Phân lập một số chủng nấm đảm có khả năng sinh laccase và nghiên cứu tiềm năng ứng dụng laccase trong oxy hóa các hợp chất s phenolic và một số hợp chất ô nhiễm vòng thơm

Trong các enzyme hiện đang nghiên cứu và ứng dụng vào xử lý ô nhiễm môi trường hiện nay, hướng nghiên cứu enzyme ngoại bào như laccase, manganese peroxidase MnP, lignin peroxidase LiP từ

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới ThS Đào Thị Ngọc Ánh, PGS TS Đặng Thị Cẩm Hà, TS Đinh Thị Thu Hằng, ThS Phùng Khắc Huy Chú, đã chỉ bảo, quan tâm hướng dẫn và dìu dắt tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, giúp tôi có thêm nhiều kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong nghiên cứu khoa học

Đồng thời, tôi cũng xin lời cảm ơn tới KS Nguyễn Duy Trung, NCS Nguyễn Thị Lan Anh, KS Trần Thị Thu Hiền, KS Nguyễn Hải Vân cùng các anh chị cán bộ của nhóm nghiên cứu, các nghiên cứu sinh và các bạn sinh viên đang công tác và học tập tại phòng Công nghệ sinh học tái tạo môi trường đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin cảm ơn các thầy cô trong Khoa Công nghệ sinh học – Viện Đại học Mở

Hà Nội, những người thầy đã truyền đạt cho tôi những kiến thức cơ bản, quý báu trong quá trình học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn bố mẹ, anh chị, những người thân trong gia đình và bạn bè đã tạo điều kiện động viên, giúp đỡ tôi cả về vật chất lẫn tinh thần trong thời gian qua

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2015

Sinh viên

Bùi Thế Sơn

MỞ ĐẦU 8

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 10

1.1 Laccase 10

1.1.1 Tổng quan về laccase 10

1.1.2 Cơ chế xúc tác của laccase 13

1.1.3 Một số tính chất hóa sinh của laccase 16

1.1.4 Ứng dụng của laccase 16

1.2 Oxy hóa hợp chất S-phenolic bởi laccase 17

1.3 Nghiên cứu sử dụng laccase loại màu thuốc nhuộm 19

1.3.1 Thuốc nhuộm 19

1.3.2 Nghiên cứu loại màu thuốc nhuộm bởi laccase từ vi sinh vật 21

1.4 Nghiên cứu phân hủy các chất diệt cỏ 23

1.4.2 Chất diệt cỏ 2,4,5-T 23

1.4.2 Sử dụng vi sinh vật sinh laccase và laccase để phân hủy chất diệt cỏ 24

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 27

2.1 Vật liệu 27

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 27

2.1.2 Hóa chất 27

2.1.3 Thiết bị, máy móc 27

2.2 Phương pháp phân lập nấm đảm có khả năng sinh laccase 27

2.3 Phương pháp xác định hoạt tính laccase 28

2.4 Xác định khả năng sinh laccase của các chủng thuần khiết 29

2.5 Đánh giá khả năng oxy hóa cơ chất S-phenolic bằng dịch enzyme thô 30

2.6 Đánh giá khả năng loại màu bằng dịch enzyme thô 30

2.7 Đánh giá khả năng phân hủy 2,4,5 – T bằng dịch enzyme thô 31

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Phân lập các chủng nấm 32

3.2 Khảo sát khả năng sinh tổng hợp laccase của các chủng nấm 34

3.3 Khả năng oxy hóa cơ chất S-phenolic bằng dịch enzyme thô 37

3.4 Khả năng loại màu thuốc nhuộm bằng dịch enzyme thô 40

3.6 Khả năng phân hủy 2,4,5-T bằng dịch enzyme thô của FAL1 46

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

Tài liệu tham khảo 50

Phụ lục……… 53

Danh mục các ký hiệu và thuật ngữ viết tắt

PCDDs polychlorinated dibenzo-p-dioxin , gọi tắt là dioxin

PCDFs polychlorinated dibenzofuran , gọi tắt là furan

ppm parts per million (là đơn vị đo các mật độ tương đối thấp)

Danh mục các bảng và hình minh họa

Bảng 1 Một số vi sinh vật có khả năng sinh laccase/ laccase-like……… 11

Bảng 3.1 Hình thái khuẩn lạc 10 chủng thuần khiết ……… 32

Bảng 3.2 Hoạt tính laccase của hai mẫu M và mẫu C sau 5 ngày theo dõi……… 47

Hình 1.1 Hình ảnh chung về không gian 3 chiều của laccase 12

Hình 1.2 Trung tâm hoạt động của laccase ………13

Hình 1.3 Cơ chế xúc tác của laccase……… 14

Hình 1.4 Các kiểu xúc tác của laccase……… 15

Hình 1.5 Cấu trúc một số chất thuộc nhóm S-phenolic……… 19

Hình 1.6 Cấu trúc một số loại thuốc nhuộm 20

Hình 1.7 Cấu trúc chất diệt cỏ 2,4,5-T……… 23

Hình 3.1 Hoạt tính laccase của các chủng nấm nuôi cấy trên môi trường PDB……… 35

Hình 3.1 Hoạt tính laccase của các chủng nấm nuôi cấy trên môi trường TSH1………… 35

Hình 3.4 Kết quả oxy hóa cơ chất acetonsyringone của 6 chủng nấm nghiên cứu………….39

