Phân lập và xác định các đặc tính sinh học của vi khuẩn VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS gây bệnh hoại tử gan thận trên một số loài cá biển ở vùng biển hải phòng

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ------ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -





 -

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:

PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI

KHUẨN VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN

THẬN TRÊN MỘT SỐ LOÀI CÁ BIỂN Ở VÙNG BIỂN HẢI PHÒNG

Giáo viên h ướng dẫn : TS Phạm Thị Tâm

Sinh viên th ực hiện : Đỗ Thị Vân Anh

L ớp: 11-02

Hà Nội - 2015

LỜI CẢM ƠN

Tr ước hết, em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ thuộc Khoa

Công ngh ệ sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi nhất cho em

có th ể thực tập và hoàn thành đề tài này

Em c ũng xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS Phạm Thị Tâm

Gi ảng viên Khoa Công nghệ Sinh học, Viện Đại Học Mở Hà Nội, người đã trực tiếp tận

tình h ướng dẫn và dìu dắt em trong suốt quá trình em thực tập và hoàn thành đề tài

Em không th ể quên gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, những người thân, các anh

ch ị khóa trước, bạn bè đã luôn bên em, tận tình giúp đỡ, cổ vũ động viên trong suốt

th ời gian em thực tập và hoàn thiện đề tài

Trong quá trình th ực tập không tránh khỏi được những sai sót, kính mong các

th ầy cô giáo, các anh chị và các bạn đóng góp ý kiến để em tiếp thu và hoàn thiện

Em xin chân thành c ảm ơn!

Hà N ội, ngày tháng năm 2014

Sinh viên

Đỗ Thị Vân Anh

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Brain Heart Infusion Broth BHI Broth

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Việt Nam là một quốc gia ven biển nằm bên bờ Tây của Biển Đông, có bờ biển dài hơn 3.260 km trải dài từ Bắc tới Nam; tạo điều kiện thuận lợi cho sự hình thành và phát triển kinh tế, đặc biệt là nghề nuôi trồng thủy hải sản Nuôi trồng thủy sản là ngành công nghiệp sản xuất thực phẩm phát triển nhanh nhất trên thế giới, mang lại

những tiềm năng to lớn để chúng ta đẩy mạnh chiến lược phát triển kinh tế biển

Theo thống kê của Tổng cục Thủy sản (Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn), tổng sản lượng thủy sản nuôi trồng trong 8 tháng đầu năm 2014 ước đạt 543 nghìn tấn, trong đó sản lượng khai thác 244 nghìn tấn, sản lượng nuôi trồng 299 nghìn tấn, đưa tổng sản lượng thủy sản 8 tháng đầu năm xấp xỉ 4,0 triệu tấn, tăng 4,0%, trong đó sản lượng khai thác 1,9 triệu tấn (tăng 4,9%), sản lượng nuôi trồng 2,1% (tăng 3,1%) Tổng cục Thủy sản cũng cho biết, giai đoạn 2011 - 2015 ngành thủy sản sẽ hướng tới sự phát triển bền vững là một ngành xuất khẩu hàng hóa lớn, có khả năng cạnh tranh cao và hội nhập vững chắc thế giới

Hiện nay, đối tượng nuôi và mô hình nuôi thủy sản ở Việt Nam khá phong phú.Trong đó, mô hình nuôi cá lồng đang ngày càng khẳng định được vị trí của mình Đây là mô hình được áp dụng cho nhiều loài cá có giá trị kinh tế cao Cá khi nuôi trong lồng phải chịu rất nhiều yếu tố gây stress do phải thích nghi với môi trường sống mới, tập quán sinh sản và kiếm ăn bị đảo lộn, sức đề kháng bị ảnh hưởng Vì thế, cá nuôi lồng thường mắc một số bệnh do vi khuẩn và virus gây ra Đáng lưu ý nhất là bệnh

hoại tử gan thận trên cá biển do chủng vi khuẩnVibrio parahaemolyticus gây ra, làm thiệt

hại không nhỏ đến người nuôi cá biển

Bệnh hoại tử gan thận xuất hiện ở hầu hết các loài cá biển (cá mú, cá chẽm, cá giờ, cá hồng, cá bớp…), đặc biệt là cá nuôi lồng, xuất hiện ít ở cá nước ngọt Khi vi

khuẩn Vibrio parahaemolyticus xâm nhập vào cơ thể cá biển, gây hoại tử lên các nội

quan của cá (đặc biệt là gan, thận), lở loét lớp biểu bì

Gan và thận bị hoại tử, gan từ màu xám nâu chuyển thành màu vàng, làm cho cá biển chết hàng loạt Bệnh thường xảy ra ở các giai đoạn của cá, vì vậy tìm ra phương pháp phòng và trị bệnh có thể hạn chế những tổn thất do dịch bệnh gây ra là hết sức cần thiết

Thực tế trong nuôi trồng thủy sản, người dân thường sử dụng nhiều hóa chất và kháng sinh để khống chế vi khuẩn này, song việc sử dụng kháng sinh có thể gây hiện tượng nhờn thuốc và không mang lại hiệu quả cao Vi khuẩn này có khả năng tạo ra màng bảo vệ (biofilm) trước thuốc diệt khuẩn và kháng sinh Chính vì thế, dịch bệnh thường bùng phát trở lại rất nhanh sau khi thuốc hết tác dụng Mặt khác, dư lượng kháng sinh trong sản phẩm từ cá biển có thể gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng thịt cá

và sức khỏe của con người

Để giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh điều trị bệnh và đảm bảo chất lượng sản phẩm từ cá biển, việc nghiên cứu ra một loại vắc-xin phòng bệnh là tương đối cần thiết Bước đầu tiên để tạo ra vắc-xin là phải phân lập và sàng lọc được các chủng có tính đại diện kháng nguyên để làm cơ sở cho việc tạo chủng có khả năng tạo kháng thể bảo hộ

Xuất phát từ thực trạng nêu trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “ Phân lập

và xác định các đặc tính sinh học của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận trên một số loài cá biển ở vùng biển Hải Phòng” làm cơ sở ban

đầu hướng đến việc sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thận ở cá biển trên quy

mô công nghiệp

2 Mục tiêu nghiên cứu

2.1 Mục tiêu chung

Phân lập được các chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus từ mẫu bệnh phẩm

trên một số loài cá biển (cá mú, cá hồng, cá bớp) bị bệnh hoại tử gan thận ở vùng biển Hải Phòng

2.2 Mục tiêu cụ thể

- Phân lập được 6- 8 chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus từ mẫu bệnh phẩm

trên một số loài cá biển (cá mú, cá hồng, cá bớp) bị bệnh hoại tử gan thận

-Xác định các đặc tính sinh học điển hình của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus:

đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh hóa, khả năng gây bệnh, tính kháng kháng sinh

