Nghiên cứu khả năng phân hủy dầu DIESEL của màng sinh học do chủng vi khuẩn tạo thành được phân lập từ mẫu đấu và mẫu nước ô nhiễm dầu tại tỉnh quảng ngãi

Đánh giá khả năng phân hủy dầu diesel của màng sinh học do chủng vi khuẩn tạo thành .... Nghiên cứu được một số đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn sử dụng dầu diesel và tạo màng tốt nh

Viện đại học mở hà nội KHOA công nghệ sinh học

Người hướng dẫn : ths Cung thị ngọc mai

sinh viên thực hiện : đinh trần thu phương

Viện đại học mở hà nội KHOA công nghệ sinh học

Người hướng dẫn : ths Cung thị ngọc mai

sinh viên thực hiện : đinh trần thu phương

Lời cảm ơn!

Trước hết, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới ThS Cung Thị

Ngọc Mai, TS Lê Thị Nhi Công cán bộ phòng Công nghệ sinh học Môi trường, Viện

Hàn Lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn và chỉ dạy trong suốt thời gian tôi thực hiện khóa luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn tới Phụ trách Phòng CNSH môi trường là TS Đỗ Thị

Tố Uyên cùng toàn thể cán bộ nhân viên Phòng Công nghệ sinh học Môi trường, đặc

biệt là ThS Vũ Thị Thanh đã giúp đỡ, chỉ bảo tận tình trong suốt quá trình tôi học tập

nghiên cứu hoàn thành khóa luận của mình

Bên cạnh đó, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô Khoa công nghệ Sinh học, Viện Đại Học Mở Hà Nội cùng với Lãnh đạo viện Công nghệ sinh học, Viên Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu tại trường cũng như tại viện

Cuối cùng, tôi xin gửi gửi lời cảm ơn sâu sắc đến những người thân trong gia đình, ban bè đã luôn bên cạnh ủng hộ và giúp đỡ tôi rất nhiều cả về vật chất và tinh thần để tôi có thể hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này

Một lần nữa xin chân thành cảm ơn!

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ……… 1

PHẦN 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tình trạng ô nhiễm dầu và hậu quả tác động của nó 3

1.1.1 Tình trạng ô nhiễm dầu trên thế giới và ở Việt Nam 3

1.1.2 Hậu quả của ô nhiễm dầu 4

1.2 Các phương pháp xử lý ô nhiễm dầu 5

1.2.1 Phương pháp cơ học 5

1.2.2 Phương pháp hóa học 5

1.2.3 Phương pháp sinh học 6

1.3 Vai trò của vi sinh vật trong xử lý nước ô nhiễm dầu 7

1.3.1 Vi sinh vật có khả năng phân hủy dầu 7

1.3.2 Cơ chế phân hủy dầu diesel của vi sinh vật 7

1.4 Giới thiệu chung về màng sinh học (biofilm) 12

1.4.1 Khái niệm màng sinh học (biofilm) 12

1.4.2 Sự hình thành, thành phần và cấu trúc của biofilm 12

1.4.3 Ứng dụng của màng sinh học 15

1.5 Ảnh hưởng của một số điều kiện hóa lý đến sự hình thành và phát triển của biofilm 17

1.5.1 Ảnh hưởng của pH 17

1.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 17

1.5.3 Ảnh hưởng của nguồn carbon 18

1.5.4 Ảnh hưởng của nguồn nitrogen 19

1.6 Các phương pháp phân loại vi sinh vật 20

1.6.1 Phân loại theo phương pháp truyền thống 21

1.6.2 Phân loại theo phương pháp sinh học phân tử 21

PHẦN 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Vật liệu 23

2.1.1 Nguyên liệu 23

2.1.3 Máy móc và thiết bị nghiên cứu 24

2.2 Phương pháp nghiên cứu 25

2.2.1 Làm giàu vi khuẩn và phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sử dụng dầu diesel ………… ……….………25

2.2.2 Khảo sát khả năng sử dụng dầu diesel của các chủng vi khuẩn 26

2.2.3 Đánh giá khả năng tạo màng sinh học (biofilm) của các chủng vi khuẩn phân lập được 27

2.2.4 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn 28

2.2.5 Phân loại, định tên vi khuẩn dựa vào xác định trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA và xây dựng cây phát sinh chủng loại 30

2.2.6 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện hóa lý đến sự hình thành màng sinh học của vi khuẩn 32

2.2.7 Đánh giá khả năng phân hủy dầu diesel của màng sinh học do chủng vi khuẩn tạo thành 33

PHẦN 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Làm giàu và phân lập tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng sử dụng dầu diesel 34

3.2 Khảo sát khả năng sử dụng dầu diesel của các chủng vi khuẩn phân lập được 36

3.3 Đánh giá khả năng tạo màng sinh học (biofilm) của các chủng vi khuẩn đã phân lập được 37

3.4 Nghiên cứu được một số đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn sử dụng dầu diesel và tạo màng tốt nhất từ các chủng vi khuẩn đã phân lập được 38

3.5 Định tên và xây dựng cây phát sinh chủng loại 39

3.5.1 Tách chiết DNA tổng số của chủng vi khuẩn QND10 39

3.5.2 Nhân đoạn gen mã hóa 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR 40

3.6 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện hóa lý đến sự hình thành màng sinh học của chủng Acinetobacter sp QND10 42

3.6.1 Ảnh hưởng của pH 42

3.6.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 43

3.6.3 Ảnh hưởng của nguồn carbon 45

3.7 Đánh giá khả năng sử dụng dầu diesel của màng sinh học do chủng

Acinetobacter sp QND10 tạo thành 47

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

PHỤ LỤC 58 

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Nguồn C được vi sinh vật sử dụng 18 Bảng 1.2 Nguồn N được vi sinh vật sử dụng 19 Bảng 2.1: Máy móc và thiết bị dung trong đề tài 24 Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn trên môi trường HKTS với mẫu làm giàu không và có bổ sung glucose 36

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1 Sự hoạt động của chất phân tán 6

Hình 1.2 Quá trình chuyển hóa alkane 9

Hình 1.3 Quá trình phân hủy Hydrocarbon và sinh trưởng của vi sinh vật hiều khí 10

Hình 1.4 Con đường phân hủy hiếu khí của n-alkane 11

Hình 1.5 Quá trình hình thành màng sinh học của vi sinh vật 13

Hình 1.3: Ảnh hiển vi điện tử phóng đại 21.850 lần, hiển thị cấu trúc không gian của một màng sinh học với mạng lưới ngoại bào xung quanh 15

Hình 3.1 Mẫu làm giàu trên môi trường khoáng Gost dịch có bổ sung 1% dầu DO 35

Hình 3.2: Khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn trên môi trường khoáng Gost dịch có bổ sung 1% dầu diesel 37

Hình 3.3: Khả năng bắt giữ tinh thể tím của màng sinh học của các chủng vi khuẩn 38

sau 48 giờ nuôi cấy 38

Hình 3.4: khả năng tạo màng của các chủng vi khuẩn 38

Hình 3.5: Hình thái khuẩn lạc (A) và hình thái tế bào (B) của chủng QND10 39

Hình 3.6: Điện di đồ DNA tổng số của chủng vi khuẩn QND10 39

Hình 3.7 Điện di đồ sản phẩm PCR nhân đoạn gen 16S rRNA của chủng QND10 40

Hình 3.8: Cây phát sinh chủng loại của chủng vi khuẩn QND10 41

Hình 3.9: Khả năng bắt giữ tím tinh thể của màng sinh học do chủng Acinetobacter sp QND10 tạo thành ở các pH khác nhau sau 48 giờ 42

Hình 3.10: Ảnh hưởng của pH đến khả năng tạo màng sinh học của chủng vi khuẩn Acinetobacter sp QND10 43

Hình 3.11: Khả năng bắt giữ tím tinh thể của màng sinh học do chủng Acinetobacter sp QND10 tạo thành ở các nhiệt độ khác nhau sau 48 giờ 44

Hình 3.12: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng tạo màng sinh học của chủng vi khuẩn Acinetobacter sp QND10 44