Hình 3.5 Kết quả oxy hóa cơ chất syringaldehyde của 6 chủng nấm nghiên cứu………… 40

Hình 3.6 Kết quả loại màu Methyl Orange của 6 chủng nấm nghiên cứu……… 41

Hình 3.7 Khả năng loại màu Methyl Orange của 6 chủng nấm nghiên cứu……… 41

Hình 3.8 Kết quả loại màu RBBR của 6 chủng nấm nghiên cứu……… 42

Hình 3.9 Khả năng loại màu RBBR của 6 chủng nấm nghiên cứu……… 42

Hình 3.10 Kết quả loại màu Evans Blue của 6 chủng nấm nghiên cứu……… 43

Hình 3.11 Khả năng loại màu Evans Blue của 6 chủng nấm nghiên cứu……… 43

Hình 3.14 Sự thay đổi màu giữa mẫu C và mẫu chứa dịch laccase thô của FAL11 sau 24h thí nghiệm……… 45

Hình 3.15 Kết quả quét phổ UV-VIS của mẫu M và mẫu đối chứng……… 46

Hình 3.16 Kết quả quét phổ UV-VIS của mẫu M và mẫu đối chứng C……… 47

MỞ ĐẦU

Sự ô nhiễm môi trường hiện nay ngày càng nghiêm trọng do các hoạt động sản xuất công nghiệp của con người Đặc biệt có những hợp chất hữu cơ rất bền vững, độc hại và khó phân hủy sinh ra từ các hoạt động công nghiệp (như nước thải màu thuốc nhuộm) hoặc là hệ quả từ chiến tranh (như chất diệt cỏ/ dioxin) v.v Việc xử lý những chất ô nhiễm này bằng các phương pháp hóa học, lý học hay hóa-lý đều cho thấy những hạn chế như chi phí cao, tốn kém, hiệu quả chưa cao, chưa phân hủy triệt để, dễ tạo ra các sản phẩm phụ còn độ độc cao, khó phân hủy, gây nguy cơ ô nhiễm thứ cấp

Gần đây, với sự phát triển không ngừng của công nghệ sinh học, phương pháp phân hủy sinh học sử dụng các loại enzyme đang trở thành công cụ xử lý hiệu quả cao, chi phí thấp và đặc biệt rất thân thiện với môi trường Trong các enzyme hiện đang nghiên cứu và ứng dụng vào xử lý ô nhiễm môi trường hiện nay, hướng nghiên cứu enzyme ngoại bào như laccase, manganese peroxidase (MnP), lignin peroxidase (LiP)

từ các chủng vi sinh vật đã được quan tâm do tính xúc tác không đặc hiệu của các enzyme này, đặc biệt là laccase bởi phổ cơ chất rất rộng của nó Laccase cùng MnP và LiP đã được chứng minh có khả năng phân hủy dioxin, PAH, các thuốc nhuộm màu v.v [3] Ngoài ra, laccase còn được sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, một trong

số đó là tham gia quá trình chuyển hóa sinh khối thực vật nhằm tạo nguồn nguyên liệu cho sản xuất các cụm hóa chất kiến tạo Do đó phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng sinh ra các loại enzyme trên đã được nhiều nhà nghiên cứu thực hiện,

các hợp chất S-phenolic và một số hợp chất ô nhiễm vòng thơm” đã được tiến hành với nội dung như sau:

- Phân lập các chủng nấm sinh tổng hợp laccase từ một số địa phương

- Đánh giá khả năng oxy hóa các hợp chất S-phenolic của laccase từ các chủng nấm phân lập được

- Đánh giá khả năng loại màu thuốc nhuộm của laccase thô từ các chủng nấm trên

- Đánh giá khả năng phân hủy chất diệt cỏ 2,4,5-T của laccase thô sinh tổng hợp từ chủng đại diện

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Trong phân tử laccase có chứa 4 nguyên tử đồng có khả năng oxy hóa cơ chất

sử dụng phân tử oxy làm chất nhận điện tử Khác với phần lớn các enzyme khác, laccase có phổ cơ chất rất đa dạng bao gồm diphenol, polyphenol, các dẫn xuất phenol, diamine, amin thơm, benzenthiol, dioxin và thậm chí cả các hợp chất vô cơ như iot [3]

Laccase là một enzyme phổ biến trong tự nhiên, được tìm thấy ở rất nhiều các loại cây, nấm, xạ khuẩn và vi khuẩn, đóng nhiều vai trò trong quá trình sống của sinh vật [11] Các loại laccase tách chiết từ các nguồn khác nhau thì khác nhau về khối lượng phân tử, tính chất glycosyl hóa và tính chất động học[2]

Laccase của từng loại vi sinh vật thì có một số đặc tính riêng biệt khác nhau Cho đến nay laccase ở vi khuẩn rất ít được tìm thấy nhưng trong những nghiên cứu gần đây về bộ gene của vi khuẩn đã cho thấy laccase có thể được phân bố rộng rãi trong vi

khuẩn [4] Ngoài ra, một số chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces cũng có khả năng sinh tổng hợp laccase đã được phân lập trong những năm gần đây như S coelicolor, S

psamoticus [25]

Tuy nhiên, các nghiên cứu cũng như ứng dụng của laccase chủ yếu trên đối tượng nấm lớn, các đối tượng như nấm sợi, xạ khuẩn và vi khuẩn chưa được nghiên cứu nhiều Một số vi sinh vật có khả năng sinh laccase và laccase-like (thuộc nhóm

enzyme oxy hóa đa nhân đồng có phổ cơ chất đa dạng và bản chất tương tự laccase) được miêu tả ở bảng 1

