Nghiên cứu quy trình tinh sạch hoạt chất ACARBOSE từ chủng ACTINOPLANES SP, KCTC 9161 và đánh giá độc tính cấp của ACARBOSE trên chuột thực nghiệm

Tuy nhiên, trong các hướng điều trị trên,hướng điều trị giảm khả năng phân giải đường thành glucose đang là giải pháp tốt hiện nay.Chất đang được ưu tiên nhất vẫn là acarbose - một hợp c

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TINH SẠCH HOẠT CHẤT ACARBOSE

TỪ CHỦNG ACTINOPLANES SP KCTC 9161 VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘC

TÍNH CẤP CỦA ACARBOSE TRÊN CHUỘT THỰC NGHIỆM

Giáo viên hướng dẫn:TS Đỗ Thị Tuyên Sinh viên thực hiện: Trần Ngọc Bích

Hà Nội - 2015

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TINH SẠCH HOẠT CHẤT ACARBOSE

TỪ CHỦNG ACTINOPLANES SP KCTC 9161 VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘC

TÍNH CẤP CỦA ACARBOSE TRÊN CHUỘT THỰC NGHIỆM

Giáo viên hướng dẫn : TS Đỗ Thị Tuyên

Sinh viên thực hiện : Trần Ngọc Bích

Luận văn được thực hiện tại Phòng CNSH Enzyme, Viện CNSH

Hà Nội - 2015

Và em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Th.S Lê Thanh Hoàng và tập thể cán

bộ phòng CNSH Enzyme đã hướng dẫn giúp đỡ bảo ban em rất nhiều trong suốt quá trình làm luận văn

Trong thời gian theo học tại Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại Học Mở Hà Nội, các thầy cô đã tận tình dạy dỗ, truyền đạt cho em và những bạn sinh viên những kiến thức quý báu Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến các thầy cô

Cuối cùng, em xin được cám ơn gia đình, những người bạn bè thân thiết nhất luôn bên em động viên em trong suốt thời gian học tập đặc biệt là bố mẹ luôn luôn bên cạnh hỗ trợ em những lúc khó khăn nhất

Dù đã có nhiều cố gắng, song luận văn có thể có những thiếu sót Kính mong nhận được sự chia sẻ và những đóng góp quý báu của các thầy cô giáo

Em xin trân trọng cảm ơn và gửi lời chúc sức khỏe và công tác tốt đến các quý thầy cô!

Hà Nội, tháng 6 năm 2015

Sinh viên

Trần Ngọc Bích

MỤC LỤC

LỜI CÁM ƠN i

MỤC LỤC ii

BẢNG KÍ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH VẼ vi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Bệnh đái tháo đường 3

1.2 Giới thiệu chung về acarbose 5

1.2.1 Khái niệm 5

1.2.2 Cấu trúc 5

1.2.3 Nguồn gốc 7

1.2.4 Cơ chế hoạt động 7

1.3 Tác dụng của acarbose 8

1.4 Vai trò của Actinoplanes trong sinh tổng hợp Acarbose 9

1.4.1 Đại cương về chi Actinoplanes 9

1.4.2 Đặc điểm xạ khuẩnActinoplanes sp 10

1.5 Ứng dụng của acarbose trong việc điều trị bệnh ĐTĐ type 2 12

1.6 Tình hình nghiên cứu acarbose trên Thế Giới 13

1.7 Tình hình nghiên cứu acarbose ở Việt Nam 16

CHƯƠNG 2:PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Chủng giống 18

2.2 Thiết bị dụng cụ thí nghiệm 18

2.2.1 Dụng cụ, thiết bị 18

2.3 Hóa chất 18

2.4 Môi trường nuôi cấy 19

2.5 Đệm và dung dịch 19

2.6 Phương pháp 20

2.6.1 Nuôi cấy vi sinh vật 20

2.6.2 Tách chiết và tinh sạch sơ bộ 20

2.6.3 Sắc ký bản mỏng TLC 21

2.6.4 Xác định hoạt tính ức chế α-glucosidase 21

2.6.5 Tinh sạch acarbose từ than hoạt tính 22

2.6.6 Kết tinh sản phẩm 22

2.6.7 Đánh giá độ bền của sản phẩm sau các điều kiện bảo quản 23

2.6.8 Đánh giá độc tính cấp của hoạt chất acarbose trên chuột thực nghiệm

23

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24

3.1 Lên men sinh tổng hợp acarbose 24

3.2 Tinh sạch qua cột than hoạt tính 25

3.2.1 Tinh sạch qua cột than lần 1 25

3.2.2 Tinh sạch qua cột than lần 2 26

3.3 Cô đặc, kết tinh sản phẩm đường acarbose 27

3.4 Đánh giá độ bền sản phẩm acarbose 29

3.5 Đánh giá độc tính cấp của hoạt chất acarbose trên chuột nhắt trắng 30

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32

TÀI LIỆU THAM KHẢO 33

Độ di động Thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng)

