Xác định một số tác nhân vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm trong sữa bò tươi đồng thời đề xuất một số giải pháp hạn chế

LỜI CAM ĐOAN Tác giả xin cam đoan Luận văn “XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÁC NHÂN VI SINH VẬT GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM TRONG SỮA BÒ TƯƠI ĐỒNG THỜI ĐỀ XUẤT MỘT SỐ GIẢI PHÁP HẠN CHẾ” là công trình nghiên

LU CHUYÊN NGÀNH :

ỊNH MỘT SỐ TÁC NHÂN VI SINH V ĐỘC THỰC PHẨM TRONG SỮA BÒ T

NGÀY SINH: 05/12/1989 LỚP : 13M KHểA :

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO Viện đại học mở hà nội

-

 -

LUẬN VĂN THẠC SĨ

ỊNH MỘT SỐ TÁC NHÂN VI SINH V ĐỘC THỰC PHẨM TRONG SỮA Bề T

Ề XUẤT MỘT SỐ GIẢI PHÁP HẠ

CHUYấN NGÀNH: CễNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ NGÀNH: 60420201

C VIấN: PHẠM THỊ AN TRANG NGÀY SINH: 05/12/1989

P : 13M-SH1 KHểA : 2013-2015

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

LỜI CAM ĐOAN

Tác giả xin cam đoan Luận văn “XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÁC NHÂN VI SINH VẬT GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM TRONG SỮA BÒ TƯƠI ĐỒNG THỜI ĐỀ XUẤT MỘT SỐ GIẢI PHÁP HẠN CHẾ” là công trình nghiên cứu độc

lập dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Phạm Thị Tâm

Các tài liệu tham khảo gốc, các số liệu phục vụ mục đích nghiên cứu công trình này được sử dụng đúng quy định, có nguồn gốc rõ ràng

Kết quả nghiên cứu của Luận văn này chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác ngoài công trình nghiên cứu của tác giả

Tác giả xin cam đoan những vấn đề nêu trên là hoàn toàn đúng sự thật Nếu sai, tác giả xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật

Tác giả

Phạm Thị An Trang

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến toàn bộ giáo viên khoa Sau đại học, khoa Công nghệ sinh học – Viện Đại Học Mở Hà Nội, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho em học tập và rèn luyện để hoàn thiện bản thân

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS.Phạm Thị Tâm, anh Mẫn Hồng Phước, bạn Nguyễn Mạnh Hùng, những người đã tận tình hướng dẫn, dìu dắt em để

em có thể hoàn thành bài luận văn tốt nghiệp một cách hoàn thiện nhất

Em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, người thân, những người đã luôn sát cánh động viên tinh thần, tạo điều kiện thuận lợi nhất để em hoàn thành tốt luận văn này Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn đến toàn bộ các thành viên: thầy cô, anh chị, bạn, em trong phòng thí nghiệm của khoa Công nghệ sinh học – Viện Đại Học Mở

Hà Nội đã luôn bên cạnh, trợ giúp em để em hoàn thành tốt luận văn

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 29 tháng 12 năm 2015

Học viên

Phạm Thị An Trang

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC BIỂU ĐỒ vii

MỞ ĐẦU 1

1 Mục tiêu nghiên cứu đề tài 2

2 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.Thực trạng an toàn thực phẩm trong nước và trên thế giới 4

1.1.Thực trạng an toàn thực phẩm trên thế giới 4

1.2.Thực trạng an toàn thực phẩm ở trong nước 5

2.Một số lòai vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm trong sữa 8

2.1.Vi khuẩn Clostridium perfingens 8

2.2.Vi khuẩn Bacillus cereus 10

2.3.Vi khuẩn Samonella spp 11

2.4.Vi khuẩn E.coli O157:H7 13

2.5 Vi sinh vật có mặt trong sữa tươi, tiêu chuẩn cho phép về số lượng các vi sinh vật có trong sữa 14

PHẦN II: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Đối tượng nghiên cứu 17

2.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.3 Nguyên liệu 17

2.3.1 Trang thiết bị thí nghiệm 17

2.3.2.Môi trường nuôi cấy, hóa chất nuôi cấy và xác định độc tố vi khuẩn 17

2.4.Phương pháp nghiên cứu 18

2.4.1 Phương pháp thu thập mẫu: TCVN 6400 (ISO 707), Sữa và sản phẩm sữa Hướng dẫn lấy mẫu 18

2.4.2 Phương pháp phân lập và xác định số lượng một số loài vi khuẩn 19

2.4.2.1 Xác đinh tổng số vi khuẩn hiếu khí 19

2.4.2.2 Phương pháp xác định vi khuẩn Cl.perfringens trong sữa bò tươi 20

2.4.2.3 Phương pháp xác định vi khuẩn Bacillus cereus trong sữa bò tươi 20

2.4.2.4 Phương pháp xác định vi khuẩn Samonella spp trong sữa bò tươi 21

2.4.2.5 Phương pháp xác định vi khuẩn E.coli O157:H7 trong sữa bò tươi 22

2.4.3, Xác định độc lực của vi khuẩn bằng tế bào VERO 22

PHẦN III: KẾT QUẢ DỰ KIẾN VÀ THẢO LUẬN 24

3.1 Xác định mức độ ô nhiễm một số loài vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm trong sữa tươi 24

3.1.1 Kết quả xác định tỷ lệ ô nhiễm vi khuẩn Clostridium perfringens trong sữa bò tươi 24

3.1.2 Kết quả xác định tỷ lệ ô nhiễm vi khuẩn Bacillus cereus trong sữa bò tươi

28

3.1.3 Kết quả xác định tỷ lệ ô nhiễm vi khuẩn Samonella spp trong sữa bò tươi

30

3.1.4 Kết quả xác định tỷ lệ ô nhiễm vi khuẩn E.coli O157:H7 trong sữa bò tươi 32

.3.2 Tổng hợp về tỷ lệ ô nhiễm các loài vi khuẩn trong sữa tươi 35

3.3.Ảnh hưởng của độc tố vi khuẩn lên tế bào VERO 38

3.4 Đề xuất một số giải pháp hạn chế 41

3.4.1 Giải pháp vệ sinh sữa xô vắt 41

3.4.2 Giải pháp vệ sinh sữa téc lạnh 42

3.4.3 Đối với sữa ở quầy giải khát 42

PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44

1 Kết luận 44

2 Đề nghị 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

Thức ăn đường phố : TAĐP

An toàn vệ sinh thực phẩm :ATVSTP

Trung tâm kiểm soát dịch bệnh :CDC

Staphylococcus aureus : S.aureus

Clostridium perfingens : Cl.perfingens

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Nhận định phân biệt sinh hóa của Salmonella 12