Bảng 1 Một số vi sinh vật có khả năng sinh laccase/ laccase-like

Phanerochaete

chryosponrium

Melanocarpus albomyces

Streptomyces lavendulae

Bacillus licheniformis Pycnoporus

cinnabarinus

Fusarium oxysporum

Streptomyces pasmmoticus

Bacillus halodurans

Rhizotononia solani Aspergillus

nidulans

Streptomyces viridosporus

Thermus thermophilus Trametes vesicolor Trichoderma

harzianum

Streptomyces coelicolor

Bacillus subtilis

Trametes solani Aspergillus niger

Lentinula edodes Aspergillus terreus

Tuy nhiên, ở nấm thì laccase được nghiên cứu và khảo sát rất kỹ, đặc biệt là

laccase từ nhiều đại diện thuộc 3 ngành nấm là: Ascomycetes, Deuteromycetes và

Basidiomycetes Cho đến nay, có hơn 100 đoạn gene mã hóa cho laccase được phân lập, nhưng chỉ có khoảng gần 20 gene mã hóa cho các protein cụ thể được xác định, chủ yếu trong số này là của nấm đảm [27] Phân tử laccase thường gồm một chuỗi peptide, chỉ một số loại laccase có nhiều chuỗi peptide, khối lượng phân tử dao động trong khoảng 60 đến 100 kDa Phần lớn laccase của nấm có bản chất glucoprotein với hàm lượng cacbonhydrat chiếm khoảng 10 – 25% [5]

Tuy vậy, tất cả laccase đều giống nhau về cấu trúc trung tâm xúc tác với 4 nguyên tử đồng Những nguyên tử đồng này được chia thành ba nhóm: Loại 1 (T1), loại 2 (T2) và loại 3 (T3), chúng khác nhau về tính chất hấp thụ ánh sáng và thế điện

tử Các nguyên tử đồng T1 và T2 có tính chất hấp thụ điện tử và tạo thành phổ điện tử

mạnh, trong khi cặp nguyên tử đồng T3 không tạo phổ điện tử hấp thụ điện tử và có thể được hoạt hóa khi liên kết với anion mạnh [2][3]

Phân tử laccase thông thường bao gồm 3 tiểu phần chính (vùng) A, B, C có khối lượng tương đối bằng nhau, cả ba phần đều có vai trò trong quá trình xúc tác của laccase (hình 1.1) Bốn nguyên tử đồng trong laccase cũng khác nhau về các tính chất

về cộng hưởng từ tùy vị trí của chúng trong enzyme Vị trí liên kết với cơ chất nằm ở khe giữa vùng B và vùng C, trung tâm của một nguyên tử đồng nằm ở vùng C và trung tâm ba nguyên tử đồng nằm ở bề mặt chung của vùng A và vùng C Trung tâm đồng một nguyên tử chỉ chứa một nguyên tử đồng T1, liên kết với một đoạn peptit có hai gốc histidin và một gốc cystein Liên kết giữa nguyên tử đồng T1 với nguyên tử lưu huỳnh của cystein là liên kết đồng hóa trị bền và hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 600 nm, tạo cho laccase có màu xanh nước biển đặc trưng Trung tâm đồng ba nguyên tử có nguyên

tử đồng T2 và cặp nguyên tử đồng T3 Nguyên tử đồng T2 liên kết với hai gốc histidin bảo thủ trong khi các nguyên tử đồng T3 thì tạo liên kết với 6 gốc histidin bảo thủ [3] (hình 1.2)

Hình 1.1 Hình ảnh chung về không gian 3 chiều của laccase Tiểu phần A, B, C được kí hiệu

đỏ, xanh lá cây và xanh nước biển

Hình 1.2 Trung tâm hoạt động của laccase

1.1.2 Cơ chế xúc tác của laccase

Laccase là enzyme oxy hóa khử có khả năng oxy hóa diphenol và các hợp chất

có liên quan, sử dụng oxy phân tử làm chất nhận điện tử Khác với phần lớn các loại enzyme khác, laccase có phổ đặc hiệu cơ chất khá rộng Sự phù hợp của các cơ chất đối với laccase quyết định bởi hai nhân tố chính Thứ nhất là sự phù hợp giữa cơ chất

và nguyên tử đồng T1, thứ hai là sự phụ thuộc vào sự chênh lệch giữa thế oxy-hóa khử giữa cơ chất và enzyme Các đại lượng này phụ thuộc cấu trúc hóa học của cơ chất Thế oxy hóa khử của laccase dao động trong khoảng 0,4 đến 0,8 V Cơ chất khử bị mất một điện tử nhờ xúc tác laccase thường tạo thành một gốc tự do, gốc tự do không bền này tiếp tục bị oxy hóa nhờ xúc tác bởi chính laccase đó hoặc tiếp tục các phản ứng

không cần xúc tác enzyme như hydrate hóa, phân ly hoặc polymer hóa [2]