Cộng sự (cs) World Health Organization (tổ chức y tế thế giới) Room temperature

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Danh sách thiết bị sử dụng trong thí nghiệm 18

Bảng 2.2 Danh sách các hóa chất được sử dụng trong thí nghiệm 19

Bảng 2.3 Các loại môi trường trong thí nghiệm 19

Bảng 2.4 Danh sách các dung dịch và đệm chính sử dụng trong thí nghiệm 19

Bảng 3.1 Độ bền hoạt tính và cảm quan sản phẩm acarbose sau 6 tháng 29

Bảng 3.2.Kết quả nghiên cứu độc tính cấp theo liều của bột nguyên liệu acarbose 31

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1.1.Công thức cấu tạo của acarbose 6

Hình 1.2 Cấu trúc phân tử acarbose 6

Hình 1.3 Xạ khuẩn chi Actinoplanessp 7

Hình 1.4 Acarbose ức chế cạnh tranh quá trình thủy phân tetrasaccharide bởi 8

α-glucosidase trong ruột non 8

Hình 1.5 Khuẩn lạc chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 trên môi trường thạch 11

Hình 1.6 Hình thái khuẩn lạc chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 trong môi trường lỏng. 11

Hình 3.1 Hình thái chủng xạ khuẩn Actinoplanes sp KCTC 9161 24

Hình 3.2 Sắc ký đồ TLC mẫu acarbose sinh tổng hợp từ chủng Actinoplanes KCTC 9161 25

Hình 3.3 Sắc ký đồ TLC các phân đoạn tinh sạch acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC-9161 khi qua cột than hoạt tính 1 26

Hình 3.4 Sắc ký đồ TLC các phân đoạn tinh sạch acarbose khi qua cột than hoạt tính 2 27 Hình 3.5 Quá trình cô đặc và kết tính sản phẩm đường acarbose 27

Hình 3.6 TLC kiểm tra sản phẩm acarbose tinh sạch 28

Hình 3.7 Quy trình lên men và tinh sạch acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC-9161 28

Hình 3.8 Sản phẩm acarbose sau các tháng bảo quản 30

Trần Ngọc Bích Khoa Công nghệ Sinh học

MỞ ĐẦU

Đái tháo đường (ĐTĐ) là một bệnh phổ biến Nó ảnh hưởng đến hàng triệu người cả nam và nữ, ở mọi lứa tuổi, mọi tầng lớp xã hội Gánh nặng bệnh tật do ĐTĐ đang tăng lên trên toàn cầu, đặc biệt ở các nước đang phát triển, trong đó có Việt Nam – nơi quá trình đô thị hóa đang làm thay đổi tập quán ăn uống, giảm hoạt động thể lực và tăng cân

Theo thống kê của Tổ chức y tế Thế giới (WHO), cứ mỗi ngày có 3600 bệnh nhân ĐTĐ mới được chẩn đoán Theo thông tin mới nhận (báo sức khỏe đời sống sau ngày 29/5/2015) hiện nay trên thế giới có khoảng 382 triệu người bệnh ĐTĐ, số người mắc ĐTĐ type 2 chiếm khoảng 90% Ước tính đến năm 2035, con số này sẽ tăng lên tới 592 triệu Tỷ lệ người mắc bệnh tăng nhanh ở các nước phát triển là 42% và ở các nước đang phát triển là 170% Việt Nam là nước có tốc độ tăng nhanh nhất thế giới Trong 10 năm qua, số người mắc bệnh ĐTĐ tăng 211% và lên đến 5,1 triệu người tử vong trong 2013 Và trong số đó 80 % người bị bệnh ĐTĐ sống ở những nơi thu nhập thấp và trung bình, 11% tổng chi tiêu về y tế trên thế giới được cho là do chi phí liên quan đến bệnh đái tháo đường ĐTĐ là một căn bệnh hết sức nguy hiểm bởi những biến chứng của nó Tại Việt Namcó khoảng50%bệnh nhân mắc bệnh này phát hiện bệnh khi bệnh đã nặng với nhiều biến chứng như tim mạch, thận, mắt, thần kinh ngoại…Triệu chứng ĐTĐ diễn ra âm thầm khiến người bệnh khó phát hiện đến khi xảy ra biến chứng mới đi chữa trị gây khó khăn tốn kém cho người bệnh,gia đình và xã hội