3 Nội dung nghiên cứu

- Phân lập các chủng vikhuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận

trên một số loài cá biển (cá mú, cá hồng, cá bớp) từ các mẫu bệnh phẩm

- Xác định được đặc tính sinh học của chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

gây bệnh phân lập được

- Đánh giá mức độ kháng kháng sinh và đặc tính gây bệnh trên một số loài cá

biển của 6 8 chủng vi khuẩn đã chọn lọc được

4 Ý nghĩa của đề tài

4.1 Ý nghĩa khoa học

- Kết quả xác định các đặc tính sinh học của các chủng vi khuẩn Vibrio

parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận ở cá là cơ sở khoa học trong nghiên cứu dịch tễ và xây dựng các giải pháp phòng trị bệnh

4.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Là cơ sở khoa học nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus giảm

độc lực để sản xuất vắc-xin bệnh hoại tử gan thận ở cá Vắc-xin là giải pháp hữu hiệu trong việc hạn chế dịch bệnh làm tăng hiệu quả kinh tế trong sản xuất cá biển

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình nuôi trồng thủy hải sản trên thế giới và tại Việt Nam

bệnh đầu vàng, bệnh còi,… ở tôm nuôi, bệnh xuất huyết do virus, bệnh Indivirus… ở

cá, bệnh do nhóm Vibrio sp., nấm…gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành nuôi trồng

thủy hải sản.[27]

Một trong những tác nhân gây bệnh đáng quan tâm hiện nay đó là bệnh do nhóm

vi khuẩn Vibriosp Gây ra cho động vật thủy hải sản (tôm, cá) Chúng có thể gây bệnh

qua tất các giai đoạn của động vật thủy sản và được xem là nguồn gốc gây thiệt hại nghiêm trọng trên giống thủy hải sản Nhiều trường hợp nhiễm bệnh đã được phát hiện

ở Australia, Ấn Độ, Indonesia, Philippines, Đài Loan, Thái Lan trên nhiều loài thủy hải sản khác nhau Các sự giảm sút gần đây trong ngành nuôi trồng thủy hải sản ở Việt Nam, Ấn Độ, Bangladesh, Philippines và Trung Quốc chủ yếu là do tác động của nhóm

vi khuẩn Vibriosp [27]

Theo dự báo của Trung tâm Thuỷ sản Thế giới, đến năm 2020, các nước đang phát triển sẽ chiếm tới 77% tổng tiêu thụ thuỷ sản toàn cầu và 79% tổng sản lượng thuỷ sản thế giới Như vậy là, từ năm 1997 đến năm 2020, tiêu thụ thuỷ sản ở các nước

đang phát triển sẽ tăng từ 62,7 triệu tấn lên 98,6 triệu tấn (57%), trong khi các nước phát triển sẽ chỉ tăng 4%, từ 28,1 triệu tấn lên 29,2 triệu tấn [27]

1.1.2 Tại Việt Nam

Việt Nam là một trong những quốc gia trên thế giới có nghề nuôi thủy sản phát triển và cũng là nước có lịch sử nuôi trồng thủy hải sản lâu đời Nghề nuôi thủy sản truyền thống bắt đầu từ thập niên 1960, tuy nhiên trong vòng 10 năm nay, nghề nuôi thủy sản có tốc độ phát triển rất nhanh chóng Trong những năm qua, ngành thủy sản luôn khẳng định là ngành kinh tế mũi nhọn có những đóng góp quan trọng cho sự phát triển kinh tế - xã hội nước nhà Tạo công ăn việc làm cho hàng trăm ngàn lao động, cung cấp thực phẩm thủy sản cho đời sống người dân, và đang phấn đấu trở thành ngành sản xuất hàng hóa lớn, sản phẩm thủy sản có sức cạnh tranh cao trên thị trường để tiếp tục phát triển nhanh, ổn định và bền vững Thực phẩm thuỷ hải sản còn giữ vai trò an ninh lương thực quốc gia và góp phần xoá đói giảm nghèo Thực phẩm thuỷ hải sản được đánh giá là nguồn cung cấp chính đạm động vật cho người dân Việt Nam.[27]

1.1.3 Một số khó khăn trong nuôi trồng thủy hải sản

Vai trò của nuôi trồng thủy sản là rất to lớn trong việc cung cấp thực phẩm, y học, công nghiệp, nông nghiệp hay giúp xoá đói, giảm nghèo và phát triển kinh tế - xã hội nói chung của nhiều quốc gia Tuy nhiên, với sự thâm canh hoá ngày càng cao độ, nghề nuôi đang đối mặt với nhiều thách thức lớn như về ô nhiễm môi trường, suy thoái nguồn lợi, dịch bệnh thủy sản, an toàn vệ sinh thực phẩm, phân cách và mâu thuẫn xã hội

Các mô hình chiến lược sẽ được phát triển trong thời gian tới có thể gồm: Nuôi thâm canh với hệ thống hoàn chỉnh; nuôi tuần hoàn, nuôi kết hợp và nuôi lồng biển khơi Nhằm phát triển bền vững nghề nuôi thủy sản, hiện nay, nhiều tổ chức đã nổ lực rất lớn trong việc phát triển các phương thức – qui tắc quản lý tổng hợp đối với nghề nuôi thủy sản và đã bước đầu đã được ứng dụng ở nhiều nơi như: nuôi sạch, thực hành quản lý tốt hơn, và nuôi có trách nhiệm

1.2 Lịch sử phát hiện bệnh do vi khuẩn Vibrio

Vibrio anguillarum là loài vi khuẩn đầu tiên thuộc giống Vibriođược phát hiện

gây bệnh trên cá và nó đã được phân lập từ cá chình nuôi ở Địa Trung Hải bởi Canestrini vào năm 1883 Và những năm tiếp sau đó, người ta cho rằng các tác nhân

gây bệnh Vibriosis chính loài vi khuẩn này là nguyên nhân

Tuy nhiên, sự quan tâm ngày càng nhiều đối nghề nuôi cá trên thế giới đã giúp cho vấn đề dịch bệnh được hiểu một cách rõ ràng hơn đối với mỗi vùng nuôi, từng hệ thống nuôi và vai trò của mỗi loài vi khuẩn trong sự bùng nổ của dịch bệnh Chẳng

hạn, V alginolyticusđược xác định là tác nhân thứ cấp tham gia gây bệnh đối với cá tráp (Sparus aurata) nuôi ở Israel khi loài cá này bị thương tổn (Colorni và cộng sự, 1981) Trong khi đó, V.vulnificus là tác nhân gây bệnh cho cá chình ở Nhật bản được

thông báo bởi Muroga và cộng sự năm 1979 và Bioscas vào năm 1991 Cùng với

Vibrio anguillarum, V.ordalii (Schiewe et al 1981) và V.salmonicida (Egidius et al

1986) đã xuất hiện và là những tác nhân gây bệnh rất nguy hiểm cho cá hồi nuôi ở Thái Bình Dương và Đại Tây Dương

Qua quá trình tồn tại và phát triển, các giống loài Vibrio gây bệnh đã có sự biến

đổi cấu trúc gen khác so với ban đầu, việc này đã dẫn đến hiện tượng kháng thuốc, có tác hại nghiêm trọng đối với sự phát triển của nghề nuôi thuỷ sản nói chung và nuôi cá biển nói riêng [27]

V parahaemolyticus được Fujino phát hiện lần đầu tiên vào mùa hè năm 1951 tại vùng ven biển Nhật Bản sau các vụ ngộ độc do ăn cá, hàu…Người ta đã xác định đuợc

