Phân lập và xác định các đặc tính sinh học của chủng vi khuẩn PHOTOBACTERIUM DAMSELAE gây bệnh tụ huyết trùng ở cá biển nuôi lồng tại hải phòng

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ------ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA CHỦNG VI KHUẨN PHOTOBACTERIUM DAMSELAE GÂY BỆNH TỤ HU

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -





 -

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:

PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA CHỦNG

VI KHUẨN PHOTOBACTERIUM DAMSELAE GÂY BỆNH TỤ HUYẾT

TRÙNG Ở CÁ BIỂN NUÔI LỒNG TẠI HẢI PHÒNG

Giáo viên hướng dẫn: TS Phạm Thị Tâm Sinh viên thực hiện: Trương Thu Hương Lớp: 1102

Hà Nội – 2015

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến TS Phạm Thị Tâm, người đã tận tình hướng dẫn, dìu dắt em trong suốt quá trình em thực tập và hoàn thành khóa luận này

Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ thuộc Khoa Công nghệ sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi nhất cho

em có thể thực tập và hoàn thành khóa luận này

Cuối cùng, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân đã luôn ở bên em cổ vũ, động viên, cảm ơn các anh-chị, bạn bè trong phòng thí nghiệm Vi Sinh, khoa Công Nghệ Sinh Học, Viện Đại Học Mở Hà Nội đã luôn tận tình giúp đỡ trong suốt thời gian em thực tập và hoàn thiện đề tài này

Trong quá trình thực tập không tránh khỏi được những sai sót, kính mong các thầy cô giáo, các anh-chị và các bạn đóng góp ý kiến để cá nhân em tiếp thu và hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 26 tháng 5 năm 2015 Sinh viên

Trương Thu Hương

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

2.1 Mục tiêu chung 2

2.2 Mục tiêu cụ thể 2

3 Ý nghĩa của đề tài 3

3.1 Ý nghĩa khoa học 3

3.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

4 Thời qian và địa điểm nghiên cứu 3

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Lịch sử phát triển nuôi trồng thủy sản 4

1.1.1 Lịch sử phát triển nuôi trồng thủy sản trên thế giới 4

1.1.2 Lịch sử phát triển nuôi trồng thủy sản trong nước 5

1.2 Lịch sử phát hiện bệnh do vi khuẩn Photobacterium damselae 7

1.2.1 Lịch sử phát hiện bệnh trên thế giới 7

1.2.2 Lịch sử phát hiện bệnh ở Việt Nam 7

1.3 Tổng quan về vi khuẩn Photobacterium damselae 8

1.3.1 Phân loại khoa học 8

1.3.2 Đặc điểm hình thái 9

1.3.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 9

1.3.4 Đặc điểm gây bệnh của Photobacterium damselae 10

1.3.5 Độc tố vi khuẩn và cơ chế gây bệnh 13

1.3.6 Khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn Photobacterium damselae 14

1.3.7 Các phương pháp kiểm tra sự có mặt của Photobacterium damselae 15

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 16

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.1.2 Động vật thí nghiệm 16

2.1.3 Môi trường và hóa chất 16

2.1.4 Thiết bị và dụng cụ 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 21

2.2.1 Phương pháp thu và xử lý mẫu 22

2.2.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn P.damselae 22

2.2.3 Phương pháp hóa sinh 24

2.2.4 Phương pháp nghiên cứu tính kháng kháng sinh của một số chủng vi khuẩn P.damselae phân lập 25

2.2.5 Phương pháp gây nhiễm động vật thí nghiệm 26

2.2.6 Phương pháp đánh giá sự ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến sự phát triển và khả năng gây dung huyết của vi khuẩn P.damselae 26

PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn Photobacterium damselae gây bệnh trên cá biển nuôi lồng 27

3.2 Xác định sự ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến sự phát triển và khả năng gây dung huyết của vi khuẩn P.damselae 31

3.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian nuôi cấy 32

3.2.2 Ảnh hưởng của pH 34

3.2.3 Ảnh hưởng của độ mặn (NaCl) 36

3.3 Kết quả thử nghiệm khả năng kháng kháng sinh của các chủng Photobacterium damselae phân lập được 37

3.3 Khả năng gây bệnh cho cá mú của chủng vi khuẩn phân lập 39

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Biểu đồ nuôi trồng thủy sản toàn cầu theo vùng năm 2012 4

Hình 1.2 Biểu đồ sản lượng thủy sản Việt Nam qua các năm 1995-2012 6

Hình 1.3 Hình thái vi khuẩn P.damselae dưới kính hiển vi điện tử 9

Hình 2.1 Sơ đồ tiếp cận nội dung nghiên cứu của đề tài 21

Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc trên môi trường Marine agar 28

Hình 3.2 Hình thái vi khuẩn P.damselae soi dưới kính hiển vi điện tử 28

Hình 3.3 Hình thái khuẩn lạc khi ria trên môi trường TCBS 29

Hình 3.4 Kết quả thử nghiệm các phản ứng sinh hóa 31

Hình 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian nuôi cấy đến sự phát triển của vi khuẩn P.damselae 33

Hình 3.6 Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của vi khuẩn P.damselae 35

Hình 3.7 Ảnh hưởng của độ mặn đến sự phát triển của vi khuẩn P.damselae 36

Hình 3.8 Đánh giá khả năng kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn P.damselae phân lập 38

