Nghiên cứu sàng lọc và thu nhận APTAMER đặc hiệu kháng sinh PENICILLIN

Dư lượng kháng sinh trong các mẫu thực phẩm và một số phương pháp xác định dư lượng kháng sinh .... Một số phương pháp xác định dư lượng kháng sinh Việc phân tích nhóm kháng sinh trong

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài: NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC VÀ THU NHẬN APTAMER ĐẶC HIỆU

KHÁNG SINH PENICILLIN

Giáo viên hướng dẫn:

PGS.TS LÊ QUANG HUẤN

TS LÃ THỊ HUYỀN

Hà Nội – 2015

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, con xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất từ trái tim con đến bố

mẹ thân yêu đã nuôi lớn, dạy dỗ và luôn bên cạnh động viên con Con hiểu rằng, bao nhiêu khó khăn, vất vả, mồ hôi và nước mắt mà bố mẹ đã chịu đựng để cho con cuộc sống tốt đẹp nhất Con yêu và cảm ơn bố mẹ rất nhiều

Và để hoàn thành khóa luận này, lời đầu tiên em muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Lê Quang Huấn, TS Lã Thị Huyền đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Em xin bày tỏ lời cảm ơn đến quý Thầy, Cô giáo trong khoa Công nghệ sinh học - Viện Đại Học Mở Hà Nội đã giảng dạy, chỉ bảo tận tình em trong suốt bốn năm qua, những kiến thức mà em nhận được trên giảng đường đại học vừa là nền tảng cho quá trình nghiên cứu khóa luận và vừa là hành trang qúy báu giúp em vững bước trong tương lai

Em muốn gửi lời cảm ơn đến các anh chị phòng Công nghệ Tế bào động vật – Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hướng dẫn rất nhiệt tình và cho em những lời khuyên bổ ích về chuyên môn trong quá trình thực hiện đề tài

Nhân dịp này em muốn gửi lời cảm ơn đến người thân, bạn bè đã luôn bên em, giúp đỡ, động viên em trong suốt thời gian qua

Hà Nội, ngày… tháng… năm 2015

Sinh viên

Nguyễn Như Hoa

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC HÌNH vi

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về penicillin 3

1.1.1 Kháng sinh penicillin 3

1.1.2 Lịch sử phát hiện và sản xuất penicillin 3

1.1.3 Phân loại 5

1.1.4 Cấu trúc hóa học và một số tính chất của các penicillin 5

1.1.5 Cơ chế tác động của kháng sinh penicillin lên vi khuẩn 7

1.1.6 Kháng sinh trong chăn nuôi 8

1.1.6.1 Tác dụng của việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi 8

1.1.6.2 Tình hình sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi ở một số quốc gia 8

1.1.7 Dư lượng kháng sinh trong các mẫu thực phẩm và một số phương pháp xác định dư lượng kháng sinh 9

1.1.7.1 Dư lượng kháng sinh trong các mẫu thực phẩm 10

1.1.7.2 Quy định về tồn dư kháng sinh nhóm β-Lactam trong thực phẩm 10

1.1.7.3 Một số phương pháp xác định dư lượng kháng sinh 11

1.2 Tổng quan về aptamer 13

1.2.1 Khái niệm 13

1.2.2 Đặc trưng của aptamer 13

1.2.3 Ưu điểm của aptamer so với kháng thể 14

1.2.4 Phương pháp thu nhận aptamer – phương pháp SELEX 14

1.2.5 Tình hình nghiên cứu aptamer trong và ngoài nước 17

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Vật liệu 18

2.1.1 Sinh phẩm 18

2.1.2 Hóa chất 18

2.1.3 Trang thiết bị 19

2.2 Phương pháp nghiên cứu 20

2.2.1 Chuẩn bị thư viện 20

2.2.1.1 PCR làm giàu thư viện 20

2.2.1.2 Cắt DNA sợi đôi thành sợi đơn 21

2.2.2 Phương pháp SELEX sàng lọc aptamer đặc hiệu penicillin 22

2.2.3 Phương pháp tách dòng và giải trình tự 24

2.2.3.1 Nhân bản aptamer liên kết với penicillin bằng kỹ thuật PCR 24

2.2.3.2 Phân tích điện di trên gel agarose 26

2.2.3.3 Phương pháp tinh sạch sản phẩm phản ứng PCR 26

2.2.3.4 Phản ứng gắn gen vào vector tách dòng 27

2.2.3.5 Biến nạp plasmid vào E.coli chủng DH5α 28

2.2.3.6 Phương pháp tách DNA plasmid từ vi khuẩn E coli 29

2.2.3.7 Phương pháp xác định trình tự nucleotide 31

2.2.3.8 Phương pháp xác định ái lực gắn giữa aptamer với penicillin 31

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 33

3.1 Kết quả sàng lọc aptamer liên kết penicillin 33

3.1.1 Chuẩn bị thư viện 33 3.1.2 Kết quả sàng lọc aptamer liên kết penicillin 34 3.2 Kết quả tách dòng aptamer liên kết penicillin sau khi sàng lọc 39 3.3 Xác định ái lực liên kết của aptamer (các phân tử DNA sợi đơn) với penicillin 41 3.4 Xác định trình tự aptamer thu được 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

E.coli Vi khuẩn Escherichia coli

Taq polymerase Enzyme polymerase chịu nhiệt

X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indodyl-β-galactosidase

EtBr Ethidium bromide

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Cấu trúc chung của các penicillin 6