Trung tâm nguyên tử đồng một nguyên tử (T1) là nơi diễn ra phản ứng oxy hóa

cơ chất Cơ chất chuyển một điện tử cho nguyên tử đồng T1, biến nguyên tử đồng T1 (Cu2+) trở thành dạng Cu+, hình thành phân tử laccase có cả 4 nguyên tử đồng đều ở trạng thái khử (Cu+) Một chu kỳ xúc tác liên quan đến sự vận chuyển đồng thời 4 electron từ nguyên tử đồng T1 sang cụm nguyên tử đồng T2/T3 qua cầu tripeptide bảo thủ His-Cys-His Phân tử oxy sau đó oxy hóa laccase dạng khử, tạo thành hợp chất trung gian peroxy, và cuối cùng bị khử thành nước

Hình 1.3 Cơ chế xúc tác của laccase

Ngoài ra cơ chế xúc tác có thể xảy ra theo một trong các cơ chế sau Cơ chế đơn giản nhất có thể diễn ra khi các cơ chất bị oxy hóa trực tiếp bởi trung tâm hoạt động do

4 nguyên tử đồng đảm nhiệm Tuy nhiên, các phần tử cơ chất thường có cấu tạo cồng kềnh hoặc có thế khử quá lớn, vì vậy chúng không thể tiếp cận được trung tâm phản ứng của phân tử laccase Trong trường hợp này cần một hợp chất hóa học trung gian (mediator) Hợp chất hóa học này có thể tiếp xúc với trung tâm phản ứng của laccase

và bị laccase oxy hóa thành dạng gốc tự do Sau đó mediator ở dạng oxy hoá nhận một điện tử của cơ chất và trở thành khử, tiếp tục tham gia vào chu kỳ xác tác Ngược lại, laccase sau khi cho mediator một điện tử thì trở thành dạng khử, và sau đó bị oxy hoá thành dạng oxy hoá và tiếp tục tham gia vào chu kỳ xúc tác tiếp theo (Hình 1.4) Các mediator thường phù hợp cho laccase là 3-Hydroxyanthranillic acid (HAA), 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid), N-hydroxybenzo-trialzone (HBT), N-

hydroxyphtaimide (HPI), violuric acid ( VLA) v.v Sự tham gia của mediator đã làm tăng phổ cơ chất xúc tác và tính không đặc hiệu cơ chất của laccase

Hình 1.4 Các kiểu xúc tác của laccase (a) Chu kỳ xúc tác không có sự tham gia của các mediator (b) Chu kỳ xúc tác với sự tham gia của các mediator

Các chất ức chế của laccase thường là các ion nhỏ như azide, cyanide, fluoride Các ion này sẽ liên kết vào trung tâm đồng 3 nguyên và cản trở các dòng điện tử đi đến các nguyên tử này Các chất ức chế laccase khác là ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), acid béo, tropolone, acid kojic và acid coumaric, nhưng chúng chỉ có tác dụng ức chế ở nồng độ cao hơn Các hợp chất chứa sulfhydryl như L-cystein, dithiothreitol và thioglycolic acid cũng được coi là các chất ức chế laccase [2][3]

1.1.3 Một số tính chất hóa sinh của laccase

Hằng số Michaelis-Mesten (Km) của laccase dao động trong giới hạn khá rộng, trong khoảng 2 -500 µM phụ thuộc vào nguồn enzyme và cơ chất Hằng số này chính

là đặc trưng cho hoạt tính xúc tác của enzyme [3]

Laccase hoạt động tối thích trong khoảng pH 4-6 đối với cơ chất phenolic Khi tăng pH sang vùng trung tính hoặc vùng kiềm thì hoạt tính của laccase bị giảm, nguyên nhân do anion nhỏ là hydroxyt đã ức chế laccase Mặt khác tăng pH còn làm giảm thế oxy hóa – khử của các cơ chất phenolic nên phenolic dễ bị oxy hóa bởi laccase hơn Do vậy hoạt tính laccase ở các pH khác nhau là kết quả của hai tác dụng đối lập của pH là

sự tăng chênh lệch thế oxy hóa – khử laccase – cơ chất và tác dụng ức chế trung tâm đồng ba nguyên tử của ion hydroxyt Đối với các cơ chất không phải phenolic như ABTS thì phản ứng oxy hóa không liên quan đến sự vận chuyển ion, do đó pH tối thích nằm trong khoảng 2-3 Ngược lại, tính bền của laccase cao nhất trong khoảng pH kiềm nằm trong khoảng 8-9 [3]

Độ bền nhiệt của laccase phụ thuộc vào vi sinh vật mà nó sinh ra Thông thường laccase bền nhiệt ở nhiệt độ từ 30-50oC và mất hoạt tính rất nhanh khi nhiệt độ lên tới trên 50oC[2][3] Laccase bền nhiệt nhất được phân lập chủ yếu từ các loài thuộc sinh vật nhân sơ Laccase có nguồn gốc từ nấm thì thời gian bán hủy của nó thường nhỏ hơn

để phân giải chất độc trong nước thải các ngành công nghiệp kể trên, như là sản xuất giấy, dệt may, hóa dầu, tổng hợp polymer, sản xuất rượu và nước giải khát v.v Ngoài

ra, laccase cũng đã được nghiên cứu để ứng dụng để sản xuất thuốc chống ung thư, và

là một thành phần trong mỹ phẩm [3][27]