21 loài thuộc giống Vibrio, trong đó có 4 loài thuộc tác nhân gây bệnh cho người gồm: V cholera, V parahaemolyticus, V vulnificus, V alginolyticus[28]

V cholera phân bố rộng khắp với số lượng lớn lan tới cả chân Mỹ, gây bệnh dịch

tả cho một số vùng châu Á, Ấn Độ và Đông Nam Á Chúng từng gây đại dịch do lây truyền qua tiếp xúc, nước, sữa, thực phẩm và côn trùng

V parahaemolyticus là vi sinh vật biển, tồn tại tự nhiên trong nước biển, thường gặp ở các loại hải sản loại nhuyễn thể và giáp sát trong nước biển

Năm 2001, Vibrio alginolyticus được xác định là tác nhân gây bệnh trên cá bớp

có dấu hiệu lở loét tại Đài Loan (Rajan et al 2001) Đến năm 2006 Vibrio vulnificus

được xác định chính là nguyên nhân gây bệnh trên cá bớp Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu chính thức nào về cá bớp bị lở loét nuôi ở Đồng Bằng Sông Cửu Long Trong bài báo này, chúng tôi trình bày kết quả phân lập, đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn và xác định độ nhạy của một số loại kháng sinh đối với vi khuẩn phân lập được nhằm cung cấp thông tin cho việc phòng trị bệnh hiệu quả [29]

Ngoài ra, những người dân sống ven sông và vùng duyên hải tại Canada thường

có thú đào vớt nghêu sò Tuy nhiên ít người ý thức rằng các loại thủy sản này đôi khi

là mối đe dọa về sức khỏe Cũng như bất cứ loài thủy sản nào khác, sò ốc cũng có thể

bị nhiễm bởi các loại vi khuẩn như E coli spp, Salmonella spp, Vibrio vulniculus,

Vibrio parahaemolyticus và các loại virus như virus Norwalk( Norovirus) và virus bệnh viêm gan A

Bệnh viêm ruột do V parahaemolyticus là bệnh truyền nhiễm cấp tính lây theo

đường ăn uống Vi khuẩn V parahaemolyticus gây ra hai hội chứng lâm sàng khác biệt nhau là tiêu chảy kiểu tả nhẹ và tiêu chảy phân có nhiều máu, kèm theo đau bụng và sốt, kiểu lỵ trực khuẩn Thông thường bệnh nhẹ và ít nguy hiểm, song nếu phát hiện chậm và không được điều trị kịp thời cũng có thể gây tử vong

Hiện nay, V parahaemolyticus đã được xác nhận là nguyên nhân gây ra nhiều vụ

ngộ độc thức ăn do ăn cá biển và hải sản Trong khoảng 50 năm qua, người ta đã nghiên cứu nhiều về loại vi khuẩn này Các nhà khoa học lo ngại do biến đổi khí hậu,

nhiệt độ tăng lên dẫn đến sự tăng vọt bất ngờ và đột ngột của V parahaemolyticus -

loại vi khuẩn một thời có vẻ như chỉ gây nhiễm khuẩn nhẹ Dịch tễ học của vi khuẩn đã

thay đổi và những týp huyết thanh mới phát hiện đã được thừa nhận là nguyên nhân của sự thay đổi này

1.2.2 Tại Việt Nam

Hiện nay, đối tượng nuôi và mô hình nuôi thủy sản ở Việt Nam khá phong phú Đặc biệt những năm gần đây, người dân chú ý đến khả năng nuôi cá mú, đặc biệt là cá

mú chấm nâu (Epinephelus coioides) là loài được nuôi phổ biến ở các tỉnh Phú Yên,

Khánh Hòa, Vũng Tàu, Quảng Ninh, Hải Phòng do đặc điểm lớn nhanh, thịt thơm ngon

và nguồn giống cung cấp cho người nuôi ổn định Mặc dù nghề nuôi cá mú đã mang lại hiệu quả kinh tế cao cho người nuôi cá biển nhưng rủi ro do dịch bệnh xảy ra cũng gây ảnh hưởng không nhỏ đến nghề nuôi cá mú Có nhiều nguyên nhân gây thiệt hại cho

nghề nuôi cá mú, trong đó có nguyên nhân bệnh do vi khuẩn Vibrio sp gây chết cá nuôi Cá mú bị bệnh do vi khuẩn Vibrio sp gây ra thường có các biểu hiện khác nhau

như: Hiện tượng mắt lồi và mù mắt hay hiện tượng lở loét, xuất huyết cơ thể Ngoài ra,

vi khuẩn Vibrio sp còn gây bênh phổ biến trên một số loài cá khác như cá hồng, cá

giò, cá chẽm, cá bớp…Trong đó, hiện tượng lở loét, xuất huyết cơ thể ở cá là chủ yếu với các biểu hiện da cá sẫm màu, xuất hiện các đốm đỏ trên thân và tại các đốm đỏ này bắt đầu lở loét dần dần và lan rộng ra xung quanh Cùng với đó là sự xuất huyết miệng, vây, hậu môn và đuôi cá Cá thường bơi gần mặt nước, sát bờ ao hay lưới lồng nuôi Khi giải phẫu nội tạng có thể nhìn thấy gan cá có màu nhợt nhạt hay có chất dịch trong xoang bụng ở một số trường hợp cá bị bệnh nặng

V parahaemolyticus có thể gây ra viêm đường tiêu hóa, nhiễm trùng vết thương

và nhiễm trùng huyết ở người Nhiễm trùng huyết là mối đe dọa nghiêm trọng vì sinh vật gây bệnh lây lan nhanh hoặc các độc tố của chúng sinh ra có thể tồn tại lâu dài và

lưu thông trong máu Tác nhân vi khuẩn Vibrio gây xuất huyết cơ thể, xuất hiện các vết

lở loét ở thân, cuống đuôi và vây thối rữa ở cá mú giống và cá mú thịt là do vi

khuẩn Vibrio parahaemolyticus, V.alginolyticus (Leong tak Seng,1994; Somkiat

Kanchanakhan, 1996; Nguyễn Thị Thanh Thùy et al., 2009)[28]; gây hội chứng đường

ruột ở cá mú là do vi khuẩn Vibrio alginolyticus và V carchariae (Lee và cs, 1995; Yii

và cs, 1997)[28]; gây triệu chứng mắt lồi và mù mắt ở cá mú là do nhóm vi

khuẩn Vibrio gây ra, chúng phá hủy cấu trúc đặc trưng của mắt, làm khả năng bắt mồi

của cá kém đi, từ đó làm cá yếu dần và chết (Sindermann, 1970; Richardol, 1972; Lom, 1970)[28]