Hiện nay,thuốc điều trị ĐTĐ rất đa dạng.Có các hướng điều trị như tăng khả năng sử dụng insulin củatế bào, giảm khả năng phân giải đường thành glucose ở ruột non Tuy nhiên, trong các hướng điều trị trên,hướng điều trị giảm khả năng phân giải đường thành glucose đang là giải pháp tốt hiện nay.Chất đang được ưu tiên nhất vẫn là acarbose - một hợp chất hữu cơ giả đường có nguồn gốc từvi sinh

vật Đặc biệt là xạ khuẩn Actinoplanes sp Xạ khuẩn sinh trưởng nhanh hiệu quả

cao ngoài ra còn sử dụng các nguyên liệu dễ kiếm nên giá thành sẽ thấp hơn.Xuất phát từlí do trên,chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu quy trình tinh sạch hoạt

chất acarbose từ chủng Actinoplanes sp và đánh giá độc tính cấp của acarbose trên

Trần Ngọc Bích Khoa Công nghệ Sinh học

chuột thực nghiệm” trong khuôn khổ đề tài “Nghiên cứu quy trình công nghệđiều chế acarbose làm nguyên liệu thuốc chữa bệnh đái tháo đường” do TS.Đỗ Thị Tuyên làm chủ nhiệm vớimục tiêu: (1) xây dựng được quy trình tinh sạch hoạt chất acarbose (2) nghiên cứu độ bền sản phẩm và (3) đánh giá được độc tính cấp của sản phẩm acarbose

Trần Ngọc Bích Khoa Công nghệ Sinh học

CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh đái tháo đường

Đái tháo đường là căn bệnh đầy thách thức ảnh hưởng đến hàng triệu người trên thế giới Nếu không kiểm soát được, nó sẽ dẫn đến suy giảm sức khỏe và các vấn đề nghiêm trọng khác Đái tháo đường là một bệnh mãn tính trong đó cơ thể không sản xuất đủ insulin, hay không thể sử dụng insulin Thông thường, các loại tinh bột,chất đường và các chất dinh dưỡng khác được phân tách thành glucose, và được máu chuyển đến các tế bào Các tế bào sử dụng insulin, một chất nội tiết tố (hormone) do tuyến tụy tiết ra, giúp chuyển hóa glucose thành năng lượng Nếu không có đủ insulin, hay insulin không được sử dụng đúng, glucose sẽ tăng lên trong máu và nước tiểu, điều này sẽ gây nên rất nhiều vấn đề về sức khỏe Nguyên nhân của bệnh Đái tháo đường hiện vẫn chưa được xác định rõ ràng Có thể là do mối quan hệ gia đình, chẳng hạn nếu cha mẹ bị đái tháo đường thì con của họ sẽ dễ

bị đái tháo đường hơn Một nguyên nhân khác đó là lối sống, bao gồm chế độ ăn và tập luyện, cũng giữ một vai trò quan trọng Đái tháo đường type 2 có khuynh hướng

dễ xảy ra hơn ở người thừa cân

Đái tháo đường đang phát triển mạnh và gây ảnh hưởng đến 285 triệu người trưởng thành trên thế giới – chiếm 6,4% dân số trưởng thành trên toàn cầu Đến

2030, con số này được dự báo tăng lên đến 438 triệu người hay 7,8% dân số trưởng thành trên toàn cầu Căn bệnh này làm hao tổn chi phí của những người mắc bệnh Bên cạnh hàng trăm trường hợp tử vong, bệnh đái tháo đường còn có thể làm suy yếu chức năng của tim, thận, mắt, và thần kinh Đái tháo đường thường đi kèm với bệnh tim, đột quỵ, tăng huyết áp, bệnh thận, mù mắt, tổn thương thần kinh, và đoạn chi Đái tháo đường tạo ra những gánh nặng kinh tế do gia tăng tỷ lệ mắc bệnh mới

và số lượng các thương tật liên quan cùng xuất hiện Hiện nay, người ta ước tính chi phí chăm sóc y tế hàng năm trên toàn thế giới cho bệnh nhân đái tháo đường vào khoảng 223 tỷ đô-la, con số này đang tiếp tục tăng lên theo tỷ lệ mắc bệnh đái tháo đường mới Hội Đái tháo đường quốc tế (IDF) ước tính chi tiêu cho bệnh đái tháo đường trên toàn thế giới tối thiểu sẽ là 561 tỷ đô-la vào năm 2030