Laccase cũng có tiềm năng cao trong công nghệ nano sinh học để tạo các biosensor có độ nhạy cao Laccase còn được sử dụng để tham gia phân hủy các hợp chất lignocellulose, các hợp chất phenol phát thải từ hoạt động hóa dầu, sản xuất các hợp chất hữu cơ, và các chất ô nhiễm khó phân hủy thông qua quá trình oxy hóa khử Laccase được cố định trên các vật liệu mang và hệ thống laccase – chất gắn kết tỏ ra hiệu quả trong việc chuyển hóa các chất ô nhiễm chứa phenol và các hợp chất dẫn xuất clo phenol khác như hợp chất PAH, PCB, thuốc nổ TNT trong khai khoáng, quân sự, thuốc trừ sâu DDT, HCH v.v, thuốc diệt cỏ (2,4-D, 2,4,5-T) dùng trong nông nghiệp[3][21][27]

1.2 Oxy hóa hợp chất S-phenolic bởi laccase

Laccase xúc tác cho quá trình oxy hóa nhiều cơ chất phenol và các hợp chất thơm khác dưới điều kiện có oxy không khí Laccase từ nấm, đặc biệt từ các chủng

nấm đảm Basidiomycetes tỏ ra có nhiều ứng dụng trong công nghệ sinh học dựa trên

phổ rộng các cơ chất có thể bị oxy hóa tại vùng tiểu phần của nguyên tử Cu T1 Nó oxy hóa mạnh một số thành phần phenolic có nguồn gốc từ lignocellulose, góp phần tham gia chuyển hóa phế phẩm từ thực vật, hoặc có thể được dùng để loại màu nước thải từ công nghiệp dệt nhuộm [12]

Sự phân hủy sinh học lignin là 1 quá trình oxy hóa bởi nấm đảm, bẻ gãy liên kết Aryl-ete (β-O-4) và oxy hóa phân hủy chuỗi cạnh bên của p-hydroxyphenyl (H), guaiacyl (G) and syringyl (S) các tiểu phần lignin, tạo ra các sản phẩm phenolic (acids, ketones and aldehydes) Một vài chất trong số chúng (như acetosyringone, syringaldehyde, p-hydroxy-cinnamic acids, v.v) có thể đóng vai trò như chất gắn kết tự nhiên của laccase Trong quá trình oxy hóa, các cơ chất phenolic này thúc đẩy hoạt động oxy hóa polymer lignin của chính chúng, và nhiều hợp chất vòng thơm khó phân hủy Trong những phát hiện gần đây, các nhà khoa học đã nhấn mạnh về tiềm năng

công nghệ sinh học cao của laccase nấm và những mediator tự nhiên của chúng để cải thiện khả năng chuyển hóa phế phẩm của thực vật trong công nghệ hiện đại xử lí lignin Hơn nữa, sinapic acid, acetosyringone và các thành phần khác có hoạt tính sinh học với các đặc tính kháng khuẩn và chống oxy hóa, có thể được dùng để bổ sung các đặc tính mới cho cellulose và sợi gỗ, xúc tác bởi laccase Các thành phần phenolic khác

có thể được chiết xuất từ lignin gỗ như syringaldehyde hoặc vanillin cung cấp mùi thơm, vị hoặc dùng là một hóa chất chuẩn đoán trong y học [12]

Các thí nghiệm đo màu dựa trên sự oxy hóa các thành phần phenolic có liên quan tới các tiểu phần S-lignin đã được Isabel Pardo và cộng sự nghiên cứu Các thành phần này, vốn là cơ chất tự nhiên của laccase, có thể là mấu chốt trong sự phân hủy lignocellulose dựa vào mối liên kết giữa carbonhydrats và lignin ở thành tế bào thứ cấp

ở cỏ; hoặc được sử dụng làm chất gắn kết hiệu quả nâng cao khả năng phân hủy các chất gây ô nhiễm và polymer phức hợp Khả năng chuyển hóa các cơ chất S-phenolic này càng tốt, thì càng chứng tỏ đặc tính oxy hóa sinh học càng cao của laccase sinh tổng hợp từ vi sinh vật đó, nhất là các chủng nấm đảm

Các hợp chất S-phenolic được sử dụng trong nghiên cứu sàng lọc các dòng laccase đột biến theo hướng ứng dụng trong phân hủy lignocellulose đã được tiến hành Phương pháp này giúp giảm thiểu thời gian cũng như tập trung khư trú thẳng vào mục đích nhằm sàng lọc nhanh chủng vi sinh vật sinh laccase có khả năng tham gia vào quá trình phân hủy lignocellulose [12] Ba chất thuộc nhóm S-phenolic được sử dụng là sinapic acid, acetosyringone, syringaldehyde, cấu trúc của ba chất này được thể hiện tại hình 1.5

Sinapic acid Acetosyringone Syringaldehyde

Hình 1.5 Cấu trúc một số chất thuộc nhóm S-phenolic

1.3 Nghiên cứu sử dụng laccase loại màu thuốc nhuộm

1.3.1 Thuốc nhuộm

Thuốc nhuộm là những chất hữu cơ có màu, hấp thụ mạnh một phần nhất định của quang phổ ánh sáng nhìn thấy và có khả năng gắn kết vào các vật liệu dệt Thuốc nhuộm có thể có nguồn gốc thiên nhiên hoặc tổng hợp Hiện nay, con người hầu như chỉ sử dụng thuốc nhuộm tổng hợp Đặc điểm nổi bật của các loại thuốc nhuộm là độ bền màu – tính chất không bị phân hủy bởi điều kiện, tác động khác nhau của môi trường, đây vừa là yêu cầu với thuốc nhuộm lại vừa là vấn đề với xử lí nước thải dệt nhuộm Màu sắc của thuốc nhuộm có được là do cấu trúc hóa học của nó Một cách chung nhất, phân tử thuốc nhuộm bao gồm các nhóm mang màu và nhóm trợ màu Nhóm mang màu là những nhóm có các nối đôi liên hợp với hệ điện tử linh động như

