghiệm 45
Trang 7DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Dự đoán chức năng của các gen ORFs trong nhóm gen sinh tổng hợp dihydrochalcomycin 17
Bảng 3.1 Kết quả thử hoạt tính kháng sinh của chủng Streptomyces sp
KCTC 0041BP ban đầu và các chủng đột biến M3-8-13, M3-1-10 37Bảng 3.2 Kết quả thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp TLC với chủng đột biến M3-1-10, M3-8-13 và chủng wild type 38
Trang 8MỞ ĐẦU
Bệnh nhiễm khuẩn là một trong những nguyên nhân hàng đầu đe dọa đến sự
an toàn của con người Những trận đại dịch không những cướp đi sinh mạng con người mà thậm chí còn dẫn đến sự diệt vong của một đế chế hùng mạng Chính điều
đó đã thôi thúc các nhà khoa học trên thế giới phải tìm ra được một chất có khả năng phòng chống và điều trị các bệnh nhiễm khuẩn
Ngày nay với sự phát triển vượt bậc của công nghệ sinh học đã tìm ra rất nhiều chất kháng sinh (CKS) phục vụ đời sống con người Trong số hơn 10.000 CKS được tìm ra thì có khoảng 2.000 chất do thực vật tạo ra, khoảng 8.000 chất là kháng sinh do vi sinh vật tổng hợp, trong đó xạ khuẩn tổng hợp trên 80% [11]
Tuy nhiên, do việc sử dụng các CKS không hợp lý đã làm xuất hiện hiện tượng kháng kháng sinh Số lượng các vi khuẩn kháng với chất kháng sinh ngày càng gia tăng Vì vậy, đi kèm với các biện pháp sử dụng kháng sinh an toàn, hợp lý thì việc nghiên cứu sản xuất ra các chất kháng sinh mới có nhiều đặc tính ưu việt thực sự rất cần thiết
Xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC0041BP đang được nghiên cứu ở nhiều
nước như Hàn Quốc, Việt Nam Đây là chủng hoang dại sinh tổng hợp ra Dihydrochalcomycin và đã được phân lập, xác định cấu trúc hóa học bởi nhóm nghiên cứu tại Hàn Quốc [19]
Kháng sinh Dihydrochalcomycin (C35H58O14) là kháng sinh thuộc nhóm Macrolide 16C, được sử dụng trong điều trị nhiễm trùng đường hô hấp Kháng sinh
Dihydrochalcomycin được tách chiết từ chủng xạ khuẩn Streptomycessp KCTC
0041BP, có tác dụng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn Gr- (Gram âm) và Gr+ (Gram dương) bằng cách liên kết vào tiểu phần 50S của ribosome, ngăn cản quá trình sinh tổng hợp protein của vi khuẩn Nhiều nhà khoa học đã và đang quan tâm nghiên cứu về loại kháng sinh này bởi nhiều ưu điểm vượt trội của nó như ít độc, dung nạp tốt, thải trừ nhanh, có hoạt tính kháng khuẩn rất mạnh và đặc biệt chưa xuất hiện hiện tượng kháng thuốc
Trang 9Các nhóm nghiên cứu trên thế giới xác định toàn bộ nhóm gen của xạ khuẩn này Toàn bộ nhóm gen tham gia sinh tổng hợp có chuỗi trình tự là 75.5kb và có khoảng 23 ORF chứa thông tin di truyền và mã hóa của các gen tham gia con đường
tổng hợpDihydrochalcomycin: gerB, gerM1, gerN, gerR, gerP1, gerP2, gerG, gerE, ger D, gerF, gerM2, gerP3, gerH, gerK1, gerM3, gerT1, gerA, gerS1, gerS2, gerS3, ger S4, gerS5, gerY, gerT2, gerK2 Hiện nay, đã có một số gen được nghiên cứu chứng minh chức năng của chúng là: gerT1, gerT2, gerK1, gerF, gerR, gerM2,
gerM1 [1], [4], [5], [13]
Trong 31 gen tham gia vào quá trình sinh tổng hợp kháng sinh Dihydrochalcomycin, gen gerMIII có chức năng mã hóa tổng hợp enzyme 2- O-methyltransferase.Enzyme2-O-methyltransferase (GerMIII) cùng với 3 - O-methyltransferase (GerMII) sẽ xúc tác phản ứng methyl hóa nhóm -OH tại vị trí C2,
C3 tạo gốc đường D-mycinose
Gen gerMIII đã có khóa luận tốt nghiệp “Nghiên cứu tạo đột biến gen mã hóa cho enzyme 2 - O-methyltransferaza (gen GerM3 ) b ằng phương pháp tiếp hợp trên
x ạ khuẩn Streptomyces sp KCTC0041BP’’ - Ngô Văn Luân (2013) Sau khi đã đột
biến gen gerMIII và đã được chứng minh bằng sàng lọc trên môi trường có bổ sung kháng sinh Apramycin và Neomycin tạo chủng đột biến có trao đổi chéo đơn và chủng có trao đổi chéo kép Tuy nhiên mới bước đầu sàng lọc chủng đột biến có trao đổi kép làm mất gen ger MII Để chứng minh đột biến mất gen ger MII và làm
rõ hơn chức năng của gen ger MII, năm 2014 khóa luận tối nghiệp “Bước đầu nghiên c ứu tách chiết và kiếm tra sản phẩm kháng sinh của chủng xạ khuẩn đột
bi ến gen ger MII từ chủng Streptomyces sp KCTC 0041BP ban đầu” - Nguyễn Thị
Hà (2014)
Tuy nhiên mới bước đầu tách chiết và phân tích một lượng nhỏ sản phẩm kháng sinh từ chủng xạ khuẩn đột biến.Vì vậy nhóm nghiên cứu thực hiện đề tài :
“Nghiên cứutách chiếtvà phân tích cấu trúc kháng sinh thu được từ chủng xạ
khuẩn Steptomyces sp KCTC0041BP sau khi đã đột biến mất gen ger MIII”
Trang 10- Tách chiết và thử hoạt tính kháng sinh thô của chủng xạ khuẩn Streptomyces
sp KCTC 0041BP đã đột biến mất gen gerMIII