Hình 3.9 Dấu hiệu bệnh lý của cá sau gây nhiễm 41

Hình 3.10 Hình ảnh kết quả phân lập lại của các chủng P.damselae 42

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các đặc tính sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn P.damselae 10

Bảng 2.1 Thiết bị chính dùng trong nghiên cứu 20 Bảng 3.1 Các mẫu bệnh phẩm và đặc điểm hình thái của các chủng phân lập

từ các mẫu bệnh phẩm mang các biểu hiện nhiễm Photobacterium 27 Bảng 3.2: Các đặc tính sinh hóa điển hình của vi khuẩn Photobacterium

damselae phân lập trên cá biển nuôi lồng 30 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian nuôi cấy đến khả năng gây dung huyết của vi khuẩn P damselae T1.7 và T1.8 34 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của pH đến khả năng gây dung huyết của vi khuẩn 35 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của độ mặn đến khả năng gây dung huyết của 37

Bảng 3.6: Khả năng kháng kháng sinh của các chủng P.damselae phân lập 37 Bảng 3.7: Kết quả cảm nhiễm trên cá mú bởi vi khuẩn P.damselae 40

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Những năm gần đây, nghề nuôi trồng thủy sản (NTTS) đã không ngừng phát triển và ngày càng chiếm vị trí quan trọng trong ngành Thủy sản nói riêng và kinh tế đất nước nói chung Với kim ngạch xuất khẩu năm 2010 đạt 4,94 tỷ USD, thủy sản

là một trong ba ngành có đóng góp lớn nhất cho tổng kim ngạnh xuất khẩu của Việt Nam Trong sự phát triển chung của ngành NTTS thì nuôi biển được coi là chiến lược hàng đầu và mở ra nhiều hứa hẹn với mục tiêu xuất khẩu trong tương lai Các đối tượng nuôi biển chủ yếu là cá, tôm hùm, động vật thân mềm và rong biển trong

đó cá có nhiều tiềm năng để phát triển nuôi với quy mô công nghiệp Thống kê của

Bộ Thuỷ sản năm 2006, số lồng nuôi cá biển ở nước ta có 16.319 lồng, tổng sản lượng cá nuôi đạt 3.508 tấn Trong đó, vùng nuôi tập trung chủ yếu ở Hải Phòng (Vịnh Lan Hạ, Bến Bèo - Cát Bà) có 6.000 lồng, với sản lượng nuôi 1.200 tấn; Quảng Ninh (Vịnh Hạ Long) có 5.700 lồng, với sản lượng đạt 1.300 tấn; Kiên Giang (huyện đảo Phú Quốc) có 131 lồng, sản lượng nuôi đạt 90 tấn

Tuy nhiên, khi nghề nuôi cá biển phát triển thì người nuôi cũng gặp không ít khó khăn, trong đó, vấn đề lo ngại lớn nhất là dịch bệnh gây ra trên cá Qua một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng những tác nhân gây bệnh chủ yếu trên cá biển nuôi lồng thường là virus, nấm và vi khuẩn trong đó nguy hiểm nhất là bệnh tụ huyết trùng

(xuất huyết nhiễm trùng) do vi khuẩn Photobacterium damselae gây ra Vi khuẩn

tấn công và gây bệnh trên cá biển nuôi ở tất cả các giai đoạn phát triển của cá từ giai đoạn ấu trùng, cá giống đến cá nuôi thương phẩm Khi bị bệnh cá có thể biểu hiện ở dạng mãn tính và cấp tính, biểu hiện bệnh tụ huyết trùng như: gây loét trên da, xuất hiện các nốt kem trắng hoặc u hạt tubercules màu trắng ở một số cơ quan nội tạng, gây hoại tử trong nội tạng, hoại tử tập trung ở thận và lá lách, gây nhiễm trùng và hoại tử rộng rãi [30] Dấu hiệu lâm sàng của cá bệnh như: cá ăn kém, da tối mầu, mang hoại tử Cá bệnh có thể chết sau 5-10 ngày với tỷ lệ chết cao từ 80-100% gây thiệt hại kinh tế ở các nước như: Nhât, Mỹ, Pháp, Tây Ban Nha, Hy Lạp, Thổ Nhĩ

Kỳ, Ở Việt Nam, bệnh phân bố ở hầu hết các vùng nuôi trên cả nước Bệnh xảy ra hầu hết các giai đoạn của cá, vì vậy, việc tìm ra phương pháp phòng và trị bệnh có thể hạn chế những tổn thất do dịch bệnh gây ra là hết sức cần thiết

Thực tế hiện nay, trong NTTS, người dân thường sử dụng nhiều hóa chất và kháng sinh để khống chế vi khuẩn này, song việc sử dụng kháng sinh có thể gây hiện tượng nhờn thuốc và không mang lại hiệu quả cao Vi khuẩn này có khả năng tạo ra màng bảo vệ (biofilm) trước thuốc diệt khuẩn và kháng sinh Chính vì thế, dịch bệnh thường bùng phát trở lại rất nhanh sau khi thuốc hết tác dụng Mặt khác,

dư lượng kháng sinh trong sản phẩm từ cá biển có thể gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng thịt cá và sức khỏe của con người Để giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh điều trị bệnh và đảm bảo chất lượng sản phẩm từ cá biển, việc nghiên cứu các giải pháp phòng bệnh trong đó hướng đến sản xuất vắc-xin phòng bệnh tụ huyết trùng ở

cá biển mang tính bền vững và hết sức cần thiết

Xuất phát từ lý luận và thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành đề tài:

“Phân lập và xác định đặc tính sinh học của chủng vi khuẩn Photobacterium

damselae gây bệnh tụ huyết trùng trên cá biển nuôi lồng tại Hải Phòng” làm cơ

sở ban đầu hướng đến việc sản xuất vắc-xin phòng bệnh tụ huyết trùng ở cá biển

trên quy mô công nghiệp

2 Mục tiêu nghiên cứu

2.1 Mục tiêu chung

Phân lập và xác định được các đặc tính sinh học điển hình của vi khuẩn

Photobacterium damselae.