Bệnh lở loét được ghi nhận đã xuất hiện và làm chết cá vào mùa hè năm 2008 -

2009 ở một số cơ sở nuôi cá mú tại Sông Cầu, thuộc tỉnh Phú Yên và Cam Ranh thuộc tỉnh Khánh Hòa Trong năm 2010 và đầu năm 2011, bệnh cũng xuất hiện nhiều ở các vùng nuôi cá mú trong ao và trong lồng nổi trên biển thuộc các tỉnh Phú Yên, Khánh Hòa và Vũng Tàu Bệnh xuất hiện nhiều vào mùa hè và nhất là vào lúc giao mùa, gây tỉ

lệ chết cao

1.3 Tổng quan về bệnh hoại tử gan thận ở cá biển

Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus có thể kí sinh trên rất nhiều loài cá biển có giá

trị kinh tế phân bố ở các vùng biển khác như các loài cá ở vùng biển ấm như cá chẽm

(Lates calcarifer), cá hồng (Lutjanus spp.), cá giò (Rachycentron canadum), cá mú (Epinephelus spp.) Bệnh do vi khuẩn V parahaemolyticus gây ra được báo cáo đã gây

thiệt hại kinh tế cho nghề nuôi cá biển ở nhiều nước trên thế giới 1, 3, 12, 18

Bệnh do vi khuẩn V parahaemolyticus gây ra đặc trưng bởi sự xuất hiện các đốm

đỏ, xuất huyết (bên ngoài hoặc nội quan bên trong) Vẩy cá bị tróc, rụng, tạo nên các vết loét ngày càng lan rộng và sâu Vây cá có thể bị mòn cụt, xơ xác Giải phẫu mẫu cá bệnh cho thấy hiện tượng xuất huyết nội tạng (đặc biệt là gan và thận) và xuất huyết trong cơ của cá Cá bị bệnh có thể chết hàng loạt khi bị cấp tính, hoặc chết rải rác khi ở thể thứ cấp tính

Đặc điểm bệnh hoại tử ở cá mú chấm cam với các triệu chứng ban đầu là cá thường bơi gần mặt nước hoặc bơi sát vào lưới, da cá sẫm màu, xuất hiện các đốm đỏ trên thân Sau đó, các đốm này tạo thành vết loét rộng ra xung quanh, kèm theo biểu

hiện xuất huyết ở vây, miệng, hậu môn, đuôi Giải phẫu nội quan thường thấy gan nhợt nhạt, thận đen bầm, đôi khi tích dịch trong xoang bụng ở một số trường hợp bệnh nặng Bệnh hoại tử gan thận xảy ra ở khắp mọi nơi có nghề nuôi động vật thủy sản nước

lợ và nước mặn Bệnh lây lan rất nhanh, nếu không phát hiện kịp thời có khả năng gây chết rất cao Bệnh thường xuất hiện vào mùa nóng và đầu mùa mưa, khi môi trường thay đổi đột ngột, làm cá dễ bị sốc Hơn nữa, vi khuẩn tổng số trong nước có xu hướng tăng khi nhiệt độ tăng Đây là điều kiện tốt cho vi khuẩn xâm nhập gây bệnh và đặc

biệt gây chết nhiều đối với cá giống mới thả nuôi Vi khuẩn V parahaemolyticus có

ảnh hưởng nghiêm trọng đến nghề nuôi thủy sản của hơn 14 nước và gây bệnh trên khoảng 48 loài cá biển

Bệnh do vi khuẩn V parahaemolyticus gây ra được chẩn đoán dựa vào những dấu hiệu bệnh lý đặc trưng như đã mô tả ở trên Nuôi cấy phân lập Vibrio trên môi trường chọn lọc và phân tích đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa 4 Ngoài ra, nhận biết V

parahaemolyticus bằng các phương pháp sinh học phân tử như phân tích trình tự gen 16S ribosomal DNA (rDNA) 11hoặc các gen độc tố đặc trưng 5

Để điều trị được bệnh hoại tử gan thận ở cá biển, một số nghiên cứu đã đề xuất biện pháp trị bệnh Vibriosis cho cá biển bằng cách cho ăn, tắm hoặc tiêm kháng sinh Biện pháp trộn kháng sinh vào thức ăn như trộn tetracyline 75-100 mg/kg cá, streptomycine 50-75 mg/kg cá, oxolinic acid 10 mg/kg cá và cho ăn liên tục trong 7 đến 10 ngày cũng cải thiện được tình trạng nhiễm bệnh do vi khuẩn Vibrio 3 Nhìn chung, kháng sinh là phương pháp chọn lựa đầu tiên dùng trị bệnh do vi khuẩn Mặc dù kháng sinh đã đem lại hiệu quả điều trị nhất định trong một số trường hợp, nhưng việc lạm dụng kháng sinh đã tạo ra các chủng vi khuẩn kháng thuốc gây khó khăn cho quá trình điều trị Nghiên cứu của Shyne và cộng sự (2008) về khả năng nhạy cảm với

kháng sinh của vi khuẩn V parahaemolyticus phân lập từ cá mú bệnh Kết quả cho

thấy hầu hết các chủng đều kháng lại sulphadiazine và amoxicillin, 87% kháng lại gentamycine, 89% kháng lại kanamycine và oxytetracycline 22.Ngoài ra, tồn dư kháng sinh trong sản phẩm thủy sản còn ảnh hưởng đến an toàn vệ sinh thực phẩm và môi trường Vì vậy, việc sử dụng kháng sinh để trị bệnh cho vật nuôi thủy sản vẫn không

nên khuyến khích và cần cân nhắc thận trọng trong từng trường hợp Chính vì những mặt trái do sử dụng kháng sinh, việc phòng bệnh cho cá nuôi vẫn luôn được chú ý trong suốt quá trình nuôi Phương pháp phòng bệnh tổng hợp thường được các trại nuôi

áp dụng như sát trùng bể, ao và dụng cụ trước mỗi đợt sản xuất, xử lý nguồn nước trước khi đưa vào sử dụng Thả cá nuôi với mật độ thích hợp, tránh làm cá bị tổn thương trong quá trình vận chuyển, tắm định kỳ để phòng các loại bệnh ký sinh trùng

và chú ý chất lượng thức ăn Tuy nhiên, đây chỉ là những biện pháp phòng bệnh đơn giản với mục đích giảm thiểu nguy cơ nhiễm bệnh, những thiệt hại do bệnh vẫn đang tiếp tục diễn ra và gây ảnh hưởng lớn cho nghề nuôi cá biển Hiện nay, giải pháp nâng cao sức đề kháng cho vật nuôi bằng cách sử dụng các chất gây kích thích miễn dịch

và vắc-xin phòng bệnh là phương pháp phòng bệnh chủ động mang lại hiệu quả cao,

đã và đang được tập trung nghiên cứu ở nhiều nước trên thế giới Song, để chế tạo ra các loại vắc-xin đặc hiệu hay chọn lựa được các hoạt chất kích thích miễn dịch đem lại hiệu quả bảo hộ cao cho vật nuôi vẫn là một thử thách không nhỏ đối với khoa học hiện nay

1.4 Vi khuẩnVibrio parahaemolyticus

1.4.1 Đặc điểm vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

1.4.1.1 Đặc điểm hình thái và cấu tạo của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

Dưới kính hiển vi quang học, Vibrio parahaemolyticus là phẩy khuẩn gram âm,

có tiên mao ở một đầu và có khả năng di động, không sinh bào tử [28]