Trần Ngọc Bích Khoa Công nghệ Sinh học

Những người bị đái tháo đường type 1 bị thiếu insulin, có nghĩa là cơ thể sản xuất không đủ insulin Như vậy các loại chất bột, đường (carbohydrates) ăn vào không được chuyển thành năng lượng Có ít hơn 10% những người bị đái tháo đường là type 1, và phần lớn các trường hợp được chẩn đoán là trẻ em và người trẻ trưởng thành

Những người bị đái tháo đường type 2 bị đề kháng với insulin Cơ thể có thể sản xuất một ít insulin nhưng nó không thể chuyển hóa được glucose Khoảng 85% đến 95% người bị đái tháo đường trên thế giới là type 2 Mặc dù đái tháo đường type 2 trước đây thường xảy ra ở người lớn tuổi, trong những năm gần đây bệnh thường xảy ra ở những người trẻ hơn và cả trẻ em

Đái tháo đường trong thai kỳ là một ví dụ của đái tháo đường "có điều kiện" Đái tháo đường "có điều kiện" xảy ra liên quan đến những tình trạng bệnh lý nào

đó, như là bệnh tuyến tụy, một số rối loạn di truyền, và mang thai Tuy nhiên, dù chỉ trong ngắn hạn, những phụ nữ bị đái tháo đường trong thai kỳ sẽ gia tăng nguy cơ mắc bệnh đái tháo đường type 2 trong giai đoạn sau của cuộc đời

Đái tháo đường type 1 có thể tiến triển nhanh, với các triệu chứng rõ ràng Đái tháo đường type 2 có xu hướng tiến triển chậm hơn, và các triệu chứng thường đi kèm với các tình trạng bệnh lý khác

Phát hiện sớm bệnh đái tháo đường giúp gia tăng cơ hội phòng ngừa hay làm chậm xuất hiện các triệu chứng Một số trong các triệu chứng kể trên có vẻ như bình thường, nhưng nếu bạn thấy sự xuất hiện của chỉ một triệu chứng thôi thì cũng nên nhờ đến sự đánh giá của nhân viên y tế

Đặc điểm của ĐTĐ type 2 với những biểu hiện như đi tiểu nhiều, khát nước Ở một số trường hợp xảy ra hiện tượng sút cân mặc dù bệnh nhân ăn nhiều hơn Do không có đủ insulin để chuyển đường vào tế bào, các cơ quan không đủ năng lượng dẫn tới hiện tượng đói và cơ thể cảm thấy mệt mỏi Những biến chứng thường gặp của bệnh đái tháo đường type 2 như nhồi máu cơ tim, tăng huyết áp, đục thủy tinh thể, tăng nhãn áp, loãng xương, suy giảm thính giác, suy thận và tổn hại thần kinh Điều trị bệnh đái tháo đường type 2 đòi hỏi một quá trình điều trị suốt đời bao gồm sự kết hợp của nhiều yếu tố.Mục tiêu điều trị là kiểm soát đường huyết ở mức

độ ổn định và ngăn ngừa biến chứng

Trần Ngọc Bích Khoa Công nghệ Sinh học

Có các biện pháp trị ĐTĐ là:

Biện pháp không sử dụng thuốc:

Theo dõi thường xuyên lượng đường trong máu kết hợp với ăn uống hợp lý, tập thể dục thường xuyên Ăn uống thực phẩm lành mạnh, ít chất béo và calo có thể giúp ngăn ngừa các biến chứng nghiêm trọng Bên cạnh đó, hoạt động thể chất khoảng 30 phút mỗi ngày, giúp giảm cân dư thừa, giữ trọng lượng cơ thể ở phạm vi vừa phải có thể làm giảm nguy cơ bệnh đái tháo đường

Thuốc điều trị ĐTĐ thường type 2 gồm các nhóm sau:

- Kích thích tụy tạng tiết thêm insulin(Sulfonylureas, repaglinide)

- Cản trở gan đưa thêm đường vào máu(Metformin, Sulfonylureas)

- Giúp cho đường đi vào tế bào dễ dàng hơn (Rosiglitazone)

- Giảm hấp thu đường qua đường ruột(Acarbose)

Trong đó,nhóm thuốc tăng tiết insulin giảm tác dụng theo thời gian,dễ gây tăng cân và hạ đường huyết,còn nhóm nhóm thứ 2nguy cơ nhiễm acid lactic theo mức độ suy giảm chức năng thận,có nhóm thuốc acarbose là không làm tăng lượng đường trong máu,ượng đường huyết ở người tiểu đường giảm đáng kể sau khi ăn,bảo tồn tế bào β,không gây dụng nạp lactose Nhóm này đang là hướng nghiên cứu chủ yếu hiện nay

