Tuyển chọn một số chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng sinh tổng hợp enzym kitinaza ngoại bào cao

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình sinh tổng hợp enzym kitinaza của các chủng vi sinh vật đã tuyển chọn .... Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh tổ

Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học

Tuyển chọn một số chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng sinh

tổng hợp enzym kitinaza ngoại bào cao

Người hướng dẫn: PGS.TS Tăng Thị Chính Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Hương Lớp: 11-04

Hà Nội – 2015

Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học

LỜI CẢM ƠN Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Tăng Thị Chính- Trưởng phòng Vi sinh

vật môi trường, Viện công nghệ môi trường đã dành thời gian công sức tận tình hướng dẫn và định hướng cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu giúp tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Tôi xin trân trọng cảm ơn ThS Đặng Thị Mai Anh đã trực tiếp hướng dẫn và

đóng góp nhiều ý kiến quý báu, chỉ bảo tôi suốt quá trình nghiên cứu đề tài

Tôi xin trân trọng cảm ơn các anh, chị phòng Vi sinh vật môi trường đã tạo điều kiện, giúp đỡ và chỉ bảo tôi trong suốt thời gian thực tập

Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy, cô Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội đã dạy dỗ tôi, cho tôi kiến thức và kinh nghiệm bổ ích trong suốt quá trình học tập

Cuối cùng, tôi dành lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình thân yêu, người thân, bạn

bè luôn ở bên tôi, cho tôi nguồn động lực,chia sẻ và giúp tôi hoàn thành tốt quá trình học tập và nghiên cứu của mình

Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2015

Sinh viên

Nguyễn Thị Hương

Nguyễn Thị Hương Lớp 11-04

MỤC LỤC CHƯƠNG1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu chung về kitin và kitinaza 3

1.1.1 Kitin 3

1.1.2 Kitinaza 5

1.2 Khả năng sinh tổng hợp enzym kitinaza của một số chủng VSV 9

1.2.1 Một số chủng VSV có HT kitinaza 9

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp kitinaza 9

1.3 Các ứng dụng của kitinaza 11

1.4 Tình hình nghiên cứu và kitinaza 14

1.4.1 Ngoài nước 14

1.4.2 Trong nước 18

Chương II PHƯƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 20

2.1 Vật liệu 20

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.1.2 Dụng cụ và thiết bị 20

2.1.3 Môi trường 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 21

2.2.1 Địa điểm thu mẫu 21

2.2.2 Phương pháp phân lập vi sinh vật 21

2.2.3 Phương pháp thuần khiết và bảo quản giống 22

2.2.4 Phương pháp xác định khả năng tổng hợp enzym kitinaza bằng phương pháp thỏi thạch 22

2.2.5 Phương pháp xác định khả năng tổng hợp enzym kitinaza bằng phương pháp giếng thạch 22

2.2.6 Nghiên cứu thành phần môi trường và nguồn dinh dưỡng, các yếu tố ảnh hưởng đến vi sinh vật 23

Chương III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

3.1 Tuyển chọn chủng vi sinh vật chịu mặn sinh enzyme kitinaza 25

3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình sinh tổng hợp enzym kitinaza của các chủng vi sinh vật đã tuyển chọn 29

3.2.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon 29

3.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ cacbon 32

3.2.3 Ảnh hưởng của nồng độ kitin 34

3.2.4 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl 37

3.2.5 Ảnh hưởng của thời gian 39

Nguyễn Thị Hương Lớp 11-04

3.2.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ 42

3.2.7 Ảnh hưởng của pH môi trường 44

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

1 Kết luận 48

2 Kiến nghị 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

Nguyễn Thị Hương Lớp 11-04

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần các môi trường sử dụng trong nghiên cứu 21

Bảng 3.1 Kết quả tuyển chọn bước đầu các chủng vi sinh vật chịu mặn sinh tổng hợp

enzym kitinaza ngoại bào 25

Bảng 3.2 Kết quả tuyển chọn các chủng VSV chịu mặn có khả năng sinh tổng hợp

enzym kitinaza ngoại bào cao 27

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sinh tổng hợp kitinaza của 30

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp enzym

kitinaza của các chủng VSV đã tuyển chọn 40

Bảng 3.8 Ảnh hưởng nhiệt độ lên khả năng sinh tổng hợp enzym kitinaza của các

chủng VSV đã tuyển chọn 43

Bảng 3.9 Ảnh hưởng pH lên khả năng sinh tổng hợp enzym kitinaza của các chủng

VSV đã tuyển chọn 45

Nguyễn Thị Hương Lớp 11-04

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cấu trúc phân tử kitin 4

Hình 1.2: Các cấu hình của kitin 4

Hình 1 3: Cơ chế hoạt động của các enzym kitinaza 7

Hình 3.1 Đường kính vòng phân giải của một số chủng VSV chịu mặn sinh tổng

hợp enzym kitinaza ngoại bào 28

Hình 3.2 Sự biến thiên HT enzym kitinaza của các chủng VSV theo nguồn C

trong MT 31

Hình 3.3 Ảnh hưởng của nguồn C đến khả năng sinh tổng hợp enzym kitinaza

ngoại bào của các chủng VSV tuyển chọn 32

Hình 3.4 Sự biến thiên HT enzym kitinaza của các chủng VSV theo nồng độ C

trong MT 34

Hình 3.5 Sự biến thiên hoạt tính enzym kitinaza theo nồng độ kitin trong môi

trường nuôi cấy 36

Hình 3.6 Sự biến thiên hoạt tính enzym kitinaza theo nồng độ NaCl trong môi

trường 39

Hình 3.7 Sự biến thiên hoạt tính enzym kitinaza của các chủng VSV theo thời

gian nuôi cấy 41

Hình 3.8 Sự biến thiên hoạt tính enzym kitinaza của các chủng VSV theo nhiệt

độ nuôi cấy 44

Hình 3.9 Sự biến thiên hoạt tính enzym kitinaza theo pH môi trường 45

Hình 3.10 Hoạt tính của các chủng VSV tuyển chọn khi nuôi cấy trong MT

thích hợp 47

Nguyễn Thị Hương 1 Lớp 11-04

MỞ ĐẦU

Với đường bờ biển dài hơn 3.200 km, Việt Nam có vùng đặc quyền kinh tế dài hơn 1 triệu km2 và hệ thống sông kênh rạch, sông, suối dày đặc Vị trí địa lý và điều kiện tự nhiên đã tạo thuận lợi cho Việt Nam đẩy mạnh phát triển ngành thủy sản

Ngành thủy sản Việt Nam có một vai trò rất lớn trong nền kinh tế quốc dân, đóng góp cho GDP cả nước khoảng 4% Trong cơ cấu nông - lâm - ngư nghiệp, thủy sản chiếm khoảng 20 - 22% tỷ trọng Việt Nam đã đứng vào Top 10 nước xuất khẩu thuỷ sản lớn nhất thế giới Tuy nhiên, vấn đề cấp bách đặt ra là mỗi năm có tới hàng ngàn tấn phế thải thủy sản được thải ra môi trường, gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng

Phế thải của ngành thủy sản phần lớn là vỏ của động vật chân khớp như: tôm, cua, ghẹ… có thành phần chủ yếu là kitin Kitin là chất khó phân hủy Có thể sử dụng nhiều biện pháp hóa lý khác nhau để phân hủy kitin nhưng chi phí rất cao Hiện nay, người ta đã nghiên cứu chiết tách enzym kitinaza phân giải kitin từ nhiều nguồn khác nhau như: động vật, thực vật, vi khuẩn, nấm…Trong đó, nguồn enzym từ vi sinh vật có nhiều ưu điểm như hoạt tính enzym cao,ổn định với nhiệt độ và pH, thời gian tổng hợp enzym từ vi sinh vật rất ngắn (chỉ vài ngày), nguyên liệu sản xuất rẻ tiền, có thể sản xuất hoàn toàn theo qui mô công nghiệp

Ngoài ra,enzym kitinaza còn có rất nhiều ứng dụng trong nông nghiệp, công nghiệp và y học Khả năng khử kitin làm cho kitinaza có giá trị trong phòng trừ dịch bệnh, giảm ô nhiễm môi trường Kitinaza được khai thác sử dụng như là tác nhân phòng trừ sinh học Chúng cũng có vai trò quan trọng sự hình thành thể nguyên sinh nấm, phòng trừ muỗi, sản xuất các kitooligosaccharid hoạt hóa, sản xuất glucosamine

và N acetyl-glucosamine, sản xuất thuốc trừ sâu sinh học ứng dụng trong việc kiểm soát nấm kí sinh trên cây trồng

Vì những lý do trên chúng tôi thực hiện đề tài: “ Tuyển chọn một số chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng sinh tổng hợp enzym kitinaza ngoại bào cao” nhằm

góp phần cung cấp thêm vào bảo tàng giống một số chủng vi sinh vật có hoạt tính kitinaza cao

Nguyễn Thị Hương 2 Lớp 11-04

Mục tiêu của đề tài:

- Tuyển chọn được 2 - 3 chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng sinh tổng

hợp enzym kitinaza ngoại bào cao

- Nghiên cứu một số điều kiện nuôi cấy thích hợp cho khả năng sinh tổng

hợp enzym kitinaza ngoại bào cao của các chủng vi sinh vật đã tuyển chọn

và làm liền các vết thương ở da Trong thực vật, kitin có ở vách các tế bào nấm họ zygomycetes, trong sinh khối nấm mốc và trong một số loại tảo

Trong các loài thủy sản đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ HL kitin-kitinaza chiếm khá cao từ 14-35% so với trọng lượng khô Vì vậy vỏ tôm, cua, ghẹ là nguồn nguyên liệu chính để sản xuất kitin-kitinaza

Về mặt lịch sử, kitin được Braconnot phát hiện đầu tiên vào năm 1821, trong cặn dịch chiết từ một loại nấm Ông đặt tên cho chất này là “Fungine” để ghi nhớ nguồn gốc của nó Năm 1823 Odier phân lập được một chất từ bọ cánh cứng mà ông gọi là chiitin, kitin hay “chiton”, tiếng Hy lạp có nghĩa là vỏ giáp nhưng ông không phát hiện

ra được sự có mặt của nitơ trong đó Cuối cùng cả Odier và Braconnot đều đi đến kết luận kitin có dạng công thức giống với cellulose

Cấu trúc hóa học của kitin:

Kitin (C8H13O5N)n là một polymer mạch dài của N-acetyl glucosamine, dẫn xuất của glucose, trong đó nhóm (-OH) của nguyên tử C(2) được thay thế bằng nhóm acetyl amin (-NHCOCH3)(cấu trúc I) Như vậy kitin là poly (N-acetyl-2-amino-2-deoxy-β-D-glucopyranose) liên kết với nhau bởi các liên kết β-(1-4) glycoside Trong đó các đơn phân của kitin cũng được đánh số như của glucose Cấu trúc của kitin là tập hợp các monosacharide (N-acetyl-β-D-glucosamine) Hơn nữa kitin tồn tại rất hiếm ở trạng thái

tự do và hầu như luôn luôn trong liên kết cộng hóa trị (covalent bond) với các protein, CaCOR 3R và các hợp chất hữu cơ khác

Nguyễn Thị Hương 4 Lớp 11-04

Hình 1.1: Cấu trúc phân tử kitin

Bằng phương pháp nhiễu xạ tia X Người ta đã chứng minh được kitin tồn tại ở ba dạng cấu hình: α, β, γ – kitin Các dạng này của kitin chỉ do sự sắp xếp khác nhau về hướng của mỗi đơn phân (N-acetyl-D-glucosamin) trong mạch Có thể biểu diễn mỗi đơn phân này bằng mũi tên sao cho phần đầu của mũi tên chỉ nhóm –CH2OH, phần đuôi chỉ nhóm –NHCOCH3, thì các cấu trúc α, β, γ- kitin được mô tả như sau:

Hình 1.2: Các cấu hình của kitin

α - kitin có cấu trúc các mạch được sắp xếp ngược chiều nhau đều đặn, nên ngoài liên kết hydro trong một lớp trong cùng một mạch, nó còn có liên kết hydro giữa các

α - kitin

Nguyễn Thị Hương 5 Lớp 11-04

lớp kề nhau giữa các mạch nên rất bền vững Do các mắt xích sắp xếp đảo chiều, xen

kẽ thuận lợi về mặt không gian và năng lượng Đây cũng là dạng phổ biến trong tự nhiên

β, γ - kitin do mắt xích ghép với nhau theo kiểu song song (β - kitin) và hai song song một ngược chiều (γ - kitin), giữa các lớp không có liên kết hydro Dạng β - kitin cũng có thể chuyển sang dạng α - kitin nhờ quá trình acetyl hóa cho cấu trúc tinh thể bền vững hơn Qua nghiên cứu về sự thủy phân kitin bằng enzym hay acid HCl đậm đặc thì người ta thấy rằng kitin có cấu trúc là một polymer được tạo thành từ các đơn vị N-Acetyl-β-D-glucosamine liên kết với nhau bởi liên kết β-(1-4) glucoside [41]

Ứng dụng của kitin:

Kitin có ứng dụng làm da nhân tạo và là nguyên liệu trung gian cho các chất quan trọng như chitosan, glucosamin và các chất có giá trị khác Chitosan là một dạng kitin

đã bị khử acetyl, nhưng không giống kitin, nó lại tan được trong dung dịch acid

Chitosan có nhiều ứng dụng trong các ngành công nghiệp, nông nghiệp, y dược

và bảo vệ MT như: sản xuất glucosamin, chỉ khâu phẫu thuật, thuốc kem, vải, làm thuốc chữa bỏng, giảm đau, thuốc hạ cholesterol, thuốc chữa bệnh dạ dày, chống đông

tụ máu, tăng sức đề kháng, chữa xương khớp, màng bao hoa quả, bảo vệ MT…Với khả năng ứng dụng rộng rãi của kitin -chitosan mà nhiều nước trên thế giới và cả Việt Nam