2.2 Mục tiêu cụ thể

- Phân lập được 06-08 chủng vi khuẩn P.damselae từ mẫu bệnh phẩm một số

loài cá biển (cá mú, cá hồng, cá bớp) nghi mắc bệnh tụ huyết trùng ở cá biển nuôi lồng tại Cát Bà

- Xác định được các đặc tính sinh học của chủng vi khuẩn P damselae phân lập

được: khả năng sinh enzym catalase, tryptophanase, khả năng sử dụng các loại đường, khả năng sinh H2S, khả năng sinh hơi, khả năng gây dung huyết

- Xác định khả năng gây bệnh của các chủng P.damselae phân lập

- Xác định tính kháng kháng sinh của các chủng P.damselae phân lập

3 Ý nghĩa của đề tài

4 Thời qian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian nghiên cứu từ 9/2014 đến 5/2015 tại Phòng Vi Sinh, khoa Công Nghệ Sịnh Học, Viện Đại Học Mở Hà Nội

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lịch sử phát triển nuôi trồng thủy sản

1.1.1 Lịch sử phát triển nuôi trồng thủy sản trên thế giới

Lịch sử của nghề nuôi trồng thủy sản trên thế giới đã được bắt đầu từ khoảng

500 năm trước công nguyên tại Trung Quốc với loài cá được nuôi đầu tiên là cá

chép (Cyprinus carpio) Hình thức sơ khai là thu cá giống từ sông để ương nuôi

trong ao vùng nước ngọt Nghề nuôi cá chép sau đó được lan rộng ra nhiều nơi ở Châu Á, Trung Đông và Châu Âu do sự di dân của người Hoa Trong khi đó, loài cá

nước lợ được nuôi đầu tiên là loài cá Măng (Chanos chanos) vào thế kỷ 15 tại

Indonesia

Trên thế giới, Châu Á cho sản lượng thủy sản nuôi trồng lớn nhất, chiếm 89% tổng sản lượng và 77% tổng giá trị sản phẩm thủy sản nuôi trồng thế giới năm 2006 Năm 2006, tổng sản lượng nuôi trồng thủy sản thế giới là 51 triệu tấn và sản lượng khai thác là 92 triệu tấn Trong số này, Trung Quốc chiếm 66,7% tổng sản lượng nuôi, các nước Châu Á khác chiếm 22,8%, và các nước khác còn lại ở Châu Âu, Châu Mỹ, Úc,… chiếm 10,5% [1,5]

Hình 1.1 Biểu đồ nuôi trồng thủy sản toàn cầu theo vùng năm 2012

Trong những năm qua, sản lượng nuôi trồng thủy sản thế giới tăng trưởng với tốc độ vừa phải Theo báo cáo mới nhất của FAO, năm 2012, sản lượng nuôi trồng thủy sản đạt mức cao kỷ lục, 90,4 triệu tấn, tương đương 144,4 tỷ đô la Mỹ; trong

đó có 66,6 triệu tấn thủy sản các loại (137,7 tỷ đô la Mỹ) và 23,8 tỷ tấn thực vật

thủy sinh nuôi(chủ yếu là tảo biển), tương đương 6,4 triệu đô la Mỹ Các đối tượng nuôi bao gồm cá có vẩy, động vật giáp xác, động vật thân mềm, ếch, bò sát (không tính cá sấu) và các loài thủy sản khác phục vụ cho nhu cầu tiêu dùng của con người Năm 2013, sản lượng nuôi trồng thủy sản đạt 70,5 triệu tấn, tăng 5,8%; trong đó, sản lượng các loài thực vật thủy sinh là 26,1 triệu tấn

Sản lượng nuôi trồng thủy sản chiếm tỷ trọng ngày càng tăng trong tổng sản lượng thủy sản toàn cầu (158 triệu tấn), từ 20,9% năm 1995 lên 32,4% năm 2005 và 40,3% năm 2010 và ở mức cao kỷ lục là 42,2% trong năm 2012 Châu Á chiếm tỷ trọng cao nhất trong tổng sản lượng nuôi toàn cầu 54%, châu Âu chiếm 18% và các châu lục còn lại <15%

Trong giai đoạn 2000-2012, sản lượng nuôi toàn cầu có mức tăng trưởng trung bình hàng năm là 6,2%, giảm so với mức tăng trưởng trong giai đoạn 1980-1990 và giai đoạn 1990-2000 tương ứng là 10,8% và 9,5% Giai đoạn 1980-2012, sản lượng nuôi toàn cầu tăng trưởng ở mức 8,6%/năm Sản lượng nuôi toàn cầu tăng gấp đôi,

từ 32,4 triệu tấn trong năm 2000 lên mức 66,6 triệu tấn năm 2012

Dự báo, giai đoạn 2013 - 2022, ngành nuôi trồng thủy sản vẫn duy trì tốc độ tăng trưởng ổn định, với mức tăng trung bình 2,4%/năm, đạt 181 triệu tấn vào năm