Bảng 1.2: Các chỉ tiêu vi sinh vật trong sữa tươi thanh trùng 16

Bảng 3.1: Phân bố các đợt lấy mẫu 24

Bảng 3.2: Kết quả xác định tổng số vi sinh vật hiếm khí 27

Bảng 3.3: Kết quả xác định tổng số vi khuẩn Bacollus cereus trong sữa 29

Bảng 3.4: Kết quả xác định tổng số vi khuẩn Clostridium perfringenstrong sữa 31

Bảng 3.5: Kết quả xác định tổng số vi khuẩn Salmonella spp trong sữa 34

Bảng 3.6: Kết quả xác định tỷ lệ ô nhiễm của các loài vi khuẩn ô nhiễm sữa 37

Bảng 3.7: Ảnh hưởng của các độc tố vi khuẩn trên tế bào VERO 39

Bảng 4.1: Kết quả chung 44

MỞ ĐẦU

Thực phẩm là nhu cầu cơ bản nhằm tồn tại và duy trì sự phát triển của con người Vệ sinh an toàn thực phẩm có tầm quan trọng đặc biệt, không những ảnh hưởng trực tiếp và thường xuyên đến sức khỏe của người dân, sự phát triển giống nòi mà còn ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình sản xuất, xuất nhập hàng hoá, phát triển du lịch, thương mại và uy tín quốc gia Chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm không được đảm bảo sẽ gây nên các bệnh (ngộ độc cấp tính, ngộ độc mãn tính, các bệnh lây truyền qua thực phẩm, thần kinh, tim mạch…) rối loạn chức năng cơ thể, ảnh hưởng đến hoạt động của hệ thống men, phát triển thể lực Cùng với sự phát triển của kinh tế đất nước, đời sống của người dân nâng cao, nhu cầu về thực phẩm cũng tăng cao đặc biệt các loại thực phẩm có nguồn gốc từ động vật như thịt, trứng, sữa… Để có được sản phẩm thịt an toàn là cả một dây chuyền bắt đầu từ con giống, thức ăn, nước uống, thực hiện quy trình vệ sinh thú y trong chăn nuôi cho đến khi gia súc được đưa đến nơi giết mổ, điều kiện vệ sinh giết mổ, quá trình pha lóc, bảo quản, vận chuyển, chế biến, tiêu thụ Trong đó khâu giết mổ và kinh doanh là rất quan trọng để kiểm tra và đánh giá chất lượng sản phẩm

Theo thống kê của Tổ chức Nông lương Thế giới (FAO) và Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) trong số các bệnh ngộ độc thịt thì có đến gần 90% do thịt bị vấy nhiễm trong quá trình giết mổ và chỉ 10% do gia súc bị bệnh Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm chính là vi sinh vật chiếm 28,1%, trong đó số vụ do nhiễm vi khuẩn

Salmonella chiếm tỷ lệ lớn đến 70%

Có rất nhiều loại vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm như:

Salmonella,Campylobacter, Clostridium, E.coli, Listeria … trong đó Salmonella

được biết đến là một trong những vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm hàng đầu Tại các nước phát triển nơi có ngành công nghiệp sản xuất và chế biến thực phẩm hiện đại cùng với quy trình kiểm tra giám sát (HACCP) chặt chẽ như Mỹ, Pháp, Đức,

Nhật… nhưng các vụ ngộ độc thực phẩm do Salmonella gây ra cũng không tránh

khỏi (Trần Thị Hạnh và cs, 2009)[21]

Sữa bò là loại thực phẩm giàu dinh dưỡng vì thế dễ tạp nhiễm các yếu tố ngộ độc Ở nước ta, song song với nhu cầu sử dụng sữa tươi dần dần tăng lên theo sự cải thiện về chất lượng cuộc sống đó là sự quan tâm đến chất lượng vệ sinh sữa Ở đây, chúng tôi đề cập đến chất lượng vệ sinh sữa tươi – sự tạp nhiễm một số vi khuẩn gây ngộ độc có mặt trong sữa tươi

Các vi khuẩn gây ngộ độc trong sữa có thể kể đến như: Samonella spp.,

Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Camplylobacter jejuni, E.coli O157:H7,… các vi khuẩn này có mặt trong sữa tươi có thể thông qua các con đường như: 1) chúng có mặt sẵn trong bầu vú do bò sữa mắc bệnh viêm vú; 2) do tạp nhiễm từ tay người vắt

sữa, do vệ sinh bên ngoài bầu vú kém (E.coli O157:H7, Listeria monocytogenes,

Salmonella spp.), hoặc tạp nhiễm từ các sụng cụ chứa sữa Các vi khuẩn này khi xâm nhập vào cơ thể với một số lượng nhất định sẽ gây ngộ độc cho cơ thể, với các triệu chứng như: đau bụng, sốt, nôn mửa, tiêu chảy, tiêu ra máu Trường hợp nặng

có thể dẫn đến viêm dạ dày ruột cấp, viêm xuất huyết bể thận hoặc có các triệu chứng thần kinh như: đau đầu, liệt cơ và có thể dẫn đến tử vong

Ở nước ta, ngộ độc do sữa tươi hầu như chưa được cảnh báo nhiều và các trường hợp ngộ độc do dùng sữa tươi cũng chưa được cảnh báo từ các cơ sở y tế Với mục đích đưa ra cái nhìn khái quát về sự tạp nhiễm một số loại vi khuẩn gây

ngộ độc thực phẩm trong sữa bò tươi, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÁC NHÂN VI SINH VẬT GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM

TRONG SỮA BÒ TƯƠI ĐỒNG THỜI ĐỀ XUẤT MỘT SỐ GIẢI PHÁP HẠN CHẾ”

1- Mục tiêu nghiên cứu đề tài

Xác định sự có mặtmột số loài vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm trong sữa bò

tươi gây hại cho sức khỏe người tiêu dùng như: Salmonella spp., Clostridium

perfrigens, Bacillus cereus, E.coli O157:H7

Đề xuất một số giải pháp kỹ thuật hiệu quả nhằm hạn chế sự tạp nhiễm của các vi khuẩn trên

2- Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Ý nghĩa khoa học

Xác định mức độ ô nhiễm Salmonella spp., Clostridium perfrigens, Bacillus

cereus, E.coli O157:H7 trong sữa bò tươi, kết quả nghiên cứu có thể làm tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu tiếp theo

Ý nghĩa thực tiễn

Nghiên cứu phần nào sẽ phản ánh sự có mặt của vi khuẩn gây bệnh có mặt trong sữa bò tươi, đồng thời giúp người tiêu dùng có nhận thực đúng đắn hơn về sản phẩm sử dụng hàng ngày tránh xảy ra những trường hợp ngộ độc gây tử vong đáng tiếc do không có hiểu biết về vệ sinh an toàn thực phẩm

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 Thực trạng an toàn thực phẩm trong nước và trên thế giới