đã nghiên cứu sản xuất các sản phẩm này Glucosamin là một hoạt chất quý được sản xuất từ vỏ tôm thông qua nguyên liệu trung gian là kitin hoặc chitosan Glucosamine được cơ thể dùng để sản xuất ra các proteoglycan Glucosamin chủ yếu được sử dụng

trong y học chữa bệnh thoái hoá khớp

1.1.2 Kitinaza

Nguồn kitinaza:

Kitinaza từ thực vật: Ở thực vật, kitinaza hiện diện chủ yếu ở hạt, thân, củ, hoa Thực vật kích thích sinh tổng hợp kitinaza như là một cơ chế phòng thủ trước các tác nhân gây bệnh Kitinaza của thực vật thường được tìm thấy ở giai đoạn đầu của sự sinh trưởng của cây Kitinaza thực vật thường thuộc dạng endokitinaza, với trọng lượng phân tử nhỏ hơn kitinaza từ côn trùng

Nguyễn Thị Hương 6 Lớp 11-04

Kitinaza từ côn trùng: Kitinaza trong côn trùng đóng một vai trò quan trọng như

là một enzym phân hủy lớp kitin trong thời kì lột xác của chúng Sau khi endokitinaza cắt ngẫu nhiên các lớp biểu bì tạo thành các kitinoligosacchride, exokitinaza sẽ cắt tiếp

để tạo thành 17TN-acetyl-glucosamine Các monomer sinh ra sẽ được tái sử dụng tạo thành lại lớp biểu bì mới Kitinaza ở côn trùng có thể bị ức chế bởi allosaminidin Kitinaza cũng có thể được tìm thấy trong động vật giáp xác như tôm sú Kitinaza ở động vật giáp xác được tạo thành trước khi quá trình lột xác ở lớp da xảy ra

Kitinaza từ vi sinh vật: Vi sinh vật là nguồn cung cấp chủ yếu kitinaza trong sản xuất Nguồn kitinaza được tạo ra bởi vi sinh vật cho HL nhiều hơn so với động, thực vật, và nhìn chung enzym cảm ứng ngoại bào thuộc hai loại endokitinaza và exokitinaza Vi sinh vật có khả năng phân hủy kitin phân bố rộng rãi trong tự nhiên Nhưng nguồn enzym từ các chủng vi sinh vật khác nhau có khả năng hòa tan trong dung dịch và kích thước rất khác nhau Bên cạnh đó độ phức tạp và thành phần dị hợp trong phân tử cũng rất đa dạng Kitin bên trong tế bào vi sinh vật do có các cơ chế bảo

vệ riêng nên không bị phân hủy bởi kitinaza của chính tế bào đó nhưng khi tiết ra MT bên lại có tính chuyên biệt để chuyển hóa và thủy phân kitin

Cơ chế hoạt động:

Quá trình thủy phân kitin là sự kết hợp của một phức hệ enzym bao gồm kitinaza (EC 3.2.1.1.4), exo-kitinaza (EC 3.2.1.14), kitobiaza (EC 3.2.1.30) and β-N-acetyl hexosaminidaza (EC 3.2.1.52) Endokitinaza cắt ngẫu nhiên bên trong chuỗi kitin tạo các đoạn oligo-N-acetyl glucosamine ngắn như là kitotetraose, kitotriose, và diacetylkitobiose Exokitinaza phân hủy kitin cho sản phẩm diacetylkitobiose không tạo ra các N-acetyl glucosamine hoặc oligomers β-Nacetyl hexosaminidaza cắt diacetylkitobiose cũng như kitotriose và kitotetraose tạo các đơn phân N-acetyl glucosamine [42]

endo-Nguyễn Thị Hương 7 Lớp 11-04

Hình 1 3: Cơ chế hoạt động của các enzym kitinaza

Các nhân tố ảnh hưởng lên HT kitinaza:

HT enzymkitinaza sinh ra ở mỗi loài khác nhau thì khác nhau HT của kitinaza cũng bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ, độ pH, các ion kim loại và cơ chất phản ứng

Tính chất sinh hóa của kitinaza

* Trọng lượng phân tử

Trọng lượng phân tử của kitinaza thu nhận từ nấm và vi khuẩn khoảng 30kDa đến 120kDa Ở tảo biển và thực vật bậc cao có trọng lượng phân tử khoảng 30kDa Ở các loài thân mềm, chân đốt, động vật có xương có trọng lượng phân tử khoảng 40- 90kDa

* Điểm đẳng điện, hằng số Michaelis

Điểm đẳng điện pI của kitinaza có giá trị từ 3- 10 ở thực vật bậc cao và tảo; ở côn trùng, giáp xác, thân mềm và cá là 4,7 - 9,3; ở VSV là 3,5 - 8,8 Hằng số Michaelis là 0,10- 0,11 (g/l)

* Nhiệt độ hoạt động

Tùy theo nguồn gốc thu nhận mà các kitinaza có thể có những giá trị nhiệt độ tối thích khác nhau Nhìn chung nhiệt độ tối ưu cho kitinaza ở VSV hoạt động là 40oC, một số loài sinh kitinaza có khả năng chịu nhiệt cao Bendt và cộng sự (2001) phát hiện

HT thủy phân kitin mạnh nhất của kitinaza từ Vibrio sp từ 30- 45oC và kitinaza chịu

nhiệt từ chủng Bacillus licheniformis phân lập ở suối nước nóng có khả năng chịu đựng

nhiệt độ cao đến 80oC Penicillium chrysogenum có nhiệt độ tối ưu là 40oC [28]

De-Nguyễn Thị Hương 8 Lớp 11-04

hui Dai (2011) đã chiết tách được kitinaza từ vi khuẩn chịu nhiệt Bacillus spHu1 có

nhiệt độ hoạt động tối thích là 60oC [12]

Phân loại kitinaza

* Dựa vào cấu trúc phân tử kitinaza thuộc hai họ Glycohydrolaza 18, Glycohydrolaza 19

từ các giống như Aeromonas hydrophyla, Bacillus circularis, Trichoderma harzianum, Aphanoclaum album, Serratia marcescens…

Họ Glycohydrolaza 19

Họ này gồm hơn 130 chi, thường thấy chủ yếu ở thực vật, ngoài ra còn có ở xạ

khuẩn Streptomyces griceus, vi khuẩn Haemophilus influenzae,… Chúng có cấu trúc

hình cầu với một vòng xoắn

* Dựa vào trình tự amino acid

Căn cứ vào trình tự amino acid, sự định vị của enzym, điểm đẳng điện, peptide nhận biết và vùng cảm ứng, người ta phân loại kitinaza thành 5 nhóm:

Nhóm I: là những đồng phân enzym trong phân tử có đầu amino giàu cystein nối với tâm xúc tác thông qua một đoạn giàu glycin hoặc prolin ở đầu carboxyl (peptide

Nhóm III: trình tự amino acid hoàn toàn khác với kitinaza nhóm I và II

Nhóm IV: là những đồng phân enzym chủ yếu có ở lá cây 2 lá mầm, 41%- 47% trình tự amino acid ở tâm xúc tác của chúng tương tự như kitinaza nhóm I, phân tử cũng có giàu đoạn cystein nhưng kích thước phân tử nhỏ hơn đáng kể so với kitinaza nhóm I