Hình 1.1: Tế bào vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

quan sát dưới kính hiển vi điện tử

Loài: Vibrio parahaemolyticus

Khuẩn lạc của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus trên môi trường TCBS có màu

xanh đậm,dạng tròn đều và bóng với kích thước từ 2- 3 mm [28]

Hình 1.2: Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

Chúng có thời gian thế hệ 8-9 phút [9], thường sống ở các cửa sông và ven biển của hầu hết các vùng ven biển trên thế giới Người ta cũng đã phân lập được chúng trong cát, bùn và nước biển cũng như hải sản [22]

Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus có khả năng hình thành màng bao sinh học

(biofilm), sự hình thành các màng bao sinh học bắt đầu khi vi khuẩn bám trên bề mặt vật chủ Sau đó, vi khuẩn tiết ra các chất hình thành nên một lớp "keo" giúp cho chúng gắn chặt vào bề mặt vật chủ Khi đã hình thành các màng bao sinh học chắc chắn trên

dạ dày tôm, các vi khuẩn bắt đầu nhân lên, màng bao là hợp chất exopolysaccharides sẽ hình thành có tác dụng bảo vệ vi khuẩn với tác dụng của các loại kháng sinh, chất khử trùng, các chất chiết xuất từ thảo dược và các phương pháp điều trị khác, trong khi các hoạt động trao đổi chất ở tế bào của chúng vẫn diễn ra bình thường

1.4.1.2 Đặc điểm sinh học

Sự phân bố của Vibrio parahaemolyticus có mối liên quan chặt chẽ với nhiệt độ

nước Ở những vùng nước có nhiệt độ trên 150C, chúng có mặt quanh năm trong nước, chất lắng cặn và có mật độ tăng cùng với sự tăng lên của nhiệt độ nước 7, 15 Ngoài ra,

pH của môi trường cũng có ảnh hưởng đến hoạt động của vi khuẩn này Nghiên cứu

cho thấy các chủng V parahaemolyticus thí nghiệm đều phát triển được trên môi

trường NB (Nutrient Broth) với pH biến thiên từ 6,0 - 9,0 Tuy nhiên, ở pH 9,0 vi khuẩn không tiết ra hemolysin trong khi ở các pH khác đều có hiện tượng này Hơn nữa, khả năng vận động bằng tiên mao của vi khuẩn bị ức chế trong môi trường kiềm nhưng không bị ảnh hưởng ở môi trường trung tính và axit Kết quả nghiên cứu này cho thấy pH của môi trường có ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất và khả năng vận động của V parahaemolyticus 16 Khi ở độ mặn thích hợp và pH 8,0, vi khuẩn V

parahaemolyticus có khả năng di động bằng tiên mao với vận tốc 60 µm/s7

1.4.1.3 Đặc tính sinh hóa

Đặc điểm sinh hóa là một chỉ tiêu rất quan trọng để phân lập một loài vi khuẩn cụ thể Đặc điểm sinh hóa dựa trên khả năng sử dụng một số hợp chất, khả năng tiết

enzyme để thủy phân các chất có trong môi trường của vi khuẩn V paraheamolyticus

khi được nuôi trong môi trường tổng hợp hoặc bán tổng hợp sẽ sử dụng các hợp chất

có sẵn để phục vụ cho nhu cầu sinh trưởng và phát triển Người ta đã xác định được

một số đặc tính sinh hóa của V parahaemolyticus gồm: phản ứng dương tính với

oxidase và catalase, khả năng sử dụng lysin, ornithin, arginine, khả năng lên men đường glucose, có khả năng di động, dung huyết dạng β, sống được trong phạm vi muối từ 3-8%, không mọc ở môi trường không có muối (0%) hoặc muối quá cao (10%), kỵ khí tùy tiện và ưa môi trường kiềm mặn [29]

Bảng 1.1: Các phản ứng sinh hóa của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

Các phản ứng sinh hóa Vibrio parahaemolyticus

Di động

Sinh catalaza

Sinh oxidaza

Phản ứng lên men yếm khí

Phản ứng lên men hiếu khí

Sinh beta – galactosidaza

-

- +

-

-

-

-

-

1.4.2 Gen độc tố và cơ chế gây bệnh của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

1.4.2.1 Gen độc tố

Vi khuẩn Vibrio gây bệnh cho vật chủ thông qua các loại độc tố (toxin), đây là các

hoạt chất sinh học có bản chất protein hoặc không phải protein do vi khuẩn tiết ra nhằm gây độc cho tế bào vật chủ Quá trình gây bệnh của chúng diễn ra theo trình tự bám dính, xâm nhập vào tế bào vật chủ và tiết ra các độc tố phá vỡ màng tế bào và gây độc cho tế

bào vật chủ V parahaemolyticus vào tế bào vật chủ thông qua phân tử gắn kết đa trị

(Multivalent Adhesion Molecule - MAM) chứa 6 hoặc 7 vùng gắn kết 7 Hoạt tính dung huyết, phân giải protein, lipid, phospholipid, cytotoxin, yếu tố gây bám dính, ngưng kết đều liên quan tới khả năng gây bệnh của nhiều loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio và được quy định bởi các gen độc tố đặc trưng 25

Cũng như các loài vi khuẩn khác thuộc giống Vibrio, vi khuẩn V

parahaemolyticus cũng tồn tại rất nhiều chủng mang các yếu tố gây độc khác nhau Hemolysin là ngoại độc tố, chuyển các dạng ion liên kết với protein như hemolysin, transferrin, lactoferrin thành dạng tự do.Trong nhiều trường hợp, phạm vi tấn công của hemolysin không dừng ở các tế bào hồng cầu mà còn mở rộng đến các tế bào biểu mô,

tế bào thần kinh và các tế bào nhân đa hình làm tăng cường độc tố và gây phá hủy các

mô Kết quả của sự phân giải này là giải phóng beta-hemolysin (phân hủy hoàn toàn hemoglobin) và alpha-hemolysin (phân hủy không hoàn toàn hemoglobin) Chủng vi

khuẩn V parahemolyticus trên môi trường thạch máu Wagatsumar đã sản xuất ra

beta-hemoglobin

Ngày nay, người ta đã phát hiện có 4 nhóm protein độc tố gây ra hiện tượng dung

huyết ở vi khuẩn Vibrio bao gồm TDH (Thermostable direct haemolysin), Hly A (E1

Tor haemolysin), TLH (Thermolabile haemolysin) và TRH (Thermostable direct related haemolysin)[18].Trong đó, TDH, TLH và TRH thường gặp ở

V.parahaemolyticus trong khi Hly A thường gặp ở V cholera25

Vi khuẩn V parahaemolyticus có ba gen độc tố hemolysin bao gồm tdh và trhmã hóa các hemolysin bền nhiệt TDH, TRH và tlh mã hóa hemolysin không bền nhiệt TLH Cả hai gen tdh và trh đều nằm trên operon độc tố Vp-toxRS, được điều hòa bởi gen toxR có trình tự bảo tồn cao trong loài19