1.1 Thực trạng an toàn thực phẩm trên thế giới

Vệ sinh an toàn thực phẩm là một trong những vấn đề được quan tâm ngày càng sâu sắc trên phạm vi mỗi quốc gia và quốc tế bởi sự liên quan trực tiếp của nó đến sức khỏe và tính mạng con người, ảnh hưởng đến sự duy trì và phát triển nòi giống, cũng như quá trình phát triển và hội nhập kinh tế quốc tế [15], [51].Cùng với

xu hướng phát triển của xã hội và toàn cầu hóa, bệnh truyền qua thực phẩm và ngộ độc thực phẩm đang đứng trước nhiều thách thức mới, diễn biến mới về cả tính chất, mức độ và phạm vi ảnh hưởng [55] Theo báo cáo của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), hơn 1/3 dân số các nước phát triển bị ảnh hưởng của các bệnh do thực phẩm gây ra mỗi năm [59] Các vụ ngộ độc thực phẩm (NĐTP) có xu hướng ngày càng tăng Nước Mỹ mỗi năm vẫn có 76 triệu ca NĐTP với 325.000 người phải vào viện và 5.000 người chết [49],[57] Ở các nước phát triển khác như EU, Hà Lan, Nga, Trung Quốc, Hàn Quốc có hàng ngàn trường hợp người bị NĐTP mỗi năm

và phải chi phí hàng tỉ USD cho việc ngăn chặn nhiễm độc thực phẩm [48][60] Tại các nước đang phát triển, tình trạng ngộ độc thực phẩm lại càng trầm trọng hơn nhiều Năm 1998, khoảng 1,8 triệu trẻ em bị tử vong do nhiễm độc thực phẩm (tiêu chảy), và đến bây giờ con số đó là hơn 2,2 triệu người tử vong hàng năm, trong

đó cũng hầu hết là trẻ em [76],[47],Tỷ lệ tử vong do NĐTP chiếm 1/3 đến 1/2 tổng

số trường hợp tử vong [58] Ở khu vực châu Phi mỗi năm có khoảng 800.000 trẻ em tử vong do tiêu chảy [46]

Ở các nước Đông Nam Á như Thái Lan, trung bình mỗi năm có 1 triệu trường hợp bị tiêu chảy Riêng trong năm 2003, có 956.313 trường hợp tiêu chảy cấp, 23.113 ca bị bệnh lỵ, 126.185 ca ngộ độc thực phẩm Trong 9 tháng đầu năm 2007, ở Malaysia, đã có 11.226 ca NĐTP, trong đó có 67% là học sinh, tăng 100% so với cùng kỳ năm trước Tại Ấn Độ 400 ngàn trẻ em bị tử vong do tiêu chảy mỗi năm [50],[61]

Thực tế cho thấy các bệnh do ăn phải thức ăn bị ô nhiễm chất độc hoặc tác nhân gây bệnh đang là một vấn đề sức khoẻ cộng đồng ở các nước đã phát triển cũng như các nước đang phát triển và đây là vấn đề sức khỏe của toàn cầu [52] Cần phải thiết lập một hệ thống quản lý ngộ độc thực phẩm và các bệnh truyền qua thực phẩm [53], [56]

1.2 Thực trạng an toàn thực phẩm ở Việt Nam

Ở nước ta, tỷ lệ ngộ độc thực phẩm (NĐTP) hiện còn ở mức cao Hàng năm,

có khoảng 150 - 250 vụ NĐTP được báo cáo với từ 3.500 đến 6.500 người mắc,

37-71 người tử vong NĐTP do hóa chất, đặc biệt là hóa chất sử dụng trong nông nghiệp như hóa chất bảo vệ thực vật (BVTV), một số hóa chất bảo quản thực phẩm, chiếm khoảng 25% tổng số các vụ NĐTP Tuy nhiên trong thực tế con số này có thể cao hơn nhiều do công tác điều tra, thống kê báo cáo chưa đầy đủ [13]

Giai đoạn 2006 - 2010, bình quân hàng năm có 189 vụ NĐTP với 6.633 người mắc và 52 người tử vong, số người mắc và số tử vong do NĐTP chưa thay đổi nhiều so với giai đoạn trước Đây là một thách thức lớn với công tác phòng chống NĐTP ở nước ta[13] Số vụ NĐTP có nguyên nhân do vi sinh vật có xu hướng giảm rõ, trong khi đó nguyên nhân ngộ độc do hóa chất có xu hướng tăng lên [24]

Trong sản xuất nông nghiệp, tình trạng sử dụng hóa chất, phân bón và các chất điều tiết sinh trưởng thiếu khoa học vẫn còn phổ biến đặc biệt là việc lạm dụng phân vô cơ, thuốc kích thích sinh trưởng Hiện tượng vùng sản xuất rau màu gần khu công nghiệp, nước tưới không đảm bảo vệ sinh vẫn còn tồn tại [4], [23], [26], [43] Tại tỉnh Nam Định (năm 2004), có 52,6% số mẫu rau quả được kiểm tra có dư lượng TBVTV, trong đó 15% số mẫu vượt giới hạn cho phép [42] Tại Hà Nội, số mẫu

có dư lượng TBVTV chiếm 69,4%, trong đó 25% vượt mức cho phép; ở TP Hồ Chí Minh là 23,66% [7], [10] Nghiên cứu của Nguyễn Sơn Hà cho thấy nhóm rau ăn

lá có tỷ lệ mẫu chứa dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật vượt mức cho phép (MRLs) cao: rau ngót 23%, nho 24% [19]

Trong chăn nuôi, giết mổ, hoá chất tồn dư trong sản phẩm chăn nuôi là nguy

cơ tiềm ẩn đe dọa tới sức khoẻ của con người [54] Phần lớn các lò mổ tập trung thiếu mặt bằng cho giết mổ, các công đoạn giết mổ không được phân chia riêng rẽ; nguồn nước sử dụng, đặc biệt là nước thải không bảo đảm vệ sinh thú y [7], [43] Công tác kiểm dịch động vật còn kém hiệu quả, trang thiết bị cho các chi cục thú y, trạm, chốt kiểm dịch còn hạn chế [14] Nghiên cứu của Đào Tố Quyên cho thấy dư lượng kháng sinh Enrofroxacin chiếm 31,4%, tỷ lệ nhiễm Ecoli trong thịt lợn là 40%,

có 25,7% mẫu thịt lợn không đạt tiêu chuẩn về nhiễm Salmonela [36] Tỷ lệ nhiễm

Salmonella và S.aureus vượt quá giới hạn cho phép trong thịt lợn tại Hà Nội lần lượt

là 4,1% và 5,5%; trong thịt gà là 8,3% và 9,7% Tại TP Hồ Chí Minh trong thịt lợn là 5,8% và 53,6%; trong thịt gà là 8,7% và 59,4% [12], [21] Tồn dư hóa chất và hóa chất bảo quản thực phẩm trong thịt và sản phẩm động vật tươi sống là vấn đề rất cần được quan tâm, Salbutamol và Clenbuterol là chất cấm sử dụng do có ảnh hưởng đến sức khỏe con người nhưng vẫn còn tồn dư trong thịt [4], [40]

Trong nuôi trồng thủy sản, thực trạng ô nhiễm môi trường nuôi do TBVTV,

sử dụng thuốc thú y và tình trạng tiêm chích tạp chất vào thuỷ sản vẫn là nguy cơ đối với an toàn thực phẩm có nguồn gốc thuỷ sản [3], [6] Nguyễn Lan Phương nghiên cứu với 300 mẫu thủy hải sản đông lạnh và chế biến sẵn tại Hà Nội năm 2006