Hình 3.13: Khả năng bắt giữ tím tinh thể của màng sinh học do chủng Acinetobacter sp QND10 tạo thành ở các nguồn carbon khác nhau 45 Hình 3.14: Ảnh hưởng của nguồn carbon đến khả năng tạo màng sinh học của chủng

Hình 3.15: Khả năng bắt giữ tím tinh thể của màng sinh học do chủng Acinetobacter

sp QND10 tạo thành ở các nguồn nitor khác nhau 46 Hình 3.16: Ảnh hưởng của nguồn carbon đến khả năng tạo màng sinh học của chủng

vi khuẩn Acinetobacter sp QND10 47

Hình 3.17: Khả năng sinh trưởng tại các nồng độ dầu DO khác nhau của chủng vi

khuẩn Acinetobacter sp QND10 48 Hình 3.18: Khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn Acinetobacter sp QND10 tại các

nồng độ dầu DO khác nhau 48 Hình 3.19 Biểu đồ thể hiện hiệu suất phân hủy dầu diesel của màng sinh học chủng vi

khuẩn Acinetobacter sp.QND10 49 

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT

Kí hiệu Ý nghĩa

Bp : Base pair (cặp bazơ)

DNA : Deoxyribonucleic acid

DO : Diesel oil (dầu diesel)

MỞ ĐẦU

Dầu mỏ là một trong những nhiên liệu quan trọng nhất của xã hội dùng để sản xuất điện và cũng là nhiên liệu của tất cả các phương tiện giao thông cũng như nhiên liệu trong đời sống hàng ngày của con người Dầu mỏ đóng vai trò quan trọng hàng đầu trong nền kinh tế toàn cầu Nó tác động tới sự phát triển nền kinh tế của mọi quốc gia trên Thế giới và hầu như mọi ngành công nghiệp đều phụ thuộc rất lớn vào nguồn

tài nguyên quý giá này

Từ nguồn tính toán, trữ lượng dầu mỏ thế giới nằm trong khoảng từ 1.148 tỉ thùng đến 1.260 tỉ thùng Dự kiến nguồn năng lượng trên thế giới từ dầu mỏ có thể lên tới 80% vào giai đoạn 2016-2017 Nhưng sự “cung không đủ cầu” do các quốc gia có nguồn dầu mỏ là quá ít so với nhu cầu sử dụng của hàng trăm quốc gia trên thế giới

Do đó việc khai thác và vận chuyển dầu ngày càng được đẩy mạnh Cùng với sự phát triển của việc khai thác, chế biến và vận chuyển dầu, một trong những vấn đề đang được quan tâm hiện nay là tình trạng ô nhiễm môi trường của các chất thải (các hydrocarbon) có trong dầu Các hiện tượng tràn dầu, rò rỉ dầu gây tình trạng ô nhiễm nghiêm trọng cho môi trường như: hủy hoại hệ sinh thái động thực vật, gây ảnh hưởng trục tiếp đến cuộc sống con người, v.v…

Phương pháp phân hủy sinh học sử dụng các tác nhân sinh học như vi sinh vật và các chất có hoạt tính sinh học do vi sinh vật sản sinh ra đã được sử dụng kết hợp cùng với các phương pháp vật lý, hóa học để xử lý nước nhiễm dầu và đã cho kết quả khả quan Gần đây, các nhà khoa học đã đưa ra phương pháp sử dụng màng sinh học (Biofilm) để xử lý các hợp chất hữu cơ khó phân hủy trong nước bị ô nhiễm dầu Màng sinh học là tập hợp các nhóm vi sinh vật trong đó các tế bào vi sinh vật được gắn chung vào trong chất nền polymer có thành phần chủ yếu là polysaccharide và protein do chúng tạo ra Chính đặc điểm này giúp các tế bào vi sinh vật chống chịu được với các điều kiện khắc nghiệt của môi trường như: sự suy giảm nguồn dinh dưỡng và các yếu tố vật lý môi trường thay đổi (sự thay đổi về pH, nhiệt độ, sự thẩm thấu hay sự mất nước của tế bào, v.v…) từ đó làm tăng hiệu suất phân hủy các hợp chất ô nhiễm khi xử lý ngoài hiện trường. 

Xuất phát từ thực tiễn đó, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu

khả năng phân hủy dầu diesel của màng sinh học do chủng vi khuẩn tạo thành được phân lập từ mẫu đất và mẫu nước ô nhiễm dầu tại tỉnh Quãng Ngãi”

Mục tiêu đề tài: Phân lập và tuyển chọn được chủng vi khuẩn có khả năng phân

hủy dầu diesel và có khả năng tạo màng tốt nhất từ các chủng vi khuẩn phân lập được tại các mẫu đất và mẫu nước ô nhiễm dầu thu thập được tại tỉnh Quảng Ngãi

Nội dung nghiên cứu:

- Làm giàu và phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sử dụng dầu diesel

- Khảo sát khả năng sử dụng dầu diesel của các chủng vi khuẩn phân lập được

- Đánh giá khả năng tạo màng sinh học (biofilm) của các chủng vi khuẩn phân lập được

- Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn sử dụng dầu diesel và tạo màng tốt nhất từ các chủng vi khuẩn đã phân lập được

- Định tên chủng vi khuẩn sử dụng dầu diesel và tạo màng tốt nhất từ các chủng vi khuẩn đã phân lập được dựa vào xác định trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA và xây dựng cây phát sinh chủng loại

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện hóa lý (pH, nhiệt độ, nguồn carbon, nguồn nitrogen) đến sự hình thành màng sinh học của chủng vi khuẩn sử dụng dầu diesel và tạo màng tốt nhất

- Đánh giá khả năng phân hủy dầu diesel của màng sinh học do chủng vi khuẩn sử dụng dầu diesel và tạo màng tốt nhất tạo thành tại điều kiện tối ưu

PHẦN 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình trạng ô nhiễm dầu và hậu quả tác động của nó

1.1.1 Tình trạng ô nhiễm dầu trên thế giới và ở Việt Nam

™ Trên thế giới

Theo báo cáo của Cơ quan Năng lượng Quốc tế (IEA), nhu cầu dầu mỏ toàn cầu

sẽ tăng nhanh trong năm 2015 [58] Do đó việc tìm kiếm, thăm dò và khai thác dầu mỏ tại các vùng biển trên thế giới hiện nay đang được tiến hành mạnh mẽ để cung cấp đủ nhu cầu sử dụng của chúng ta Việc sử dụng dầu mỏ làm nhiên liệu cho quá trình vận hành máy móc trong sản suất, việc xuất khẩu dầu mỏ đem lại năng suất hiệu quả kinh

tế và lợi nhuận rất lớn Tuy nhiên, việc khai thác, bảo quản, vận chuyển chúng vẫn còn chưa tốt dẫn tới các sự cố tràn dầu gây thiệt hại lớn không chỉ về mặt kinh tế mà còn tác động xấu đến môi trường Trên thế giới đã và đang xảy ra những vụ tràn dầu, rò rỉ dầu gây hậu quả nghiêm trọng như: Tai nạn dầu lớn nhất thế giới xảy ra vào năm

1979 Trong chiến tranh Iran – Irac (1981-1987) có 314 cuộc tấn công vào tàu chở dầu Đây là sự kiện tràn dầu lớn bắt đầu vào tháng 3/1983, khi Irac tấn công vào 5 tàu trở dầu tại bờ biển Nowrnz, làm thiệt hại 3 quy trình sản xuất dầu tại bờ biển Nowrnz,

đó là điều kiện tạo nên tràn dầu ở vùng Persian Gruff, ước tính khoảng 260.000 tấn dầu.Ngày 20/4/2010, giàn khoan Deepwater Horizon nằm cách bờ biển Louisiana của

Mỹ 50 dặm đã đột ngột phát nổ và chìm xuống biển, giết chết 11 công nhân và khiến cho hàng trăm triệu lít dầu thô tràn ra biển, trở thành sự cố tràn dầu lớn nhất từ trước tới nay Khoảng nửa triệu tấn khí, 80% trong đó là khí methane, đã rò rỉ ra biển sau vụ

nổ gây ra một thảm họa sinh thái nghiêm trọng cho khu vực rộng hơn 1.500 km2, ảnh hưởng tới việc kinh doanh của hàng loạt ngành kinh tế biển Vụ tràn dầu ở vịnh Bột Hải bắt đầu từ ngày 4/6/2011 tuy nhiên tới đầu tháng 7, sự việc này mới được thông báo rộng rãi Trung Quốc đã phải sống trong thảm họa tràn dầu lớn nhất lịch sử Hàng trăm nghìn tấn dầu tràn trên biển Hoàng Hải Một diện tích khoảng 840 đến hơn 4.000

km2 đã bị ô nhiễm nặng do dầu tràn

Những tác động của ô nhiễm dầu tới môi trường, kinh tế xã hội, sức khỏe con người, hệ sinh thái, v.v cho thấy việc cần phải nỗ lực hơn để tìm cách giải quyết là vấn đề của toàn cầu.