1.2 Giới thiệu chung về acarbose

1.2.1 Khái niệm

Acarbose là một hợp chất hữu cơ giả đường pseudo-oligosaccharide Acarboseức chế các enzyme trong ruột có khả năng phân giải các hợp chất đường phức tạp thành đường đơn là dạng có thể hấp thụ được Vì vậy, acarbose được sử dụng rộng rãi trong việc điều trị bệnh ĐTĐ type 2

1.2.2 Cấu trúc

Acarbosecó công thức cấu tạo: C25H43NO18, khối lượng phân tử: 645,605 g/mol,tên hóa học: O{4,6-dideoxy-4[1S-(1,4,6/5)-4,5,6-trihydroxy-3-hydroxymethyl-2-cyclohexen-1-yl]-amino-α-D-gluco-pyranosyl}-(1→4)-O-α-D-glucopyranosyl-(1→4)-D-gluco-pyranose

acarviosin này mà acarbose có kh

ruột (Lee et al 1997)

B được thay thế bởi liên k

một nguyên tử carbon (C7) và liên k

Khoa Công ngh

Hình 1.1.Công thức cấu tạo của acarbose

c nhóm C7 N-aminocyclitol Acarbose gồm 2 thành ph

n với một phân tử maltose Acarviosin là thành ph

u trúc của acarbose, nó gồm một nhóm valienamine, m

ới nhóm 4-amino-4,6-dideoxyglucose Chính nhacarviosin này mà acarbose có khả năng ức chế cạnh tranh với các enzyme

t chất ức chế cạnh tranh oligosaccharide, b

i liên kết α-1,4 Một ví dụ so sánh giữ

t tương tự acarbose

Hình 1.2 Cấu trúc phân tử acarbose

ấu sự khác biệt giữa maltotetraose và acarbose: nhóm

ng B bị vắng mặt Liên kết O-glycoside giữa đơn v

i liên kết N-glycoside Vị trí O5 của đường A đưcarbon (C7) và liên kết đôi hình thành giữa C5 và C7

Khoa Công nghệ Sinh học

m 2 thành phần, một Acarviosin là thành phần quan

t nhóm valienamine, một vòng dideoxyglucose Chính nhờ phân tử

a C5 và C7

Trần Ngọc Bích

1.2.3 Nguồn gốc

Acarboseđược tìm th

Actinoplanes sp được phân l

đến nay, acarbose chỉ đư

Xạ khuẩn thuộc chi

khí, hóa dị dưỡng, ưa ẩm Nh

có cấu trúc giống với các c

động của enzyme, chiếm ch

c tìm thấy lần đầu tiên vào cuối những năm 1960, t

c phân lập trong mẫu đất trồng cà phê ở Ruiru, Kenya Cho được tìm thấy ở vi sinh vật, chúng được mộ

ển của các sinh vật xung quanh bằng cách tác

a những loài này

nhiên, acarbose được tổng hợp bởi (Hemker et al 2001)là hai chi của xạ khuẩn Xạ khuẩn là m

ng rãi trong tự nhiên, có thể tìm thấy ở ðất, nýớc và các loài th

t Chúng là các vi khuẩn Gram dương, có tỉ lệ (%G+C) trong DNA cao M

ưng chúng thường sinh trưởng dưới dạng sợi và có nhi

ều có khả năng sinh kháng sinh

c chi Actinoplanes phát triển dưới dạng sợi phân nhánh, hi

m Những nghiên cứu hiện nay thường tập trung vào chi

t là chủng Actinoplanes sp SE50 (Goeke et al 1996)

ng sinh acarbose cao và không gây hại

Hình 1.3 Xạ khuẩn chi Actinoplanessp

ng

nh tranh là những phân tử có tác dụng ức chế enzyme, th

i các cơ chất, do đó có khả năng liên kết với trung tâm ho

m chỗ của cơ chất Vì vậy, chúng có khả năng làm gi

t bằng cách làm giảm số lượng enzyme có kh

c Tú 2000, Phạm Thị Trân Châu và Trần Thị Áng 2009)