- 2008 có 27% mẫu không đạt tiêu chuẩn về mặt vi sinh [34] Nghiên cứu của Trịnh Bảo Ngọc năm 2009 cho thấy 100% mẫu thủy sản bị nhiễm kim loại nặng As, Cr, Hg,

Pb, Cd, Ni Mức độ nhiễm E.coli rất cao, cao hơn hàng trăm đến hàng nghìn lần so

với tiêu chuẩn cho phép [32] Thực trạng ô nhiễm hóa chất, kháng sinh trong các sản phẩm trên không những tác động xấu tới hoạt động xuất khẩu thủy sản [54], [45]

mà còn có thể gây ra nhiều loại bệnh với người tiêu dùng, ảnh hưởng không nhỏ tới việc xuất khẩu các sản phẩm này sang Hoa Kỳ và nhiều nước khác [14], [43]

Tình trạng an toàn vệ sinh thức ăn đường phố (TAĐP) đã được cải thiện nhờ việc triển khai xây dựng phường điểm về ATVSTP thức ăn đường phố [16], [18], [20] theo quy định của Bộ Y tế [8], [9] Điều kiện ATVSTP tại các bếp ăn tập thể

của cơ quan, trường học đã được cải thiện đáng kể [25] Tuy nhiên, đa số các

cơ sở kinh doanh dịch vụ TAĐP được đầu tư ít vốn, triển khai trong điều kiện môi trường chưa đảm bảo vệ sinh, thiếu hạ tầng cơ sở và các dịch vụ nước sạch [27], và kiến thức ATVSTP của người trực tiếp chế biến, kinh doanh còn nhiều hạn chế [29], [41] Nghiên cứu của Lê Văn Giang năm 2006 ở huyện Gia Lâm cho thấy có 20% số

cơ sở không đạt về điều kiện ATVSTP [18] Nghiên cứu của Lý Thành Minh ở

thị xã Bến Tre cho thấy tỉ lệ nhiễm S.aureus là 49,6% và Ecoli là 23,6% [30] Năm

2007, nghiên cứu của Trần Việt Nga cho thấy còn 18,2% bếp ăn tập thể không đạt tiêu chuẩn về vệ sinh cơ sở, 9% mẫu thức ăn chính không đạt tiêu chuẩn về chỉ tiêu

Coliforms [31] Tại Thanh Hóa, tỷ lệ ô nhiễm chung của các mẫu thức ăn đường phố và dụng cụ chế biến là 57,74% Năm 2008, kết quả nghiên cứu tại Nha Trang cho thấy

có 39,5% món ăn hải sản sống không đạt tiêu chuẩn vệ sinh về VSV Có tới 31,8%

bàn tay của nhân viên tiếp xúc trực tiếp với thực phẩm bị nhiễm S.aureus [22]

Đa số các cơ sở chế biến thực phẩm ở nước ta có quy mô vừa và nhỏ với đặc điểm thiếu vốn đầu tư, mặt bằng sản xuất hẹp, chế biến thủ công, thiết bị cũ và lạc hậu nên việc tuân thủ các quy trình kỹ thuật chế biến thực phẩm, kiểm soát nguồn nguyên liệu đầu vào theo quy định còn nhiều hạn chế và chưa đảm bảo tiêu chuẩn chất lượng ATVSTP [9], [39] Trong 2 năm gần đây, thực phẩm chế biến thủ công

có nhiều tiến bộ nhưng độ an toàn của thực phẩm chế biến thủ công thấp hơn thực phẩm chế biến công nghiệp [11] Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Hùng Long trên địa bàn Hà Nội cho thấy nhận thức, thái độ, hành vi ATVSTP của người quản

lý cơ sở đúng chỉ đạt 57,6 - 97% của thực phẩm chế biến thủ công thấp hơn thực phẩm chế biến công nghiệp [28] Nghiên cứu của Hoàng Cao Sạ năm 2009 cho thấy các nhóm ô nhiễm vi sinh vật nhiều nhất là thịt lợn qua chế biến, nước đá và các loại rau sống [37] Điều này cho thấy thực trạng ATVSTP tại các cơ sở chế biến thực phẩm còn nhiều vấn đề bức xúc cần được quan tâm giải quyết trong thời gian tới Nghiên cứu của Nguyễn Văn Thể ở tỉnh Bắc Giang năm 2008 cho thấy

có 60% thực hành đúng về ATVSTP [38] Một nghiên cứu khác của Hoàng Thị Điền cho thấy tỷ lệ biết chọn thực phẩm chín ăn ngay ở địa bàn vùng cao tối đa

chỉ chiếm 31,33%, vùng thấp là 81,3%, chỉ có 7,67% người dân ở vùng cao quan tâm đến nhãn hàng hóa thực phẩm và 14,33% người ở vùng cao, 78,33% người ở vùng thấp biết 9 loại thực phẩm thường gây ngộ độc [177] Nguyễn Thanh Phong cho thấy kiến thức của người tiêu dùng về ô nhiễm thực phẩm đạt 49,5% (Hà Nội 49,9%, Hà Tĩnh 46%, Thái Bình 53%) [33]

Theo một phân tích của Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa bệnh (CDC), từ năm 1993 đến năm 2006 hơn 1500 người tại Hoa Kỳ bị bệnh do uống sữa tươi hoặc

ăn pho mát làm từ sữa tươi Ngoài ra, CDC báo cáo khả năng gây bệnh sữa chưa tiệt trùng là 150 lần do thực phẩm gây ra và kết quả trong viện báo cáo sữa chưa tiệt trùng gây bệnh gấp 13 lần so với sữa tiệt trùng Sữa tươi là sữa từ những con bò, cừu,

dê chưa được tiệt trùng để diệt vi khuẩn có hại, Sữa chưa tiệt trùng có thể mang các vi

khuẩn có hại như Salmonella, E.coli, Clostridium perfingens, Bacillus cereus,…

Những vi khuẩn có hại có thể ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏecủa bất kỳ ai uống sữa tươi và nó còn ảnh hưởng đến phụ nữ mang thai, trẻ em, thanh thiếu niên,…[77] Ghi nhận từ Trung tâm kiểm soát dịch bệnh (CDC) Hoa Kỳ có ba trường

hợp nhiễm khuẩn Salmonella do sữa gây ra trong giữa năm 1999 và 2010 Tác động trực tiếp của E.coli O157:H7 trên người là rất ít, nhưng nó có thể gây ra cá bệnh

nghiêm trọng và thậm chí gây tử vong như hội chứng tan huyết ure huyết, CDC ước tính rằng từ năm 1999 đến năm 2010 chỉ có 5 trong số 63.153 trường hợp bệnh do

E.coli là do uống sữa [78]