>C=C<, >C=N-, -COOH, -OH, -N=N-, v.v Nhóm trợ màu là nhóm thế cho hoặc nhận điện tử, như –SOH, -COOH, -OH, -NH2, v.v đóng vai trò tăng cường màu của nhóm mang màu bằng cách dịch chuyển năng lượng của hệ điện tử [1][3] Một số thuốc nhuộm màu được sử dụng như chất màu tiêu chuẩn cho nghiên cứu khả năng loại màu bởi vi sinh vật nói chung và laccase nói riêng như Methyl Orange (470 nm), Evans Blue (605 nm) and Remazol Brilliant Blue (640 nm) [12] (Hình 1.3)

Methyl Orange Remazol Brilliant Blue

Evans Blue

Hình 1.6 Cấu trúc một số loại thuốc nhuộm

Nước thải màu sinh ra chủ yếu từ các ngành công nghiệp như sản xuất thuốc nhuộm, dệt nhuộm, in ấn Nước thải màu từ công nghiệp dệt là hỗn hợp của các công đoạn hồ sợi, nấu, tẩy, tẩy trắng, làm bóng sợi, nhuộm in và hoàn tất Hai phần trăm màu được tạo ra bị thất thoát trực tiếp vào nguồn nước và hơn 10% sau đó bị mất mát trong quá trình nhuộm màu vải Những hợp chất nêu trên đã thành vấn đề quan tâm trong hoạt động bảo vệ môi trường [30] Ước tính có hơn 10.000 thuốc nhuộm và chất màu khác nhau thường được sử dụng Tổng sản lượng màu hữu cơ của thế giới lên tới hơn 100.000 tấn/năm Số lượng lớn thuốc nhuộm trong công nghiệp dệt thải vào môi trường do khả năng hấp thụ kém của chúng vào sợi vải [16]

Các nhóm màu khác nhau như azo, triphenylmethan và phthalocyanine đã làm cho màu của thuốc nhuộm có cấu trúc đa dạng Ngoài ảnh hưởng đến thị giác và tác động bất lợi do nhu cầu oxy hóa học của màu thuốc nhuộm, nhiều loại màu tổng hợp còn thể hiện tính độc, gây ung thư và đột biến gene Đặc biệt là các màu tổng hợp có lưu huỳnh và các sản phẩm phân hủy liên quan đến chúng có chứa các nguyên tố cấu trúc, đặc tính chưa được biết rõ hay rất hiếm trong tự nhiên; chúng không chỉ có ảnh hưởng xấu đến thẩm mỹ mà còn kháng lại sự tấn công của vi sinh vật và tăng tính độc của nước và đất [29] Khi đi vào nguồn nước nhận như sông, hồ v.v với một nồng độ rất nhỏ thuốc nhuộm đã cho cảm nhận về màu sắc Thuốc nhuộm thải ra càng nhiều thì màu nước càng đậm Màu của nước thải cản trở sự hô hấp, sinh trưởng của các loài thủy sinh vật Nó tác động xấu đến khả năng phân giải của vi sinh đối với các chất hữu

cơ trong nước thải

1.3.2 Nghiên cứu loại màu thuốc nhuộm bởi laccase từ vi sinh vật

Trong số nhiều cơ chế sinh học loại bỏ màu đã được đăng tải trong các tạp chí khoa học thì hấp phụ sinh học kết hợp với phân hủy sinh học dường như có tiềm năng lớn cho áp dụng quy mô công nghiệp Vi khuẩn phân hủy những màu này cần có sự tham gia của enzyme nội bào trong khi nấm phân hủy chúng bằng các enzyme ngoại bào [30] Ngày nay, hầu hết nghiên cứu liên quan đến phân hủy đều tập trung vào loài

nấm đảm Phanerochaete chrysosporium, nó được biết đến với khả năng khoáng hóa

thuốc nhuộm màu xanh lục và xanh cotton khi sử dụng hệ sợi của nấm sau khi nuôi cấy

96 h [1] A ochraceus NCIM-1146 cũng có khả năng phân hủy màu thuốc nhuộm xanh

hòa bình đậm 25 khá tốt Chủng Pinicillium ochorochloron MTCC 517 trong quá trình

phân hủy màu sinh học màu xanh triphenylmethan ngoài sinh LiP loài nấm này còn sinh laccase, mà không thấy sự xuất hiện của enzyme ngoại bào MnP [1]

Rất ít nghiên cứu thực hiện xử lý loại màu bởi nấm men Chỉ tìm thấy một vài đại diện nấm men Ascomycetous như Candida zeylanoides, C tropicalis,

Debaryomyces polymorphus và Issatchenkia occidentalis thực hiện phân hủy màu bằng

hệ enzyme và loại màu các thuốc nhuộm azo khác nhau [1] Loài nấm men

Debaryomyces polymorphus có khả năng loại được 4 màu Reactive Red M-3BE, Procion Scharlach H-E3G, Procion Marine H-EXL và Reactive Brillant Red K-2BP với hiệu suất loại màu đạt 69-94% [1]