Nhóm V: dựa trên những dữ liệu về trình tự, người ta nhận thấy vùng gắn kitin (vùng giàu cystein) có thể đã giảm đi nhiều lần trong quá trình tiến hoá ở thực vật bậc cao Ngoài ra, theo cơ chế xúc tác của kitinaza ta có các loại kitinaza sau: endokitinaza, kitin-1,4-β-kitobiosidaza, N-acetyl-β-D-glucosamine (exokitinaza) và kitobiaza

1.2 Khả năng sinh tổng hợp enzym kitinaza của một số chủng VSV

1.2.1 Một số chủng VSV có HT kitinaza

Hiện nay kitinaza được tìm thấy trong các nhóm vi khuẩn như là Serratia, Chromobacterium, Klebsiella, Pseudomonas, Clostridium, Vibrio, Arthrobacter, Beneckea, Aeromonasvà Streptomyces Ngoài ra, kitinaza cũng được tìm thấy trong các chủng nấm như Trichoderma, Penicillium, Lecanicillium, Neurospora, Mucor, Beauveria, Lycoperdon, Aspergillus, Myrothecium, Conidiobolus, Metharhizium, Stachybotrys và Agaricus

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp kitinaza

Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Trong chu trình phát triển của VSV, các yếu tố dinh dưỡng cung cấp từ bên ngoài đóng vai trò chủ chốt Đặc biệt quan trọng là nguồn cacbon Các VSV khác nhau có khả năng sử dụng nguồn cacbon tối thích khác nhau cho sự sinh trưởng và phát triển của chúng Giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ các nguồn thức ăn cacbon khác nhau phụ thuộc vào hai yếu tố: một là thành phần hoá học và tính chất sinh lý của

Nguyễn Thị Hương 10 Lớp 11-04

nguồn thức ăn này, hai là đặc điểm sinh lý của từng loại VSV Ngoài ra để nuôi cấy VSV nhằm mục đích sinh tổng hợp các enzym như kitinaza, proteaza thì nguồn cacbon thường được sử dụng là mono và di-polysacarit Đối với VSV thì tinh bột là nguồn cacbon thích hợp cho quá trình sinh trưởng cũng như tổng hợp amylaza Ngoài ra các sản phẩm thuỷ phân không hoàn toàn của tế bào như dextrin và oligosacarit cũng có ảnh hưởng tốt Các nguồn đường đơn giản như saccarose, glucose, fructoza không chỉ đóng vai trò lớn trong quá trình sinh trưởng mà còn ảnh hưởng tích cực đến sinh tổng hợp kitinaza

Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Nguồn nitơ dễ hấp thụ nhất đối với VSV là dạng NH3 và NH4+ Trong tự nhiên nitơ tồn tại phần lớn ở dạng N2 và trong các hợp chất hữu cơ N2 tương đối trơ về mặt hoá học và VSV không thể hấp thụ được, chỉ có một số ít loài VSV có khả năng đồng hóa N2 làm nguồn thức ăn cho mình Các VSV có khả năng đồng hoá rất tốt nitơ chứa trong thức ăn hữu cơ Các thức ăn này sẽ là nguồn cacbon và nitơ cho các VSV không

có khả năng hấp thụ trực tiếp các protein cao phân tử

VSV có khả năng sử dụng cả nguồn nitơ vô cơ và nitơ hữu cơ Tỷ lệ giữa nồng

độ nitơ vô cơ và nitơ hữu cơ trong môi trường cũng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của VSV Tỷ lệ này khác nhau ở các VSV nhưng đều dựa trên cơ sở nguồn nitơ vô cơ đóng vai trò khởi động trong quá trình tạo sinh khối vi sinh trong khi nguồn nitơ hữu cơ có vai trò kích thích sinh tổng hợp enzym

Nguồn dinh dưỡng khoáng

Các chất khoáng như Fe, Mn, Zn, Mo, Cu… có vai trò quan trọng như tham gia vào quá trình chuyển hoá vật chất của VSV, tham gia thành phần cấu tạo protein, enzym, điều hoà pH MT nuôi cấy nên ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp enzym nói chung, kitinaza nói riêng

Ảnh hưởng của pH

pH môi trường là yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát triển của VSV pH đóng vai trò quyết định trong sinh tổng hợp enzym Loại enzym được sinh tổng hợp, số đơn vị enzym được tạo ra và hoạt lực của enzym đều phụ thuộc vào sự

Nguyễn Thị Hương 11 Lớp 11-04

thay đổi của pH môi trường Mỗi loài khác nhau thích nghi với một độ pH khác nhau Với vi khuẩn tổng hợp kitinaza có HT cao nhất với điều kiện pH thường là từ 7-8

Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh enzym của VSV Mỗi loài VSV có khoảng nhiệt độ tối ưu khác nhau Nhiệt độ từ 30-40oC là tối ưu cho

sự sinh trưởng của đa số vi khuẩn và xạ khuẩn, nhiệt độ tối đa dưới 50oC Nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp có thể kìm hãm sự sinh trưởng, thậm chí có thể giết chết VSV, quá trình tổng hợp enzym sẽ bị ức chế

Ảnh hưởng của cơ chất cảm ứng

Để kích thích vi sinh vật tổng hợp kitinaza người ta thường cho chất cảm ứng kitin vào môi trường nuôi cấy, có nhiều loại kitin, mỗi loại kitin với HL khác nhau có ảnh hưởng khác nhau đến sự tổng hợp kitinaza Trong hầu hết các trường hợp, khi nồng độ kitin khoảng 1- 1,5% là VSV có khả năng tạo kitinaza [11] Trong số các cơ chất kitin, kitin huyền phù có khả năng kích thích tạo kitinaza cao nhất vì dễ phân giải hơn các loại khác Ngoài ra, có thể sử dụng nhiều cơ chất kitin khác như: vách tế bào

nấm, vỏ tôm, cua,…

1.3 Các ứng dụng của kitinaza

* Ứng dụng sản xuất chitosan

Chitosan và các dẫn xuất của chúng đều có tính kháng nấm, kháng khuẩn, như ức

chế hoạt động của một số loại vi khuẩn như E.Coli, diệt được một số loại nấm hại dâu

tây, cà rốt, đậu và có tác dụng tốt trong bảo quản các loại rau quả có vỏ cứng bên ngoài, làm chậm lại quá trình bị thâm của rau quả, có khả năng tự phân huỷ sinh học cao, có khả năng tạo phức với một số kim loại chuyển tiếp như: u(II), Ni(II), Co(II)

Do vậy chúng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: Trong lĩnh vực xử lí nước thải và bảo vê MT, dược học và y học, nông nghiệp, công nghiệp, công nghệ sinh học

* Ứng dụng trong sản xuất Glucosamin

Glucosamine đặc hiệu trong điều trị thoái hóa khớp là do nó có 3 tác dụng: kích thích sản xuất sụn, giảm đau khớp và chống viêm trong đó tác dụng kích thích sản xuất sụn đóng vai trò quan trọng nhất Glucosamine là thành phần chính của proteoglycan -1

Nguyễn Thị Hương 12 Lớp 11-04

trong 3 thành phần (proteoglycan, collagen, tế bào sụn) cùng với nước cấu tạo nên sụn khớp Proteoglycan như sợi dây thừng xâu chuỗi với collagen, có vai trò giữ nước để làm trơn và nuôi dưỡng collagen