Hình 1.2: Các kháng sinh ức chế tổng hợp vách tế bào vi khuẩn 7

Hình 1.3:Một trong các dạng cấu trúc của aptamer 14

Hình 1.4: Quy trình phương pháp Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment (SELEX) 15

Hình 1.5: Sơ đồ các phân tử DNA sợi đơn trong thư viện aptamer 16

Hình 2.1: Sơ đồ cấu tạo vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen) 27

Hình 2.2 : Hình ảnh minh họa kỹ thuật ELISA trực tiếp 31

Hình 3.1: Kết quả phản ứng PCR làm giàu thư viện 33

Hình 3.2: Kết quả PCR với khuôn là ssDNA sau vòng sàng lọc thứ nhất 35

Hình 3.3: Kết quả PCR làm giàu sau vòng sàng lọc 3, 4 36

Hình 3.4: Kết quả PCR làm giàu sau vòng sàng lọc 6 37

Hình 3.5: Kết quả PCR làm giàu sau vòng sàng lọc 7 37

Hình 3.6: Kết quả PCR vòng sàng lọc loại trừ 38

Hình 3.7: Kết quả biến nạp vector pCR2.1 mang sản phẩm PCR vào tế bào 39

E coli chủng DH5α 39

Hình 3.8: Kết quả PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi ApF2/ApR2 40

Hình 3.9: Kết quả tách chiết DNA plasmid mang sản phẩm PCR 40

Hình 3.10: Kết quả ELISA giữa aptamer đặc hiệu kháng sinh penicillin 42

Hình 3.11: Biểu đồ thể hiện khả năng gắn kết của các aptamer đặc hiệu penicillin 43

Hình 3.12: Kết quả xác định trình tự nucleotide của dòng chứa aptamer số 1 44

Hình 3.13: Kết quả xác định trình tự nucleotide của dòng chứa aptamer số 2 44

Hình 3.14: Cấu trúc không gian của aptamer (dòng số 1) có khả năng gắn kết với penicillin 45

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Dư lượng tối đa kháng sinh nhóm β-Lactam trong thực phẩm 10

Bảng 2.1: Thành phần phản ứng PCR làm giàu thư viện 20

Bảng 2.2: Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR làm giàu thư viện 21

Bảng 2.3: Thành phần phản ứng tạo sợi đơn ADN 21

Bảng 2.4: Thành phần phản ứng PCR khuếch đại các trình tự gắn 25

Bảng 2.5: Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại các trình tự gắn 25

Bảng 2.6: Thành phần phản ứng gắn đoạn gen vào vector pCR2.1 28

Bảng 3.1: Kết quả đo nồng độ ssDNA sau vòng sàng lọc 1 35

Bảng 3.2: Nồng độ ssDNA của các mẫu aptamer sau khi PCR với cặp mồi lệch 41

Bảng 3.3: Kết quả ELISA giữa aptamer đặc hiệu kháng sinh penicillin với BSA-penicillin 43

MỞ ĐẦU

Ngày nay khi xã hội phát triển càng cao thì nhu cầu đời sống con người cũng cao hơn, trong đó “chất lượng và an toàn”chiếm một vị trí rất quan trọng Tuy nhiên, trong lĩnh vực chăn nuôi gia súc, gia cầmhiện nay việc hướng dẫn và quản lý sử dụng thuốc kháng sinh còn lỏng lẻo do đó tình trạng sử dụng các chất kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi khá tùy tiện Từ đó đã để lại tồn dư các kháng sinh trong sản phẩm thực phẩm ( thịt, cá, trứng, sữa,…) gây nguy hại nghiêm trọng đến sức khỏe người tiêu dùng

và uy tín hàng xuất khẩu của nước ta

Kháng sinh penicillin là “thần dược” thế hệ đầu tiên có tính kháng khuẩn rất mạnh đối với nhiều loại vi khuẩn Penicillin đóng một vai trò hết sức quan trọng trong việc chống lại nhiều bệnh tật cho con người và các loài động vật Bên cạnh đó, nó được xem là “vũ khí mạnh mẽ” đối với các nhà chăn nuôi trong việc kích thích tăng trưởng động vật, nâng cao năng suất Vì mục đích lợi nhuận mà sức khỏe của người tiêu dùng

bị nguy hại do không may sử dụng những sản phẩm thực phẩm có tồn dư kháng sinh Theo các báo cáo về y tế, penicillin là kháng sinh thường gây dị ứng nhất Đã có trường hợp người bị nổi mần da trầm trọng vì uống sữa có dư lượng penicillin (<1 IU/ngày tương đương 0.003 IU/ml)

Việc xác định nhanh hàm lượng kháng sinh tồn dư trong thực phẩm để từ đó con người biết cách phòng tránh là điều rất quan trọng đối với sức khỏe của chúng ta Trước đây có một số phương pháp xác định dư lượng kháng sinh trong thực phẩm như phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, sắc ký lỏng ghép khối Và gần đây có phương pháp phân tích dựa trên phản ứng giữa kháng nguyên – kháng thể Mỗi phương pháp

có những ưu, nhược điểm khác nhau Do đó, việc tìm ra phương pháp mới sao cho hiệu quả là điều cần thiết.Aptamer là các oligonucleotide (các acid ribonucleoic, RNA và các sợi đơn của acid deoxyribonucleoic, ssDNA) hoặc là các phân tử peptide có cấu hình không gian đặc trưng và có khả năng nhận biết và gắn kết với các phân tử đích tương đương kháng thể đơn dòng Aptamerđã trở thành lớp chất có nhiều tiềm năng và

hy vọng nhất để tạo KIT chẩn đoán và thuốc điều trị hướng đích, Với những ưu diểm

vượt trội, chúng tôi tiến hành nghiên cứu khả năng sử dụng aptamer đặc hiệu kháng sinh penicillin nhằm tạo KIT xác định nhanh kháng sinh này trong thực phẩm Tuy nhiên, trước tiên cần phải trải qua giai đoạn sàng lọc để thu được aptamer đặc hiệu kháng sinh penicillin Trong khuôn khổ khóa luận tốt nghiệp, chúng tôi tiến hành đề

tài: “Nghiên cứu sàng lọc và thu nhận aptamer đặc hiệu kháng sinh penicillin”