à một chất như vậy Acarbose có cấu tạo tương

u gồm bốn đơn phân, các đơn phân liên kết v

ơ thể, tinh bột và một số loại đường bị α-amylase tuy

Khoa Công nghệ Sinh học

m 1960, từ các chủng Ruiru, Kenya Cho

t với nhau bằng amylase tuyến tụy

Trần Ngọc Bích

thủy phân thành oligosaccharide,

oligosaccharide, disaccharide thành glucose và các

đường trong máu Bản ch

1,4 giữa các đơn phân trong các phân t

y phân thành oligosaccharide, ở màng ruột non, α-glucosidase tiếp t

oligosaccharide, disaccharide thành glucose và các đường đơn khác, làm t

n chất của các enzyme này lả có khả năng cắt đ

n phân trong các phân tử đường

ng về cấu trúc và kích thước nêu trên, acarbose có thglucosidase hay α-amylase Các liên kế này tồn tại trong trong 4

thủy phân các phân tử đường phức tạp Vì v

c hiện tượng tăng đường huyết đột ngột sau khi

a acarbose được minh họa ở hình 1.4 (Wehmeier and Piepersberg

Acarbose ức chế cạnh tranh quá trình thủy phân tetrasaccharide

α-glucosidase trong ruột non

a acarbose

t nhiều ưu điểm trong việc điều trị bệnh ĐTĐ Do c

ng đến insulin, acarbose không làm làm tăng insulin huykháng insulin, bảo tồn tế bào beta tuyến tụy, giảm nồ

ông có khả năng ức chế β-glucosidase (lactase), do không dung nạp lactose (Hanefeld et al 2008)

đường huyết là khác nhau, acarbose có thể

i các thuốc trị liệu khác như sulfonylurea, metformin ho type 2(Piñol et al 2007)

Khoa Công nghệ Sinh học

(lactase), do đó sẽ không

Bởi cơ chế tác được dùng đơn sulfonylurea, metformin hoặc insulin

Trần Ngọc Bích Khoa Công nghệ Sinh học

Bên cạnh ứng dụng trong điều trị ĐTĐ type 2 acarbose còn được thử nghiệm

để sản xuất nhiều loại thuốc phòng và chữa bệnh khác như: béo phì, mỡ máu,dạ dày,bệnh mục xương ở người hoặc dùng trong chăn nuôi để tăng tỉ lệ thịt và mỡ

trong vật nuôi(Frommer et al 1975)

Acarbose còn có tác dụng giảm nguy cơ tim mạch Một số nghiên cứu dịch tễ học đã chỉ ra rằng tăng đường huyết sau ăn có liên quan đến nguy cơ mắc bệnh tim mạch Các nghiên cứu so sánh hiệu quả điều trị bằng acarbose và glimepiride đối với hàm lượng licoprotein trong huyết thanh ở bệnh nhân ĐTĐ type 2 mới được chuẩn đoán Các bệnh nhân được chỉ định ngẫu nhiên để điều trị trong 12 tuần chia thành 3 nhóm: Với acarbose, glimepiride, đối chứng ăn uống bình thường và kết quả cho thấy acarbose đã làm giảm nguy cơ tim mạch (Hayashim et al 2008)

1.4 Vai trò của Actinoplanes trong sinh tổng hợp Acarbose

1.4.1 Đại cương về chi Actinoplanes

Chi Actinoplanes pháttriển dưới dạng sợi phân nhánh, không đứt đoạn, Gram

dương, một phần sợi dinhdưỡng có thể là Gram âm, không nhuộm kháng acid, rất ít sợi khí sinh hoặc không có, tạo nhiềuloại sắc tố có khả năng khuếch tán Bào tử chứa trong túi bào tử, sinh trên cuống sinh bào tử hoặckhông cuống, ít khi trong thạch Dưới điều kiện nhất định, nhiều chủng có hệ sợi sắp xếp dạng que(palisade) Khi đó, túi bào tử chủ yếu được sinh ở đầu các sợi Bào tử hình cầu hoặc que ngắn, sắpxếp theo nhiều cách khác nhau bên trong túi bào tử, được hình thành bằng cách đứt đoạn sợi bêntrong túi bào tử trực tiếp hoặc sau vài lần phân nhánh Sau khi ngâm trong nước, bào tử di độngđược giải phóng ra từ túi bào tử, trong một số trường hợp, khả năng di động xuất hiện sau khi bàotử được giải phóng Bào tử di động chứa tiên mao cực Thành tế bào chứa meso-2,6-diaminopimelic acid, LL -2,6-diaminopimelic acid, hydroxydiaminopimelic và glycine(Lechevalier and

Lechevalier 1970)

ThànhphầnđườngchứaD-xylosevàL-arabinose.Thànhphầnphospholipidchínhlàphosphatidylethanolamin Hiếu khí, hóa dị dưỡng hữu cơ, ưa ấm hoặc ưa nhiệt vừa phải Hầu hếtcác chủng đều không cần các nhân tố sinh trưởng hữu cơ Tỷ lệ mol GC trong ADN là 72-73%