* Ứng dụng trong việc phân lập tế bào trần

Sử dụng enzymkitinaza để phá hủy vách tể bào của vi sinh vật tạo tế bào trần Nghiên cứu về ảnh hưởng của một số nhân tố đến sự tạo tế bào trần từ nấm

Trichoderma reesi đã cho thấy vai trò của kitinaza trong việc tạo tế bào trần [19], ứng dụng kitinaza từ Enterobactersp NRG4 nuôi trên MT bán rắn để phân lập tế bào trần từ nấm và nấm men, thành tế bào nấm men Rhaffia Rhodozyme đã được phân giải thành công bằng hỗn hợp enzym trong đó có kitinaza từ Baccilus circulans [7]

*Ứng dụng sản xuất kitooligosaccharid, Nacetyl-D-Glucosamine

Kitooligosaccharid đã được Murao (1992) và Stoyachenko (1994) sản xuất bằng

enzymkitinaza do vi khuẩn Vibrio Alginolyticus và Streptomyces kurssanovii tổng hợp

[52],[63] Kitooligosaccharides và Nacetyl-D-lucosamine cũng được Ghanem (2011)

sản xuất từ Aeromonassp và các loại vi khuẩn sinh kitinaza [12]

* Sản xuất protein đơn bào

Vyas (1991) đã sử dụng enzymkitinaza từ Myrhothecium verrucaria trong việc

sản xuất protein đơn bào [34] Owhashi (2000) và Guevara (2006) cũng đã ứng dụng

kitinaza của Alternaria alternata được phân lập từ đất bị ô nhiễm cá để sản xuất

protein đơn bào phục vụ cho nông nghiệp [27]

* Trừ muỗi

Mendosa ES, Vartak PH, Rao JU (1996) dùng enzymkitinaza từ Myrhothecium verrucaria để trừ côn trùng gây hai trong đó có muỗi Aedas aegypti Gkargkas đã nghiên cứu về N-acetyl-[beta]-d-glucosaminidaza được sinh ra bởi Fusarium oxysporumF3 phát triển trên môi trường bán rắn và ứng dụng trong trừ muỗi, nấm và

côn trùng gây bệnh [14]

* Ứng dụng trong phòng trừ sinh học

Đa số các loài nấm gây bệnh đều chứa kitin như: Fusarium, Gliocladium,

Rhizotonia, Ustilago, Erysiphe, Botrytis, Sclerotium và Alternaria Kitinaza sẽ phân

Nguyễn Thị Hương 13 Lớp 11-04

hủy kitin, ức chế nhiều nấm, côn trùng và chân đốt gây hại Các loài côn trùng như Lepidoptera trichoplusia (sâu cải), Pieris rapae, sâu trên râu bắp, bướm đêm, sâu thuốc lá… lớp Coleopterabao gồm bọ cánh cứng khoai tây Colorado, bọ vòi voi vỏ tròn, bọ cánh cứng đậu Mexico và ấu trùng sống ở rễ bắp, lớp Homoptera bao gồm rệp cây bông cải, rệp cây khoai tây, rệp đỏ California, lớp Thysanoptera bao gồm bọ trĩ củ hành, lớp Orthoptera bao gồm châu chấu, lớp Hemiptera bao gồm bọ xít ở lúa Vai trò của enzymkitinaza sinh ra bởi Serratia marcescens trong việc phòng trừ Sclerotium rofsi đã được nghiên cứu bởi Ordentlich và cs (1988) [26] Inbar J và Chet I (1991) chứng minh rằng kitinaza sản sinh bởi Aeromonas cavie có vai trò trong phòng trừ các

vi khuẩn gây bệnh trong đất Mahadevan (1997) đã nghiên cứu vai trò của kitinaza

trong việc trừ nấm Streptomyces lydicus WYEC 108, kết quả thành tế bào bị enzymkitinaza phá hủy S lydicus cũng sản sinh một hoặc nhiều kháng sinh kháng nấm

nhưng kitinaza giữ vai trò quan trọng trong phòng trừ nấm [18] Vai trò của kitinaza từ

chủng stenotrophomonas maltophilia trong việc phòng trừ Bipolaris sorokiniana đã

được Zhang (2000) chứng minh Gen tổng hợp kitinaza đã được chuyển vào thực vật

để kháng côn trùng Kitinaza ở thực vật là protein cảm ứng thông qua sự nhiễm bởi tác nhân gây bệnh Kitinaza của cây khoai mỡ Trung Quốc được xịt lên dâu tây bị nhiễm nấm mốc bột, kết quả là những tác nhân gây bệnh màu trắng trên trái và lá của dâu biến mất trong ngày sau khi xịt và không xuất hiện trong thời gian hơn 2 tuần, thực vật chuyển gen kháng côn trùng bằng gen sinh kitinaza cũng đã được sản xuất Cây thuốc

lá với gen kitinaza biểu hiện sự kháng lại côn trùng độc [18] Ứng dụng kitinaza để trừ

nấm gây bệnh tàn rụi chậm Phytophthora capsici trên cây tiêu với một hợp chất chứa

chủ yếu là kitinaza được tổng hợp từ VK [6]

* Ứng dụng trong y dược

Trong cơ thể động vật và thực vật, kitinaza liên quan đến cơ chế bảo vệ [15] HT kitinaza trong huyết thanh người cũng được báo cáo với vai trò chống lại những tác nhân gây bệnh [10] Kitinaza được ứng dụng trong sản xuất thể nguyên sinh ở nấm, thuốc chữa bệnh bằng phương pháp hoạt hóa các kitooligosaccharide Hiện nay, các nhà khoa học đã đề xuất một phương pháp chẩn đoán mới các bệnh truyền nhiễm do

Nguyễn Thị Hương 14 Lớp 11-04

nấm bằng cách sử dụng kitinaza từ Vibrio parahemolyticus (kitinaza VP1) Nó kết hợp

chặt chẽ với kitin và có thể sử dụng như một mẫu dò để nhận diện một cách đặc hiệu các vách tế bào nấm hay những vết chồi nấm men trong những lát cắt mẫu mô bệnh Hiện nay,kitinaza được ứng dụng để chẩn đoán các bệnh do nấm gây ra dựa trên nguyên tắc kitin hiện diện nhiều trong vách hầu hết các nấm gây bệnh, ít nhất là một giai đoạn trong chu trình sống của nấm sợi hay vết chồi ở nấm men Do đó cần một phương pháp nhuộm kitin đặc biệt cho nấm, tạo cơ sở xây dựng một phương pháp chẩn đoán nhanh chóng, hiệu quả các loài nấm gây bệnh [15] Các nhà khoa học đã thử nghiệm HT kháng nấm của kitinaza tái tổ hợp trong cơ thể chuột và thỏ bị nhiễm các

loại nấm khác nhau như Aspergillus, Candida… Kết quả cho thấy hiệu quả của sự điều

trị với tác nhân kháng nấm được ước lượng trên 3 thông số là mức độ giảm tỉ lệ chết, mức độ giảm số lượng tế bào nấm nuôi cấy từ các cơ quan, mức độ giảm lưu thông kháng nguyên nấm [15] Hiện nay, các nhà khoa học đề nghị sử dụng kitinaza với các tác nhân kháng nấm khác (amphotericin B, các dẫn xuất azol…) Kitinaza có thể phát huy hiệu quả của các tác nhân kháng nấm ở liều lượng không gây tác dụng phụ cho bệnh nhân Ngoài ra, việc kết hợp giữa kitinaza và laminarinaza được ghi nhận là hữu hiệu hơn trong việc tấn công vào vách tế bào nấm (so với chỉ dùng kitinaza) [15] Bên cạnh đó, kitinaza có tiềm năng trong việc sản xuất các loại kem hay thuốc bôi ngoài da chống bệnh do vi nấm thường xảy ra ở các nước vùng nhiệt đới