Mục tiêu đề tài: Xây dựng được phương pháp sàng lọc và sàng lọc được một đến hai aptamer có khả năng liên kết đặc hiệu với penicillin

Nội dung nghiên cứu:

- Sàng lọc aptamer đặc hiệu với penicillin từ thư viện

- Tách dòng và xác định trình tự các aptamer sau sàng lọc

- Nghiên cứu lựa chọn aptamer đặc hiệu với kháng sinh penicillin

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về penicillin

1.1.1 Kháng sinh penicillin

Penicillin là kháng sinh thế hệ đầu tiên có tính kháng khuẩn rất mạnh đối với

nhiều loại vi khuẩn Penicillin được chiết ra từ dịch nuôi cấy nấm Penicillium

chrysogenum Penicillin lần đầu tiên phát hiện có tác dụng chống vi khuẩn gram dương

Staphylococcus , Diplococcus…nhưng hầu như không có tác dụng chống vi khuẩn gram

âm và nấm men Vài thập niên trở lại đây đã phát hiện ra nhiều loại penicillin mới trong đó một số có hiệu quả chống lại vi khuẩn gram âm và nấm men như

Saccharomyces cerevisiae đơn bội và E.coli

Một số đặc điểm của penicillin: Ức chế sinh tổng hợp peptidoglycan ở vách tế bào vi khuẩn; tăng cường phân giải vách tế bào Vi khuẩn gram âm có vách tế bào chứa

ít peptidoglycan nên ít nhạy cảm với penicillin hơn so với vi khuẩn gram dương.Vi khuẩn gram âm có lớp phospholipid bao phủ bên ngoài làm penicillin khó thấm [23]

1.1.2 Lịch sử phát hiện và sản xuất penicillin

Penicillin được phát hiện tình cờ vào năm 1928 bởi Alexander Fleming, khi ông

nhận thấy một hộp petri nuôi Staphylococcus bị nhiễm nấm mốc Penicillium notatum

có xuất hiện hiện tượng vòng vi khuẩn bị tan xung quanh khuẩn lạc nấm(cụ thể là nấm xuất hiện trên đĩa và phát triển thành các tảng nấm; xung quanh tảng nấm, những mảng

vi khuẩn đã bị phá hủy) Ông kết luận rằng, nấm này đã tạo 1 chất giết chết các vi khuẩn Chất này giống enzyme là lysozym mà ông đã phát hiện ra vài năm trước Chất

này có thể giết vi khuẩn gây bệnh tên Staphylcooccus[24]

Ông đã sử dụng ngay tên giống nấm Penicillin để đặt tên cho chất có khả năng

tiêu diệt vi khuẩn này (1929) [24]

Mỹ đã triển khai lên men thành công penicillin theo phương pháp lên men bề mặt (1931) Tuy nhiên, cũng trong khoảng thời gian đó mọi nỗ lực nhằm tách và tinh chế

penicillin từ dịch lên men đều thất bại do không bảo vệ được hoạt tính kháng sinh của chế phẩm tinh chế và do đó vấn đề penicillin tạm thời bị lãng quên [24]

Năm 1938 ở Oxford, khi tìm lại các tài liệu khoa học đã được công bố, Ernst Boris Chain quan tâm đến phát minh của Fleming và ông đã đề nghị Howara Walter Florey cho tiếp tục triển khai nghiên cứu này Ngày 25/05/1940, penicillin đã được thử nghiệm rất thành công trên chuột [17]

Tuy nhiên, trước khi thử nghiệm trên người, các nhà khoa học phải tạo được penicillin nguyên chất Đây là vấn đề then chốt Công việc này giao cho Edward Abraham đảm nhiệm.Edward Abraham nghiên cứu tìm ra được kỹ thuật tách sau này gọi là sắc ký hấp phụ (adsorption chromatography) Dung dịch nuôi cấy nấm có chứa penicillin được đưa qua các ống chứa đầy các chất hấp phụ; chúng sẽ tách penicillin khỏi các tạp chất

Phòng thí nghiệm của Florey nhanh chóng chuyển thành một nhà máy nhỏ, các ống nghiệm chứa đầy penicillin được theo dõi tỉ mỉ Tuy nhiên, sản lượng của nhà máy vẫn còn thấp, 500 lít chất lỏng nuôi cấy chỉ sản xuất ra lượng penicillin đủ chữa cho 4 hoặc 5 người

Sau đó, công trình được chuyển sang Mỹ, lúc này, mục đích của các nhà khoa học

là chế tạo penicillin trên quy mô công nghiệp Nhiều kỹ thuật như dùng tia cực tím, tia