- Phân tích cấu trúc kháng sinh thu được từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp
KCTC 0041BP
Nội dung thực hiện:
- Tách kháng sinh thô bằng phương pháp quay cô chân không
- Xác định hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khoanh giấy lọc
- Xác định hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp chạy sắc ký bản mỏng TLC
- Nghiên cứu tách và tinh sạch kháng sinh bằng Prep-TLC(Preparative-TLC)
- Phân tích kháng sinh bằng phương pháp sắc ký lỏng kết hợp phối khổ ( Mass) và phương pháp ESI-Mass
LC Xây dựng quy trình tinh sạch kháng sinh thô trong phòng thí nghiệm
Trang 11PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về kháng sinh
1.1.1 Lịch sử về kháng sinh
Năm 1928, nhà sinh vật học người Anh Alexander Fleming trong khi nghiên cứu tụ cầu ông nhận thấy xung quanh khuẩn lạc mốc xanh nhiễm vào hộp petri nuôi
tụ cầu tạo thành vòng vô khuẩn.Hiện tượng kì lạ này đã được Fleming nghiên cứu,
phân lập thuần khiết và xác định được mốc xanh đó là Penicillium notatum – một
chủng tạo penicillin
Năm 1938, Fleming nhận được thư của hai nhà khoa học từ trường Đại học Oxford là Ernst Boris Chain và Howard Walter Florey, với lời đề nghị được hợp tác với ông để tiếp tục thực hiện công trình nghiên cứu về penicillin và họ đã thử nghiệm thành công penicillin trên chuột vào 1940
Năm 1941, nhóm đã chọn được loại nấm Penicillium ưu việt nhất là chủng Penicillum chrysogenium, chế ra loại penicillin có hoạt tính cao hơn cả triệu lần penicillin do Fleming tìm thấy lần đầu năm 1928
Năm 1945, Fleming được giải thưởng Nobel về y học cùng với Ernst Boris Chain và Howard Walter Florey
Một số kháng sinh khác : sulfornamid được Gerhard Domard (Đức) tìm ra vào năm 1932 và streptomycin được Selman Waksman và Albert Schat tìm ra vào năm
1934 Sau này đặc biệt ở hai thập kỷ cuối của thế kỷ XX, công nghệ sinh học và hóa dược phát triển mạnh, người ta đã tìm ra được rất nhiều loại kháng sinh mới Ngày nay con người biết được khoảng 8000 chất kháng sinh khác nhau có nguồn gốc từ nấm mốc, xạ khuẩn và vi khuẩn, 100 loại được dùng trong Y khoa và Thú y
1.1.2 Định nghĩa về kháng sinh
Thời kì vàng son của kháng sinh bắt đầu từ khi sản xuất penicillin để dùng
trong lâm sàng (1941) Khi đó người ta đã định nghĩa :" Kháng sinh là những sản
ph ẩm trao đổi chất tự nhiên được các vi sinh vật tiết ra (vi khuẩn, vi nấm), có tác
d ụng ức chế sự phát triển hoặc tiêu diệt chọn lọc đối với các vi sinh vật khác", theo
Trang 12Tuy nhiên, với sự phát triển của khoa học, người ta có thể tổng hợp, bán tổng hợp các kháng sinh tự nhiên (chloramphenicol); tổng hợp nhân tạo các chất có tính kháng sinh: sulfamid, quinolon hay chiết xuất từ vi sinh vật những chất diệt được tế
bào ung thư (actinomycin) Vì thế định nghĩa kháng sinh đã được thay đổi: “Kháng sinh là t ất cả các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp với nồng độ rất
th ấp có khả năng đặc hiệu kìm hãm sự phát triển hoặc tiêu diệt đối với các vi sinh
v ật gây bệnh, đồng thời không có tác dụng hoặc tác dụng yếu lên con người, động
v ật và thực vật bằng con đường cung cấp chung”[3]
Để biểu thị độ lớn giá trị hoạt tính sinh học của kháng sinh trong 1 ml dung dịch (đơn vị/ml) hay 1 mg chế phẩm (đơn vị/mg), thường dùng đơn vị kháng sinh Đơn vị kháng sinh là lượng kháng sinh tối thiểu hoà tan trong một thể tích môi trường xác định, có tác dụng ức chế hay tiêu diệt vi sinh vật kiểm định trong thời gian xác định[3] Đơn vị kháng sinh quốc tế là UI, ví dụ 1 UI penicillin = 0,6 µg, còn 1 UI streptomycin = 1,0 µg (Hopwood, 2007)
1.1.3 Phân loại kháng sinh
Việc phân loại nhằm khái quát một cách có hệ thống danh mục các CKS do việc tìm ra các CKS ngày càng nhiều Nhờ đó tiết kiệm thời gian khi nghiên cứu các CKS mới về cấu trúc hoá học, cơ chế tác dụng và khả năng ứng dụng trong công tác chữa bệnh
Có thể phân loại kháng sinh dựa trên nhiều phương diện như phổ tác dụng, cơ chế tác dụng, nguồn gốc, con đường sinh tổng hợp hay cấu trúc hóa học Tuy nhiên, phân loại theo cấu trúc hóa học là phương pháp khoa học nhất, đưa ra một cái nhìn
tổng quát nhất đối với các nhóm kháng sinh
Theo cấu trúc hóa học, kháng sinh được phân thành 9 nhóm chính [3]:
- Nhóm 1: Các kháng sinh cacbonhydrate
- Nhóm 2: Các lactonemacrolide
- Nhóm 3: Các kháng sinh quinolone và dẫn xuất
- Nhóm 4: Các kháng sinh peptide và amino acid
- Nhóm 5: Các kháng sinh dị vòng chứa nitơ
Trang 13- Nhóm 6: Các kháng sinh dị vòng chứa oxy
- Nhóm 7: Các kháng sinh mạch vòng no
- Nhóm 8: Các kháng sinh chứa nhân thơm
- Nhóm 9: Các kháng sinh mạch thẳng