Protein TDH và TRH được mã hóa bởi gen tdh và trh tương ứng được coi là yếu

tố độc tính quan trọng trong quá trình gây bệnh của V parahaemolyticus20, 14 Gen

tdh , trh lần lượt có kích thước 250bp và 251 bp Giữa các chủng V.parahaemolyticus

có các đoạn gen độc tố khác nhau Hầu như tất cả các mẫu lâm sàng có tdh hoặc trh,

hoặc cả hai, trong khi gần như tất cả các mẫu từ môi trường không có hoặc có tỉ lệ thấp 1-5% [20]

Các chủng V parahaemolyticus có chứa các đoạn gen tdh và trh mã hóa các protein độc tố TDH và TRHcùng nằm trong operon độc tố V parahaemolyticustoxRS (Vp-toxRS), được điều hòa bởi gen toxR Gen toxR là gen điều hòa kiểm soát sự biểu

hiện của các gen mã hóa cho các nhân tố độc lực ngoại bào quan trọng và các gen liên

quan đến các độc tố khác Gen toxR có kích thước 368 bp là gen điều hòa cho operon

Vp-toxRS 26, tồn tại ở tất cả các chủng V parahaemolyticus Gen toxR là gen điều hòa kiểm soát sự biểu hiện của nhiều gen mã hóa của nhiều loài trong chi Vibrio, có trình tự

bảo tồn đặc trưng cho loài nên có thể được sử dụng làm gen đích để xây dựng phương

pháp phát hiện nhanh V parahaemolyticus trong mẫu thủy sản bằng kỹ thuật PCR Gen

tlh có kích thước 451 bp mã hóa một hemolysin không bền nhiệt TLD có trình tự amino

acid bảo thủ trong họ Vibrionaceae, nên có tiềm năng làm vắc-xin điều trị bệnh thủy sản

và marker chẩn đoán bệnh do Vibrio

Hầu hết các nghiên cứu về độc tố và cơ chế gây độc của Vibrio, nhất là V

parahaemolyticus đã được nghiên cứu tương đối sâu, chủ yếu là nghiên cứu các chủng phân lập từ người Kết quả đạt được mang lại nhiều ý nghĩa quan trọng trong y học, giúp chẩn đoán và điều trị bệnh do vi khuẩn này gây ra Tuy nhiên, số lượng công trình nghiên cứu cơ bản về các loại vi khuẩn gây bệnh cho đối tượng thủy sản vẫn còn hạn chế Việc tìm hiểu đặc điểm, cơ chế gây độc và tác hại của chúng trên đối tượng nuôi là rất cần thiết nhằm tìm ra các giải pháp hạn chế thiệt hại do vi khuẩn gây ra cho đối tượng thủy sản

1.4.2.2 Cơ chế gây bệnh

Vi khuẩn này có khả năng hình thành màng bao sinh học là hợp chất exopolysaccharides Sự hình thành các màng bao sinh học bắt đầu khi vi khuẩn bám trên bề mặt vật chủ Sau đó, vi khuẩn tiết ra các chất hình thành nên một lớp "keo" giúp cho chúng gắn chặt vào bề mặt vật chủ Các vi khuẩn bắt đầu nhân lên, màng bao sẽ hình thành có tác dụng bảo vệ vi khuẩn với tác dụng của các loại kháng sinh, chất khử

trùng, các chất chiết xuất từ thảo dược và các phương pháp điều trị khác, trong khi các hoạt động trao đổi chất ở tế bào của chúng vẫn diễn ra bình thường

Khi vi khuẩn V parahaemolyticus xâm nhập vào cơ thể cá biển, vi khuẩn lấy ion

Fe++ từ tế bào hồng cầu hình thành enzyme protease phục vụ cho quá trình tổng hợp protein của chúng

1.5 Các phương pháp kiểm tra sự có mặt của Vibrio parahaemolyticus

Có nhiều phương pháp được sử dụng để phát hiện V parahaemolyticus như dựa

vào quan sát hình thái dưới kính hiển vi điện tử, các đặc tính sinh hóa và các kỹ thuật sinh học phân tử như PCR, RAPD…

Các loài V parahaemolyticus khi nuôi cấy trên môi trường chọn lọc Thiosulfate

Citrate Bile Salt Sucrose (TCBS) có màu xanh lá cây hoặc màu xanh đậm trên thạch

Ngoài ra, V parahaemolyticus còn phát triển trên môi trường chọn lọc khác là

CHROMagarTMVibrio cho thấy các khuẩn lạc có màu tía hoặc màu tím

Kỹ thuật PCR được sử dụng để phát hiện V parahaemolyticus trong các mẫu

nước hoặc trên các loài cá biển Phương pháp này thực hiện nhanh, dễ dàng và đáng tin cậy

1.6 Triệu chứng của cá khi mắc bệnh do vi khuẩn Vibrio paraheamolyticus

Cá biếng ăn, hoạt động bơi bị rối loạn Cơ thể có màu đen đặc biệt ở vùng lưng và trên các vết thương tổn; da, vây có thể sưng lên và bị lở loét Cơ nổi hạch, mang nhợt nhạt, mắt cá lồi đục

Lớp cơ dưới da có nhiều sắc tố melanin màu đen và thể hiện dấu hiệu hoại tử, có hiện tượng lở loét của lớp biểu bì Lá lách, gan, thận bị hoại tử, vết hoại tử này lan nhanh, hoá lỏng và lá lách sẽ có màu đỏ anh đào, rồi mất dần hình dạng ban đầu của

nó, gan chuyển từ màu xám nâu thành màu vàng Các cơ quan bên trong khoang bụng xuất hiện mạch máu nổi rõ lên Tim cá bị bệnh xuất hiện các vết nâu đen

1.7 Đặc điểm hệ miễn dịch ở cá xương

Miễn dịch học ở cá được được chia thành hai loại:

1.7.1 Miễn dịch tự nhiên

Miễn dịch tự nhiên (hay còn gọi là miễn dịch không đặc hiệu) là khả năng tự bảo

vệ sẵn có của cá thể ngay từ khi mới sinh, không đòi hỏi phải có sự tiếp xúc trước với tác nhân gây bệnh và mang tính di truyền giống nhau giữa các cá thể cùng loài Vai trò của hệ miễn dịch tự nhiên được coi như là tuyến phòng thủ đầu tiên bảo vệ cơ thể chống lại các vật lạ xâm nhập và nó có ý nghĩa vô cùng quan trọng cho giai đoạn đầu đời, khi mà hệ miễn dịch thích nghi chưa được hoàn thiện Nhiều nghiên cứu về các khía cạnh khác nhau của hệ miễn dịch không đặc hiệu ở cá xương đã được tổng quan bởi các tác giả Chistiakov (2007) 6,Van (2008) 24 Hầu hết các nghiên cứu đều mô tả

về thành phần cấu thành và chức năng của chúng trong cơ chế tạo đáp ứng miễn dịch

tự nhiên ở cá Ba thành phần chính tạo nên hệ miễn dịch tự nhiên ở cá bao gồm hàng rào vật lý, hàng rào dịch thể và hàng rào tế bào không đặc hiệu