2022 và tăng 18% so với mức trung bình giai đoạn 2010 - 2012 Đến năm 2030, sản lượng nuôi trồng thủy sản dự kiến tăng thêm 30 triệu tấn và đóng góp khoảng 62% nguồn cung thủy sản toàn cầu

Nuôi trồng thủy sản sẽ tiếp tục mở rộng ra khắp các châu lục, với sự đa dạng của các loài nuôi và hình thức sản phẩm Các nước châu Á sẽ tiếp tục chiếm phần lớn sản lượng nuôi trồng thủy sản của thế giới Năm 2030, các nước Đông Nam Á

sẽ đóng góp 15,9% thị phần và Ấn Độ, 9,2%.Trung Quốc dự kiến sẽ đóng góp 56,9% tổng sản lượng nuôi trồng thủy sản toàn cầu [6]

1.1.2 Lịch sử phát triển nuôi trồng thủy sản trong nước

Ở Việt Nam, nghề nuôi trồng thủy sản (NTTS) cũng phát triển rất năng động Nghề nuôi thủy sản truyền thống bắt đầu từ thập niên 1960, tuy nhiên trong vòng 10 năm nay, nghề nuôi thủy sản có tốc độ phát triển rất nhanh chóng Theo thống kê của Bộ Thủy sản (2006) thì năm 1999 cả nước có tổng cộng trên 524.619 ha, đạt sản lượng 480.767 tấn Năm 2005, cả nước có gần 1.000.000 ha nuôi thủy sản, đạt

sản lượng 1.437.356 tấn, trong đó, sản lượng nuôi thủy sản nước lợ - măn là 546.716 tấn, sản lượng nuôi nước ngọt đạt 890.650 tấn [1,5]

Theo Tổng cục Thủy sản, giai đoạn 2006 - 2010, diện tích NTTS tăng đều qua từng năm, đến năm 2010, sản lượng tăng gấp 6 lần so với chỉ tiêu đề ra trong kế hoạch Tốc độ tăng trưởng bình quân về diện tích tăng 1,7%/năm; sản lượng tăng trung bình 12,9%/năm, từ 1.694 nghìn tấn năm 2006 lên 2.828 nghìn tấn năm 2010 Giá trị sản xuất thủy sản tăng từ 25.898 tỷ đồng năm 2006 lên 36.150 tỷ đồng năm

2010, tăng trưởng 8,7%/năm

Hình 1.2 Biểu đồ sản lượng thủy sản Việt Nam qua các năm 1995-2012

Trong giai đoạn 1995-2012, sản lượng thủy sản Việt Nam đã duy trì tăng trưởng liên tục với mức tăng bình quân là 9,07%/năm Đến năm 2014, tổng sản lượng thủy sản đạt 6,3 triệu tấn, trong đó nuôi trồng thủy sản đạt 3,6 triệu tấn; giá trị xuất khẩu thủy sản đạt 7,92 tỷ USD, tăng 18% so với năm 2013, góp phần thúc đẩy phát triển nền kinh tế của cả nước và đem lại nhiều lợi nhuận cho người dân Tuy nhiên, tình hình dịch bệnh thủy sản vẫn còn xảy ra ở nhiều nơi [3] Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, năm 2014, kim ngạch xuất khẩu thuỷ sản đạt trên 7,9 tỷ USD, tăng 18% so với năm 2013 và vượt 13% so với mục tiêu 7 tỷ USD Đây được xem là con số ấn tượng của ngành thuỷ sản trong năm 2014 và vượt qua những kịch bản lạc quan nhất Tuy nhiên, theo nhiều chuyên gia, xuất khẩu thuỷ sản, năm 2015 ngành này vẫn còn nhiều khó khăn do chưa giải quyết triệt để những tồn tại và còn phụ thuộc nhiều vào yếu tố thị trường bên ngoài [6]

1.2. Lịch sử phát hiện bệnh do vi khuẩn Photobacterium damselae

1.2.1 Lịch sử phát hiện bệnh trên thế giới

Bệnh tụ huyết trùng (pseudotuberculosi) hay còn được gọi là xuất huyết

nhiễm trùng, gây ra bởi vi khuẩn ưa mặn Photobacterium damselae (P.damselae)

Nó lần đầu tiên được phân lập từ các quần thể cá rô trắng (Morone americanus) hoang dã và cá vược (M saxatilis) vào năm 1963 ở vịnh Chesapeake, Hoa Kỳ, hiện

là tác nhân gây bệnh của nhiều loại cá biển Căn bệnh này có ảnh hưởng lớn về kinh

tế cả ở Nhật Bản, và ở khu vực Địa Trung Hải, do nó gây ra thiệt hại trong các trang trại cá tráp và cá chẽm [26] Từ năm 1969, căn bệnh này đã là một trong những bệnh nguy hiểm tại Nhật Bản (Kusuda & Yamaoka, 1972) Từ năm 1990 nó đã gây

ra thiệt hại về kinh tế ở các nước châu Âu khác nhau trong đó có Pháp, Ý, Tây Ban

Nha, Hy Lạp, Thổ Nhĩ Kỳ, Bồ Đào Nha và Malta [24]

Bệnh lý bùng phát phụ thuộc vào nhiệt độ và thường xảy ra khi nhiệt độ nước tăng lên trên 18-20°C Dưới nhiệt độ này, cá ở tình trạng ủ bệnh (Romalde, 2002) [32]