™ Ở Việt Nam

Việt Nam đang phải đối mặt với tình trạng ô nhiễm môi trường biển và ngày càng trở nên nghiêm trọng do hậu quả của sức ép dân số, sức ép tăng trưởng kinh tế, khả năng quản lý và sử dụng kém hiệu quả các nguồn tài nguyên biển Hội đồng nghiên cứu Quốc gia Hoa Kỳ (NRC) năm 2009 đưa ra con số uớc đoán rằng Việt Nam, hàng năm có khoảng 3,2 triệu tấn dầu làm ô nhiễm biển từ các nguồn khác nhau Các nguồn

ô nhiễm chính được ghi nhận là từ dầu, phụ gia và sự cố tràn dầu gây tổn thất không nhỏ về mặt kinh tế và hệ sinh thái Việt Nam Theo đánh giá của Viện Khoa học và Tài nguyên Môi trường biển-Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam: Từ năm 1989 đến nay, vùng biển Việt Nam có khoảng 100 vụ tràn dầu do tai nạn tàu, các vụ tai nạn này đều đổ ra biển từ vài chục đến hàng trăm tấn dầu [56] Trong 2 năm 2006 và 2007 tại ven biển các tỉnh miền Trung và miền Nam đã xảy ra một số sự cố tràn dầu không rõ nguồn gốc, nhất là từ tháng 1 năm 2007 đến tháng 6 năm 2007, có rất nhiều vệt dầu trôi dạt dọc bờ biển của 20 tỉnh từ đảo Bạch Long Vĩ xuống tới mũi Cà Mau Trong sự

cố này, các cơ quan chức năng đã thu gom được 1720,9 tấn dầu Tháng 6/2009, tàu Nhật Thuần đã chìm sâu xuống biển Vũng Tàu sau khi bùng cháy trong khoảng 2 giờ liền Theo Sở Tài nguyên Môi trường tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu, tại thời điểm xảy ra tai nạn, trong tàu Nhật Thuần có chứa khoảng 1.795m3 dầu cặn và chất thải lẫn dầu [4]

1.1.2 Hậu quả của ô nhiễm dầu

Sự cố tràn dầu gây ô nhiễm môi trường biển, ảnh hưởng nghiêm trọng đến các hệ sinh thái Đặc biệt là hệ sinh thái rừng ngập mặn, cỏ biển, vùng triều bãi cát, đầm phá

và các rạn san hô Ô nhiễm dầu làm giảm khả năng chống đỡ, tính linh hoạt và khả năng khôi phục của các hệ sinh thái Hàm lượng dầu trong nước tăng cao, các màng dầu làm giảm khả năng trao đổi oxy giữa không khí và nước, làm giảm oxy trong nước, làm cán cân điều hòa oxy trong hệ sinh thái bị đảo lộn

Ngoài ra, dầu chứa nhiều thành phần khác nhau, làm biến đổi, phá hủy cấu trúc tế bào sinh vật, có khi gây chết cả quần thể Dầu thấm vào cát, bùn ở ven biển có thể ảnh

hưởng trong một thời gian rất dài Đã có nhiều trường hợp các loài sinh vật chết hàng loạt do tác động của sự cố tràn dầu

Điều đáng báo động nữa là dầu lan trên biển và dạt vào bờ trong thời gian dài không được thu gom sẽ làm suy giảm lượng cá thể sinh vật, gây thiệt hại cho ngành khai thác và nuôi trồng thủy, hải sản Dầu gây ô nhiễm môi trường nước làm cá chết hàng loạt do thiếu oxy hòa tan Dầu bám vào đất, kè đá, các bờ đảo làm mất mỹ quan, gây mùi khó chịu đẫn đến doanh thu của ngành du lịch cũng bị thiệt hại nặng nề Nạn tràn dầu còn làm ảnh hưởng đến hoạt động của các cảng cá, cơ sở đóng mới và sửa chữa tàu biển Do dầu trôi nổi làm hỏng máy móc, thiết bị khai thác tài nguyên và vận chuyển đường thủy [57]

1.2 Các phương pháp xử lý ô nhiễm dầu

1.2.1 Phương pháp cơ học

Khi sự cố tràn dầu xảy ra, phương pháp cơ học được xem là biện pháp xử lý đầu tiên giúp ngăn chặn, khống chế và thu gom nhanh chóng lượng dầu tràn Một số biện pháp được sử dụng phổ biến như: dùng phao ngăn dầu chuyên dụng, dùng tre nứa kết thành phao ngăn nhằm quây gom, dồn dầu vào vị trí nhất định; thu gom bằng cách bơm, hút, vớt thủ công, chứa vào các phương tiện đơn giản, v.v

1.2.2 Phương pháp hóa học

Trong việc xử lý ô nhiễm dầu, phân hủy dầu là biện pháp bắt buộc khi không thể

tổ chức thu hồi bằng biện pháp cơ học Phương pháp được áp dụng là sử dụng các chất phân tán, các chất phá nhũ tương dầu-nước, chất keo tụ và hấp thụ dầu, v.v Ưu điểm

ở đây là xử lý nhanh tuy nhiên lại không xử lý được triệt để và gây ô nhiễm thứ cấp Việc sử dụng chất phân tán có thể gây tổn thất trên các hệ thực vật và động vật trên biển và ven bờ Do vậy chỉ nên sử dụng chất phân tán sau khi các phương phác xử lý khác không đạt hiệu quả cao

Trong sự cố tràn dầu, vì tỉ trọng của dầu nhỏ hơn nước, nền dầu sẽ nổi trên mặt nước Sự khuấy trộn tự nhiên của nước sẽ làm cho lượng dầu tràn phân tán xuống dưới Nhưng quy trình tự nhiên này mất một khoảng thời gian khá lâu để dầu hoàn toàn biến mất khỏi bề mặt nước Để cho phản ứng tự nhiên này được nhanh hơn người

ta thường sử dụng chất phân tán dầu Những chất tăng độ phân tán với thành phần

chính là những chất hoạt động bề mặt Nhưng chất hoạt động bề mặt là những hóa chất đặc biệt bao gồm hydrophilic (phần ưa nước) và olephilic (phần ưa dầu)

Hình 1.1 Sự hoạt động của chất phân tán [55]

Tác nhân phân tán hoạt động như một chất tẩy rửa những hóa chất này làm giảm bớt lực căng mặt phân cách giữa dầu và nước tạo ra những giọt dầu nhỏ tạo điều kiện

để diễn ra việc phân hủy sinh học và phân tán Một số chất phân tán đã được thương mại hóa trên thị trường như: Superdispersant-25 (công ty cổ phần Việt Nam APTES); Oil Slick Dispersant – 25 (Công ty cổ phần Công nghệ EMS Việt Nam), v.v…

1.2.3 Phương pháp sinh học

Phương pháp sinh học hiện nay là phương pháp xử lý dầu tràn có hiệu quả và an toàn cho môi trường nhất được sử dụng kế tiếp ngay sau các biện pháp ứng cứu nhanh Ứng dụng công nghệ sinh học là công nghệ sử dụng hệ thống sinh học mà chủ yếu là các vi sinh vật tự nhiên để khôi phục lại đất hoặc nước đã bị ô nhiễm bởi các chất độc hại đối với sức khỏe con người và môi trường sống Việc xử lý dầu tràn bằng ứng dụng công nghệ phân hủy sinh học đảm bảo an toàn cho môi trường hơn các công nghệ khác, đặc biệt trong điều kiện sinh thái đa hệ, việc áp dụng công nghệ phân hủy sinh học làm sạch dầu cũng như làm sạch các chất độc hại khác đạt hiệu quả cao cả về mặt công nghệ và về kinh tê