X và các chất hóa học tác động đến cấu trúc di truyền của nấm đều được sử dụng nhằm tạo ra chủng penicillin với sản lượng cao Năm 1943, dự án chế tạo penicillin đứng thứ nhì trong danh sách các công trình ưu tiên sau dự án Mahattan chế tạo bom nguyên tử Năm 1944, một ca chữa trị bằng penicillin tốn 200 đô-la, tuy nhiên, giá này nhanh

chóng giảm xuống, rẻ hơn cả giá đóng gói sản phẩm Năm 1945, Fleming, Chain và

Florey được trao tặng giải thưởng Nobel y họcvề công trình nghiên cứu penicillin [24] Ngày nay, người ta đã điều chế được hơn 100 kháng sinh penicillin sinh tổng hợp Tuy nhiên chỉ penicillin G và penicillin V là được sản xuất trong công nghiệp với tỷ lệ 80% và 20% Năm 1975 sản lượng penicillin khoảng 35.000 tấn, trong đó 38% được

dùng để chữa bệnh dưới dạng penicillin V và penicillin G, 12% dùng trong thú y và 43% được sử dụng để điều chế các kháng sinh penicillin bán tổng hợp, và trên 20 penicillin bán tổng hợp đã được sản xuất lớn Năm 2012 tổng sản lượng penicillin của thế giới là khảng 300.000 tấn/năm [18]

1.1.3 Phân loại

Phân nhóm penicillin thuộc nhóm β-lactam Dựa vào nguồn gốc có thể sắp xếp các penicillin thành 3 nhóm:

Penicillin nhóm I:

• Gồm các penicillin tự nhiên, được chiết suất từ môi trường nuôi cấy nấm

Penicillinum notatum hoặc Penicillinum chrysogenumnhư Penicillin G,

Penicillin V, không kháng được penicilinase

• Các penicillin tự nhiên được hấp thu nhanh và thải trừ nhanh ra khỏi cơ thể cho nên thời gian tác dụng ngắn

1.1.4 Cấu trúc hóa học và một số tính chất của các penicillin

Theo cấu trúc hóa học, các chất kháng sinh penicillin được phân loại vào nhóm lactam

β-Cấu tạo: Khung cơ bản của các penicillin là 6-APA (6-aminopenixilanic axit), có

nhân thiazolidine và vòng β-lactam [18] Các penicillin có công thức chung:

R-C9H11N2O4S

Hình 1.1: Cấu trúc chung của các penicillin

Trong số các penicillin kể trên, penicillin G là kháng sinh tiêu biểu nhất trong nhóm β-lactam

Tính chất:

• Vòng β-lactam là yếu tố quyết định hoạt tính của các kháng sinh penicillin

• Do có nhóm carboxyl (-COOH) nên các kháng sinhnhóm β-lactam này có tính acid Khi thay thế -H của nhóm carboxyl bằng kim loại kiềm thì được các penicillin dễ tan trong nước và tạo muối ít tan với các amin

• Penicillin là bột màu trắng, không mùi, vị đắng, tan nhiều trong nước, rất hút nước Các penicillin đều có vòng beta-lactamin không bền vững dễ bị phân hủy khi gặp ẩm và môi trường kiềm, acid (pH tối ưu từ 6-6,5); các tác nhân oxy hóa, khử (KMnO4) Sự hư hỏng cũng gia tăng theo nhiệt

độ.Các hóa chất có kim loại nặng cũng làm mất tác dụng của penicillin

(thuốc đỏ)[27] Vi khuẩn ở trực tràng có khả năng tiết penicilinase

1.1.5 Cơ chế tác động của kháng sinh penicillin lên vi khuẩn

Hình 1.2:Các kháng sinh ức chế tổng hợp vách tế bào vi khuẩn

Penicillin tấn công vào việc tạo thành tế bào của vi khuẩn Điểm tác dụng chính

là hệ thống enzyme xúc tác tạo mạng của các peptidoglycan:

peptidoglycan-transpeptidase và D-alanin-carboxy-peptidase

Từ hình1.2 có thể thấy các penicillin nhóm β-lactam ức chế quá trình tổng hợp

vách của vi khuẩn Các penicillin gắn với transpeptidase (transpeptidase là

enzyme-đích được mọi β-lactam ưa chuộng, nên còn gọi là PBP: Penicillin Binding Protein), enzyme xúc tác cho sự nối peptidoglycan để tạo vách vi khuẩn Vách vi khuẩn là bộ

phận rất quan trọng để đảm bảo sự tồn tại và phát triển Thành phần đảm bảo cho tính bền vững cơ học của vách là mạng lưới peptidoglycan, gồm các chuỗi glycan nối chéo với nhau bằng chuỗi peptid Khoảng 30 enzymecủa vi khuẩn tham gia tổng hợp

peptidoglycan, trong đó có transpeptidase (hay PBP) Các penicillin tạo phức bền với

transpeptidase, ức chế tạo vách vi khuẩn, làm ly giải hoặc biến dạng vi khuẩn Vách vi khuẩn Gram (+) có mạng lưới peptidoglycan dầy từ 50-100 phân tử, lại ở ngay bề mặt

tế bào nên dễ bị tấn công Còn vi khuẩn Gram (-) vách chỉ dày 1-2 phân tử nhưng lại được che phủ ở lớp ngoài cùng một vỏ bọc lipopolysaccharid như một hàng rào không thấm kháng sinh, muốn có tác dụng, kháng sinh phải khuếch tán được qua ống dẫn của màng ngoài như amoxicillin, một số cephalosporin [25]

1.1.6 Kháng sinh trong chăn nuôi

1.1.6.1 Tác dụng của việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi

Trong chăn nuôi hiện nay, vấn đề sử dụng thuốc kháng sinh là rất phổ biến Nó được sử dụng với 3 mục đích: điều trị bệnh, phòng bệnh và dùng như chất kích thích sinh trưởng đem lại những lợi ích sau [26]:

-Tăng năng suất sinh trưởng và sinh sản ở gia súc, gia cầm

-Tăng hiệu quả sử dụng thức ăn, làm cho vật nuôi thích ứng nhanh chóng với sự thay đổi bất thường về cơ cấu và chủng loại nguyên liệu trong khẩu phần ăn

-Nâng cao chất lượng sản phẩm (giảm tỷ lệ thịt mỡ, tăng tỷ lệ thịt nạc, làm cho thịt trở nên mềm hơn và không nhiễm mầm bệnh)

-Phòng các bệnh mạn tính và ngăn chặn xảy ra những dịch bệnh do vi trùng -Tăng hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi

1.1.6.2 Tình hình sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi ở một số quốc gia

• Trên thế giới:

Ở Mỹ hàng năm khoảng 6 triệu pao (xấp xỉ 2730 tấn) kháng sinh được dùng trong chăn nuôi Xấp xỉ 80% gia cầm, 70% lợn, 70% bò sữa và 60% bò thịt ở Mỹ được nuôi

dưỡng bằng thức ăn có bổ sung kháng sinh và cứ mỗi một USD chi phí cho kháng sinh dùng trong thức ăn, người chăn nuôi thu được lợi tức 2- 4 USD

Theo số liệu của viện Thú y Mỹ (AHI), lượng kháng sinh được sử dụng trong chăn nuôi ở Mỹ năm 1999 là khoảng 20,42 triệu pao (9270 tấn), trong đó kháng sinh nhóm Ionophore và arsen chiếm nhiều nhất (47,5%), tetracycline (15,67%), penicillin (4,26%) và các loại khác (32,57%) Trong số 20,42 triệu pao, có khoảng 2,8 triệu pao (13,7%) được dùng như chất kích thích sinh trưởng

Theo số liệu của Ghislain Follet, trong năm 1997 tổng lượng kháng sinh dùng trong nhân y và chăn nuôi ở các nước châu Âu là 10.500 tấn (quy theo mức 100% tinh khiết của các thành phần hoạt tính), trong đó 52% sử dụng trong nhân y, 33% trong điều trị thú y và 15% như chất bổ sung trong thức ăn chăn nuôi [26]

• Tại Việt Nam:

Theo điều tra của PGS.TS Lã Văn Kính (2007) về thực trạng sản xuất thức ăn chăn nuôi ở hai khu vực Hà Nội và TP Hồ Chí Minh với tổng số 20 nhà máy Kết quả điều tra cho thấy 100% các nhà máy vẫn thường xuyên sử dụng kháng sinh làm chất kích thích sinh trưởng và phòng bệnh bổ sung vào thức ăn cho lợn, đặc biệt là lợn con

và lợn choai Tỷ lệ sử dụng kháng sinh trong thức ăn cao: 100% có oxytetracycline, 67% có cloramphenicol, 30% có olaqundox, 7% có dexamethasol [19]

Giám sát tình hình sử dụng kháng sinh tại 30 trại lợn thịt và 30 trại nuôi gà thịt trên địa bàn tỉnh Hưng Yên và Hà Tây cho thấy 60% mẫu lợn thịt và 70% mẫu gà thịt nhiễm tetracyclin hoặc tylosin [20] Một số mẫu vượt quá nồng độ cho phép Giám sát

ở 55 trang trại nuôi lợn thịt ở tỉnh Đồng Nai và Bình Dương cho thấy tình trạng nhiễm kháng sinh khá phổ biến: 52% nhiễm tylosin, 41% nhiễm tetracycline, 7% nhiễm oxytetracycline và 2% nhiễm chlotetracyclin Một số mẫu cũng vượt quá ngưỡng giới hạn cho phép [20]

1.1.7 Dư lượng kháng sinh trong các mẫu thực phẩm và một số phương pháp xác

định dư lượng kháng sinh

1.1.7.1 Dư lượng kháng sinh trong các mẫu thực phẩm

Chúng ta không thể phủ nhận rằng: kháng sinh đã và đang đóng vai trò quan trọng trong chăn nuôi, không chỉ để đề phòng và trị bệnh mà còn được dùng ở liều thấp nhằm kích thích sinh trưởng [21] Nó đã đem lại lợi ích rất lớn cải thiện 4-16% tốc độ tăng trưởng và 2-7% hiệu suất lợi dụng thức ăn.Tuy nhiên, việc lạm dụng, sử dụng bất hợp pháp hoặc sử dụng sai nguyên tắc kháng sinh trong chăn nuôi đã gây hiện tượng kháng thuốc hoặc tồn dư thuốc trong sản phẩm thực phẩm, ảnh hưởng xấu đến sức khỏe cộng đồng cũng như hiệu quả điều trị bệnh [1] Việc sử dụng không đúng cách dẫn đến những hậu quả nghiêm trọng và một trong số những hậu quả đó là để lại tồn

dư các kháng sinh trong sản phẩm thực phẩm (thịt, cá, trứng, sữa…) gây nguy hại đến sức khỏe người tiêu dùng

1.1.7.2 Quy định về tồn dư kháng sinh nhóm β-Lactam trong thực phẩm

Ở Việt Nam, ngày 19/12/2007, Bộ Y Tế ban hành quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học và hóa học trong thực phẩm kèm Quyết định số 46/2007/QĐ-BYT, trong đó có giới hạn tối đa dư lượng kháng sinh nhóm β-Lactam (cụ thể ở đây là Benzylpenicillin/Procaine benzylpenicillin) trong thực phẩm như sau:

Bảng 1.1: Dư lượng tối đa kháng sinh nhóm β-Lactam trong thực phẩm

Thực phẩm

Thịt Gan Thận Sữa(µg/l) Thịt Gan Thận Thịt Gan Thận

Chú ý: Có dấu * nghĩa là chỉ áp dụng đối với procaine benzylpenicillin

MRL (Maximum Residue Level): Giới hạn dư lượng tối đa

Quy định ADI: 0-30 µg penicillin/kg thể trọng/ngày Dư lượng của benzylpenicillin và procaine benzylpenicillin phải thấp hơn mức này ADI (Acceptable Daily Intake) là

lượng ăn vào hàng ngày chấp nhận được

1.1.7.3 Một số phương pháp xác định dư lượng kháng sinh

Việc phân tích nhóm kháng sinh trong các nền mẫu sinh học (có nguồn gốc từ động vật) trước đây đã được nhiều tác giả nghiên cứu, có thể kể đến như: Xác định định tính theo phương pháp vi sinh vật [18] [22], bán định lượng bằng phương pháp ELISA, định lượng bằng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử [31], phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [28] [29] [30] Trong những năm gần đây, kỹ thuật sắc ký khối phổ đang được nghiên cứu và áp dụng

Trong các mẫu thực phẩm, cụ thể là sữa có các phương pháp hóa học, vi sinh vật được sử dụng để phát hiện dư lượng kháng sinh Phương pháp hóa học gồm: phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-performance liquid chromatography, HPLC),sắc

ký lớp mỏng (thin – layer Chromatography, TLC), sắc ký khí lỏng (gas-liquid chromatography [11]

• Phương pháp vi sinh vật:

Ở nhiều quốc gia, các phương pháp phân tích bằng vi sinh vật được sử dụng phổ biến để xác định dư lượng kháng sinh vì tính đơn giản, tiện lợi của nó Có nhiều test vi sinh vật đã được nghiên cứu và ứng dụng để xác định kháng sinh trong nhiều loại sản phẩm như test bốn đĩa “Four Plate Test” [22], test ba đĩa “Three Plate”…[2]

• Phương pháp sắc ký lớp mỏng (thin – layer Chromatography,TLC):

Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách Pha tĩnh là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, được trải thành lớp mỏng đồng nhất

và được cố định trên các bản kính hoặc bản kim loại Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ quy định trong từng mục đích cụ thể Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được di

chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau Kết quả, ta thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng Các mẫu được áp dụng chủ yếu là dược phẩm

và một số loại thực phẩm như sữa, mật ong, thịt, cá…Phương pháp này chủ yếu có vai trò định tính, thử tinh khiết và đôi khi để bán định lượng hoạt chất của thuốc, khó xác định được chính xác hàm lượng kháng sinh tồn dư trong mẫu

• Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-Performance Liquid

Chromatography, HPLC):

Là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ Qúa trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay sàng lọc theo kích cỡ Phạm vi ứng dụng của HPLC rất rộng, như phân tích các hợp chất protein, axit nucleic, sắc tố thực vật, chất màu, dược phẩm, chất kháng sinh, chất an thần, …

So với sắc ký lỏng cổ điển, ưu điểm của hệ thống HPLC là thời gian chạy nhanh, độ tách tốt, độ nhạy caonhưng nhược điểm là đắt tiền nên khó áp dụng trên quy mô lớn

• Phương pháp dựa trên phản ứng giữa kháng nguyên - kháng thể

(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay):

Là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm Hiện nay, ELISA được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như

y học, nông nghiệp và đặc biệt là trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lượng các sản phẩm sinh học

Phương pháp này có lợi thế hơn các phương pháp sắc ký do thời gian thực hiện nhanh hơn và rẻ hơn Tuy nhiên, chúng chỉ có thể xác định sự có mặt hay không có mặt cũng như lượng kháng sinh có trong mẫu nghiên cứu mà không thể phân tích từng loại kháng sinh được

1.2 Tổng quan về aptamer

1.2.1 Khái niệm

Aptamer là các oligonucletide (ssDNA, RNA)hoặc là các phân tử peptide có cấu hình không gian đặc trưng và có khả năng gắn kết với các phân tử đích tương đương kháng thể đơn dòng Aptamer được sàng lọc từ nguồn các oligonucleotide với trình tự

ngẫu nhiên theo quy trình sàng lọc và làm giàuin vitro, gọi là quy trình SELEX –

Systematic Evolution of Ligans by Exponential enrichment do Ellingtone,Tuerk đề xuất[3] [4].Các aptamer được xác nhận như một lớp chất thay thế kháng thể đơn dòng bởi các lớp chất có nhiều ưu điểm vượt trội so với kháng thể, như tính ổn định, có khả

năng tạo ra trong điều kiện invitro, không cần tới động vật thí nghiệm, có thể biến tính

và hồi tính thuận nghịch, có thể biến đổi hóa học mà không ảnh hưởng tới hoạt tính gắn kết với phân tử đích Aptamer có thể nhận biết một khoảng rộng từ các ion, các phân

tử, các chất, các độc tố, cho tới các tế bào với tính đặc hiệu và ái lực cao Có thể nói aptamer đã trở thành lớp chất có nhiều tiềm năng và hy vọng nhất để tạo KIT chẩn đoán và thuốc điều trị hướng đích…