1.1.4 Cơ chế tác dụng của kháng sinh
Các kháng sinh tác dụng cơ bản qua việc ức chế các phản ứng tổng hợp rất khác nhau của tế bào vi sinh vật gây bệnh Chúng liên kết vào các vị trí chính xác hay các phân tử đích của tế bào vi sinh vật mà tạo ra các phản ứng trao đổi chất làm
ức chế hay tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh
Các đích tác dụng đặc trưng cho từng nhóm kháng sinh, tuy nhiên trong nhiều trường hợp người ta vẫn chưa biết được chính xác hết Có 6 mức tác dụng khác nhau đối với tế bào vi khuẩn hoặc nấm: tác dụng lên thành tế bào, tác dụng lên màng nguyên sinh chất, tác dụng lên quá trình tổng hợp DNA, tác dụng lên quá trình tổng hợp protein, tác dụng lên sự trao đổi chất hô hấp và cuối cùng là tác dụng lên sự trao đổi chất trung gian [7]
1.1.4.1 Ức chế quá trình tổng hợp thành tế bào của vi khuẩn
Các β-Lactam ngăn cản sự tổng hợp các mucopeptide, làm rối loạn quá trình nhân lên của vi khuẩn Khi có mặt kháng sinh, vi khuẩn có thể vẫn tiếp tục nhân lên với vách không hoàn chỉnh hoặc không có vách nhưng chúng dễ bị tiêu diệt bởi thực bào, nhân tố lý hóa học
Xycloserin tác động bằng cách ngăn cản tập hợp các tetra và pentapeptide do
ức chế enzym tổng hợp D-alanin
Bacitracin: thay đổi tính thẩm thấu chọn lọc của màng nguyên tương của vi khuẩn
1.1.4.2 Ức chế chức năng của màng tế bào
Thay đổi chức năng năng lượng, ảnh hưởng sự hô hấp tế bào: gramicidin, sideromycin
Kháng sinh gắn lên màng tế bào chất làm thay đổi cân bằng thẩm thấu của màng tế bào như kháng sinh polypeptide: polymycin, colistin và kháng sinh chống
Trang 141.1.4.3 Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein
Nhóm aminoglycoside gắn với receptor trên tiểu phần 30S của ribosome, ngăn cản phức hợp khởi đầu hoạt động bình thường, can thiệp tiếp cận tRNA làm cho quá trình dịch mã không chính xác
Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phần 50S của ribosome ức chế enzyme peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các acid amin mới vào chuỗi polypeptide mới thành lập
Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phần 50S của ribosome làm ngăn cản sự thành lập phức hợp đầu tiên để tổng hợp chuỗi polypeptide
1.1.4.4 Ức chế quá trình tổng hợp nucleic acid
Nhóm refampin gắn với enzyme RNA polymerase ngăn cản quá trình sao mã tạo thành mRNA (RNA thông tin)
Nhóm quinolone ức chế tác dụng của enzyme DNA gyrase làm cho hai mạch đơn của DNA không thể duỗi xoắn làm ngăn cản quá trình nhân đôi của DNA Nhóm sulfamide có cấu trúc giống PABA(paminobenzonic acid) có tác dụng cạnh tranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp nucleic acid
Nhóm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác có quá trình tạo nhân purine làm ức chế quá trình tạo nucleic acid
1.1.4.5 Ức chế quá trình trao đổi chất folate
Folic acid là cơ sở cho sự tổng hợp methionine, purine và pyrimidine, từ đó tổng hợp nên protein và các acid nucleic của vi khuẩn Sulfamid và trimethoprim có cấu trúc hoá học tương tựp-aminobenzoic acid (PABA) và folic acid Khi sử dụng, sulfamid đối kháng cạnh tranh với PABA một tiền chất để tổng hợp folic acid, sẽ gây thiếu purine, nucleic acid Trimethoprim ức chế dihydrofolate reductase ngăn quá trình chuyển hóa dihydrofolate thành tetrahydrofolate (dạng hoạt động của folic acid), làm cho sự hoạt động của tế bào bị rối loạn
1.1.5 Các nghiên cứu gần đây về kháng sinh
Những năm 1940 – 1959 được coi là thời kỳ hoàng kim của việc nghiên cứu CKS với hàng loạt CKS mới liên tiếp được phát hiện như : gramixidin, tiroxidin do Rene
Trang 15Jules Dobos phát hiện năm 1939, streptomycin do Waksman phát hiện năm 1941, erythromycin do Gurre phát hiện năm 1952…Cùng với việc phát hiện ra các CKS mới, công nghệ lên men sản xuất CKS cũng ra đời và dần được hoàn thiện [21]
Ngay từ những năm 1950, CKS đã được nghiên cứu sử dụng trong việc phòng chống bệnh, kích thích sự tăng trưởng của động vật nuôi và cây trồng CKS thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực khác nhau trên thế giới Tốc độ tìm kiếm các CKS trong thời gian gần đây vẫn diễn ra nhanh chóng, nhiều trung tâm nghiên cứu khoa học về y học, dược phẩm và nông nghiệp tại nhiều nước trên thế giới vẫn liên tục phát triển được hàng loạt các CKS mới có giá trị ứng dụng trong thực tiễn
Năm 1999 một chất kháng sinh mới khác được phát hiện có tác dụng ngăn chặn hiện tượng cholesterol, tăng sức đề kháng đối với các chất độc của chuột, ngoài ra kháng sinh này còn có hoạt tính chống nấm gây bệnh mạnh Đó là kháng
sinh loposomal HA – 92, được tách từ xạ khuẩn Streptomyces CDRLL – 312