Các thành phần hóa học có trong dầu mỏ thường rất khó phân hủy Do đó, việc ứng dụng các quá trình sinh học để xử lý ô nhiễm dầu mỏ có đặc điểm rất đặc biệt Công nghệ sinh học được ứng dụng trong vấn đề dầu tràn là việc sử dụng các vi sinh vật (nấm men hay vi khuẩn) để thúc đẩy sự suy thoái của hydrocarbon dầu mỏ Đó là một quá trình tự nhiên do vi khuẩn phân hủy dầu thành các chất khác Các sản phẩm

có thể được tạo ra là CO2, nước và các hợp chất đơn giản mà không ảnh hưởng đến môi trường

1.3 Vai trò của vi sinh vật trong xử lý nước ô nhiễm dầu

1.3.1 Vi sinh vật có khả năng phân hủy dầu

Trong dầu mỏ chủ yếu là các hợp chất hydrocarbon nên dễ bị vi sinh vật phân hủy trong điều kiện hiếu khí và kị khí Có nhiều loại vi sinh vật có khả năng sử dụng hydrocarbon như nguồn carbon và năng lượng duy nhất [5, 8, 9] Trong tự nhiên các vi sinh vật phân hủy dầu và các sản phẩm từ dầu mỏ luôn tồn tại và phân bố rộng rãi trong hệ sinh thái khác nhau chiếm khoảng dưới 1% tổng số vi sinh vật dị dưỡng Tuy nhiên khi môi trường bị ô nhiễm dầu số lượng các nhóm vi sinh vật này đều tăng nhanh chóng và có thể lên tới 10% trong tổng số vi sinh vật dị dưỡng, thậm chí trong một số trường hợp đặc biệt có thể lên tới 90% [18] Các nhà khoa học đã tìm ra những

vi sinh vật có khả năng phân hủy dầu mỏ bao gồm:

- Vi khuẩn: Achromobbacter, Aeromonas, Arthrobacter, Bacillus, Brevebacterium,

Flavobacterium, Lactobacillus, Leucothrix, Moraxella, Pseudomonas,…

- Xạ khuẩn: Streptomyces sp., Actinomyces sp.,

- Nấm: Allescheria, Botrytis, Candida, Debaromyces, Fusarium, Hansenula,

Oidiodendrum, Penicillium, Rhodosporidium, Saccharomyces, Torulopsis, [6, 8, 51]

Mỗi loài vi sinh vật chỉ có thể phân hủy mạnh một hoặc một vài hydrocarbon khác nhau có trong thành phần của dầu mỏ Vì vậy, việc sử dụng tập hợp các vi sinh vật sẽ giúp cho quá trình phân hủy hydrocarbon xảy ra nhanh và triệt để hơn

1.3.2 Cơ chế phân hủy dầu diesel của vi sinh vật

Alkane là thành phần chủ yếu trong dầu thô (khoảng 50%) Chúng có thể được phân loại gồm: alkane mạch thẳng (n-alkane), mạch vòng (cyclo-alkane) và phân nhánh (iso-alkane) và được tìm thấy ở ba trạng thái: khí (C1-C4), lỏng (C5-C16) và rắn (C17) [36]

Để kích thích quá trình phân hủy của vi sinh vật người ta thường bổ sung vào môi trường một số loại vi sinh vật phù hợp hoặc cung cấp dinh dưỡng (nitrogen, phosphore…) cho vi sinh vật bản địa phát triển Vi khuẩn là nhóm vi sinh vật chính

tham gia phân hủy dầu mỏ Nhiều vi khuẩn đã được ghi nhận về khả năng sử dụng hydrocarbon như nguồn carbon và nitrogen, chẳng hạn như các chủng vi sinh vật thuộc

các chi: Arthrobacter, Acinetobacter, Candida., Pseudomonas, Rhodococcus,

Streptomyces, Bacillus, Acinetobacter, v.v… Ngoài ra, một số loài vi khuẩn có khả

năng phân hủy cao các hydrocarbon, vì thế gọi là vi khuẩn hydrocarbonoclastic Chúng đóng vai trò quan trọng trong việc loại bỏ hydrocarbon từ môi trường ô nhiễm [31,50] Vi khuẩn tham gia vào phân hủy hydrocarbon có trong dầu mỏ theo những con đường rất khác nhau Người ta phân chúng vào ba nhóm dựa trên cơ chế chuyển hóa dầu của chúng như sau:

™ Nhóm 1: Bao gồm những vi sinh vật phân giải các chất mạch hở như rượu, mạch thẳng, như aldehyde ceton, acid hữu cơ

™ Nhóm 2: Bao gồm những vi sinh vật phân hủy các chất hữu cơ có vòng thơm như benzen, phenol, toluen, xilen

™ Nhóm 3: bao gồm những vi sinh vật phân hủy hydratcarbon dãy polymetyl,

Schneiker và cộng sự (2006) đã tìm thấy một loại vi khuẩn biển Alcanivora

borkumensis có khả năng đồng hóa cả alkane thẳng và alkane phân nhánh, nhưng

không thể chuyển hóa các hydrocarbon thơm Alcanivorax dieselolei, proteobacterium cũng là một vi khuẩn hydrocarbonoclastic, nó không thể đồng hóa

g-đường hoặc acid amin như các nguồn năng lượng và carbon nhưng nó có thể sử dụng

một số acid hữu cơ và alkane Acinetobacter đã được tìm thấy là chi có khả năng sử

dụng n-alkane chiều dài chuỗi C10-C40 như một nguồn carbon duy nhất [45, 48] Hexadecan có trong thành phần béo của dầu thô và là một trong những thành phần chính của dầu diesel [24] Sự phân hủy hexadecan đã được quan sát bởi các loài

vi khuẩn, chẳng hạn như Pseudomonas putida, Rhodococcus erythropolis và Bacillus

thermoleovorans [15] và hai chủng vi khuẩn Flavobacterium sp ATCC 39723 và Arthrobacter sp [46] alkane không tan trong nước Khả năng hòa tan của alkane phụ

thuộc phần lớn vào trọng lượng phân tử Phân tử lượng càng lớn, độ hòa tan càng giảm [29] Các n- alkane có độ dài trung bình (C10-C24) dễ bị phân giải nhất Các ankan có mạch càng dài thì khả năng phân giải càng giảm.      

Hình 1.2 Quá trình chuyển hóa alkane (a)- Methane chuyển hóa thành methanol nhờ MMO; (b) – Butan chuyển hóa thành 1- butanol nhờ BMO; (c)- octan chuyển hóa thành 1-octanol; (d)- Octane chuyển hóa

thành 2-octanol; (e) Farnesol chuyển hóa thành 1-hydroxyfarnel

Các vi sinh vật phân giải được alkane là nhờ chúng tiết ra các enzyme xúc tác cho quá trình phân hủy alkane Ayala và Torres (2004) đã chỉ ra sự tham gia của 3 enzyme quan trọng trong sự phân giải alkane: Methane monooxygenase (MMO), hydroxylase alkan (Alk) và Cytochrome P450 monooxygenase [19]

Sự phân hủy hiếu khí alkane cần O2 như một chất bắt buộc trong quá trình hô hấp Quá trình oxy hóa của metan dẫn đến sự hình thành của methanol sau đó được chuyển thành formaldehyde và acid formic Hợp chất này có thể được chuyển đổi sang

CO2 hay đồng hóa cho sinh tổng hợp các hợp chất hữu cơ khác hoặc bằng các con đường monophosphate ribulose hoặc bằng con đường serine [38] Sự phân hủy hoàn toàn hydrocarbon chủ yếu xảy ra trong điều kiện hiếu khí (Hình 1.3) [44]