Trên thế giới hiện nay đã có các quy trình xử lý thuốc nhuộm trong nước thải

bằng vi sinh vật Laccase từ chủng nấm Polyporus sp S133 có khả năng phân hủy màu

RBBR thành hai sản phẩm nhỏ là sodium 2-sulfonate và sodium 2-((3-aminophenyl)sulfonyl) ethyl sulfate Tuy khối lượng phân

1-amino-9,10-dioxo-9,10-dihydroanthracene-tử của những sản phẩm phân hủy nhỏ hơn nhưng độc tính không ít hơn so với hợp chất ban đầu Vì vậy vẫn cần được tiếp tục nghiên cứu cho đến khi loại bỏ được hoàn toàn các sản phẩm trung gian nguy hại với sức khỏe con người [9]

Selvam và cộng sự đã công bố hai chủng là Schizophyllum commune và Lenzites

eximia có khả năng loại màu từ nước thải trong công nghiệp nhuộm [22] Trong đó,

chủng Schizophyllum commune loại được 76,15% xử lý theo mẻ và ở điều kiện xử lý liên tục loại được 55,92%; còn chủng Lenzites eximia loại được lần lượt là 75,23% và

54,60% sau 5 ngày xử lý Một nghiên cứu khác của Rani và cộng sự cũng đã sử dụng

chủng nấm Daedalea flavida đã loại bỏ được 80% màu metani yellow sau 10 ngày với

nồng độ ban đầu 50 ppm [20]

Ở nước ta hiện nay các nhà máy dệt nhuộm sử dụng trên 70% thuốc nhuộm hoạt tính so với các loại thuốc nhuộm khác như phân tán, hoàn nguyên v.v Cho đến thời điểm này vẫn chưa có công trình xử lý nước thải nhuộm nào sử dụng vi sinh vật sinh

tổng hợp enzyme hay enzyme thô cố định để xử lý thuốc nhuộm ở quy mô công nghiệp Nước ta là nước nhiệt đới, có đa dạng vi sinh vật cao và đặc biệt là nấm có khả năng sinh tổng hợp hệ enzyme oxidoreductase như Lac, LiP và MnP Do đó việc tìm kiếm, phát hiện và khai thác enzyme ngoại bào ở Việt Nam để xử lý các chất đa vòng thơm trong đó có chất diệt cỏ/dioxin và thuốc nhuộm sẽ mở ra triển vọng lớn trong việc làm sạch các chất ô nhiễm giảm bớt tác hại mà chúng gây ra đối với môi trường sống và sức khỏe của con người

1.4 Nghiên cứu phân hủy các chất diệt cỏ

1.4.2 Chất diệt cỏ 2,4,5-T

2,4,5-T là tên gọi tắt của 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid Công thức hóa học

là C8H5O3Cl3, khối lượng phân tử 255,49 g/mol Công thức cấu tạo được thể hiện ở hình 1.5 2,4,5-T tinh khiết có dạng tinh thể rắn, không mùi, từ không màu đến màu vàng nâu nhạt, tan ít trong nước, độ hòa tan trong nước ở 30oC là 238 mg/l, tan tốt trong dung môi hữu cơ Tỷ trọng là 1,8 g/cm ở 20oC Nhiệt độ nóng chảy trong khoảng 154-158oC Thời gian bán hủy trong đất là 15-59 ngày [3]

1.4.2 Sử dụng vi sinh vật sinh laccase và laccase để phân hủy chất diệt cỏ

Trong thập kỷ qua, các chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy chất diệt cỏ/dioxin và các chất tương tự dioxin đã được phân lập và nghiên cứu ngày càng sâu về tính đa dạng, sinh thái và sinh học phân tử của các loài vi sinh vật này Các nghiên cứu chỉ ra có 4 cơ chế phân hủy và chuyển hóa dioxin khác nhau [26]:

(1) Các enzyme hydrocarbon oxygenase oxy hóa cắt vòng thơm nhờ các vi sinh vật hiếu khí

(2) Loại halogen của các sản phẩm cắt vòng bởi các vi sinh vật hiếu khí

(3) Phân hủy bởi các enzyme ngoại bào như laccase, laccase-like, manganese, peroxidase, lignin peroxidase do vi sinh vật tạo ra

(4) Loại khử halogen bởi các vi sinh vật kỵ khí

Trong 10 năm trở lại đây, các nghiên cứu về các con đường phân hủy dioxin và các chất tương tự dioxin rất được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm Trong đó quá trình phân hủy bởi các vi sinh vật hiếu khí được nghiên cứu kĩ nhất ở chủng

Spingomonas sp RW1 Hiện nay các con đường phân hủy theo con đường đồng trao đổi chất đã được nghiên cứu ở các chủng vi sinh vật thuộc các chi khác như:

Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Sphingomonas, Terrabacter, Beijerinkia, Alcaligenees, Klebsiella, Burkholderia,v.v [26]

Nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn kỵ khí và hiếu khí đã chứng tỏ khả năng phân hủy dịch chiết đất và 2,3,7,8-TCDD Kết quả từ các mẫu đất có bổ sung vi sinh vật đã cho thấy khả năng chúng không chỉ phân hủy 2,3,7,8-TCDD mà còn cả furan Nghiên cứu cũng đã chứng minh khả năng phân hủy của chủng XKDN1, XKDN19 có thể phân hủy 85,97% của 333,3 ppt đồng phân 2,3,7,8-TCDD sau 2 tuần nuôi cấy, đồng thời, chủng này cũng có khả năng phân hủy 78,7% anthracen và 22,4% fluoranthen sau 3 tuần nuôi cấy [10]