Vi khuẩn P.damselae có khả năng tuân thủ và xâm nhập vào tế bào biểu mô

cá Khả năng xâm nhập này đã được chứng minh trước đây bởi Magariños et al (1996) và Yoshida et al (1997) Tuy nhiên, đây là nghiên cứu đầu tiên của động

học và độ đặc hiệu của quá trình này Hình ảnh bằng chứng của giai đoạn trong

tế bào của P.damselae bên trong tế bào biểu mô cá được cung cấp bởi các quan

sát bằng kính hiển vi điện tử và kỹ thuật huỳnh quang hiển vi ánh sáng Với đặc tính chọn lọc diệt vi khuẩn ngoại bào, kháng sinh Gentamycin được sử dụng trong các xét nghiệm Gentamycin để xác nhận sự xâm nhập vào biểu mô cá của

P.damselae [19]

1.2.2 Lịch sử phát hiện bệnh ở Việt Nam

Ở Việt Nam, một số loài cá thuộc họ các mú, cá giò, cá vược cũng đã phát

hiện sự hiện diện của P.damselae Trong đó có các loài E.coioides, E.fuscogutatus, E.tauvina, E.lanceolatus, E.malabaricus ở Khánh Hoà; loài E.coioides ở Cát Bà (Hải Phòng) và Cửa Hội (Nghệ An) Bệnh tụ huyết trùng trên cá biển tại Việt Nam

được báo cáo lần đầu tiên vào năm 2002 trên cá mú (Epinephelus spp) nuôi lồng trên vịnh Hạ Long Kết quả điều tra ở huyện Vân Đồn, Quảng Ninh (2002) có số lồng bị bệnh Bệnh xuất hiện từ tháng 5 đến tháng 10, nhiệt độ thích hợp bệnh phát triển 25-300C

Kết quả điều tra sơ bộ của Khoa Nông Lâm Ngư – Trường đại học Vinh cho thấy cá nuôi tại vùng biển Nghệ An, Thanh Hóa thường gặp bệnh có dấu hiệu tương

tự như bệnh tụ huyết trùng Tuy nhiên, cho tới nay ở Việt Nam vẫn chưa có một báo cáo khoa học cụ thể nào về tình hình dịch bệnh

Biểu hiện bệnh lý bên ngoài cho thấy khi mắc bệnh, cá thường bỏ ăn, màu sậm

đi, mang và nội tạng xuất huyết Bệnh cấp tính cá chết sau 3-5 ngày với tỉ lệ cao, có thể từ 80-100%

1.3. Tổng quan về vi khuẩn Photobacterium damselae

1.3.1 Phân loại khoa học

Loài: Photobacterium damselae

Theo Love và các cộng sự, ban đầu Photobacterium damselae được mô tả như một loài Vibrio gây bệnh mới, gây lở loét ở Chromis punctipinnis Kể từ đó, các báo

cáo về khả năng gây bệnh đối với nhiều loài cá khác nhau (cá bơn, cá hồi vân, cá tráp, cá vược, cá mập) và động vật có vú (cá heo, con người) đã tăng lên rất nhiều

Ban đầu, P.damselae được mô tả như Vibrio damselae, sau đó chúng được phân loại lại là một thành viên trong chi Listonella Đến năm 1991, được chuyển giao cho các chi Photobacterium Trong một nghiên cứu sau đó của Gauthier và các cộng sự

(1995) về các tác nhân gây bệnh tụ huyết trùng ở một số loài cá đã xác định chủng

vi khuẩn này là một thành viên của Photobacterium damselae bằng phương pháp

phân tích loài theo các trình tự 16S rDNA và DNA [18]

1.3.2 Đặc điểm hình thái

Hình 1 3 Hình thái vi khuẩn P.damselae dưới kính hiển vi điện tử

Photobacterium damselae là trực khuẩn Gram âm, kích thước khoảng 0.5 - 0.8

µm x 0.7 - 2.6 µm, lưỡng cực [10]

1.3.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

Về điều kiện nuôi cấy, vi khuẩn phát triển tốt nhất trên môi trường có nồng độ NaCl từ 1,0%- 2,5%, nhiệt độ nuôi cấy từ 15ºC- 32,5ºC Không phát triển trong môi trường có nồng độ NaCl 0%, 8%, 10%, 12% và không thể phát triển nếu thiếu Na+ Môi trường nuôi cấy cấp 1 tốt nhất là môi trường Brain Heart Infusion Agar (BHI agar), Thiosulfate Citrate Bile Salt Sucrose (TCBS), Marine Agar hoặc môi trường thạch máu cừu (2% máu cừu) không bổ sung thêm muối Khuẩn lạc trên môi trường thạch máu có màu xám, đục, đường kính khoảng 1mm, viền trơn, gây dung huyết dạng β và quan sát được rõ ràng sau 48h ở nhiệt độ 28ºC [19,15]

Vi khuẩn bắt màu Gram âm, nhuộm lưỡng cực, khi nhuộm thường thấy vi khuẩn bắt màu sẫm ở hai đầu, ở giữa nhạt hơn do hiện tượng nguyên sinh chất bị

dung giải về hai đầu của vi khuẩn Là vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí tùy tiện; không có

khả năng phát quang và không sinh bào tử Dương tính với các phản ứng oxidase, catalase, methyl red, khử nitrate, sinh acid từ glucose Âm tính với các phản ứng indol, citrate, phân giải gelatin, không sinh H2S (phản ứng KIA), không sử dụng sucrose (trong môi trường TCBS) [33]