Năm 2003, nhiều nước trên thế giới vẫn tiếp tục phát hiện được hàng loạt các CKS mới Tại Nhật Bản, chất kháng sinh mới là yatakemycin đã được tách chiết từ
xạ khuẩn Streptomycessp TP – A0356 bằng phương pháp sắc ký cột CKS này có khả năng kìm hãm sự phát triển của nấm Aspergillus fumigalus và Candida albicans Ngoài ra chất này còn có khả năng chống lại các tế bào ung thư [5]
Năm 2007, tại Hàn Quốc đã phân lập được loài xạ khuẩn Streptomyces sp
C684 sinh CKS laidlomycin, chất này có thể tiêu diệt cả những tụ cầu đã kháng methicillin và các cầu khuẩn kháng vancomycin [28]
Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học hiện đại cùng sự hỗ trợ của nhiều ngành khoa học khác đã giúp cho việc tìm kiếm và ứng dụng CKS đạt được những thành tựu rực rỡ Để sản xuất CKS con người không chỉ tìm kiếm những chủng vi sinh vật sinh CKS từ tự nhiên mà còn cải tạo chúng bằng nhiều phương pháp như dùng kỹ thuật di truyền và công nghệ gen, gây đột biến định hướng, chọn dòng gene sinh tổng hợp, tạo và dung hợp tế bào trần để tạo ra các chủng có hoạt
Trang 16tính kháng sinh cao, đồng thời nhằm mục đích tìm kiếm các loại kháng sinh mới và quý trong thời gian ngắn [10], [26]
1.2 Tổng quan về xạ khuẩn Streptomyces
1.2.1 Vai trò của xạ khuẩn trong tự nhiên
Xạ khuẩn (Actinobacteria) thuộc chủng vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên Chúng có trong đất, nước, rác, phân chuồng, bùn, thậm chí
cả trong cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được
Theo Waskman thì trong một gam đất có khoảng 29.000 - 2.400.000 mầm xạ khuẩn, chiếm 9-45% tổng số VSV [22]
Sự phân bố của xạ khuẩn còn phụ thuộc nhiều vào độ pH môi trường, chúng
có nhiều trong các lớp đất trung tính và kiềm yếu hoặc axit yếu 6,8 - 7,5 Xạ khuẩn
có rất ít trong lớp đất kiềm hoặc axit và càng hiếm trong các lớp đất rất kiềm, số lượng xạ khuẩn trong đất cũng thay đổi theo thời gian trong năm
Trong quá trình trao đổi chất, xạ khuẩn còn có thể sinh ra các chất hữu cơ như các loại vitamin nhóm B (B1, B2, B6, B12), một số acid hữu cơ như acid lactic, acid acetic; acid amin như acid glutamic, metionin, tryptophan, lizin
Một trong những đặc tính quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành chất kháng sinh, 60 - 70% xạ khuẩn được phân lập từ đất có khả năng sinh chất kháng sinh Cho tới nay khoảng hơn 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới thì có tới 80% là do xạ khuẩn sinh ra [3] Trong số đó có trên 15% có nguồn
gốc từ các loại xạ khuẩn hiếm như Micromonospora Actinomadura, Actinoplanes, Streptoverticillium, Streptosporangium… Điều đáng chú ý là các xạ khuẩn hiếm đã
cung cấp nhiều chất kháng sinh có giá trị đang dùng trong y học như gentamixin, tobramixin, vancomixin, rosamixi
Ngoài ra, xạ khuẩn tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hoá nhiều hợp chất trong đất, nước Dùng để sản xuất nhiều enzym như proteaza amylaza, xenluloza…một số axit amin và axit hữu cơ
Một số xạ khuẩn có thể gây bệnh cho người, động vật Các bệnh này được gọi tên chung là Actinomycosis [11]
Trang 171.2.2 Giới thiệu về xạ khuẩn Streptomyces
Chi Streptomyces là một giống xạ khuẩn bậc cao được Wakman và Henrici đặt
tên năm 1943 [27]
Đường kính sợi xạ khuẩn khoảng 1 - 10 µm, khuẩn lạc thường không lớn và
có đường kính khoảng 1 - 5 mm Khuẩn lạc chắc, dạng da mọc đâm sâu vào cơ chất
Bề mặt khuẩn lạc thường được phủ bởi khuẩn ti khí sinh dạng nhung, dày hơn cơ chất, đôi khi có tính kỵ nước
Xạ khuẩn chi Streptomyces sinh sản vô tính bằng bào tử Trên đầu sợi khí sinh
hình thành cuống sinh bào tử và chuỗi bào tử Cuống sinh bào tử có những hình dạng khác nhau tùy loài: thẳng, lượn sóng, xoắn, có móc, vòng Bào tử được hình thành trên cuống sinh bào tử bằng hai phương pháp phân đoạn và cắt khúc Bào tử
xạ khuẩn có hình bầu dục, hình lăng trụ, hình cầu với đường kính khoảng 1,5 µm Màng bào tử có thể nhẵn, gai, khối u, nếp nhăn tùy thuộc vào loài xạ khuẩn và môi trường nuôi cấy Thường trên môi trường có nguồn đạm vô cơ và glucoza, các bào
tử biểu hiện các đặc điểm rất rõ
Màu sắc của khuẩn lạc và hệ sợi khí sinh cũng rất khác nhau tùy theo nhóm Streptomyces, màu sắc này cũng có thể biến đổi khi nuôi cấy trên môi trường khác nhau Vì vậy mà ủy ban Quốc tế về phân loại xạ khuẩn ISP đã nêu ra các môi trường chuẩn và phương pháp chung để phân loại nhóm VSV này
Các loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có cấu tạo giống vi khuẩn Gr (+),