2 Một số loài vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm trong sữa

2.1. Vi khuẩn Clostridium perfingens

Vi khuẩn Clostridium perfringens (tên

cũ là C.welchii) được Welch và Nuttal phân lập

từ năm 1882.Là vi khuẩn Gram dương, hình

que, kỵ khí, sinh nội bào tử

Vi khuẩn thường đứng một mình hoặc

thành cặp, có giáp mô và nha bào trong cơ thể

động vật nhưng không hình thành giáp mô và nha bào trong điều kiện nuôi cấy

Clostridium perfringens không có lông, không có khả năng di động Chúng thường

cư trú ở hệ tiêu hóa của người và động vật Khoảng 25% quần thể dân cư hàng ngày

thải ra Clostridium perfringens theo phân ra ngoài [2] Vi khuẩn này thường chuyển

sang dạng bào tử va sống rất lâu trong môi trường xung quanh và thường gây ô nhiễm vào thức ăn Phần lớn các vụ ngộ độc thực phẩm có nguyên nhân là

Clostridium perfringens thường do ăn các thức ăn để nguội, các loại thực phẩm hun khói, sữa chưa thanh trùng…

Clostridium perfringens là vi khuẩn đòi hỏi điều kiện yếm khí khắt khe, chúng có thể phát triển tốt ở nhiệt độ 30-37 oC và trong các môi trường có bổ sung đường hoặc máu Trong môi trường nước gan yếm khí, chúng phát triển làm đục môi trường và có sinh hơi, sủi bọt Nuôi cấy trong môi trường sữa bò tươi, vi khuẩn làm đông vón sữa do sinh acid, bên cạnh đó chúng tạo ra vòng dung huyết kép đặc trưng, vòng ngoài tan huyết không hoàn toàn Hiện tượng dung huyết này là do các độc tố α, β, ө Trong môi trường gelatin, chúng làm tan chảy gelatin độc tố λ, K Khi nuôi cấy trong các môi trường đặc có huyết thanh người hoặc lòng đỏ trứng gà,

vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc có màu trắng sữa do tác động của độc tố α hoạt hóa men leucithinase, đây chính là cơ sở của phản ứng Nagler để bước đầu xác định

Clostridium perfringens, tuy nhiên không phải tất cả Clostridium perfringens đều

sản sinh leucithinase và ngược lại [66]

Bào tử của Clostridium perfringens có khả năng chịu nhiệt và chúng sẽ phát

triền trở lại rất nhanh nếu thức ăn sau khi nấu được giữ trong điều kiện nhiệt độ và

độ ẩm thích hợp Nha bào của một số chủng type A và C chỉ bị tiêu diệt ở nhiệt độ

100oC trong 1 giờ

Clostridium perfringens cư trú trong đất, đường tiêu hóa của người và gia súc khỏe mạnh Bất cứ một loại thực phẩm nào cũng có thể nhiễm vi khuẩn

Clostridium perfringens và nha bào của chúng Hiện tượng ngộ độc do Clostridium

perfringens là do độc tố của chúng gây nên Vi khuẩn này sinh ra 5 loại độc tố θ, α,

β, λ, K trong đó độc tố gây ngộ độc chủ yếu là α, β, λ [65] Ngoài ra, ngoại độc tố sản sinh ra trong quá trình nảy mầm nha bào cũng là yếu tố gây ngộ độc Người ta

thường tìm thấy độc tố này ở Clostridium perfringens type A,C,D [62]

Triệu chứng đầu tiên xuất hiện sau khi ăn thức ăn bị nhiễm vi khuẩn

Clostridium perfringens khoảng 8-22 giờ Bệnh nhân đau quặn bụng đột ngột, tiếp sau đó là ỉa chảy và buồn nôn Bệnh diễn biến thường nhẹ và nhanh trong ngày, cũng có thể kéo dài hơn ở người già và trẻ nhỏ Bệnh nhân mất nước trầm trọng

Trường hợp nặng có thể dẫn tới tử vong, tỷ lệ tử vong do ngộ độc Clostridium

perfringens khá cao khoảng 30% Vi khuẩn Clostridium perfringens là một trong

những nguyên nhân chính gây ngộ độc thực phẩm Trong các trường hợp ngộ độc

do vi khuẩn này người ta thấy số lượng vi khuẩn có trong 1g thực phẩm là 105CFU

và trong 1g phân của bệnh nhân là 106CFU

2.2. Vi khuẩn Bacillus cereus

Bacillus cereus là trực khuẩn gram dương, sinh nội nha bào, nha bào này

nằm ở phía cuối vi khuẩn và không làm biến dạng vi khuẩn Trên môi trường thạch PEMBA (Polymyxin pyruvate Egg yolk Mannitol Bromothymolblue Agar), khuẩn lạc to, có màu xanh ngọc lam và có vùng đục bao quanh do sản sinh lecithinase Vi khuẩn này có thể phát triển được trong khoảng nhiệt độ từ 7-490C, pH từ 4,3-9,3, nồng độ muối tối đa là

7,5% Ở điều kiện bất lợi vi khuẩn Bacillus cereus sinh nha bào và nha bào này chỉ

bị tiêu diệt ở nhiệt độ 100oC trong thời gian 160 phút[68]

Thực phẩm tạp nhiễm vi khuẩn Bacillus cereus rất phổ biến Người ta đã

phân lập được vi khuẩn này trong thịt tươi với số lượng 101-102 CFU/g [68] số lượng vi khuẩn phân lập được trong mẫu thực phẩm chế biến từ thịt có bổ sung phụ gia cao hơn là 102-104CFU/g [73] Trong trường hợp thực phẩm có chưa 105-108 vi

khuẩn Bacillus cereus sẽ sản sinh độc tố trong đường tiêu hóa của người sử dụng

[68]

Vi khuẩn Bacillus cereus gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm lẻ tẻ khắp nơi

trên thế giới Người bị mắc bệnh tiêu chảy do độc tố nội bào tử nhiều hơn là do sự

xâm nhiễm vi khuẩn vào cơ thể Có 2 loại ngộ độc thực phẩm do Bacillus cereus,

phụ thuộc vào tác động của độc tố enterotoxin, bao gồm: 1) gây hội chứng ỉa chảy sau khi ăn các loại thức ăn đã chế biến giàu đạm như thịt, sữa; 2) gây hội chứng nôn sau đó bệnh nhân có thể bị tiêu chảy Những triệu chứng này thường xảy ra sau khi

sử dụng thức ăn từ 1-5 giờ Dạng ngộ độc này thường gặp trong trường hợp bệnh nhân sử dụng các loại thực phẩm giàu tinh bột [68]

2.3. Vi khuẩn Samonella spp

Trong tự nhiên có khoảng 1600 chủng Salmonella Hiện nay theo phân loại

của Kauffmann-White người ta đã phân loại được

600 type huyết thanh trong đó có 86 type huyết

thanh đã được phân loại ở Việt Nam Nhưng các

trường hợp ngộ độc thực phẩm thường do hai chủng

Salmonella typhimurium và Salmonella enteritidis

gây nên [70] Các vi khuẩn này có mặt trong ống

tiêu hóa của người và gia sức bị bệnh Sự lây lan mầm bệnh có thể do tiếp xúc trực tiếp với nguồn bệnh hoặc do thức ăn bị nhiễm trùng Theo tác giả Đoàn Băng Tâm

thì trong phân bê nghé bị tiêu chảy thường phân lập được serotype Salmonella

typhimurium và Salmonella enteritis [1] Đây là nguồn reo rắc mầm bệnh ra môi trường nuôi Nếu công tác vệ sinh chuồng trại, thân thẻ bò sữa không đảm bảo thì

sự tạp nhiễm của vi khuẩn này vào sữa là điều dễ dàng xảy ra

Vi khuẩn Salmonella thuộc nhóm trực khuẩn bắt mài Gram âm, có khả năng

di động đặc tính sinh hóa của chúng được thể hiện trong bảng sau:

Bảng 1.1: Nhận định phân biệt sinh hóa của Salmonella (theo Edwards và

Ewing) Hóa chất Phản ứng

Bệnh ngộ độc do Salmonella thường gặp ở người lớn nhưn trẻ em hoặc

người già do sức đề kháng ở những cá thể này kém nên mức độ trầm trọng và tính nguy hiểm cao hơn nhiều so với người trưởng thành [2]

Con người thường nhiễm Salmonella do sử dụng các thức ăn như: sữa tươi

vừa mới vắt chưa được thanh trùng hoặc sữa để lâu, cá thịt ôi thiu hoặc chế biến ở những nơi có nguồn nước bị ô nhiễm, …

Vi khuẩn Salmonella có sức đề kháng cao, trong các sản phẩm có nguồn gốc

động vật chúng có thể tồn tại được vài tháng, ở điều kiện pH là 4,3-9,6 vi khuẩn vẫn

có thể phát triển được Vi khuẩn này rất dễ bị tiêu diệt ở nhiệt độ thanh trùng, chúng

bị tiêu diệt ở điều kiện nhiệt độ 75oC trong vòng 10 phút Tuy nhiên nếu thực phẩm nhiễm khuẩn được giữ lạnh và khi đưa về nhiệt độ thích hợp thì vi khuẩn

Salmonella sẽ phát triển rất nhanh và có thể gây bệnh

Triệu chứng ngộ độc do Salmonella chủ yếu là hội chứng viêm dạ dày, tiểu

tràng cấp (đôi khi có viêm đại tràng) bao gồm hiện tượng sốt, đau bụng, ỉa chảy, buồn nôn, gây mất nước ở trẻ nhỏ Thời gian nung bệnh từ 6-72 giờ, phổ biến 12-36 giờ sau khi ăn thức ăn nhiễm khuẩn Bệnh thường khởi phát đột ngột với các triệu chứng sốt và rét run, đau bụng quặn, nôn, ỉa chảy phân lỏng đôi khi có lẫn áu và chất nhầy Thể bệnh nhẹ bệnh nhân chỉ đau tức bụng nhẹ, không có biểu hiện sốt hoặc đi lỏng Ở thể bệnh nặng, bệnh nhân số cao, rét run, nôn thốc nôn tháo, bụng đau quặn, ỉa chảy nhiều lần, cơ thể mất nước trầm trọng, trụy tim mạch

2.4. Vi khuẩn E.coli O157:H7

E.coli O157:H7 là trực khuẩn Gram âm, trên

môi trường Mackonkey Sorbitol vi khuẩn mọc thành

các khuẩn lạc màu nâu nhạt do không lên men đường

Sorbitol E.coli O157:H7 được phát hiện tại Mỹ vào

năm 1982 trong món thịt băm, sau này ghi nhận

được ở Osakai(1996) và nhiều nơi khác ở Nhật Bản,

gây tử vong 10 ca trong số 8000 ca nhiễm Các cơ quan y tế của Nhật vẫn chưa rõ nguyên nhân lây truyền, người ta cho rằng có thể nguyên nhân lây lan là do món cá chình truyền thống cũng có thể từ thịt lợn, bò, rau diếp sống hoặc một món ăn sống nào khác,… [2]

Vi khuẩn thường có mặt trong thịt bò, các loại thịt được chế biến và giết mổ

ở những nơi ô nhiễm, trong sữa tươi chưa thanh trùng, trong nước không được clo hóa cẩn thận Vi khuẩn này có thể gây bệnh với số lượng vi khuẩn rất nhỏ Khả năng sống sót của vi khuẩn cao, kể cả trong điều kiện nhiệt độ thấp hoặc trong môi trường acid Các trường hợp có dấu hiệu tiêu chảy ra máu hoặc tiêu chảy kéo dài

hơn 3 ngày sau khi sử dụng 1 loại thực phẩm nào đó thì có thể bệnh nhân đã nhiễm

vi khuẩn E.coli O157:H7

Chủng E.coli O157:H7 không chỉ gây triệu chứng tiêu chảy mà nó còn gây

viêm thận cấp, xảy thai Người già trên 65 tuổi và trẻ em dưới 5 tuổi bị nhiễm chủng vi khuẩn này thường có nguy cơ viêm thận cao hơn ở người trưởng thành [74] Vi khuẩn này có thể gay nguy hiểm đến tính mạng con người với các triệu chứng Urê huyết, thiếu máu, suy thận cấp, giảm tiểu cầu Tỷ lệ tử vong có thể lên tới 3-5% [75]

Không giống với hầu hết các type E.coli khác, E.coliO157:H7 không sinh

trưởng ở nhiệt độ 44,5oC mà sinh trưởng ở nhiệt độ tối đa ở nhiệt độ 42oC E.coli

O157:H7 sinh độc tố trong môi trường pH khoảng 3,7-3,9, không sinh trưởng trong

môi trường có 8,5 NaCl Dòng O157 sản sinh verotoxin, người tiêu thụ ăn phải thức

ăn nhiễm 20-100 vi khuẩn thuộc serotype này sẽ bị đau bụng quặn, viêm đại tràng với hội chứng kiết giống lỵ trực khuẩn, đi tiêu phân có lẫn máu do bị ruột viêm xuất huyết Bệnh nhân ngộ độc có thể sốt hoặc không Bệnh diễn biến nặng, có thể gây xuất huyết nội ở não, phổi, thận và có thể gây suy thận dẫn tới hội chứng urê huyết.[2]

2.5.Vi sinh vật có mặt trong sữa tươi, tiêu chuẩn cho phép về số lượng các vi sinh vật có mặt trong sữa

Sữa được tổng hợp ra từ các tế bào đặc biệt của tuyến vú và được đổ vào các ống dẫn để đi tới các bể sữa Sự tạp nhiễm vi khuẩn vào sữa được xác định thông qua 3 đường chính đó là: 1) vi khuẩn có sẵn trong bầu vú; 2) vi khuẩn tạp nhiễm từ bên ngoài bầu vú, tay người vắt sữa; 3) và vi khuẩn tạp nhiễm từ các dụng cụ chứa sữa [72] Đối với những cơ sở chăn nuôi bò khỏe mạnh thì sự tạp nhiễm vi khuẩn vào sữa tươi thông qua việc vệ sinh cơ thể bò sữa, chuồng trại, bầu tiểu khí quyển chuồng nuôi, dụng cụ chứa sữa