1.7.2 Miễn dịch đặc hiệu

Miễn dịch đặc hiệu hay còn gọi là miễn dịch mắc phải (miễn dịch thích nghi) là đáp ứng miễn dịch chỉ có thể thấy ở động vật có xương sống và có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cơ thể chống lại sự tái nhiễm bệnh Đặc điểm quan trọng của cơ chế đáp ứng miễn dịch này là tính đặc hiệu, tính đa dạng và tính nhớ, nhờ đó mà khi gặp lại cùng loại kháng nguyên, cơ thể sẽ hình thành nên đáp ứng miễn dịch thứ cấp đặc trưng với thời gian phản ứng nhanh và cường độ mãnh liệt hơn Cho đến nay, các nghiên cứu tương đối đầy đủ các khía cạnh liên quan đáp ứng miễn dịch đặc hiệu ở cá chỉ mới tập trung trên các đối tượng quen thuộc như cá hồi, cá da trơn và cá chép Những yếu tố cơ bản của hệ miễn dịch mắc phải là các thụ quan tế bào lympho T, lympho B, các phân tử kháng thể (Immuno globulin- Ig) 23 Tuyến ức, thận và lách là

ba cơ quan lympho lớn nhất ở cá xương Thận của cá, ngoài chức năng tạo máu còn là nơi chứa các tế bào lympho B sinh kháng thể

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: mẫu cá mắc bệnh hoại tử gan thận được thu thập từ vùng biển Hải Phòng

2.2 Vât liệu

2.2.1 Thiết bị và dụng cụ phòng thí nghiệm

2.2.1.1 Thiết bị

Bảng 2.1 Thiết bị chính dùng trong nghiên cứu

Tủ cấy vô trùng Sanyo (Nhật)

Nồi hấp vô trùng Nhật

Máy lắc Gyromax 737R Amerex Instrument (Đức)

Máy li tâm Mictocentriguge- Sorvall (Mỹ)

2.2.2 Môi trường và hóa chất

• Môi trường LB(Luria Betarni) lỏng:

• Môi trường Kligler Iron Agar (KIA):

• Hóa chất bổ trợ trong phản ứng sinh hóa Indol: Xylen

• Dung dịch nước muối pha loãng 0.9% và 1.5%

2.3.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

Phân lập chủng vi khuẩn V parahaemolyticus trên các mẫu cá bệnh phẩm được

tiến hành theo quy trình sau:

- B ước 1: Xử lý mẫu

Các mẫu gan, thận, da, mắt, vây cá thu được từ các mẫu bệnh phẩm bằng các dụng cụ thí nghiệm vô trùng Nghiền nhỏ mẫu trong dung dịch nước muối 1,5% Mix đều bằng máy vortex thu được dịch xử lý mẫu

- B ước 2: Tăng sinh sơ bộ

Lấy 1ml dịch xử lý mẫu bổ sung vào 9ml môi trường BHI đã hấp vô trùng Nuôi lắc ở 28ºC, 150 vòng/ phút trong vòng 24 giờ

- B ước 3: Phân lập trên môi trường nuôi cấy chọn lọc TCBS

Thu dịch sau tăng sinh sơ bộ, tiến hành pha loãng mẫu theo hệ số nhân 10-1, 10

-2, 10-3, .10-7 Lấy 100µl mỗi dịch pha loãng cấy chang đều lên bề mặt môi trường TCBS trên đĩa petri Nuôi trong tủ ấm 28ºC trong vòng 24 giờ

Chọn lọc những khuẩn lạc có hình thái giống của vi khuẩn V parahaemolyticus

trên môi trường TCBS (khuẩn lạc hình tròn, bóng, có màu xanh lá cây hoặc màu xanh đậm) Nhuộm Gram các chủng vi khuẩn lựa chọn, tuyển chọn các chủng vi khuẩn có

hình thái giống với chủng vi khuẩn V parahaemolyticus : Gram âm, hình que thẳng

hoặc hơi uốn cong, kích thước 0,3-0,5 x 1,4-2,6 µm Sau đó tiến hành ria thuần những chủng được tuyển chọn trên môi trường TCBS, nuôi trong tủ ấm 28℃ trong vòng 24h

Tiến hành cấy ria riêng rẽ các chủng vi khuẩn lựa chọn trên môi trường BHI agar

- B ước 4: Thử nghiệm các phản ứng sinh hóa của các chủng vi khuẩn tuyển

ch ọn

Tiến hành thử nghiệm các phản ứng sinh hóa bao gồm: thử nghiệm khả năng di động, thử nghiệm catalase, khả năng sử dụng các loại đường (glucose, lactose), thử nghiệm khả năng sinh gas, sinh H2S, khả năng sinh indol, thử khả năng dung huyết

- Bước 5: Dựa vào các kết quả sinh hóa tuyển chọn ra các chủng vi khuẩn

V parahaemolyticus.

Dựa vào các đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus là có khả

năng di động, sử dụng đường glucose, khả năng sinh indole, phản ứng dung huyết và catalase Và dựa vào kết quả sinh hóa của các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn, ta sẽ chọn

ra được chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

- Bước 6: Tiến hành giữ giống các chủng vi khuẩn tuyển chọn

Chuẩn bị ống eppendorf mới, glyxerol và môi trường BHI rồi đem hấp vô trùng, hấp xong cho ngay vào tủ cấy vô trùng và để nguội Lấy 600 l môi trường BHI vào trong ống eppendorf mới, tiếp tục lấy que cấy đầu tròn lấy khuẩn lạc cho vào ống eppendorf Mỗi một chủng vi khuẩn ta lên giữ khoảng 2- 5 ống eppendorf Sau đó, đem nuôi lắc ở 28ºC, 150 vòng/ phút trong vòng 24 giờ

Sau khi nuôi lắc xong, bổ sung khoảng 400 l glyxeron vào trong từng ống eppendorf Mix đều bằng máy vortex Sau đó, giống vi khuẩn được bảo quản ở nhiệt

độ -20ºC

2.3.2 Các phương pháp sinh hóa

- Phản ứng lên men đường trong môi trường KIA: sử dụng môi trường tổng hợp KIA (Kligler Iron Agar) Hấp tiệt trùng môi trường, rồi đổ ra các ống nghiệm vô trùng 15ml/ống, để tạo ống thạch nghiêng sao cho phần thạch nghiêng bằng 2 lần phần thạch đứng Vi khuẩn được lấy từ đĩa thạch BHI agar bằng que cấy vô trùng, cấy ria lên bề mặt thạch nghiêng, dùng que cấy kéo một đường từ dưới lên và cấy đâm sâu vào phần môi trường thạch đứng Nuôi vi khuẩn ở nhiệt độ 28ºC, sau 24h đem ra đọc kết quả Ghi nhận kết quả:

• Khả năng sử dụng đường: Vi khuẩn không sử dụng glucose và lactose có

cả ống thạch không chuyển màu, vi khuẩn sử dụng cả hai loại đường là glucose

và lactose có cả ống thạch chuyển sang màu vàng, vi khuẩn chỉ sử dụng glucose không sử dụng lactose có phần đáy ống ngiệm chuyển vàng phần thạch ngiêng có màu đỏ

• Khả năng sinh H2S: Vi khuẩn có khả năng sinh H2S sẽ làm ống thạch chuyển màu đen do H2S tạo kết tủa với ion sắt hay chì có trong môi trường