Bảng 1.1 Các đặc tính sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn P.damselae [33]

Các phản ứng sinh lý, sinh hóa Photobacterium damselae

-

-

V

- +

- +

-

+

- +

- + +

-

V + (+) dương tính; (-) âm tính; (V) dương tính hoặc âm tính

1.3.4. Đặc điểm gây bệnh của Photobacterium damselae

loài cá có tầm quan trọng kinh tế trong nuôi trồng thủy sản (cá Mú, cá Giò, cá Tráp,

cá Bống bớp, cá Vược) đã chịu rất nhiều thiệt hại do P.damselae gây ra [7]

Các báo cáo gần đây về sự cô lập của tác nhân gây bệnh này từ cá biển bị bệnh

trên các loài nuôi mới, cho rằng P.damselae có thể được coi như là một tác nhân

gây bệnh mới nổi trong nuôi trồng thủy sản biển (Labella et al, 2011)

P.damselae được tìm thấy nhiều hơn trong các loài cá biển trong những tháng thời tiết ấm áp, khi hầu hết các dịch truyền nhiễm đã lây lan Phát hiện này cho thấy

P damselae đã xuất hiện ít nhiều trong cá khỏe mạnh được nuôi trong cùng khu vực

bị nhiễm bệnh và số lượng cá bị nhiễm tăng khi nhiệt độ lên cao, nâng cao khả năng

nhiễm trùng cùng với loài Vibrio spp khác Sự lây lan giữa cá bệnh sang cá khỏe mạnh đang xảy ra ngày càng nhiều, vì có nhiều cá nhiễm P damselae mà không có

triệu chứng biểu hiện bên ngoài nên người nuôi không biết để phòng trị

Tác nhân gây bệnh có thể lây nhiễm sang các loài cá mới thông qua nước, và

sự lây lan của căn bệnh này phụ thuộc phần lớn vào nhiệt độ nước và độ mặn [16] Bệnh thường xảy ra với tỷ lệ chết rất cao vào các tháng mùa hè, tại các thời điểm khác trong năm cá chết rải rác Sự bùng phát bệnh phụ thuộc vào nhiệt độ và thường xảy ra khi nhiệt độ nước tăng lên trên 18oC, dưới nhiệt độ này cá ở tình trạng ủ bệnh

[32] Dấu hiệu điển hình của cá nhiễm P.damselae là xuất hiện vùng xuất huyết và

tổn thương loét trên bề mặt cơ thể Cá bệnh hầu hết có triệu chứng chung khá điển hình trên nhiều loài: xuất hiện vết loét trên da, cá kém ăn hoặc bỏ ăn, da màu sẫm Giải phẫu bên trong cơ thể cho thấy: thận bị sưng, xuất hiện các đốm trắng dạng hạt trong mô thận, gan tuỵ [27], mang và nội tạng xuất huyết, hoại tử trong nội tạng, hoại tử tập trung ở thận và lá lách, gây nhiễm trùng và hoại tử rộng rãi Bệnh cấp tính cá chết sau 3-5 ngày với tỉ lệ cao, có thể từ 80-100% Trong cá trinh nữ, vết loét thường xảy ra trong khu vực của các vây ngực và cuống đuôi và có thể đạt 5-20mm Trong khi ở cá bơn các triệu chứng đáng chú ý nhất là xuất huyết sâu rộng trong mắt, miệng và hàm Trong cá ngừ, các u hạt bao quanh mô hoại tử và vi khuẩn thường xuất hiện nhiều trong lá lách, thận và gan của cá nhiễm [27]

Hầu hết các bệnh nhiễm trùng đã được báo cáo gây ra bởi P.damselae ở người

có nguồn gốc chính từ những vết thương ngoài da khi tiếp xúc với nguồn nước biển

hoặc dụng cụ trong quá trình xử lý đối tượng mang mầm bệnh và một số trường hợp xảy ra sau khi ăn hải sản [8,9,20,22,30]

Các bệnh nhân bị nhiễm P.damselae phát triển suy đa cơ quan trong vòng vài

giờ sau khi khởi phát triệu chứng ban đầu, mặc dù đã điều trị hóa trị liệu chuyên sâu

và điều trị phẫu thuật Trong một trường hợp tử vong được báo cáo trong năm 1984, một bệnh nhân đã bị thương trong khi xử lý cá da trơn, vết thương xảy ra trên tay và hiện tượng phù nề đã lan rộng ra cẳng tay trong vòng chưa đầy 24 giờ [12] Trong một trường hợp tử vong khác được báo cáo, một bệnh nhân bị thương trong khi xử

lý cá, chủng vi khuẩn P.damselae được phân lập trong môi trường nhân tạo từ các

mẫu vết thương của người này nhưng không được phân lập từ mẫu máu [17] Những đối tượng trong nhóm này đều có sức khỏe bình thường và chỉ bị nhiễm bệnh khi có các vết thương hở tiếp xúc với mầm bệnh Thông qua các dữ liệu và quan sát cho thấy rằng, sự lây nhiễm từ cá bệnh đem lại nguy cơ rất cao gây hại cho sức khỏe con người và những người suy giảm miễn dịch có nguy cơ lây nhiễm lớn hơn đặc biệt là nếu họ bị thương trong khi chế biến xử lý cá Do đó các cá nhân nên thực hiện theo biện pháp phòng ngừa thích hợp, chẳng hạn như đeo găng tay và sử dụng xà phòng kháng khuẩn [12]