1.2.2 Đặc trưng của aptamer

Chiều dài của aptamer thường ngắn hơn 150 bazơ (nucleotide).Aptamer có khả năng hình thành cấu trúc không gian ba chiều bền vững trong dung dịch Vì các oligonucleotide sợi đơn theo cùng nguyên tắc bổ trợ như các phân tử sợi kép Do vậy khá đơn giản để có thể dự đoán cấu trúc bậc hai trên cơ sở tính toán mô hình dựa vào cấu trúc bậc nhất với năng lượng tự do thấp nhất

Hình 1.3: Một trong các dạng cấu trúc của aptamer 1.2.3 Ưu điểm của aptamer so với kháng thể

 Độ tinh khiết của aptamer cao hơn được tổng hợp và tinh sạch trong khi đó sản xuất kháng thể phải sử dụng các hệ thống sinh học, các cơ thể sống và quá trình tinh sạch khó khăn hơn

 Giá thành sản xuất aptamer thấp hơn, thời gian sàng lọc ngắn hơn so với việc sản xuất các kháng thể

 Phổ đích của aptamer rất rộng so với kháng thể từ những phân tử nhỏ như ion kim loại Na+, Zn2+… đến những đại phân tử, thậm chí tế bào [5] [6]

 Aptamer nhân tạo ổn định hơn trong hầu hết các điều kiện môi trường so với kháng thể

 Aptamer có hạn sử dụng dài hơn và có thể biến tính thuận nghịch mà không mất đặc tính so với kháng thể

 Aptamer có khả năng cải biến hóa học linh hoạt để ứng dụng vào nhiều chức năng, mục đích sử dụng khác nhau

1.2.4 Phương pháp thu nhận aptamer – phương pháp SELEX

Khái niệm:

Phương pháp SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential

Enrichement) là phương pháp sử dụng một nhóm các kỹ thuật sinh học phân tử để tổng

hợp in vitro oligonucleotide có khả năng liên kết với phân tử đích [7] Trong quá trình

sàng lọc aptamer theo một quy trình SELEX gồm nhiều vòng sàng lọc với 3 quá trình:

chọn lọc những trình tự oligonucleotide (aptamer) gắn với phân tử đích từ thưviện

oligonucletide ngẫu nhiên, thu nhận và khuếch đại những aptamer có khả năng liên kết đặc hiệu với phân tử đích [3] [7]

Hình 1.4: Quy trình phương pháp Systematic Evolution of Ligands by Exponential

Enrichment (SELEX)

Thư viện oligonucleotideDNA ngẫu nhiên:

Quy trình SELEX sàng lọc aptamer bắt đầu từ một thư viện oligonucleotide DNA ngẫu nhiên [3] [7]

Vùng cố địnhVùng ngẫu nhiên Vùng cố định

Hình 1.5:Sơ đồ các phân tử DNA sợi đơn trong thư viện aptamer

Thư viện này gồm ssDNA có độ đa dạng cao (khoảng 1015 phân tử) Mỗi ssDNA

có một vùng trung tâm là các trình tự ngẫu nhiên có n nucleotit từ 20 - 80 nucleotit được gắn với hai đầu là những trình tự cố định (vùng cố định này là vị trí gắn mồi cho phản ứng PCR) khoảng 18 – 21 nucleotit.Trong các thí nghiệm đã được tiến hành vềaptamer, sử dụng phương pháp SELEX chọn lọctrong thư viện ban đầu thường có

109 đến 1014, 1015 phân tử [8]

Quá trình sàng lọc:

Đầu tiên, thư việnđược ủ với những phân tử đích trong đệm, nhiệt độ phù hợp Sau đó,sử dụng các kỹ thuật khác nhau để tách các phức hợp aptamer – đích ra khỏi những phân tử không gắn đặc hiệu Sử dụng màng nitrocellulose là phương pháp phổ biến để tách những phân tử protein Bên cạnh đó, một số phương pháp như cố định các phân tử đích vào một phức hệ đặc biệt như sepharose[13], agarose [14] hay hạt từ tính [15] cũng là những phương pháp được sử dụng cho giai đoạn tách Những trình tự gắn đặc hiệu đã thu được sau giai đoạn phân tách được giải hấp và khuếch đại để cung cấp thư viện cho vòng sàng lọc sau[15] Quá trình chọn lọc và khuếch đại này được lặp lại cho đến khi sàng lọc được aptamer có ái lực cao nhất với phân tử đích Phân tửaptamer được lựa chọn sẽ được chuyển sang quá trình tách dòng và giải trình tự [3] [7] [8]

1.2.5 Tình hình nghiên cứu aptamer trong và ngoài nước

Với những ưu việt vượt trột của mình, aptamer đã và đang trở thành nhóm chất có nhiều tiềm năng, hy vọng trong nhiều lĩnh vực: vận chuyển các phân tử, chẩn đoán các mối nguy, tạo cảm biến sinh học, điều trị ung thư, y dược, thuốc phân tử, điều trị lâm sàng, thực phẩm, …

 Trong lĩnh vực chế tạo cảm biến sinh học: aptamer được sử dụng để phát hiện kháng sinh tồn dư trong thực phẩm như streptomycin, tetracyclin, penicillin, neomycin Aptamer cũng được sử dụng để phát hiện độc tố nấm

ở nồng độ nano gram: mycotoxin[11], ochratoxin A (OTA), fumonsin B1 (FB1), nephrotoxin[11] [12]