Ngoài cơ chế phân hủy chất diệt cỏ/dioxin và các chất tương tự dioxin bởi các enzyme nội bào tức là phải chuyển các chất độc qua màng tế bào thì cơ thể xúc tác phân hủy các hợp chất đó bằng các enzyme ngoại bào cũng đã được quan tâm, trong đó

có laccase và laccase-like (thuộc nhóm enzyme oxy hóa đa nhân đồng có phổ cơ chất

đa dạng và bản chất tương tự laccase) [26]

Laccase đã được chứng minh là hiệu quả trong việc loại bỏ các chất độc hại thông qua quá trình oxy hóa, giúp chuyển hóa các chất gây ô nhiễm môi trường, như là dioxin, từ dạng cấu trúc phức tạp về dạng đơn giản hơn và ít độc hơn, thậm chí là hết độc Laccase cố định đang được nghiên cứu và cho thấy có tiềm năng để xử lí các hợp chất phenolic và clo phenolic gây ô nhiễm môi trường Laccase cũng được phát hiện là khả năng chuyển đổi của 2,4,6-trichlorophenol về 2,6-dichloro-1,4-hydroquinol và 2,6-dichloro-1,4-benzoquinone Ngoài ra, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng laccase từ một số chủng nấm đảm có thể được sử dụng để oxy hóa các anken, carbazole, N-ethylcarbazole, fluorene, và dibenzothiophene trong sự hiện diện của ABTS là chất gắn kết [11]

Isoxaflutole là một loại thuốc diệt cỏ được kích hoạt trong đất và thực vật bởi

sự phát sinh diketonitrile, dạng hoạt động và gây độc của thuốc diệt cỏ Laccase có thể chuyển hóa diketonitrile thành acid Các báo cáo và nghiên cứu đã chỉ ra hệ laccase – chất gắn kết tỏ ra hiệu quả trong công nghệ phục hồi sinh học đối với nhóm chất polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) Laccase cũng được sử dụng để giảm thiểu

sự hình thành các hợp chất dị vòng như các thuốc trừ sâu hữu cơ có gốc halogen ở trong đất [3][27]

Các nghiên cứu quốc tế về vi sinh vật sinh laccase ứng dụng trong phân hủy chất diệt cỏ/dioxin đã và đang có những bước tiến triển

Các vi sinh vật phân hủy 2,4-D đã được tìm thấy trong một số loại đất, bùn, vùng nước hiếu khí gần bề mặt, phân ủ, bùn hoạt tính, các hồ, và các sông 2,4-D được chuyển hóa thành 2,4-DCP và sau đó được oxy hóa đến 3,5-dichlocatechol Ryan và Rumbus

thông báo về khoáng hóa 2,4,5-T bởi nấm đảm Phanerochaete chrysosporium

BKM-F-1767 trong điều kiện nuôi cấy lỏng và trong đất [22] Tuy nhiên, một số nghiên cứu về phân hủy 2,4-D và 2,4-DCP bởi các vi nấm đã được công bố Đến năm 2005 Vroumsia

và đồng sự mới công bố chi tiết về khả năng phân hủy 2,4-D và 2,4-DCP bởi

Aspergillus penicilloides, Mortierella isabellina, Chrysosporium pannorum và Mucor

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu nấm đảm thu thập từ các khu vực khác nhau như rừng Quốc gia Ba Vì, rừng Mã Đà (Đồng Nai), Đồi Thịt Băm - A Lưới (Thừa Thiên Huế), rừng Quốc gia Xuân Sơn - Phú Thọ và Tuyên Quang Mẫu được bảo quản và vận chuyển về phòng thí nghiệm trong 24 giờ, sử dụng làm nguồn nguyên liệu cho phân lập

2.1.2 Hóa chất

Hóa chất được sử dụng để nghiên cứu là các hóa chất tinh khiết, đảm bảo chất lượng như: sinapic acid; acetosyringone và syringaldehyde; Methyl Orange; Evans Blue; Remazol Brilliant Blue (RBBR); ABTS; 2,4,5-T v.v được sử dụng của các hãng như Sigma, Merk v.v Hóa chất sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật được sản xuất tại Việt Nam và Trung Quốc

2.1.3 Thiết bị, máy móc

Các thiết bị, máy móc được sử dụng là của Viện Công nghệ sinh học và của phòng Công nghệ sinh học Tái tạo môi trường Các thiết bị bao gồm: Box cấy vô trùng Laminar của Pháp, Cân kỹ thuật của hãng Ohaus, máy đo quang phổ hấp thụ Novaspec

II, cân điện tử, nồi khử trùng ướt, nồi khử trùng khô, tủ sấy, máy nuôi lắc nhiệt ổn định, tủ nuôi ổn nhiệt, máy ly tâm, máy chu trình nhiệt, thiết bị phân tích PAH là UV-VIS: GBC-CINTRA4, tủ lạnh các loại 40C, -200C, -800C, lò vi sóng Panasonic và các dụng cụ thí nghiệm khác như: bình tam giác, bình trụ, đầu typ, ống ly tâm, micropipet của hãng Eppendorf, v.v

2.2 Phương pháp phân lập nấm đảm có khả năng sinh laccase

Sử dụng môi trường PDA có bổ sung Guaiacol 0.01 % để phân lập, Guaiacol dóng vai trò chất chỉ thị cho sự có mặt của nhóm enzyme ligninolytic (laccase, MnP