Hiện nay, trên thế giới đã xuất hiện rất nhiều trường hợp bệnh nhân bị nhiễm

P.damselae với tỷ lệ tử vong cao

P.damselae tồn tại trong môi trường nước mặn, bắt buộc phải có Na+, chúng được tìm thấy quanh năm nhưng chưa có một kết luận nào về mùa vụ phát triển bệnh của nó Tuy nhiên, vào mùa đông thì số lượng vi khuẩn rất ít, có thể phân lập khi sử dụng môi trường tăng sinh chọn lọc

P.damselae cũng được phân lập từ lớp dịch nhầy, chất bẩn tích tụ trong lồng nuôi hoặc từ mẫu nước nuôi cá bị bệnh Cá sống sót sau dịch bệnh có thể trở thành

nguồn mang mầm bệnh P.damselae trong nước [28]

Cá có thể được gây nhiễm bằng cách tiêm, ngâm, cho ăn thức ăn chứa vi khuẩn, nuôi chung cá khoẻ với cá bệnh

P damselae, tác nhân gây bệnh tụ huyết trùng ở cá Chúng có khả năng dung huyết trên đĩa thạch máu cừu (dạng β) Mức độ khác nhau giữa các tán huyết

P.damselae đã được phân lập Hai kiểu hình hemolytic tách biệt có thể được quan sát thấy trên đĩa thạch máu, với các chủng cho thấy một quầng tán huyết lớn (LH)

và các chủng sản xuất một quầng tán huyết nhỏ (SH), ngoài ra có các chủng lại có thể được mô tả như vừa tán huyết (MH) [12,13,14,21,24]

1.3.5 Độc tố vi khuẩn và cơ chế gây bệnh

Photobacterium damselae , trước đây là Vibrio damselae, là một tác nhân gây

bệnh của một loạt các động vật biển như cá, động vật giáp xác, động vật thân mềm

và các loài thú biển Ở con người, nó có thể gây ra nhiễm trùng và có thể phát triển thành hoại tử fasciitis gây tử vong Mặc dù các cơ sở di truyền về độc lực của vi khuẩn ở đây không phải là hoàn toàn sáng tỏ, nhưng những phát hiện gần đây chứng minh rằng phospholipase-D dly (damselysin) và các chất độc tạo thành HlyApl và HlyAch đóng một vai trò chính trong độc lực cho homeotherms và poikilotherms Việc tìm ra các plasmid độc lực pPHDD1 mã hóa dly và HlyApl đã có khả năng tạo

cơ sở chính cho sự phát triển của một dòng cao huyết tán trong phân loài Ngoài ra, trường hợp các chủng thiếu pPHDD1 cũng có khả năng gây bệnh mạnh mẽ cho nhiều loài cá cho thấy sự tồn tại của các yếu tố độc lực có khả năng gây bệnh rất

lớn Phân tích sâu hơn về trình tự bộ gen hoàn chỉnh của P.damselae chắc chắn sẽ

cung cấp một bức tranh rõ ràng hơn về các yếu tố độc lực của loại vi khuẩn này gây bệnh ở các phạm vi khác nhau [34]

Thành phần chính trong các sản phẩm ngoại bào có liên quan đến độc lực bao gồm các protease, hemolysins (Norqvist et al., 1990; Toranzo & Barja, 1993) Những cơ chế này có thể gây phá hủy mô tế bào và gây xuất huyết, đóng một vai trò quan trọng trong sự xâm nhập của các vi khuẩn gây bệnh trong cơ thể cá (Finkelstein et al., 1992; Silva et al., 2003) Tuy nhiên, Osorio và các cộng sự (2000) đã chứng minh rằng sự có mặt của các sản phẩm ngoại bào này không phải

là điều kiện quyết định cho khả năng phát sinh độc lực gây bệnh của chủng vi khuẩn này Một số protease trong sản phẩm ngoại bào của vi khuẩn cũng được coi là yếu

tố độc lực ở nhiều vi khuẩn gây bệnh (Ishihara et al., 2002; Miyoshi et al., 2002;

Farto et al., 2006) Protrease hạn chế sự hoạt động của enzym đã được phát hiện ở

P.damselae bao gồm cả phosphatases, esteraza, amylase và glycosidases [34]

Rất ít thông tin về các yếu tố độc lực của P damselae gây nhiễm trùng huyết ở

động vật thủy sản và con người Một thông tin ban đầu đã được quan sát thấy giữa

khả năng gây bệnh của P.damselae ở chuột và cho sản lượng lớn một độc tố tiêu tế bào Chuẩn bị dly lấy từ phần tinh khiết trong môi trường nuôi cấy cho thấy khả

năng chống lại hồng cầu của 16 loài động vật homeotherm, và chuột là loài động vật nhạy cảm hơn Các nghiên cứu khác đã báo cáo rằng các sản phẩm ngoại bào của vi khuẩn này cũng có hoạt tính gây dung huyết trên hồng cầu cá bơn Một đặc tính sâu

sắc hơn về dly cho thấy nó có hoạt động D-phospholipase chống sphingomyelin, phosphatidylcholine và phosphatidylethanolamine Các gen độc tố dly, được nhân

bản vô tính và trình tự của nó đã được xác định Tuy nhiên, bối cảnh của bộ gen của

gen dly vẫn khó nắm bắt, các quan sát ban đầu thấy rằng chủng cao huyết tán mang lại đột biến tự phát và giảm đáng kể hoạt động tán huyết khi đã bị mất gen dly [13]