TheoKurweil, R., and M Busse.1973 [67], sữa tươi được vắt ra từ những con

bò sữa khỏe mạnh có chứa 1 lượng nhỏ các loài vi khuẩn (nhỏ hơn 1000 vi

khuẩn/1ml sữa) và số lượng vi khuẩn này nằm trong khoảng cho phép tổng số các vi sinh vật có mặt trong sữa tươi Đối với bò sữa bị bệnh viêm vú, số lượng vi khuẩn

có sẵn trong sữa tươi thường rất lớn và chủng loại vi khuẩn phụ thuộc vào các loài

vi khuẩn gây bệnh, kỳ nhiễm bệnh và tỷ lệ và cá thể mắc bệnh trong đàn bò Các

loài vi khuẩn có mặt trong sữa bò bị bệnh viêm vú thường là Streptococcus., trong

đó chủ yếu là các chủng S.agalactiae and S.uberis [72]; Streptococcus aureus xuất hiện trong sữa với số lượng lớn, 60.000 vi khuẩn/1ml sữa [69]

Sự tạp nhiễm vi khuẩn vào sữa từ bên ngoài bầu vú vào sữa có liên quan tới

vệ sinh bầu vú và tay người vắt sữa, các vi khuẩn này bao gồm Streptococcus

aureus, các vi khuẩn gram âm như Salmonella, E.coli, Campylobacter; các vi khuẩn chịu nhiệt (nha bào của C.perfringens, và các vi khuẩn có thể phát triển ở nhiệt độ thấp: Listeria monocytogenses [72]

Dụng cụ chứa sữa cũng là nguồn tạp nhiễm vi khuẩn vào sữa, cặn sữa thừa nếu không được rửa sạch sẽ là môi trường lý tưởng cho sự phát triển của các loài vi khuẩn Sữa tươi được chứa trong các dụng cụ chứa sữa bẩn sẽ tạp nhiễm vi khuẩn

và số lượng vi khuẩn này nhân lên rất nhanh và gây nguy hiểm cho người sử dụng

Sự nhiễm khuẩn từ con đường này thường chứa các vi khuẩn như Clos.perfringens,

Listeria monocytogenses, Clos.botulinum, Campylobacter jejuni. Đặc biệt các ứng dụng chứa sữa làm từ cao su thường hay gây tạp nhiễm các vi khuẩn yếm khí như

Clos.perfringens, Listeria monocytogenses, Clos.botulinum, Campylobacter jejuni.

Theo tiêu chuẩn TCVN 5860:2007, chỉ tiêu vi sinh vật trong sữa tươi thanh trùng, được qui định như sau:

Bảng 1.2: Các chỉ tiêu vi sinh vật trong sữa tươi thanh trùng (TCVN

5860:2007, kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F12 Sữa và sản phẩm sữa, Tổng cục Tiêu

chuẩn Đo lường Chất lượng, Bộ Khoa học và Công nghệ)

Tổng số vi sinh vật hiếu khí, số khuẩn

4

Coliforms, số vi khuẩn trong 1 ml sản

Salmonella, số vi khuẩn trong 25 ml sản

Clostridium perfringens, số vi khuẩn

PHẦN II: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu sữa bò tươi được ấy từ xô vắt sữa, thùng bảo quản lạnh và sữa thanh trùng ở các cơ sở bán sữa tươi cho người tiêu dùng ở khu vực Ba Vì, Gia Lâm - Hà Nội

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Xác định mức độ ô nhiễm một số loài vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm trong các mẫu sữa tươi thu thập;

- Xác định yếu tố độc lực của một số vi khuẩn trong số các vi khuẩn phân lập được đối với tế bào biểu mô ruột (VERO);

- Đề xuất một số giải pháp kỹ thuật hiệu quả nhằm hạn chế sự tạp nhiễm của các vi khuẩn trên

2.3 Nguyên liệu

2.3.1 Trang thiết bị thí nghiệm

- Các dụng cụ thủy tinh: bình tam giác, ống nghiệm, đĩa hộp lồng, đèn cồn, phiến kính, lá kính,…

- Các thiết bị phòng thí nghiệm khác: bình nuôi cấy yếm khí, tủ ấm CO2, tủ ấm,

tủ sấy, tủ lạnh, tủ cấy vi sinh, kính hiển vi, máy lắc, máy Vortex, nồi hấp tiệt trùng, kính hiển vi,…

- Các dụng cụ khác: pippet, que cấy, đèn cồn, chai lấy mẫu,…

2.3.2 Môi trường nuôi cấy, hóa chất nuôi cấy và xác định độc tố vi khuẩn

- Các môi trường tổng hợp của các hãng MECK và OXOID như:

 Môi trường nước thịt

 Pepton water

 Thạch thường

 Thạch máu

 MacKonkey Sorbitol Agar

 Brilliant Green Broth

 Rappaport Vassiliadis

 XLD

 BHI

 Kligler Agar

 Nước gan yếm khí

 Oxford Agar, PALCAM agar

 PEMBA Agar

 Kamali Broth, Kamali Agar

 Baird Packer, huyết tương thỏ đông khô

 Tế bào VERO

 Các hóa chất làm phản ứng sinh hóa khác

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp thu thập mẫu: TCVN 6400 (ISO 707), Sữa và sản phẩm sữa

H ướng dẫn lấy mẫu

Sữa được lấy mẫu từ các hộ gia đình chăn nuôi nhỏ lẻ, người vắt sữa vệ sinh sạch sàn chuồng bò, lau rửa vú bò, lau rửa tay bằng xà phòng và khăn sạch, vắt sữa vào xô sạch Sau đó, các xô đổ vào téc lạnh

Mẫu được lấy đại diện từ các xô vắt sữa, téc lạnh đã được làm đồng nhất và các địa điểm giải khát bán sữa tươi uống đã tiệt trùng bằng phương pháp Pasteur Lấy mẫu sữa từ các xô khác nhau, téc lạnh lấy mẫu không lặp với các xô đã lấy mẫu trước đó Chuyển vô khuẩn 500ml sữa sang dụng cụ chứa sữa, mỗi bình đựng riêng một mẫu, làm mát mẫu ngay tức thời và bảo quản duy trì nhiệt độ đó đưa về phòng thí nghiệm Mẫu sẽ được phân tích trong vòng 36 giờ kể từ khi thu thập

Các bình chứa sữa đã được tiệt trùng, được bọc bằng túi đã tiệt trùng Khi lấy mẫu, người lấy mẫu phải tuân thủ đúng quy trình lấy mẫu

+ Rửa tay bằng xà phòng và lau khô tay, tay đeo găng tay tiệt trùng và thay thế sau mỗi mẫu

+ Đánh dấu mỗi bình chứa mẫu và ghi đầy đủ thông tin ngày giờ, địa điểm lấy mẫu

+ Mở nắp bình chứa mẫu rồi lấy mẫu nhanh chóng đóng nắp lại Chú ý không làm ô nhiễm bên trong các bình chứa và các nắp

+ Các mẫu lấy xong được để trong hộp kín, tránh lây nhiễm chéo, có đá khô bảo quản lạnh