* Ứng dụng xử lý nước thải

Trong nước thải đặc biệt là nước thải của các nhà máy chế biến thủy hải sản chứa một lượng lớn kitin khó phân hủy gây ô nhiễm môi trường Người ta có thể sử dụng vi sinh vật có khả năng sinh kitinaza có HT cao hoặc sử dụng CPE kitinaza để xử lý nước thải nhiễm kitin Wang (2001) đã xử lí nước thải chứa động vật có vỏ bằng cách sử

dụng enzymkitinaza từ vi khuẩn Bacillus cereus, B alvei, and B sphaericus phân lập

từ nước thải [35] Rattanakit (2007) sử dụng enzymkitinaza phân lập từ Aspergillussp

để xử lý MT nhiễm kitin [60]

1.4 Tình hình nghiên cứu và kitinaza

1.4.1 Ngoài nước

Nguyễn Thị Hương 15 Lớp 11-04

* Nghiên cứu về kitinaza trích ly từ thực vật

Abeles (1971) đã nghiên cứu và tinh sạch kitinaza có trong lá đậu [36] Mauch (1988) đã tinh sạch kitinaza và 0-1,3-glucanaza từ vỏ đậu, tiềm năng kháng nấm của 2 loại enzym này cũng đã được nghiên cứu [37] Hou, Chen và Lin (1998) đã phát hiện enzymkitinaza ở các phần khác nhau trên cây khoai lang (Ipomoea batatas) và nghiên cứu các điều kiện tối ưu để enzym hoạt động bằng cách sử dụng bột kitin thương mại [16]

* Nghiên cứu về kitinaza được sinh tổng hợp từ vi khuẩn

Takahashi (1993) và Stoyachenko (1994) đã tinh sạch và khảo sát một số tính

chất của enzymkitinaza từ Vibriosp và Streptomyces kurssanovii [38], [39] Wang và

Hang (2001) đã xử lí nước thải chứa động vật có vỏ bằng cách sử dụng enzymkitinaza

từ vi khuẩn Bacillus cereus, B alvei vàB sphaericus phân lập từ nước thải [35] Vi

khuẩn C4 thuộc chi Sanguibacter được Tao (2005) phân lập từ đất, vi khuẩn này đã cho

ra nguồn enzymkitinaza ngoại bào có khối lượng phân tử từ 57-58,8 kDa, pI= 4,2 Tuy nhiên, enzym có vùng pH hoạt động rộng từ 3,0 đến 8,0, hoạt động tối ưu ở pH = 4,6

và khả năng chịu nhiệt lên đến 60oC vẫn duy trì 50% HT và ứng dụng kitinaza trong phòng trừ côn trùng gây hại [40] Dahiya và cs (2005) đã ứng dụng kitinaza từ

Enterobacter sp NRG4 nuôi trên MT án rắn để phân lập tế bào trần từ nấm và nấm

men [8] Dahiya và cs (2006) Nghiên cứu enzymkitinaza từ Baccilus circulans và ứng

dụng để phân giải thành tế bào nấm men (Rhaffia Rhodozyme) [7] Lee (2007) đã nuôi

cấy, tinh sạch và khảo sát một số đặc điểm của kitinaza từ vi khuẩn Bacillus sp [21] De-hui Dai (2011) phát hiện được nhóm vi khuẩn chịu nhiệt Bacillus sp HU1 từ đất ở

suối nước nóng Trung Quốc cho nguồn enzymkitinaza mới có khả năng chịu nhiệt, khi

ủ ở pH tối ưu 6,5 vẫn giữ được họat tính khi gia nhiệt ở 60oC trong thời gian 100 phút

* Nghiên cứu về kitinaza được sinh tổng hợp từ nấm sợi

Nấm sợi được xem là nguồn cung cấp enzym cho HT cao và ổn định, là đối tượng được chú ý để nghiên cứu nhiều trong lĩnh vực enzym Pedraza-Reyes và Lopez-Romero (1989) đã nghiên cứu về các đặc tính của hai loại enzym ngoại bào kitinaza ở

nấm mốc Mucor rouxii [29]

Nguyễn Thị Hương 16 Lớp 11-04

Abdel-Naby và cs (1992) đã tinh sạch và khảo sát tính chất của enzymkitinaza từ

Aspergillus carneus [3]

Kumari và Panda (1994) đã nghiên cứu về ảnh hưởng của một số nhân tố đến sự

tạo tế bào trần từ nấm sợi Trichoderma reesi và cho thấy vai trò của kitinaza trong việc tạo tế bào trần [19] Kitinaza từ thể tự tiêu Penicillium oxalicum đã được Rodriguez,

Copa Patino, Pérez Leblic (1995) tinh sạch bằng phương pháp tủa muối amoni sunfat

và tính chất của nó cũng đã được khảo sát với pH và nhiệt độ tối ưu là 5,0 và 35°C, enzym này bền vững ở nhiệt độ tối đa 45°C và pH dao động từ 4,0 đến 6,0 [32]

Escott, Hearn và Adams (1998) đã tủa và tinh sạch enzymkitinaza từ chủng

Aspergillus fumigatus, phát hiện enzymkitinaza có khối lượng phân tử 45kDa khác biệt

rõ nét với enzym từ chủng Aspergillus carneus có khối lượng khoảng 25kDa Bên cạnh

đó, qua phân tích thành phần acid amin trong chủng Aspergillus carneus đã cho thấy enzym chứa nhiều acid amin asparagine, serine, threonine hoạt đông trong điều kiện tối

ưu pH 5,2 ở 50oC [10]

Kawachi (2001) nghiên cứu phương pháp tinh sạch và các đặc tính của

enzymkitinaza ngoại bào từ chủng nấm kí sinh Isaria japonica và chiết tách được 2

loại enzymkitinaza với khối lượng tương ứng 43,2kDa và 31,1kDa hoạt động tốt trong khoảng pH khá thấp từ 3,5 đến 4,5 ở nhiệt độ từ 40 - 50oC [17] Những đặc điểm của

kitinaza và endo-ß-1,3-glucanaza từ Trichoderma harzianum Rifai T24 có liên quan

đến phòng trừ nấm bệnh Sclerotium rolfsii và Rhizoctonia solani đã được El-Katatny

và cs nghiên cứu năm 2001 [9]