Hình 1.3 Quá trình phân hủy hydrocarbon và sinh trưởng của vi sinh vật hiếu khí Quá trình phân hủy hoàn toàn các hydrocarbon chủ yếu diễn ra trong điều kiện hiếu khí và bao gồm một số bước như mô tả ở hình 1.3 Đầu tiên các hydrocarbon tiếp xúc với vi khuẩn có khả năng phân hủy chúng Quá trình này bắt đầu từ hydrocarbon không tan trong nước và đòi hỏi có sự tham gia của chất hoạt động bề mặt sinh học được tạo ra bởi vi khuẩn giúp các vi sinh vật có thể tiếp xúc trực tiếp với chất ô nhiễm Tiếp đó, các hydrocarbon sẽ được hoạt hóa và kết hợp của O2 dưới sự xúc tác bởi oxygenase và peroxidase Sau đó các con đường chuyển đổi thành các hydrocarbon thông qua chu trình Krebs và việc sinh tổng hợp sinh khối tế bào từ các chất chuyển hóa trung tâm là acetyl-CoA, succinate và pyruvate, đường cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp và cho sự tăng trưởng của vi sinh vật đó

Sự phân hủy của n-alkane bắt đầu từ quá trình oxy hóa của một nhóm methyl tạo

ra một rượu bậc một sau đó bị oxy hóa thành aldehyde tương ứng, cuối cùng chuyển thành acid béo Acid béo liên kết với CoA và nhờ oxy hóa tại vị trí β tạo ra acetyl-CoA[49] Tuy nhiên, trong một số trường hợp, cả 2 đầu của phân tử alkane bị oxy hóa thông qua hydroxyl ở vị trí đầu và cuối của các nhóm methyl, làm cho một loại acid

o Cả 2 quá

ủy hiếu khí

(2): Tấn cô

boxylic nhờyển đổi th

y hóa này c

ne

trí carbon

tại vị trí βeton tươngste bị thủy

Acremonium spp oxy hóa ethanol bởi monooxygenase phụ thuộc NADPH, sau đó

được oxy hóa thành acetaldehyde và acid acetic Acetate được tạo thành đồng hóa thành carbon tế bào thông qua chu trình acid tricarboxylic ngược lại và bỏ qua glyoxalate Tương tự như vậy, một số propan và butan cũng có khả năng tăng trưởng

về alkane mạch dài, chẳng hạn như n-dodecane và n-hexadecan

1.4 Giới thiệu chung về màng sinh học (biofilm)

1.4.1 Khái niệm màng sinh học (biofilm)

Biofilm là một tập hợp các vi sinh vật bám trên bề mặt của vật thể rắn hoặc bề mặt chất lỏng tạo thành lớp màng bao phủ bề mặt đó Phần lớn các vi sinh vật sinh trưởng trên môi trường bán lỏng đều có khả năng tạo ra màng sinh học Trong màng sinh học,

hệ vi sinh vật có khả năng chống chịu các điều kiện khắc nghiệt của môi trường tốt hơn, hỗ trợ trao đổi chất tốt hơn và hạn chế sự cạnh tranh của các vi sinh vật khác [40]

™ Nhóm vi khuẩn tạo biofilm

Biofilm là cấu trúc thường gặp trong tự nhiên, trên 90% vi khuẩn sống trong màng sinh học như các váng trên mặt nước, cặn máy lọc, v.v Để có thể tồn tại trong điều kiện khó khăn (thiếu dinh dưỡng, thay đổi nhiệt độ, áp suất, v.v ) vi sinh vật bám lên

bề mặt, liên kết với các loài khác để sống cộng sinh và tự bảo vệ mình

Vi khuẩn bám vào bề mặt theo nhiều cách khác nhau Một số vi khuẩn tự bản thân

đã có tính kết dính nhờ lipopolysaccharides ngoại bào cộng với những đặc tính cấu trúc tế bào hỗ trợ cho việc di chuyển đến bề mặt là các phần phụ gốc protein như lông nhung hoặc lông roi Các vi khuẩn khác chỉ tổng hợp chất kết dính cần thiết khi có bề

mặt để chúng bám vào, điển hình như vi khuẩn gây viêm đường hô hấp Pseudomonas

aeruginosa gặp một mặt kính, trong vòng 15 phút, nó sẽ kích hoạt ngay một hệ gene

cần để tổng hợp polysaccharide, khi vi khuẩn đã bám vào bề mặt, chúng phân chia và liên tục sản xuất nhiều polysaccharide để tạo nên màng sinh học hoàn chỉnh [21]

1.4.2 Sự hình thành, thành phần và cấu trúc của biofilm

™ Sự hình thành màng sinh học

Hình 1.5 Quá trình hình thành màng sinh học của vi sinh vật Quá trình hình thành màng sinh học gồm 5 giai đoạn:

- Giai đoạn 1 và 2: Các tế bào vi sinh vật dạng tự do được gắn trên 1 bề mặt bất kỳ và liên kết với nhau thường được chia thành 2 giai đoạn là đảo ngược và không thể đảo ngược Khi chưa có sự hình thành cầu polymer giữa các chất nền và EPS bài tiết bởi các vi sinh vật Khi vi sinh vật sinh trưởng, phát triển và có sự hình thành cầu polymer giữa các chất nền và EPS bài tiết bởi các vi sinh vật sẽ tạo nên giai đoạn bám dính không thể đảo ngược được Ở giai đoạn này, chất nền được hình thành với số lượng lớn từ các đại phân tử trong chất lỏng hoặc các vật liệu phủ nhân tạo Sau đó, các vi sinh vật lơ lửng trong chất lỏng được vận chuyển đến bề mặt bằng cách khuếch tán đối lưu hoặc tự vận động và tạo đọ bám dính yếu với bề mặt rắn Các tế bào này sẽ có xu hướng chuyển sang một trạng thái ổn định hơn với bề mặt với các chất ngoại bào được tiết ra và bám dính trên đó Quá trình gắn các vi sinh vật đầu tiên bị ảnh hưởng rất nhiều bởi các thuộc tính bề mặt như độ nhám, chất mang và tỷ lệ vi sinh vật được vận chuyển đến bề mặt

- Giai đoạn 3: Các tế bào vi sinh vật bắt đầu phát triển, gắn chặt vào bề mặt chất mang

và liên kết với nhau tạo thành cụm tế bào

- Giai đoạn 4: Ở giai đoạn phát triển, các tế bào bắt đầu gắn chặt với chất mang đồng thời liên kết với nhau và tăng trưởng Giai đoạn này bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như việc vận chuyển, khuếch tấn các chất dinh dưỡng, lực cắt của dòng chảy, tốc độ tăng trưởng của vi sinh vật Sau giai đoạn này, sự hình thành màng sinh học cơ bản hoàn

tất sự tăng trưởng của vi sinh vật sống trong màng phụ thuộc rất nhiều vào sự sẵn có của chất dinh dưỡng Vì vậy nồng độ chất dinh dưỡng và sự khuếch tán của nó đóng một vai trò quan trọng trong sự hình thành màng sinh học

- Giai đoạn 5: Ở giai đoạn này lượng vi sinh vật trong màng rất lớn, màng sinh học sẽ đạt đến một độ dày nhất định, chất dinh dưỡng dần cạn kiệt, các tết bào vi sinh vật bắt đầu phát tán ra môi trường bên ngoài, gắn vào một vị trí khác của chất mang và lại tiếp tục hình thành một màng sinh học mới

™ Thành phần và cấu trúc của màng sinh học

Một màng sinh học trong tự nhiên gồm hai thành phần chính: thành phần tế bào (tập hợp các tế bào của một hay nhiều loài vi sinh vật khác nhau bám dính trên bề mặt nhất định) và mạng lưới các hợp chất ngoại bào (esxtracellular polymeric subtances – EPS) bao quanh các tế bào tạo nên cấu trúc đặc trưng cho màng sinh học Trong đó, khối lượng tế bào vi sinh vật chiếm 2-5% tổng khối lượng màng sinh học, 3-6% là EPS và ion, còn lại là nước [17] Một tế bào riêng lẻ có thể tạo ra vài thành phần ngoại bào khác nhau tùy thuộc vào điều kiện môi trường, đặc tính của từng loài vi khuẩn cũng như cách thức hình thành màng sinh học của chúng