hiếu khí, dị dưỡng các chất hữu cơ Nhiệt độ tối ưu thường là 25-30ºC, pH tối ưu 6,5 - 8,0 Một số loài có thể phát triển ở nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn (xạ khuẩn
ưa nhiệt và ưa lạnh) Chi xạ khuẩn này có khả năng tạo thành số lượng lớn các CKS
ức chế vi khuẩn, nấm sợi, các tế bào ung thư, virus và nguyên sinh động vật [23]
1.2.3 Sự hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn
Một trong những đặc điểm quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành CKS Trong số 8000 CKS hiện biết trên thế giới có trên 80% là có nguồn gốc
từ xạ khuẩn [3]
Trang 18Một trong những tính chất của các CKS có nguồn gốc từ VSV nói chung và từ xạ
khuẩn nói riêng là có tác dụng chọn lọc Mỗi CKS chỉ có tác dụng với một nhóm VSV
nhất định Hầu hết CKS có nguồn gốc xạ khuẩn đều có phổ khángkhuẩn rộng Khả
năng kháng khuẩn của các CKS là một đặc điểm quan trọng để phân loại xạ khuẩn
Có nhiều quan điểm khác nhau về khả năng hình thành CKS Một số tác giả
cho rằng sự hình thành CKS là do cơ chế giúp cho VSV tồn tại trong môi trường tự
nhiên Số khác cho rằng, sự hình thành CKS là do sự cạnh tranh trong môi trường
dinh dưỡng Hầu hết các tác giả cho rằng kháng sinh là sản phẩm chuyển hóa thứ
cấp được hình thành vào cuối pha tích lũy thừa, đầu pha cân bằng của chu kỳ sinh
trưởng [14]
Mặc dù CKS có cấu trúc khác nhau và VSV sinh ra chúng cũng đa dạng,
nhưng quá trình sinh tổng hợp chúng chỉ theo một số con đường nhất định
- CKS được tổng hợp từ một chất chuyển hóa sơ cấp, thông qua một chuỗi
phản ứng enzym
- CKS được hình thành từ hai hoặc ba chất chuyển hóa sơ cấp khác nhau
- CKS được hình thành bằng con đường polyme hóa các chất chuyển hóa sơ cấp, sau đó tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzym khác
Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều CKS có
cấu trúc hóa học và có tác dụng tương tự nhau Quá trình sinh tổng hợp CKS phụ
thuộc vào cơ chế điều khiển đa gene, ngoài các gene chịu trách nhiệm tổng hợp
CKS, còn có cả các gene chịu trách nhiệm tổng hợp các tiền chất, enzym và
cofactor
1.3. Xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP
1.3.1 Đặc điểm nuôi cấy
Năm 1996, chủng Streptomyces.spKCTC 0041BP có khả năng tạo CKS
Dihydrochalcomycin được Kim và cs phân lập tại Hàn Quốc Đặc điểm nổi bật của
xạ khuẩn là có hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh và không có vách ngăn (chỉ trừ
cuống bào tử khi hình thành bào tử) Hệ sợi mảnh, đường kính thay đổi trong
khoảng 0,2 - 2 µm
Trang 19Xạ khuẩn Streptomyces sp.KCTC 0041BP sinh sản vô tính bằng bào tử Trên
đầu sợi khí sinh hình thành cuống bào tử và chuỗi bào tử Cuống sinh bào tử có hình thẳng hoặc lượn sóng (Rf - Rectiflexibiles) Bào tử được hình thành trên cuống sinh bào tử bằng hai phương pháp phân đoạn và cắt khúc Bào tử có hình bầudục, hình lăng trụ, hình cầu với đường kính khoảng 1,5 µm Bề mặt bào tử trơn nhẵn Sm (Smooth) Màng bào tử có nếp nhăn trên môi trường ISP2
Khuẩn lạc thường không lớn, có đường kính khoảng 1 - 5 mm Khuẩn lạc rắn chắc, mọc đâm sâu vào cơ chất Bề mặt khuẩn lạc thường được bao phủ bởi khuẩn ti
khí sinh dạng nhung, dày (Hình 1) Nó có khả năng phát triển tốt trên môi trường
ISP1, ISP2, ISP4, Gause 2 và R2YE, đặc biệt là môi trường ISP2 và R2YE
Hình 1.1 Khu ẩn lạc của chủng Streptomyces sp KCTC 0041BP trên
môi tr ường ISP2
Trang 20Hình 1.2 Hình d ạng KTKS và KTCC của chủng Streptomyces sp KCTC 0041BP
phóng đại (× 4.500-15.000)
1.3.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
Chủng Streptomyces sp KCTC 0041BP có thể sinh trưởng trong dải nhiệt độ
25 - 32 °C, thích hợp nhất ở 28 – 30 °C và hoàn toàn không phát triển được ở 37 °C hoặc cao hơn
Chủng phát triển tốt ở khoảng pH = 6 ÷ 9 Ở pH< 6 hoặc pH > 9 thì chủng
phát triển kém hoặc không phát triển Chủng Streptomyces sp KCTC 0041BP hình
thành sắc tố melanin trên môi trường thạch tyrosine (ISP-7)
1.3.3 Khả năng kháng khuẩn với một số vi sinh vật kiểm định
Xạ khuẩn Streptomyces sp.KCTC 0041BP sinh kháng sinh có khả năng ức chế
vi khuẩn Gr (+) và vi khuẩn Gr (-) Tuy nhiên, kháng sinh này có khả năng ức chế cao hơn đối với vi khuẩn Gr (+) Điều này được giải thích bởi vi khuẩn Gr (-) có lớp thành tế bào dày và nhiều lớp hơn so với vi khuẩn Gr (+), vì vậy chúng ít chịu ảnh hưởng bởi kháng sinh hơn Trong các vi khuẩn Gr+ được nghiên cứu, khả năng ức
chế vi sinh vật của xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP lên vi khuẩn Bacillus cereus là lớn nhất (D = 21,33 mm), tiếp theo là vi khuẩn Bacillus subtilis (D =
1.4. Xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC0041 bp đã được đột biến GerMIII