Nghiên cứu ban đầu đã chứng minh rằng, ảnh hưởng lớn nhất của khả năng

dung huyết của P.damselae gây nguy hiểm cho chuột Trên thực tế, các nghiên cứu

trước đây đã báo cáo rằng liều gây tử vong cho người, cá gần như giống nhau đến 50% liều gây tử vong cho chuột Các nghiên cứu khác đã báo cáo rằng, các chủng

thiếu gen dly vẫn cho thấy tính độc đối với chuột và cá, điều này chỉ ra rằng dly

không phải là một điều kiện tiên quyết cho độc lực vi khuẩn này [14, 21, 24] Ngoài

ra, các sản phẩm ngoại bào của chủng độc lực không có sự hiện diện của gen dly

cũng gây chết cho cá và chuột, cũng như gây độc cho người [14, 21] Điều này cho

thấy các yếu tố độc lực khác không phải là gen dly cũng có thể đóng một vai trò

quan trọng trong yếu tố gây bệnh của vi khuẩn này, nhưng bản chất của chúng vẫn chưa được biết

1.3.6. Khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn Photobacterium damselae

Theo nghiên cứu của Pasqualina Laganà và cộng sự (2011) [25], thử nghiệm

tính mẫn cảm của các chủng P.damselae phân lập ở một số trang trại nuôi trồng thủy sản ở Ý cho thấy các chủng P.damselae phân lập có khả năng kháng với một

số loại kháng sinh bao gồm: ampicillin, carbenicillin, kanamycin, cefalothin; trong

khi đó lại mẫn cảm với các loại kháng sinh gồm: chloramphenicol, nitrofurantoin và tobramycin

Theo nghiên cứu của Toranzo et al (1991), Bakopoulos et al (1995) và Sano (1998) các kháng sinh được sử dụng rộng rãi nhất để điều trị tụ huyết trùng bao gồm Amoxicillin, Chloramphenicol, Erythromycin, Florfenicol, Flumequine, axit oxolinic, oxytetracycline, nitrofurazone, trimethoprim sulfadiazine- và tetracycline [11]

Tuy nhiên, Thyssen và Ollevier (2001) đã nghiên cứu tính nhạy cảm với một

số kháng sinh của P.damselae phân lập từ các khu vực địa lý khác nhau Cho thấy,

phần lớn các chủng (93%) kháng với Erythromycin và một tỷ lệ thấp (dưới 10%) kháng với Amoxicillin, Ampicillin, Florfenicol và Trimethoprim-sulfamethoxazole Trong khi đó các chủng vi khuẩn lại rất nhạy cảm với Kanamycin, Florfenicol và trimethoprim-sulfamethoxazole [29]

Nghiên cứu khả năng kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn gây bệnh là cơ

sở quan trọng để đưa ra các biện pháp trong phòng và điều trị bệnh trên cá nuôi biển Hiện nay, chưa có một công trình nghiên cứu nào trong nước công bố về khả

năng kháng kháng sinh của vi khuẩn P.damselae phân lập tại Việt Nam

1.3.7. Các phương pháp kiểm tra sự có mặt của Photobacterium damselae

Có nhiều phương pháp được sử dụng để phát hiện P.damselae như dựa vào

quan sát hình thái dưới kính hiển vi điện tử, các đặc tính sinh hóa và các kỹ thuật sinh học phân tử như PCR, RAPD…

Theo Kudo và cộng sự, các loài P.damselae khi nuôi cấy trên môi trường chọn

lọc Thiosulfate Citrate Bile Salt Sucrose (TCBS) có khuẩn lạc màu xanh lá cây

[28] Ngoài ra, P.damselae còn phát triển trên môi trường khác là môi trường thạch

nước biển cho thấy các khuẩn lạc có màu nâu đỏ hoặc trắng đục, trơn, tròn và lồi

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Các mẫu cá biển có các biểu hiện của bệnh tụ huyết trùng được thu thập ở vùng biển quanh khu vực đảo Cát Bà

2.1.2 Động vật thí nghiệm

Động vật thí nghiệm: Cá mú có trọng lượng 50-100g, khỏe mạnh được nuôi trong bể nuôi phòng thí nghiệm

2.1.3 Môi trường và hóa chất

Một số môi trường sử dụng cho phân lập và nuôi cấy

- Môi trường Marine agar

- Môi trường Brain Heart Infusion (BHI) Broth

Dung dịch xanh bromothymol 0,2%

- Môi trường Kligler Iron Agar (KIA)

- Môi trường thạch máu

- Hóa chất

Các loại hóa chất tinh khiết cần thiết cho các kỹ thuật vi sinh và hóa sinh của các hãng: Sigma, Bio-Basic, Invitrogen, Biological, Merck…bao gồm: Ampicilin, Gentamicin, Norfloxacin, Enrofloxacin, Erythromycn, Cao nấm men, Peptone,

NaCl, Agar, Kovac’s, Xylen, Glycerol, Gential, Lugol, Fushsin, Safranin,…

2.1.4 Thiết bị và dụng cụ

- Thiết bị

Bảng 2.1 Thiết bị chính dùng trong nghiên cứu

Máy lắc Gyromax 737R Amerex Instrument (Đức)