™ Thành phần mạng lưới và các hợp chất ngoại bào (EPS)

Thành phần polymer ngoại bào rất đa dạng tùy loài vi sinh vật, dạng màng sinh học và điều kiện hình thành Nhưng về cơ bản đều bao gồm các polysacchrides chiếm khoảng 40-95%, protein là 1-60%, acid nucleic là 1-10%, 1-40% là lipid [27] Về cơ bản màng sinh học càng dày, thời gian tồn tại càng lâu thì hàm lượng EPS càng nhiều Mật độ tế bào tập trung cao nhất ở lớp đỉnh của màng sinh học và giảm dần theo độ sâu nhưng thành phần EPS lại phong phú hơn ở phía trong màng sinh học Thành phần EPS trong hầu hết các màng sinh học cũng khác biệt so với những vi khuẩn ở dạng sống tự do Những thành phần chính được xem xét trong một màng sinh học bao gồm polysaccharide, protein và DNA

trò quan trọng trong quá trình hình thành màng sinh học đặc biệt là giai đoạn đầu bởi

nó quy định đặc tính hình thành màng sinh học cho từng loài vi sinh vật, đảm nhiệm chức năng tiết các hợp chất ngoại bào cũng như có chứa các yếu tố phụ trợ tế bào như lông roi, lông nhung hỗ trợ cho việc bám dính của các tế bào khác lên bề mặt giá thể

™ Cấu trúc màng sinh học

Cấu trúc màng sinh học có tổ chức, đặc thù và phản ánh các chức năng nhất định của màng sinh học Trong màng sinh học có các kênh vận chuyển, qua đó cung cấp nước, các chất dinh dưỡng cho vi sinh vật tồn tại trong chúng và đem chất thải đi [47] Giữa các tế bào vi khuẩn diễn ra sự trao đổi thông tin liên lạc đảm bảo cho màng sinh học được hình thành một cách chính xác Màng sinh học có cấu trúc không đồng nhất, bao gồm nhiều lớp vi khuẩn hiếu khí bên trên và nhiều lớp vi khuẩn kỵ khí bên dưới

Do các luồng nước chảy qua khuấy động nên các vi khuẩn kỵ khí và hiếu khí song song tồn tại trong các hốc nhỏ phân bố khắp trong màng sinh học Chiều dày của màng sinh học thay đổi từ một vài μm thậm chí đến vài cm tùy thuộc vào loài vi sinh vật, tuổi màng sinh học, lượng dinh dưỡng và áp lực dòng chảy [23, 35]

Hình 1.3: Ảnh hiển vi điện tử phóng đại 21.850 lần, hiển thị cấu trúc không gian của

một màng sinh học với mạng lưới ngoại bào xung quanh [53]

1.4.3 Ứng dụng của màng sinh học

Thuật ngữ “biofilm” được biết đến từ năm 1978 và được mô tả đầu tiên bởi Costerton và cộng sự [26] Và tới nay nó đã được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực Có nhiều bể phản ứng sử dụng biofilm để xử lý lượng lớn thể tích nước thải ô nhiễm như bể phản ứng tầng sôi (BFD), bể xử lý kỵ khí (USB), bùn hạt kỵ

khí (EGSB) Gần đây, việc sử dụng kết hợp màng sinh học kỵ khí và hiếu khí xử lý nước ô nhiễm như bể lọc sinh học, bể tiếp xúc sinh học luân phiên, bể phản ứng sinh học ngập nước, bể phản ứng cố định tế bào [28]

Ở Việt Nam, những nghiên cứu về màng sinh học không chỉ ngăn ngừa tác hại của vi khuẩn mà còn ứng dụng chúng trong nhiều lĩnh vực, từ công nghiệp cho đến y

tế Bằng cách chọn lựa loại vi khuẩn đặc trưng, thay đổi tỷ lệ vi khuẩn, dung môi, v.v các nhà khoa học có thể tạo ra màng sinh học với đa dạng công dụng Công ty

Cổ phần Composite và Công nghệ Ánh Dương đã áp dụng công nghệ màng sinh học của vi sinh vật để xủ lý nguồn nước thải sinh hoạt, nước thải công nghiệp, nước thải bệnh viện, trong sản phẩm “bồn composite xử lý nước thải” [1]

Công ty Cổ phần Năng lượng và Môi trường NUSA Việt Nam đã phát triển và ứng dụng màng sinh học chế phẩm dạng hạt để xử lý nước thải sinh hoạt, biogas, v.v… trong công nghệ xử lý nước thải NUSA Septic – F với công suất xử lý 1-2

m3/ngày đêm [2]

Bên cạnh đó, các nhà sinh vật học làm việc tại Đại học Calgary và các kỹ sư tại Đại học Alberta, Canada đã sử dụng các màng sinh học để làm sạch các độc tố từ nguồn nước thải sau quá trình xử lý hỗn hợp tự nhiên của: cát, đất sét và các khoáng chất khác thành nguyên liệu cho các nhà máy lọc dầu để sản xuất ra xăng và dầu diesel [54]

Tại Việt Nam, nghiên cứu ứng dụng màng sinh học để xử lý nước ô nhiễm dầu vẫn còn nhiều hạn chế Nghiên cứu của nhóm tác giả Nguyễn Quang Huy tại trường

ĐH Khoa học Tự nhiên đã ứng dụng màng sinh học do chủng Bacillus licheniformis

A4.2 có khả năng chuyển hóa hoàn toàn lượng phosphore trong môi trường tương đương 6 mg/l sau 7 ngày nuôi cấy [13]

Ngoài ra, công nghệ màng lọc sinh học MBR đã được Công ty cổ phần phát triển Công nghệ mới Hà Nội ứng dụng trong xử lý nước cho cả nước cấp và xử lý nước thải

có hiệu quả cao trong việc loại bỏ các chất hữu cơ và vô cơ cũng như các vi sinh vật có hại trong nước thải [3]

Bên cạnh các ứng dụng để xử lý nước ô nhiễm, ứng dụng của màng sinh học trong lĩnh vực y học và thực phẩm đã đạt được một số thành quả nhất định Nghiên cứu khả

năng tạo màng sinh học ở nhiều loại môi trường khác thay cho môi trường nước dừa già truyền thống, do khoa Công nghệ Thực phẩm, Đại học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh thực hiện; sử dụng màng sinh học làm màng bao thực phẩm, bảo quản dừa tươi (2-4 tuần) và thịt tươi (2-3 ngày) do Đại học Bách khoa Tp.Hồ Chí Minh thực hiện v.v…

1.5 Ảnh hưởng của một số điều kiện hóa lý đến sự hình thành và phát triển của biofilm

1.5.1 Ảnh hưởng của pH

Tế bào vi khuẩn có các kênh proton (H+) liên kết với màng vì thế các proton vận chuyển từ màng sinh chất tạo nên 1 lực đẩy proton Dòng vận chuyển proton theo gradien điện thế, đáp ứng với lực vận chuyển proton để điều hòa pH trong bào tương Những đáp ứng vi khuẩn đếnthay đổi pH bên trong và bên ngoài tế bào thông qua sự điều chỉnh các hoạt động, tổng hợp các protein và liên quan đến nhiều quá trình tế bào

khác nhau trực tiếp là sản xuất các polymer ngoại bào [30]

1.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Chuyển hóa chất dinh dưỡng liên quan trực tiếp và phụ thuộc vào sự có mặt của các enzyme Vì vậy, có thể khẳng định rằng, sự hình thành của một biofilm phụ thuộc vào sự có mặt và tốc độ phản ứng của các enzyme mà kiểm soát sự phát triển của hệ thống sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn Nhiệt độ có tương quan với tốc độ phản ứng của các enzyme vì vậy nó ảnh hưởng đến sự phát triển của tế bào, từ đó tác động đến quá trình hình thành biofilm Ngoài ra nhiệt độ môi trường còn ảnh hưởng đến các đặc tính vật lý của các hợp chất bên trong và xung quanh tế bào [30] Theo Herald và