Trần Ngọc Bích Khoa Công nghệ Sinh học

Loài chuẩn: Actinoplanes philippinensis(Couch 1950)

Bộ : Actinomycetales

Họ : Mycromonosporaceae Chi : Actinoplanes

Loài : Actinoplanes sp

(Vị trí phân loại theo khóa phân loại Bergey)

Đặc điểm hình thái:

Actinoplanes sp KCTC 9161 gram dương, cấu tạo dạng sợi, các sợi liên kết

chặt chẽ với nhau tạo khuẩn lạc riêng rẽ, màu vàng cam, ở giữa khuẩn lạc phồng lên phát triển các túi bào tử trong chứa nhiều bào tử Bào tử có thể di động Toàn bộ hệ sợi xạ khuẩn là một tế bào có nhiều nhân,không có vách ngăn ngang, nhân đơn giản,không có màng nhân (Nguyễn Lân Dũng 2006) Thành tế bào có chứa meso-2,6-diaminopimelic acid, LL-2,6-diaminopimelic acid, hydroxydiaminopimelic acid

và glycine,tỷ lệ GC trong AND là 71,32%

Xạ khuẩn sinh dưỡng bằng bào tử,phát triển mạnh trong điều kiện 25-28°C, phát triển dạng sợi,phân nhánh,ưa ẩm

Đặc điểm nuôi cấy gồm:

- Sinh trưởng trong môi trường hiếu khí

- Nhiệt độ nuôi cấy tối ưu là 25°C

- pH 6-8 là pH thích hợp để nuôi cấy

Trần Ngọc Bích Khoa Công nghệ Sinh học

Trên môi trường đĩa thạch, khuẩn lạc có dạng tròn,bề mặt nhẵn,có tâm phồng lên,phát triển chậm.(Vì khuẩn lạc dạng sợi khó mọc trong đĩa thạch).Khuẩn lạc có màu cam đường kính 1-2 mm Sau 7-10 ngày bề mặt nhăn lan rộng

Hình 1.5 Khuẩn lạc chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 trên môi trường đĩa thạch

Trên môi trường lỏng,chủng phát triển tốt,tạo thành các hạt pellet tròn,không tan khi lắc lên,màu vàng cam,một số sắc tố cam tiết ra môi trường tạo môi trường

có màu cam

Hình 1.6 Hình thái khuẩn lạc chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 trong môi trường lỏng

Nhiều nghiên cứu cho thấy các chủng Actinoplanes có vai trò quan trọng trong việc

sản xuất hoạt chất acarbose với hoạt tính ức chế α-glucosidase Dịch nuôi cấy chủng

Actinoplanessp SE50 đã được công ty Bayer AG thử nghiệm với hoạt tính ức chế amylase,maltase và saccharase trong ruột chuột (Frommer et al 1975)

Vào năm 1977, Schmidet và cộng sự đã tìm thấy hỗn hợp oligosaccharide

trong dịch lên men trong đó có acarbose hiệu lực ức chế α-glucosidase (Schmidet et

al 1997)

Trần Ngọc Bích Khoa Công nghệ Sinh học

Sau này chủng tự nhiên Actinoplanessp khác được phân lập gọi là Actinoplanessp SE50/110 đã sản xuất acarbose lên tới 1g/L và từ đó chủng này

được sử dụng rộng rãi trong nhiều nghiên cứu về gene sinh tổng hợp acarbose,chức

năng mã hóa enzyme của nó (Schwientek 2012; Klein et al 2013)

1.5 Ứng dụng của acarbose trong việc điều trị bệnh ĐTĐ type 2

Có hai hướng chính để điều trị bệnh ĐTĐ type 2 là:

- Tăng lượng insulinhay tăng độ nhạy cảm của insulin (ví dụ như sulfonylurea

có tác dụng hạ đường huyết do ngăn cản tế bào tuyến tụy tạo ra glucagon, kích thích

tế bào beta ở tụy tiết ra insulin), các loại insulin tái tổ hợp hay insulin từ thực vật chuyển gene