• Khả năng sinh gas: Vi khuẩn sinh gas sẽ taọ bọt khí đẩy lên làm tách thạch, vỡ thạch

- Phản ứng thử khả năng sinh Indol: môi trường sử dụng cho phản ứng là môi trường tryptone waster Môi trường được tiệt trùng để nguội và tăng sinh vi khuẩn Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn cấy vào môi trường, nuôi ở nhiệt độ 28°C Sau 24 giờ đem ra đọc kết quả bằng thuốc thử Kovac’s Trước khi bổ sung thuốc thử, bổ sung 1ml xylen vào ống nghiệm, lắc đều để chiết tách Indol lên lớp dung môi hữu cơ Những vi khuẩn

có hệ enzym tryptophanase sẽ oxi hóa axit amin tryptophan tạo nên các sản phẩm chứa gốc indol khi nhỏ thuốc thử vào, nó sẽ phản ứng với thuốc thử tạo một phức chất dạng quynone màu đỏ, cho kết quả dương tính với indol, những kết quả ngược lại, không tạo phức chất cơ kết quả âm tính

- Phản ứng thử khả năng sinh enzym catalase: vi khuẩn lấy từ môi trường thạch, đặt lên lam kính sạch rồi nhỏ H2O2 30% Quan sát 1-2 phút, kết quả là dương tính với thuốc thử, khi có hiện tượng sủi bọt khí do O2 với vi khuẩn hiếu khí và sinh enzym catalase Nếu vi khuẩn là kị khí hoặc không sinh enzym này thì sẽ cho kết quả âm tính, không có hiện tượng sủi bọt khí

- Phản ứng thử khả năng gây dung huyết: Nhằm mục đích phát hiện các vi sinh vật có khả năng làm tan hồng cầu Heamolysine là tác nhân làm tan hồng cầu động vật, các vi sinh vật khác nhau thì heamolysine khác nhau nên cường độ biểu hiện tan hồng cầu khác nhau Sử dụng môi trường blood agar hấp tiệt trùng, để nguội đến nhiệt độ thích hợp sau đó bổ sung 5 – 10% máu cừu, hoặc bê non Ria vi khuẩn cần thử ngiệm trên môi trường nuôi ở 28ºC trong 24 – 48 h rồi quan sát kết quả:

• Không tan huyết ( kiểu γ): không có sự tan huyết

• Tan huyết β: Phân giải hoàn toàn hồng cầu, xung quanh khuẩn lạc là một vòng trong suốt rông 2 – 4mm, tiêu huyết hoàn toàn, không còn hồng cầu ở xung quanh

• Tan huyết α: Xung quanh và dưới khuẩn lạc đổi màu xanh nâu do việc chuyển hóa heamoglobin (hồng cầu) => methemoglobin (màu xanh hoặc nâu) Methemoglobin hình thành do sắt hóa trị 2 bị chuyển hóa thành hóa trị 3 không

có khả năng vận chuyển oxy nữa

- Phản ứng thử khả năng di động của vi khuẩn:môi trường bán thạch 0,5%-0,8% thạch Thành phần môi trường LB có bổ sung 0,5%-0,8% thạch Dùng que cấy thẳng, lấy vi khuẩn, cấy đâm sâu vào bên trong môi trường thạch, đọc phản ứng sau 24- 48h

Vibrio parahaemolyticus có cấu tạo bởi 1 tiên mao nên nó có khả năng di động, mọc lan ra khỏi đường cấy, làm đục môi trường xung quanh, do đó cho kết quả (+) với thử nghiệm này Những chủng vi khuẩn không có cấu tạo bởi tiên mao thì không làm đục môi trường, chỉ mọc trên đường cấy, cho kết quả (-)

2.3.3 Đánh giá tính kháng kháng sinh trên một số chủng vi khuẩn Vibrio

parahaemolyticus phân lập được

• Mục đích:

Nghiên cứu khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus là

đưa ra cái nhìn tổng quan để đánh giá hiệu quả sử dụng kháng sinh điều tị bệnh cho cá, đồng thời đưa ra phác đồ điêu trị bệnh hoại tử gan thận trên một số loài cá biển Với logic tiếp cận như vậy, trong thí nghiệm này, chúng tôi đánh giá khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn phân lập với các loại kháng sinh được cho phép sử dụng trên động vật thủy sản là: Ampicilin 25 μg, Gentamycin 30 μg, Norfloxacin 10 μg, Enrofloxacin

5 μg, Erythromycin 15μg (Hãng sản xuất: MAST/Anh)

Việc đánh giá tính kháng kháng sinh được tiến hành dựa theo tiêu chuẩn của Clinical and Laboratory (CLSI) (2006): Nhạy (≥20 mm), nhạy trung bình (15-19 mm), kháng (≤14 mm)

• Phương pháp tiến hành:

- Bước 1: Hoạt hóa các chủng vi khuẩn V parahaemolyticus từ môi trường giữ

giống, đảm bảo độ thuần chủng và khả năng sinh trưởng, cũng như hoạt tính của chủng

-Bước 2: Tăng sinh trên môi trường dinh dưỡng không có chất chọn lọc BHI, mật

độ vi khuẩn đạt OD260 =0,6

-Bước 3: Pha loãng canh khuẩn đến nồng độ thích hợp Cấy trang trên môi

trường đĩa thạch thử kháng sinh

- Bước 4: Dùng kẹp vô trùng đặt đĩa giấy kháng sinh lên trên bề mặt thạch đã cấy

trang dịch vi khuẩn lên bề mặt thạch

- Bước 5: Để ở nhiệt độ môi trường từ 25-30 phút cho kháng sinh khuếch tán

trong thạch

- Bước 6: Lật úp đĩa để trong tử ấm 280C Sau 18-24 giờ, đọc kết quả

• Đọc kết quả: Sau 24 giờ dùng thước đo bán kính vòng vô khuẩn

2.3.4 Phương pháp gây nhiễm động vật thí nghiệm

Qua kết quả phân lập và định danh vi khuẩn cho thấy cá biển bị bệnh bị nhiễm vi

khuẩn Vibrio parahaemolyticus, tuy nhiên để kiểm tra xem vi khuẩn này có phải là tác

nhân gây bệnh cho cá biển (cá Mú, cá Giò…) hay không chúng tôi tiến hành cảm nhiễm gây bệnh bằng các chủng vi khuẩn đã phân lập được cho cá Mú trong phòng thí nghiệm

Cá được đưa vào gây bệnh hoàn toàn khoẻ mạnh trước khi tiến hành cảm nhiễm nhân tạo Cá được nuôi trong điều kiện các yếu tố thuỷ lý, thuỷ hoá thích hợp Thời gian tiêm bắt đầu từ 14h00 ngày 20 tháng 3 năm 2015, cá nuôi có sục khí liên tục, cá ở

lô đối chứng tiêm nước muối sinh lý 0,85%/con

Trong nghiên cứu về bênh học, người ta đã xác định được khả năng bị bệnh của vật nuôi phụ thuộc vào các yếu tố: môi trường sống, mầm bệnh, độc lực và cơ thể vật chủ

2.3.4.1 Gây nhiễm bằng vi khuẩn