Gen GerMIII thuộc nhóm gen tham gia vào con đường sinh tổng hợp kháng
sinh Dihydrochalcomycin từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP đã
được đăng bản quyền trên gen bank với mã số AY 118081
Trang 21Trong 31 gen tham gia vào con đường sinh tổng hợp, gen GerMIII được dự đoán với chức năng là mã hóa, tổng hợp enzyme 2-O-methyltransferase Enzyme 2-O-methyltransferase (GerMIII) cùng với 3-O-methyltransferase (GerMIII) sẽ xúc tác phản ứng methyl hóa nhóm –OH tại vị trí C2, C3 tạo gốc đường D-mycinose Theo kết quả nghiên cứu, hoạt tính và chức năng của gen GerMIII đã được chứng minh bằng phương pháp đột biến gen (tiếp hợp gen) để tạo chủng xạ khuẩn đột biến không có chứa gen GerMIII
Tiếp tục phân tích đánh giá sản phẩm trung gian từ chủng xạ khuẩn đột biến gen GerMIII, tách chiết và tinh sạch hợp chất có hoạt tính sinh học mới
1.5 Tổng quan về kháng sinh dyhidrochalcomycin
Macrolide là kháng sinh được sử dụng để chống nhiều vi khuẩn là cầu khuẩn
Gr+ hiếu khí và kị khí, tác dụng tốt với vi khuẩn nội bào (Mycoplasma, Rickettsia, Chlamydia ), điều trị nhiễm trùng gây ra bởi Haemophilus influenzae, nhiễm trùng
đường hô hấp và nhiễm trùng mô mềm … Kháng sinh macrolide là sản phẩm tự
nhiên chiết xuất từ xạ khuẩn Streptomyces, có phổ kháng khuẩn rộng hơn so với
kháng sinh penicillin, có khả năng thấm sâu vào ổ mủ nên là một chọn lựa tốt cho phòng ngừa nhiễm khuẩn hô hấp, có tác dụng hiệp lực với polypeptide, sulfamid
Nhóm macrolide có độc tính rất thấp, thường chỉ sốt, nôn mửa, dị ứng da
Kháng sinh macrolide cấu tạo gồm một vòng lactone lớn (có từ 12-16 nguyên
tử C) gắn với các phân tử đường bằng các liên kết glycosidic Dựa vào số nguyên tử
C trong vòng lactone, kháng sinh macrolide được chia thành 3 nhóm: macrolide 12C, 14C và 16C Trong đó, kháng sinh nhóm macrolide 16C có vai tròquan trọng nhất với nhiều ưu điểm vượt trội hơn so với macrolide l2C và 14C vì kháng sinh
nhóm này chưa xuất hiện hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn [22]
Có nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng kháng sinh thuộc nhóm macrolide có khả năng ức chế cạnh tranh trung tâm hoạt động của enzyme petidyltransferase của tế bào vi khuẩn như carbomycin, spiramycin, chalcomycin nhưng duy nhất chỉ có kháng sinh macrolide l6C có thể liên kết trực tiếp với trung tâm hoạt động của
Trang 22Với nhiều ưu điểm như vậy kháng sinh nhóm macrolide 16C là nhóm kháng sinh đang được nỗ lực nghiên cứu bởi rất nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới với mục tiêu chính là: tạo ra các kháng sinh không bị ảnh hưởng bởi cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn và từ đó nghiên cứu và phát triển nhóm kháng sinh polyketide synthase (PKS) thế hệ mới
1.5.1 Cấu trúc của dyhidrochalcomycin
Dihydrochalcomycin có công thức phân tử là (C35H58O14), tan trong Aceton, Benzen, Chloroform, Ethylacetat, Methanol, không tan trong nước và n – Hexan (Kim và cs, 1996)
Dihydrochalcomycin thuộc nhóm kháng sinh macrolide 16C, là sản phẩm trao đổi chất bậc 2 của chủng xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP, được tách chiết lần đầu tiên và xác định cấu trúc năm 1996
Hình 1.3.C ấu trúc của Dihydrochalcomycin [19]
Về cấu trúc, kháng sinh dihydrochalcomycin cấu tạo gồm 3 thành phần chính: Trung tâm là macrocylic lacton, phần trung tâm được gắn với 2 gốc đường khử là D-mycinose và D-chalcose lần lượt tại vị trí C20 và C5 thông qua cầu nối O-glycosydic Hai gốc đường này tham gia tạo tính tan và tính gắn với đích tác dụng thuốc có vai trò vô cùng quan trọng trong việc thể hiện hoạt tính sinh học trong các chất chứa nó và trong kháng sinh này (Ta Thi Thu Thuy và cs, 2008) [14]
1.5.2 Vai trò và hoạt tính sinh học
Trang 23Qua nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng, kháng sinh dihydrochalcomycin đã biểu hiện hoạt tính kháng khuẩn rất mạnh có thể ức chế và tiêu diệt cả vi khuẩn Gr- và
Gr+ Đã phân lập thành công chủng xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP tạo
ra chất kháng sinh này, đồng thời cấu trúc hóa học của kháng sinh này cũng được xác định bởi nhóm nghiên cứu tại Hàn Quốc, kháng sinh này được xác định là chất dẫn xuất của kháng sinh chalcomycin đã được xác định trước đó bởi nhóm nghiên cứu khác [15],[20] Mặc dù toàn bộ cơ chế tác dụng của dihydrochalcomycin chưa được nghiên cứu hoàn toàn đầy đủ nhưng một số nghiên cứu đã khẳng định hoạt tính sinh học của dihydrochalcomycin hoàn toàn tương tự như hoạt tính của kháng
sinh chalcomycin và mycinamycin [18]