Zottola (1988) đã quan sát thấy sự biểu hiện của bề mặt vi khuẩn Listeria

monocytogenes phụ thuộc vào nhiệt độ như sau: các tế bào ở 35oC thể hiện có 1 lông roi, trong khi ở 21oC chủng có 2 hoặc 3 lông roi, ở 10oC các tế bào này có thể biểu hiện tới 1 vài lông roi Như vậy, tương tác ban đầu giữa vi khuẩn và bề mặt để hình thành biofilm tăng theo chiều giảm nhiệt độ do ở nhiệt độ thấp các polysaccharides có cấu trúc đồng nhất hơn [32]

1.5.3 Ảnh hưởng của nguồn carbon

Trong các nguồn dinh dưỡng thì carbon (C) là nguồn vật chất quan trọng trong quá trình sinh trưởng của vi sinh vật Trong tế bào nguồn C trải qua một loạt quá trình biến hoá hoá học phức tạp sẽ biến thành vật chất của bản thân tế bào và các sản phẩm trao đổi chất C có thể chiếm đến khoảng một nửa trọng lượng khô của tế bào Đồng thời hầu hết các nguồn C trong các quá trình phản ứng sinh hoá còn sinh ra trong tế bào nguồn năng lượng cần thiết cho hoạt động sống của vi sinh vật Một số vi sinh vật dùng CO2 làm nguồn C duy nhất hay chủ yếu để sinh trưởng, khi đó nguồn C không phải là nguồn sinh năng lượng

Vi sinh vật sử dụng một cách chọn lọc các nguồn C Đường nói chung là nguồn C

và nguồn năng lượng tốt cho vi sinh vật Nhưng tuỳ từng loại đường mà vi sinh vật có những khả năng sử dụng khác nhau Ví dụ trong môi trường chứa glucose và galactose

thì vi khuẩn Escherichia coli sử dụng trước glucose (gọi là nguồn C tốc hiệu) còn

galactose được sử dụng sau (gọi là nguồn C trì hiệu) Hiện nay trong các cơ sở lên men công nghiệp người ta sử dụng nguồn C chủ yếu là glucose, saccharose, tinh bột (bột ngô, bột khoai sắn, v.v ), cám gạo, các nguồn cellulose tự nhiên hay dịch thuỷ phân

cellulose

Năng lực đồng hoá các nguồn C ở các vi sinh vật khác nhau là không giống nhau

Có loài có khả năng sử dụng rộng rãi nhiều nguồn C khác nhau, nhưng có loài khả

năng này rất chọn lọc Chẳng hạn vi khuẩn Pseudomonas có thể đồng hoá được tới

trên 90 loại hợp chất C, nhưng các vi khuẩn thuộc nhóm dinh dưỡng methyl (methylotrophs) thì chỉ đồng hoá được các hợp chất 1C như methanol, methane, v.v Nguồn C chủ yếu được vi sinh vật sử dụng gồm có đường, acid hữu cơ, rượu, lipid, hydrocarbon, CO2, CO32-, v.v (Bảng 1.1)

Bảng 1.1 Nguồn C được vi sinh vật sử dụng

Đường Glucose, fructose, maltose, saccharose, tinh bột, galactose, lactose,

mannite, cellobiose, cellulose, hemicellulose, chitin

Acid hữu cơ Acid lactic, acid citric, acid fumaric, acid béo bậc cao, acid béo bậc

thấp, aminoacid

Nguồn C Các dạng hợp chất

Rượu Ethanol

Hydrocarbon Khí thiên nhiên, dầu thô, dầu paraffin

Carbonate NaHCO3, CaCO3, đá phấn

Các nguồn C

khác

Hợp chất nhóm thơm, cyanide, protein, pepton, acid nucleic

1.5.4 Ảnh hưởng của nguồn nitrogen

Trong các nguồn dinh dưỡng, bên cạnh nguồn carbon thì nitrogen (N) cũng là nguồn dinh dưỡng ảnh hưởng tới sự sinh trưởng, phát triển cũng như hình thành biofilm của vi sinh vật Nguồn N là nguồn cung cấp N cho vi sinh vật để tổng hợp nên các hợp chất chứa N trong tế bào Thường không là nguồn năng lượng, chỉ một số ít vi sinh vật tự dưỡng (thuộc nhóm ammon hoá, nhóm nitrate hoá) dùng muối ammone, muối nitrate làm nguồn năng lượng Trong điều kiện thiếu nguồn C một số vi sinh vật

kỵ khí trong điều kiện không có oxy có thể sử dụng một số aminoacid làm nguồn năng lượng Nguồn N thường được vi sinh vật sử dụng là protein và các sản phẩm phân huỷ của protein ( peptone, peptide, aminoacid, v.v ), muối ammone, nitrate, N phân tử (N2), purine, pyrimidine, urea, amine, amide, cyanide, v.v (Bảng 1.2)

Bảng 1.2 Nguồn N được vi sinh vật sử dụng

Ammone và muối

ammone

NH3, (NH4)2SO4, (dễ được hấp thu)

Nitrate KNO3 (dễ được hấp thu)

N phân tử N2 (với vi sinh vật cố định N)

Các nguồn N khác purine, pyrimidine, urea, amine, amide, cyanide (chỉ một số nhóm

vi sinh vật mới có thể đồng hoá được)

Nguồn N thường được sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật gồm có pepton, bột cá, bột nhộng tằm, bột đậu tương, bột khô lạc, cao ngô, cao thịt, cao nấm men Vi sinh vật sử dụng chọn lọc đối với nguồn N Chẳng hạn xạ khuẩn sản sinh tertramycin sử dụng cao ngô với tốc độ nhanh hơn so với sử dụng khô đậu tương hay khô lạc, bởi vì nguồn N trong cao ngô là các sản phẩm phân giải dễ hấp thu của protein Cao ngô được coi là nguồn N tốc hiệu, còn khô dầu được coi là nguồn N trì hiệu Loại N tốc hiệu là có lợi cho sự sinh trưởng của vi sinh vật, còn loại trì hiệu lại có lợi cho sự hình thành các sản phẩm trao đổi chất Khi sản xuất terramycin chẳng hạn, người ta phối hợp sử dụng cao ngô và khô dầu theo một tỷ lệ nhất định để phối hợp giữa giai đoạn sinh trưởng tạo sinh khối và giai đoạn sinh tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất, nhằm mục tiêu là nâng cao sản lượng terramycin

Năng lực hấp thu muối ammone và nitrate ở vi sinh vật là khá mạnh Ion

NH4+ sau khi được tế bào hấp thu có thể được trực tiếp sử dụng, do đó các nguồn muối ammone được coi là nguồn N tốc hiệu Còn nitrate sau khi được hấp thụ cần khử thành

NH4+ rồi mới được vi sinh vật sử dụng Đa số các vi khuẩn hoại sinh (saprophyte), vi khuẩn đường ruột, vi sinh vật gây bệnh ở người, động vật, thực vật đều có thể dùng

muối ammone, muối nitrate làm nguồn N Chẳng hạn các vi khuẩn Escherichia coli,

Enterobacter aerogenes, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, v.v đều có thể

sử dụng nguồn (NH4)2SO4 và NH4NO3 làm nguồn N; xạ khuẩn có thể sử dụng KNO3 làm nguồn N; nấm sợi có thể sử dụng KNO3 làm nguồn N Lúc dùng các muối như (NH4)2SO4 để làm nguồn N nuôi cấy vi sinh vật cần chú ý là sau khi vi sinh vật hấp thu NH4+ thì sẽ làm hạ thấp pH của môi trường Người ta gọi đó là những muối có tính sinh lý acid Ngược lại khi dùng các muối nitrate (như KNO3) sau khi vi sinh vật hấp thu NO3- thì sẽ làm nâng cao pH của môi trường Người ta gọi đó là các muối có tính sinh lý kiềm Để làm cho pH trong các môi trường nuôi cấy vi sinh vật ít bị biến động người ta bổ sung thêm các chất có tính đệm