Những nghiên cứu về kitinaza được phát triển mạnh bởi nhiều chủng nấm

Aspergillus sp cho HT enzym tốt Nghiên cứu đường hóa kitin sử dùng MT nuôi cấy bán rắn với chủng nấm Aspergillus sp S1-13 với cơ chất lấy từ chất thải trong thủy sản

nhằm tận dụng nguồn phế thải để tạo ra nguồn enzym có giá trị kinh tế cao Với phương pháp tủa muối ammonisulfate và sắc kí đã tách được một exokitinaza có khối lượng phân tử khoảng 73kDa và hai enzym endokitinaza có khối lượng lần lượt là 45kDa và 52kDa [30]

Nguyễn Thị Hương 17 Lớp 11-04

Đặc điểm của kitinaza từ Trichoderma và ứng dụng để trừ nấm Crinipellis

perniciosa gây bệnh trên cây ca cao [23]

Gkargkas (2004) nghiên cứu về N-acetyl-[beta]-d-glucosaminidaza được sinh ra

bởi Fusarium oxysporum F3 phát triển trên môi trường bán rắn và ứng dụng trong trừ

muỗi, nấm và côn trùng gây bệnh [14]

Những nghiên cứu gần đây về điều kiện tối ưu trong nuôi cấy nhằm tạo nguồn enzym HT cao và có sản lượng lớn từ những vật liệu giá trị thấp cũng được quan tâm

rất nhiều 14 chủng Penicilliumsp có HT kitinaza được phân lập và khảo sát trên MT

lên men bán rắn [5]

Rattanakit (2007) sử dụng enzymkitinaza phân lập từ Aspergillusspđể xử lý MT

nhiễm kitin [60] Swiontek-Brzezinska và cs (2007) dựa vào cơ chế hoạt động của enzym thủy phân kitin từ các chủng nấm phân lập từ vỏ tôm cho thấy kitinaza từ vi khuẩn cho HT mạnh nhất ở pH=8 khi được ủ ở 40oC khác biệt so với kitinaza từ nấm cho HT mạnh trong MT acid pH=5 ở nhiệt độ 50oC Sự khác nhau về đặc điểm enzym giữa các dòng vi sinh vật khá rõ [33]

Chủng nấm như Peniciliumsp LYG 07 được Lee và cs (2009) phân lập từ đất cho

HT enzymkitinaza từ ngày đầu tiên và tiếp tục tăng dần cho đến khi đạt được HT tối ưu sau 3 ngày nuôi cấy Kitinaza được tủa với isopropanol và sắc kí cột MonoQ và Butyl-Sepharose Khối lượng phân tử kitinaza sau khi điện đi SDS-PAGE cho kết quả là 46kDa Enzym có HT tối ưu ở pH là 5,0 và nhiệt độ là 40oC [20]

Gần đây, Ghanem và cs (2010) đã nghiên cứu cải thiện điều kiện nuôi cấy nấm

Aspergillus terreus trên cơ chất vảy cá nhằm tăng sản lượng kitinaza sinh ra [13] Năm

2011 ông đã tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy cho enzymkitinaza cao từ Alternaria alternata và ứng dụng sản xuất Kitooligosaccharides và Nacetyl-D-Glucosamine [12]

* Nghiên cứu về kitinaza được sinh tổng hợp từ vi sinh vật phân lập ở rừng ngập mặn

Hơn 300 chủng Actinomyces có khả năng sinh tổng hợp kitinaza được phân lập từ

bùn biển ở rừng ngập mặn ở phía Nam Fujian, Trung Quốc Ảnh hưởng của các chất

Nguyễn Thị Hương 18 Lớp 11-04

cảm ứng, nguồn C, N và điều kiện nuôi cấy cho sinh tổng hợp kitinaza của chủng

Streptomyces S-128 đã được nghiên cứu bởi Bingxin (1992) [4]

Maria, G.L., Sridhar, K.R and Raviraja, N.S (2005) đã phân lập được 14 chủng

nấm ký sinh trên thực vật Acanthus ilicifolius và Acrostichum aureum ở rừng ngập mặn

bờ biển phía tây nam của Ấn Độ có khả năng kháng các loại vi khuẩn Bacillus subtilis, Enterococcussp, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aerugionsa, Salmonella typhi and taphylococcus aureus và nấm Candida albicans và Trichophyton metagrophytes

HT enzym cellulaza, xylanaza, pectinaza, kitinaza và proteaza của những chủng nấm này cũng đã được nghiên cứu [24]

Mtui và Masalu (2008) đã nghiên cứu về enzym ngoại bào trong đó có kitinaza

của nấm Laetiporus sulphureus được phân lập từ rừng ngập mặn ở Tanzania, những

tính chất sinh hóa của các enzym này đã được làm rõ và ứng dụng trong hệ thống xử lý nước thải bằng phương pháp vi sinh [25]

Liu (2009) đã phân lập các chủng vi sinh vật ở đất rừng ngập mặn phía Nam Hàn

Quốc có khả năng sinh kitinaza và tinh sạch 2 loại kitinaza từ Aeromonas schubertii

[22]

1.4.2 Trong nước

* Nghiên cứu về enzymkitinaza trích ly từ thực vật

Đặng Trung Thành (2008) nghiên cứu thu nhận nguồn enzymkitinaza từ khoai lang ở Khánh Hòa đã thu được những kết quả ban đầu khả quan khi tận dụng nguồn phế phẩm từ lá khoai lang để sản xuất nguồn enzym có giá trị Nguyễn Đình Nga

(2008) khảo sát khả năng tác động lên nấm Candida albicans của enzymkitinaza thu nhận từ thực vật và nấm Trichoderma Nguyễn Quang Nhân (2009) nghiên cứu thu

nhận, tinh sạch và xác định tính chất của kitinaza từ mủ cây cao su Hevea Brasiliensis,

đề ra qui trình thu nhận kitinaza từ mủ cây cao su cũng như các đặc tính hóa lý của enzym [1], [2]

* Nghiên cứu về enzymkitinaza được tổng hợp bởi vi sinh vật

Vi sinh vật là một trong những đối tượng chính để trích ly nguồn enzymkitinaza

có HT cao Trần Thị Luyến và cs (2000) đã nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất

Nguyễn Thị Hương 19 Lớp 11-04

kitin-chitosan và chế biến một số sản phẩm công nghiệp từ phế liệu vỏ tôm, cua Đinh Minh Hiệp (2001) đã nghiên cứu quy trình chiết tách và ứng dụng nguồn enzym

kitinaza từ nấm mật Coprinus fimentarius Nguyễn Thị Hồng Thương và cs (2003) đã

khảo sát một số yếu tố tác động quá trình sinh tổng hợp hệ enzym kitinaza của các

chủng nấm mốc Trichoderma spp Tô Duy Khương (2004) đã khảo sát sự sinh tổng hợp kitinaza ở Trichoderma spp và khả năng đối kháng với một số nấm gây bệnh