 Ở Việt Nam hiện nay, aptamer là lĩnh vực nghiên cứu mới và đã có một số nghiên cứu, ứng dụng: Nghiên cứu tổng hợp các aptamer ức chế protease HIV của Đại học Khoa học Tự nhiên Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội cũng đang tiến hành các nghiên cứu ứng dụng aptamer và vật liệu nano trong: phát hiện tồn dư của thuốc bảo vệ thực vật, chất bảo quản, các ion kim loại nặng…trong sản phẩm nông nghiệp và môi trường Phòng công nghệ tế bào động vật_Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đang tiến hành đề tài nghiên cứu sản xuất chế tạo và sử dụng bộ KIT phát hiện kháng sinh trong sữa bằng kỹ thuật nano (sử dụng aptamer).Phòng đã có bài báo về aptamer được đăng trên Tạp chí

Y học Việt Nam: “Sử dụng quy trình Selex sàng lọc aptamer nhận biết đặc

hiệu vi khuẩn Escherichia Coli O157:H7”

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1 Sinh phẩm

- Thư viện ADN sợi đơn với 1015 phân tử có trình tự tự 5’ – ATC CGT CAC ACC TGC TCT CAT ATG – N40 – AAG CTT TGG TGT TGG CTT CCG TAT – 3’ nhận từ phòng Công nghệ Tế bào Động vật

- Kháng sinh penicillin được gắn với agarose có kí hiệu Penicillin – Agarose 6B

- Vector tách dòng pCR2.1-TOPO (Invitrogen) và dòng tế bào vi khuẩn E.coli

chủng DH5α phục vụ cho việc tách dòng đoạn gen đích

- Cặp mồi dùng để nhân bản đoạn gen:

ApF2: 5’ – ATC CGT CAC ACC TGC TCT CAT ATG – 3’ Tm = 52oC

ApR2: 5’ – ATA CGG GAG CCA ACA CCA AAG CTTC – 3’ Tm = 54oC

- Mồi cải biến:

ApF2B: 5’ – Biotin – ATC CGT CAC ACC TGC TCT CAT ATG – 3’

2.1.2 Hóa chất

- Khángsinh penicillin (Sigma), BSA – Bovine Serum Albumin (Sigma), sữa,

methanol, Tween 20%; Streptavidin – Peroxidase (Sigma), H2SO41N, ethanol, TMB (Tetramethyl benzidine),…

- Cao nấm men (Yeast extract), Tryptone, Agar, các chất kháng sinh Kanamycin

và Ampicilin, X-gal, IPTG, Chloroform, Isoamylalcohol, Agarose, DMSO, SDS, Etbr,

nước khử ion 2 lần, nước đã xử lý RNase và DNase,…

- Bộ Kit tinh sạch DNA từ gel agarose (QIAgen), Kit tách dòng TOPO – TA của

hãng Invitrogen, enzyme lamda exonuclease, đệm, MgCl2 ,Taq Polymerase (Promega,

Germany), dung dịch gốc của dNTPs (Hybaid, Germany)

* Môi trường nuôi cấy

- Môi trường LB lỏng: Cao nấm men 0,5%; Tryptone 1%; NaCl 0,5%

- Môi trường LB đặc: Môi trường LB lỏng có bổ sung 1.5% agar

- Môi trường LB đặc + ampicillin: Môi trường LB đặc bổ sung 50µg/ml ampicillin

Các môi trường trên được khử trùng ở 121oC, 1atm trong 30 phút, kháng sinh được bổ sung sau khi nhiệt độ giảm đến khoảng 50oC

* Các dung dịch

- Dung dịch I: Tris – HCl 50 mM, pH = 8,0; EDTA 10 mM, pH = 8,0; Glucose 50mM

- Dung dịch II: NaOH 0,2 M; SDS 1%

- Dung dịch III: Kali acetate 3 M; Axit acetic băng 11,5%

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Chuẩn bị thư viện

2.2.1.1 PCR làm giàu thư viện

Một thư viện DNA sợi đơn có trình tự 5’ – ATC CGT CAC ACC TGC TCT CAT

nghệ Tế bào Động vật được sử dụng làm nguyên liệu khởi đầu cho sàng lọc Để làm giàu lượng phân tử đưavào cho sàng lọc, thư viện được thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi ApF2/ApR2Ph có trình tự như sau:mồi ApF2: 5’ – ATC CGT CAC ACC TGC

CCA AAG CTTC – 3’.Phản ứng PCR được thực hiện với thành phần và chu kỳ như sau:

Bảng 2.1: Thành phần phản ứng PCR làm giàu thư viện Thành phần phản ứng Nồng độ Thể tích (µL)

Bảng 2.2: Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR làm giàu thư viện Nhiệt độ (°C) 94 94 55 72 72 8

Thời gian 3 phút 45 giây 45 giây 45 giây 8 phút ∞

Sau quá trình khuếch đại, chúng ta thu được một lượng lớn các DNAsợi đôi Tuy nhiên, chỉ có DNA dạng sợi đơn mới có thể cuộn gấp tạo cấu trúc không gian để ràng buộc kháng sinh penicillin Do đó, trước mỗi vòng sàng lọc, sản phẩm PCR cần được xử lý để tạo sợi đơn DNA Enzyme lamda exonucleaza là một công cụ hữu hiệu được sử dụng cho quá trình này

2.2.1.2 Cắt DNA sợi đôi thành sợi đơn

Sau khi trộn đều các thành phần trên, hỗn hợp được ủ 4h ở bể ổn nhiệt 37oC Tiếp đó,

sản phẩm cắt được đem ủ ở 75°C trong 10 phút để bất hoạt hoàn toàn enzyme lamda

exonuclease

25 chu kỳ