Đối với mẫu quầy giải khát trên địa bàn, ta lấy nguyên bình bán sẵn, không

mở ra xem Bình phải nguên vẹn, không bị nứt vỡ

2.4.2 Phương pháp phân lập và xác định số lượng một số loài vi khuẩn

2.4.2.1 Xác đinh tổng số vi khuẩn hiếu khí- TCVN 5165-90, Sản phẩm thực

ph ẩm Phương pháp xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí

Áp dụng kỹ thuật cấy láng trên môi trường thạch đếm số, sau khi ủ hiếu khí

ở nhiệt độ 30±1oC trong thời gian từ 24-48 giờ Số lượng vi khuẩn trong 1ml mẫu được tính theo số khuẩn lạc đếm được từ các đĩa nuôi cấy ở đậm độ pha loãng phù hợp với quy định của phương pháp ISO

Tính kết quảPhương pháp tính giá trị trung bình của mật độ tế bào vi sinh vật: Chọn các đĩa của hai nồng độ pha loãng liền nhau có số khuẩn lạc từ 15-300 để tính kết quả Sự phân bố các khuẩn lạc trên các đĩa nuôi cấy phải hợp lý Độ pha loãng càng cao thì số khuẩn lạc phải càng ít

Số khuẩn lạc trong 1ml mẫu sẽ được tính bằng công thức:

(n1 + 0,1n2 Trong đó:

N: (CFU/ml) Số khuẩn lạc vi khuẩn hiếu khí trong 1g hay 1 ml mẫu sản phẩm N biểu thị kết quả dưới dạng thập phân giữa 0,1 và 9,9 x 10n (n là số

mũ thích hợp của 10)

C: Số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa chọn

n1, n2: Số đĩa ở 2 đậm độ pha loãng liên tiếp đã chọn để đếm số

d: (ml) Hệ số pha loãng của đậm độ pha loãng ban đầu

2.4.2.2 Ph ương pháp xác định vi khuẩn Cl.perfringens trong sữa bò

t ươi(Nguyễn Phùng Tiến và cộng sự)[2]

Cl.perfringens là vi khuẩn kỵ khí được nuôi cấy trong môi trường nước gan yếm khí Sau khi nuôi cấy ở 37oC trong 24 giờ, vi khuẩn phát triển và sinh hơi Đếm số khuẩn lạc Cl.perfringens trên môi trường thạch chọn lọc SPS

(Sulphite Polymyxin Sulfadiazin), Cl.perfringens khử Sulphite thành Sulphide, chất

này phản ứng với sắt trong môi trường tạo thành kết tủa màu đen vì vậy trong môi

trường khuẩn lạc Cl.perfringens có màu đen Chọn những đĩa có từ 30-300 khuẩn

lạc, đếm số và để tính số khuẩn lạc trong 1ml sữa

Lấy 10 khuẩn lạc điển hình cấy vào môi trường nước gan yếm khí, mỗi khuẩn lạc vào trong 1 ống Sau khi nuôi cấy ở 37oC trong 24 giờ, nếu có phản ứng sinh hơi và khi nhuộm Gram cho thấy dạng trực khuẩn bắt màu Gram dương, mập,

hai đầu tù thì đó chính là Cl.perfringens

Cách tính số khuẩn lạc Cl.perfringens có trong 1ml mẫu sữa dựa vào tỷ lệ phần trăm những khuẩn lạc được làm test xác nhận là Cl.perfringens

 d.C2 Trong đó:

N: là tổng số Cl.perfringens có trong 1ml mẫu sữa C1: số khuẩn lạc được làm test xác nhận là Cl.perfringens

C2: số khuẩn lạc đếm được trong đĩa thạch d: độ pha loãng mẫu

2.4.2.3 Phương pháp xác định vi khuẩn Bacillus cereus trong sữa bò tươi(Nguyễn

Phùng Tiến và cộng sự) [2]

Phương pháp này dựa vào kỹ thuật sử dụng đĩa môi trường có lòng đỏ trứng

để phân biệt Bacilus cereus bằng cách tìm đường tủa đục bao quanh khuẩn lạc (do

vi khuẩn sản sinh leucithinase làm dung giải lòng đỏ trứng)

Pha loãng mẫu rồi cấy láng lên đĩa thạch PEMBA Ủ ấm đĩa ở 30oC trong 20-24 giờ, sau đó đếm khuẩn lạc Chỉ đếm các khuẩn lạc màu xanh lam xung quanh

có quầng tủa đục và tính tổng số vi khuẩn trong mẫu bằng cách nhân với 4 và độ pha loãng

Xác nhận Bacilus cereus:

- Lấy những khuẩn lạc điển hình để nhuộm Gram và soi kính Bacilus

cereus là trực khuẩn Gram dương, sinh nội nha bào, nha bào này nằm ở phía cuối vi khuẩn và không làm biến dạng vi khuẩn

- Chuyển một số khuẩn lạc điển hình sang thạch dinh dưỡng, ủ ấm ở

30oC trong 24 giờ sau đó lấy các khuẩn lạc mới cấy tiếp để làm các phản ứng sinh

hóa Đặc điểm sinh hóa của Bacilus cereus là:

2.4.2.4 Ph ương pháp xác định vi khuẩn Samonella spp trong sữa bò tươi

Kỹ thuật phát hiện Salmonella trong thực phẩm dựa theo TCVN 6402:2007

(ISO 6785:2001) Gồm các bước sau:

- Đồng nhất mẫu: Đong 25ml mẫu + 225ml nước đệm pepton, lắc đều

- Tăng sinh sơ bộ ở 37oC/24h

- Tăng sinh chọn lọc lại trên môi trường Rappaport Vassiliadis theo tỉ lệ 10-1

và 10-2

- Ria cấy canh thang RV trên các đĩa thạch chọn lọc XLD Nuôi trong tủ ấm

37oC trong 24 giờ

- Lấy các khuẩn lạc có màu đen cấy chuyển sang ống thạch Kligler và cũng ủ

ở 37oC trong 24 giờ Sau đó đem ra đọc kết quả: Kligler dương tính (xác nhận là

Salmonella ) khi phần thạch đứng chuyển sang màu đen, sinh hơi, glucose dương

tính Phần thạch nghiêng không đổi màu môi trường do Salmonella không lên men

Để xác định số lượng E.coli O157:H7 trong sữa người ta cũng pha loãng 25ml sữa trong 225ml nước sinh lý vô khuẩn rồi cấy chuyển lên thạch MacKonkey Sorbitol, ủ ấm trong 37oC trong 24 giờ Đếm các khuẩn lạc không lên men và ngưng kết kháng huyết thanh sau đó tính toán xác định số khuẩn lạc E.coli O157:H7 có trong mỗi ml sữa

2.4.3 Xác định độc lực của vi khuẩn bằng tế bào VERO

Nguyên lý: Độc tố vi khuẩn có khả năng gây bệnh tích trên tế bào VERO

- Hút 100µl dung dịch trong đã ly tâm ở trên cấy vào đĩa 24 giếng, mỗi mẫu cấy vào 2 giếng để thử độc tố không chịu nhiệt