Nghiên cứu về cấu trúc tinh thể phóng xạ để xác định cơ chế hoạt động của kháng sinh, nhóm của Hansen đã chứng minh được cấu trúc nhân macrocyclic lactone của kháng sinh này hình thành phức hệ và gắn với tiểu phần lớn của ribosome vi khuẩn tại điểm tách chuỗi polypeptide ra khỏi tâm hoạt động của enzyme peptidyltransferase Từ đó kháng sinh này có hoạt tính ức chế sinh tổng hợp protein của vi khuẩn [15], [19]
1.5.3 Các nghiên cứu về dihydrochalcomycin
1.5.3.1 Lập thư viện gen và giải trình tự nhóm gen sinh tổng hợp dyhidrochalcomycin
Qua thời gian nghiên cứu cấu trúc dihydrochalcomycin, kháng sinh này được xác định cấu trúc bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR – Nuclear Magnetic Resonance) và được phân loại thuộc nhóm kháng sinh PKS loại I Nhóm nghiên cứu đã tách và lập được thư viện gen, tách được nhóm gen tham gia vào con đường sinh tổng hợp dihydrochalcomycin từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp.KCTC 0041BP Toàn bộ nhóm gen tham gia sinh tổng hợp có chuỗi trình tự là 75,5kb đã được xác định trong đó có chứa 23 ORFs chứa thông tin di truyền, mã hóa cho các gen tham gia con đường sinh tổng hợp dihydrochalcomycin Đồng thời các gen này cũng được dự đoán cấu trúc (Bảng 1.1) Trình tự các gen này đã được đăng bản quyền trên GenBank với mã số AY118081 [11]
Trang 24Bảng 1.1 Dự đoán chức năng của các gen ORFs trong nhóm gen sinh tổng hợp
3,4-dehydratase like protein O-methyltransferase
NDP-4,6- dideoxyhexose 3,4-enoyl reductase Beta glucosidase
Cytochrome P450 hydroxylase Cytochrome P450 hydroxylase Type II thioesterase
dTDP-glucose 4,6- dehydratase Alpha-D-glucose - 1-phosphate thymidyltransferase NDP-hexose 3-epimerase
3 - O-methyltransferase Cytochrome P450 Ferredoxin dTDP-hexose 4-ketoreductase
2 - O-methyltransferase
Glycosyltransferase rRNA methyltransferase PKS[LM(KSQ,AT,ACP)M1(KS,AT,KR,ACP), M2(KS,AT,DH,KR,ACP)]
Post-PKS reductase Putative transcriptional regulator
1.5.3.2 Tách và dự đoán chức năng nhóm gen tham gia sinh tổng hợp đường chalcose và D-mycinose
D-Các gen tham gia sinh tổng hợp đường khử D-chalcose và D-mycinose đã được xác định và giải trình tự từ pGERI-5 cosmid So sánh độ tương đồng về trình
Trang 25tự các chuỗi amino acid của các gen trong cosmid với trình tự amino acid của các gen đã biết trên ngân hàng gen thế giới GenBank Các gen tham gia sinh tổng hợp 2 gốc đường khử này đã được dự đoán cấu trúc, từ đó dự đoán được con đường sinh tổng hợp gốc đường này
Trong con đường sinh tổng hợp, dTDP-4-keto-6-deoxyglucose là gốc đường trung gian cho quá trình tổng hợp cả 2 gốc đường chalcose và mycinose, được tổng hợp từ glucose-1-phosphate với hoạt tính xúc tác của các enzyme GerD có chức năng là dTDP-glucose synthase và GerE có chức năng là dTDP-glucose 4,6-dehydartase
Quá trình sinh tổng hợp đường D-chalcose bắt đầu từ gốc đường trung gian keto-6-deoxyglucose với hoạt tính xúc tác của các enzyme 3,4-isomerase (GerY) để tạo đồng phân, tiếp theo là phản ứng loại nhóm OH bởi 3,4-dehydratase (GerB) và phản ứng khử của enzyme 3,4-enoylreductase (GerN) để tạo ra 3-keto-4,6-dideoxyglucose Sản phẩm tại vị trí 3-keto sẽđược chuyển thành 3'-OH nhờ enzyme 3-ketoreductase (GerKII) tạo dTDP-4,6-dideoxyglucose Tiếp đó, gốc đường này được chuyển đến nối với nhân macrolide tại vị trí C5 nhờ hoạt tính xúc tác của chalcosylglycosyltransferase (GerTII) và cuối cùng methyl hóa nhóm -OH tại vị trí C3 nhờ hoạt động của enzyme O-methyltransferase (GerMI) tạo gốc đường D-chalcose
4-Gốc đường D-mycinose đã được nghiên cứu trong cấu trúc kháng sinh tylosin
vì vậy con đường sinh tổng hợp đã được chứng minh trong các nghiên cứu về kháng sinh này [2] Phản ứng sinh tổng hợp được bắt đầu từ dTDP-4-keto-6-deoxyglucose
để tạo thành dTDP-D-allose với xúc tác của hai enzyme 3-epimerase (GerF) và ketoreductase (GerKI) Tiếp theo là phản ứng gắn gốc đường allose vào nhân macrolacton tại vị trí C20 nhờ hoạt tính xúc tác của glycosyltransferase (GerTI).Cuối cùng hai enzyme 2-O-methyltransferase (GerMIII) và 3-O-methyltransferase (GerMII) xúc tác phản ứng methyl hóa nhóm OH tại vị trí C2, C3 tạo gốc đường D-mycinose
Trang 264-Bước cuối cùng hoàn thành cấu trúc kháng sinh dihydrochalcomycin với hoạt động của enzyme hydroxylase (GerPI)xúc tác gắn nhóm OH vào vị trí C8, và enzyme epoxidase (GerPII) với hoạt tính tạo vòng lacton tại vị trí C12-C13 của vòng dihydromacrolacton [10]
Hình 1.4 D ự đoán con đường sinh tổng hợp gốc đường khử và bước cuối hoàn
thành c ấu trúc kháng sinh dihydrochalcomycin [10]