- Giảm nồng độ đường huyết nhờ ngăn cản quá trình tiêu hóa và hấp thụ carbohydate Việc này có thể thực hiện bằng cách ức chế α-glucosidase trong ruột non Có rất nhiều hợp chất trong tự nhiên có tác dụng này như chất charantin trong quả mướp đắng, chất 6-o-caffeoyl-sophorse trong các cây thuộc họ khoai lang Tuy nhiên hầu hết các chất này có nguồn gốc thực vật (một số từ nấm) khi đem thử nghiệm trên động vật và người thì không mang lại hiệu quả cao Một số hợp chất được sử dụng làm thuốc điều trị bệnh hiện nay như: acarbose, miglitol,

voglibose, deoxynojirimycin có nguồn gốc từ vi khuẩnnhư Bacillusspp.(Quyền

Đình Thi and Vũ Văn Hạnh 2011)

Kể từ khi đượcphát hiện, acarbose đã được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong việc điều trị bệnh ĐTĐ type 2 Ưu điểm của acarbose là không làm tăng insulin huyết, không gây đề kháng insulin, bảo tồn tế bào beta, giảm nồng độ HbA1c (hemoglobin glycosyl hóa), triglyceride và giảm các biến chứng do tiểu đường Acarbose không có hoạt tính ức chế chống lại lactase và do đó sẽ không gây

ra hiện tượng bất dung nạp lactose trong cơ thể (Hanefeld et al 2008)

Ngoài ra, acarbose có thời gian bán hủy tương đối lâu, khoảng từ 6-8 giờ và được chuyển hóa hoàn toàn trong ruột người.Các sản phẩm chuyển hóa chủ yếu là dẫn xuất của 4-methylpyrogallol không độc.Một phần nhỏ được hấp thụ vào máu sẽ được bài tiết qua đường nước tiểu

Acarbose đã được sử dụng là thuốc điều trị ĐTĐ type 2, ở châu Âu và Trung Quốc là Glucobay (Bayer AG), ở Bắc Mỹ là Precose(Bayer Pharmaceutical), và

Trần Ngọc Bích Khoa Công nghệ Sinh học

Prandase (Bayer AG) ở Canada Ở nước ta Công ty Cổ phần Dược Hậu Giang sản xuất viên nén có tên thương mại Glumeca

Bởi cơ chế tác động làm giảm nồng độ đường huyết là khác nhau, acarbose được dùng đơn hoặc có thể kết hợp với các thuốc trị liệu khác như sulfonylurea, metformin hoặc insulin để điều trị bệnh ĐTĐ type 2.Ảnh hưởng của nó đến HbA1c được kiểm tra và đánh giá.Trong nhóm đối chứng, nhóm điều trị bằng sulfonylurea

và nhóm metformin, hàm lượng HbA1c giảm một cách có ý nghĩa thống kê khi bổ sung acarbose trong điều trị Việc giảm có ý nghĩa thống kê trong

6 tháng và hiệu quả ổn định này kéo dài một năm(Piñol et al 2007)

1.6 Tình hình nghiên cứu acarbose trên Thế Giới

Vào những năm 1970, các chất ức chế enzyme α-glucosidase có nguồn gốc thực vật được lần đầu nghiên cứu và thử nghiệm Tuy nhiên kết quả không khả quan

do các chất này không thể hiện hoạt tính trên cơ thể động vật Cũng trong thời gian

này, những nghiên cứu đầu tiên về acarbose xuất hiện (Hanefeld et al 2008)

Năm 2003, Choi và cộng sự đã phân lập được chủng vi sinh vật có khả năng

sinh tổng hợp acarbose cao Chủng Actinoplanes sp CKD485-16 được lên men sinh

tổng hợp acarbose với năng suất 2,3 g/L(Choi and Shin 2003)

Thực tế có rất ít công trình nghiên cứu về tối ưu môi trường lên men sinh tổng hợp acarbose trên thế giới.Đáng kể nhất là công trình của Wei và cộng sự năm

2010, khi tối ưu môi trường lên men chủng Actinoplanes sp A56 sinh tổng hợp Hàm lượng acarbose đạt được từ 837 đến 1043 mg/L (Wei et al 2010)

Wang và cộng sự đã công bố mô hình nuôi cấy và lên men theo kiểu fed-batch

trên đối tượng A.utahensis ZJB-08196 vào năm 2012.Ông đã tối ưu áp suất thẩm

thấu và bổ sung cơ chất liên tục trong quá trình lên men kết quả làm tăng sản lượng acarbose lên 4878 mg/L, tăng 15,9% so với phương pháp nuôi cấy chìm kiểu

cũ(Wang et al 2012b)

Kế thừa thành tựu trên,vào chính năm 2012,Sun và đồng nghiệp của ông tiếp

tục nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes utahensis

ZJB- 08196 khi thêm SAM (S-adenosylmethionine) vào môi trường nuôi cấy Kết quả sau 192 giờ nuôi cấy lượng acarbose đạt tới 6113 mg/L