1.6 Các phương pháp phân loại vi sinh vật

Vi sinh vật rất đa dạng trong tự nhiên nhưng chỉ một phần nhỏ trong số chúng là

có thể nuôi cấy được ở trong điều kiện phòng thí nghiệm Do đó, việc phân loại chúng gặp nhiều khó khăn Hiện nay có nhiều phương pháp để phân loại vi sinh vật Các

phương pháp truyền thống chỉ dựa vào các đặc điểm sinh lý, sinh hóa và hình thái cấu tạo bên ngoài để phân loại vi sinh vật, còn phương pháp hiện đại lại chú trọng nhiều đến việc nghiên cứu các phân tử acid nucleic như DNA, RNA để áp dụng trong phân loại Từ đó có thể thành lập cây phát sinh chủng loại, phản ánh mối quan hệ về mặt tiến hóa giữa các loài với nhau

1.6.1 Phân loại theo phương pháp truyền thống

Phương pháp phân loại truyền thống là phương án dựa trên các đặc điểm hình thái bên ngoài và các đặc điểm sinh lý của sinh vật để phân loại, cụ thể:

- Các đặc điểm về hình thái: hình dạng, kích thước, màu sắc của khuẩn lạc; hình dạng kích cỡ của tế bào vi sinh vật, các đặc điểm vi cấu trúc, có tiên mao, không có tiên mao, số lượng các tiên mao, cách thức di chuyển của tê bào, v.v…

- Các đặc điểm về sinh lý và trao đổi chất: như phản ứng nhuộm Gram, nguồn năng lượng, cơ chế chuyển hóa năng lượng, các sản phẩm lên men, các sản phẩm trao đổi thứ cấp, tính mẫn cảm với các chất ức chế và kháng sinh, v.v…

Ngoài ra, còn có nhiều phương pháp cổ điển khác nữa như: kiểm tra các phản ứng sinh hóa của vi sinh vật với các chất phản ứng khác nhau, các phản ứng miễn dịch của các kháng nguyên là thành phần cấu tạo của tế bào như kháng nguyên O của lipopolysaccharide hay của bao nhầy thường được sử dụng để phân biệt các chủng của một loài

1.6.2 Phân loại theo phương pháp sinh học phân tử

Hiện nay, các phương pháp phân loại hiện đại thương dựa trên việc đánh giá mức

độ phân tử acid nucleic Trên cơ sở trình tự DNA, người ta có thể có nhiều các phương pháp khác nhau để tiến hành phân loại

Từ cuối thể kỉ 20, đặc biệt từ năm 1980 trở lại đây, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, người ta sử dụng một phương pháp nghiên cứu mới cho phân loại vi sinh vật đó là “phân loại học phân tử” Phương pháp mới này có thể phát hiện, mô tả

và giải thích tính đa dạng sinh học ở mức độ phân tử giữa các loài và trong phạm vi loài trong thời gian ngắn và có độ chính xác cao

Trước đây, việc phận loại sinh vật đôi khi gặp khó khăn và thiếu chính xác Với

sự phát triển của kĩ thuật sinh học phân tử, việc phân loại ngày nay chủ yếu dựa vào

các nghiên cứu trên các phân tử acid nucleic (DNA, RNA) Các phương pháp này phản ánh chính xác hơn mối quan hệ về mặt tiến hóa giữa các nhóm sinh vật Tuy nhiên, cũng không thể phủ nhận vai trò của các phương pháp phân loại dựa trên các đặc điểm bên ngoài Do vậy, cần kết hợp cả 2 phương pháp để kết quả phân loại chính xác

Ngày nay, việc nghiên cứu phân tử rRNA được coi là phương pháp hữu hiệu nhất

để xác định mối quan hệ trên cây tiến hóa của các vi sinh vật vì rRNA có mặt ở tất cả các loài vi sinh vật, có chức năng xác định và là trình tự có tính bảo thủ cao, chúng chỉ khác nhau rất ít các nhóm sinh vật Dựa vào sự khác nhau này, người ta có thể đánh giá được mối quan hệ phát sinh chủng loại và phân loại các chủng vi sinh vật Trong 3 loại gen rRNA ở vi khuẩn (5S, 16S, 23S) thì gen 16S phù hợp nhất cho việc nghiên cứu phân loại Gen mã hóa cho 5S rRNA thì có kích thước khoảng 120 nucleotit ở vi khuẩn Gram âm và 116 (có khi là 117) nucleotit ở vi khuẩn Gram dương Người ta đã xác định được vài trăm trình tự 5S rRNA Tuy nhiên việc sử dụng phân tử 5S rRNA lại

có hạn chế do kích thước phân tử của nó quá nhỏ bé, do đó lượng thông tin để so sánh

bị hạn chế Trong khi đó phân tử 23S rRNA lại quá lớn (khoảng 3000 nucleotit) sẽ khó khăn hơn trong nhân dòng và phân tích trình tự Do đó phân tử 16S rRNA là lý tưởng cho việc xác định trình tự [34]

Phương pháp phân loại dựa trên trình tự 16S rRNA hiện nay được sử dụng rộng rãi nhất trong phân loại vi sinh vật và độ lớn trung bình (khoảng 1500 nucleotit) dễ dàng cho việc thao tác Các trình tự rRNA bảo thủ ở gần 2 đầu của một gen rRNA được sử dụng như là các điểm gắn các cặp mồi cho việc khuếch đại gen Bằng phản ứng PCR, người ta sẽ thu được gen mã hóa cho 16S rRNA đã được khuếch đại, có thể

đã được gắn vào vector đọc trình tự hoặc có thể được đọc trình tự trực tiếp theo phương pháp của Sanger

PHẦN 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1 Nguyên liệu

Mẫu đất và mẫu nước ô nhiễm dầu được thu thập tại khu công nghiệp Dung Quất, tỉnh Quảng Ngãi được lưu trữ tại Phòng Công nghệ sinh học môi trường, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam trong vòng 24h để phân tích

2.1.2 Hóa chất và môi trường nuôi cấy

™ Hóa chất

Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu đều là hóa chất nhập ngoại của các hãng có uy tín trên thế giới như Sigma, Merk, Fermentas, Biobasic, v.v

™ Môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy ở dạng lỏng (nuôi dịch) và dạng rắn (có bổ sung agar 18-20 g/l) Môi trường trước khi sử dụng được khử trùng ở 121oC (nếu môi trường không có

bổ sung glucose) và ở 115oC (nếu môi trường có glucose) trong 30 phút Bao gồm:

Môi trường khoáng Gost dịch (g/l): Làm giàu, phân lập vi khuẩn và đánh giá

khả năng phân hủy dầu DO của các chủng vi khuẩn

KNO3 : 3 Nước máy : tới 1 lít, pH 6,9-7,2

Môi trường khoáng Gost thạch (g/l): Thành phần giống với môi trường khoáng

Gost dịch nhưng có bổ sung thêm 18-20 g thạch agar

Môi trường MPA (g/l): Hoạt hóa chủng vi sinh vật để tạo màng sinh học Thành

phần môi trường:

Cao thịt : 3 Nước máy : tới 1 lít, pH: 7-7,2

Môi trường hiếu khí tổng số (HKTS) (g/l): Đánh giá khả năng sinh trưởng của

các chủng vi khuẩn và nghiên cứu ảnh hưởng một số yếu tố đến khả năng tạo màng của các chủng vi khuẩn

Môi trường LB (g/l): Nuôi cấy thu sinh khối tế bào để tách chiết DNA tổng số

Tryptone : 10 Nước cất : tới 1 lít, pH 7,2

Nước muối sinh lý 0,85%: Pha loãng tế bào vi sinh vật

Nước cất : tới 1 lít

Dung dịch acid acetic 33% v/v, dung dịch tím tinh thể 0,1%

2.1.3 Máy móc và thiết bị nghiên cứu

Các thiết bị, máy móc được sử dụng có độ chính xác cao tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học Môi trường và phòng thí nghiệm trọng điểm Quốc gia về công nghệ Gen- Viện Công nghệ sinh học

Bảng 2.1: Máy móc và thiết bị dung trong đề tài

Bể điện di ELITE 300 PLUS WEALTEC Đài Loan

Kính hiển vi Eclipse LV UDM NIKON Nhật Bản

Máy chuẩn pH-CyberScan pH 620 EUTECH Singapore Máy đo quang phổ UV-1601-220V SHIMADZU Nhật Bản