1.5.3.3 Sinh tổng hợp dTDP-6-deoxy-β-D-allose, chứng minh hoạt tính của
dTDP-4-keto-6-deoxyglucose reductase (GerKI)
Trong nghiên cứu này nhóm đã chứng minh hoạt tính và vai trò của gen GerKI trong sinh tổng hợp D-mycinose GerKI mã hóa cho enzyme 4-ketoreductase, tham gia phản ứng xúc tác chuyển gốc đường 4-keto-6-deoxyglucose thành 6-deoxy-D-allose Cùng với kết quả này sản phẩm được tạo thành đó là dTDP-6-deoxy-D-allose đã được xác định cấu trúc bằng phân tích NMR và HPLC (sắc ký lỏng hiệu năng cao) Kết quả nghiên cứu này có ý nghĩa khoa học rất quan trọng bởi vì đây là
Trang 27đường khử hoàn toàn mới lần đầu tiên được tổng hợp nhờ phản ứng enzyme invitro
và nhờ đó đã tìm ra phương pháp sinh tổng hợp một gốc đường quan trọng [10]
1.5.3.4 Chứng minh hoạt tính của gen glycosyltransferases GerTI và GerTII bằng
ph ương pháp gây đột biến gen
Theo kết quả nghiên cứu, hoạt tính và chức năng của gen GerTI và GerTII đã được sáng tỏ bằng phương pháp đột biến gen để tạo chủng đột biến không có chứa GerTI và GerTII Chức năng của gen này là mã hóa cho sinh tổng hợp enzyme glycosyltransferase Các enzyme này tham gia vận chuyển và gắn gốc đường mycinose
và chalcose vào nhân macrolacton Phân tích đánh giá sản phẩm trung gian từ chủng đột biến, nhóm nghiên cứu còn chứng minh được bước cuối cùng của quá trình hình thành kháng sinh và thu được hợp chất có hoạt tính sinh học mới [10]
1.5.3.5 Nghiên cứu biểu hiện gen GerF trong nhóm gen sinh tổng hợp gốc đường
kh ử dTDP-6-deoxy-D-allose
Kết quả nghiên cứu biểu hiện gen GerF trong tế bào vi khuẩn E coli
BL21(DE3)đã chứng minh hoạt tính của gen GerF mã hóa cho enzyme keto-6-deoxyglucose 3-epimerase, xúc tác tạo đồng phân quang học chuyển vị trí -
dTDP-4-OH ở vị trí C3 của đường dTDP-4-keto-6-deoxyglucose, tham gia vào chuyển hóa đường dTDP-4-keto-6-deoxyglucose thành đường dTDP-6-deoxy-D-allose trong quá trình sinh tổng hợp đường khử D-mycinose trong cấu trúc kháng sinh
dihydrochalcomycin Kết quả enzyme GerF được biểu hiện thành công trên E coli
BL21 (DE3) có khối lượng phân tử là 38kDa, đồng thời xác định được điều kiện thích hợp để biểu hiện gen GerF và enzyme này được sinh ra ở dạng tan là ở 26oC, trong 8h, nồng độ IPTG 10mmol[10]
1.5.3.6 Nghiên cứu gây đột biến gen gerMI mã hóa cho enzyme methyltransferase c ủa chủng xạ khuẩn Streptomyces sp.KCTC 0041BP bằng
O-ph ương pháp tiếp hợp
Trong kết quả nghiên cứu này đã chứng minh được chức năng của gen gerMI trong con đường sinh tổng hợp kháng sinh dihydrochalcomycin của chủng xạ khuẩn
Trang 28hợp enzyme O-methyltransferase, xúc tác phản ứng methyl hóa nhóm -OH tại vị trí
C3 của đường dTDP-4,6-dideoxyglucose tạo gốc đường D-chalcose trong cấu trúc kháng sinh dihydrochalcomycin Kết quả tạo được vector đột biến gen gerMI trong
vector pKC1139 và biến nạp thành công vào tế bào E coli ET 12567/pUZ8002[14] 1.5.3.7 Nghiên cứu tạo đột biến gen mã hóa cho enzyme 2-O-methyltransferaza (gen gerMIII) b ằng phương pháp tiếp hợp trên xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP
Kết quả đã tiếp hợp chuyển gen Plasmid pKC 1139 chứa đoạn gen đột biến UM3 – NeoR – DM3 vào tế bào xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041 hoang dại
trên môi trường MS agar thành công Sàng lọc được các chủng xạ khuẩn trên môi trường R2YE có bổ sung kháng sinh Neo và Apr để tạo chủng có trao đổi chéo đơn
và trao đổi chéo kép
Kết quả tạo được vector đột biến gen gerMIII trong vector pKC1139 và biến
nạp thành công vào tế bào E coli ET 12567/pUZ8002[13]
1.5.3.8 Bước đầu nghiên cứu tách chiết và kiểm tra sản phẩm kháng sinh của
ch ủng xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP
Nhóm đã bước đầu tách chiết thành công AND tổng số của chủng xạ khuẩn
Streptomyces sp KCTC 0041BP sau đột biến Đã sàng lọc được các chủng
M3-1-10, M3-8-21, M3-3-13 có xảy ra quá trình trao đổi chéo kép làm mất gen gerMIII bằng phản ứng nhân gen PCR thành công với các cặp mồi đặc hiệu Giải trình tự gen chứng minh chủng xạ khuẩn đã đột biến gen ger MII thành công Bước đầu chứng minh được chức năng của gen ger MIII trong con đường sinh tổng hợp kháng
sinh dihydrochalcomycin của chủng xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP
1.6 Đại cương về gen gerMIII (2-O-methyltransferase)
Gen gerMIII thuộc nhóm gen tham gia vào con đường sinh tổng hợp kháng
sinh dihydrochalcomycin từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP Toàn
bộ nhóm gen sinh tổng hợp có chuỗi trình tự là 75,5kb , trong đó có 23 ORFs chứa thông tin di truyền mã hóa các gen tham gia vào con đường sinh tổng hợp kháng