Quỳnh Hương (2006) nghiên cứu về chuyển gen kháng nấm kitinaza gluconaza vào

cây sắn thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và đã thu được một số kết quả

ban đầu Thạch Thành Trung năm 2009 nghiên cứu sự cảm ứng isozyme endokitinaza

ở Trichoderma longibrachiatumTĐ16 Lê Thị Huệ (2010) khảo sát khả năng sinh tổng

hợp enzymkitinaza của một số chủng NS thuộc giống spergillus,Trichoderma và ứng

dụng Đinh Minh Hiệp (2010) nghiên cứu enzymkitinaza và β- glucanaza từ vi nấm

Trichodermaspp và khả năng kiểm soát sinh học đối với một số nấm gây bệnh ở thực

vật [1], [2]

Nhìn chung, những nghiên cứu về kitinaza ở vi sinh vật trong nước còn rất ít, chủ

yếu nghiên cứu về kitinaza do chi Trichoderma sinh ra và ứng dụng phòng trừ nấm

bệnh trong nông nghiệp

Nguyễn Thị Hương 20 Lớp 11-04

2.1 Vật liệu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Các chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzym kitinaza ngoại bào cao

 Tủ cấy (ClasII Biohazard safety Cabinet – Esco)

 Máy lắc (Shel lad)

 Tủ ấm (Binder)

 Nồi khử trùng (SA – 300VF)

2.1.3 Môi trường

- Nước muối sinh lý NaCl 8, 5g Nước cất 1000ml

- Thuốc thử lugol

I2 1g

KI 2g

H2O cất 300ml

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Địa điểm thu mẫu

Chúng tôi tiến hành lấy mẫu bùn biển và nước biển ở vùng biển Đà Nẵng, vườn quốc gia Xuân Thủy và âu thuyền Thọ Quang

2.2.2 Phương pháp phân lập vi sinh vật

- Chuẩn bị các ống nghiệm có chứa 9ml nước muối sinh lý vô trùng để pha loãng mẫu

- Cân 10g mẫu rắn (bùn biển) cho vào 90ml nước muối sinh lý đã thanh trùng được dung dịch pha loãng 10-1 Tiếp đến dùng pipet hút 1ml dịch huyền phù ở nông độ

10-1 cho vào 9ml nước muối sinh lý vô trùng ược nồng độ pha loãng 10-2 Sau đó hút 1ml dịch huyền phù ở nồng độ pha loãng 10-2 cho vào 9ml nước muối sinh lý ta được nồng độ 10-3 và làm tương tự với các nồng độ tiếp theo cho đến nồng độ pha loãng cần thiết

- Cấy từ các nồng độ pha loãng 10-1, 10-2,…, 10-5

Nguyễn Thị Hương 22 Lớp 11-04

Thể tích cấy cho mỗi đĩa môi trường là 0,1ml dịch pha loãng, mỗi nồng độ pha loãng làm trên 2 đĩa môi trường kitin Sau đó trang đều đến khi khô mặt thạch và đem nuôi ở nhiệt độ 30oC trong 48-72h để khuẩn lạc phát triển hoàn thiện

- Đánh dấu các đĩa khuẩn lạc rồi tách khuẩn lạc riêng Sau đó, đổ lugol lên đĩa thạch đã đánh dấu để xác định đường kính vòng phân giải để chọn ra các khuẩn lạc có hoạt tính mạnh

2.2.3 Phương pháp thuần khiết và bảo quản giống

Các khuẩn lạc sau khi được tách tiến hành làm sạch cách cấy ria trên môi trường thạch đặc trưng Sau khi làm sạch, các chủng được giữ vào các ống môi trường thạch nghiêng và lưu giữ trong tủ lạnh để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo

2.2.4 Phương pháp xác định khả năng tổng hợp enzym kitinaza bằng phương pháp thỏi thạch

Các chủng VSV sử dụng kiểm tra hoạt tính được hoạt hóa trên các ống thạch chứa môi trường đặc trưng Sau đó, được nuôi cấy ở 30oC trong vòng 48h Chủng đã hoạt hóa được tiếp tục cấy trang trên các đĩa petri chứa môi trường đặc trưng và nuôi cấy ở

30oC trong vòng 48h Sau 48h lấy ra, dùng dao sạch hoặc que sắt đã thanh trùng cắt miếng thạch chứa các vi sinh vật muốn kiểm tra các hoạt tính enzym kitinaza Sau đó đặt các miếng thạch lên đĩa petri có chứa môi trường kitin, rồi nuôi cấy ở 30oC Sau 48h lấy mẫu ra đổ thuốc thử lugol để kiểm tra kết quả vòng phân giải tạo thành

2.2.5 Phương pháp xác định khả năng tổng hợp enzym kitinaza bằng phương pháp giếng thạch

Các chủng VSV được nuôi cấy trên môi trường dịch thể và được nuôi cấy ở 30oC trong vòng 48h Dịch nuôi cấy VSV sau đó được tiến ly tâm ở 4000 vòng/phút trong 20 phút để loại sinh khối và thu dịch nổi để thử hoạt tính

Môi trường kitin được đổ trên đĩa peptri Sau đó dụng dụng cụ chuyên dụng khoang các lỗ thạch trên đĩa, rồi dùng pipet nhỏ khoảng 200µl dịch nổi của các chủng VSV thu ở trên vào các giếng thạch Các đĩa sau khi đã nhỏ dịch được để ở 4oC trong

Thí nghiệm được bố trí như sau:

Môi trường cơ sở là kitin lỏng, có bổ sung các nguồn cacbon sau: glucose, saccarose, tinh bột tan (TBT), rỉ đường với nồng độ 3% Sau đó khử trùng ở 121oC, trong 15 phút Sau đó để nguội đến nhiệt độ phòng

Chủng VSV hoạt hóa trên môi trường kitin được cấy vào các môi trường trên với

tỷ lệ giống 1% Sau đó nuôi lắc ở 30oC, 150 vòng/phút Sau 48h lấy mẫu để xác định khả năng sinh tổng hợp enzym kitinaza

2.2.6.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ cacbon lên khả năng sinh tổng hợp enzym kitinaza của các chủng VSV đã tuyển chọn

Thí nghiệm được bố trí như sau:

Môi trường cơ sở là kitin lỏng với nguồn cacbon tối ưu được thay đổi nồng độ lần lượt là 2%; 2,5%; 3%; 3,5% và 4%

Chủng vi khuẩn hoạt hóa trên môi trường kitin được cấy vào các môi trường trên với tỷ lệ giống 1% Sau đó nuôi lắc ở 30oC, 150 vòng/phút Sau 48h lấy mẫu để xác định khả năng sinh tổng hợp enzym kitinaza

2.2.6.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ kitin

Các chủng VSV được nuôi cấy trên môi trường lỏng thích hợp với nồng độ kitin: 0,1%; 0,15%; 0,2%; 0,25%; 0,3% Sau đó nuôi lắc ở 30oC, 150 vòng/phút Tiến hành lấy mẫu sau 48h để kiểm tra khả năng sinh tổng hợp enzym kitinaza

2.2.6.4 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối

Các chủng VSV được nuôi cấy trên môi trường lỏng thích hợp với nồng độ muối: 0,5%; 1,5%; 2,5%; 3%; 3,5% Sau đó nuôi lắc ở 30oC, 150 vòng/phút Tiến hành lấy mẫu sau 48h để kiểm tra khả năng sinh tổng hợp enzym kitinaza