Cloning gen mã hóa pectinase từ cộng đồng vi sinh vật không thông qua nuôi cấy

Các nghiên cứu metagenome đã cho thấy vẫn còn rất nhiều nhóm vi sinh vật trong tự nhiên mà chúng ta không thể phân lập và nuôi cấy được, và vì vậy không thể giải trình tự của chúng được.

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI:

CLONING GEN MÃ HÓA PECTINASE TỪ CỘNG ĐỒNG

VI SINH VẬT KHÔNG THÔNG QUA NUÔI CẤY

Người hướng dẫn 1 : TS Lê Văn Trường

Người hướng dẫn 2 : KS Lê Trọng Tài

Sinh viên thực hiện : Đặng Duy Đức – Lớp 1101

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS Lê Văn Trường, Phòng

Di Truyền Vi Sinh Vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận này

Xin chân thành cảm ơn KS Lê Trọng Tài cùng tập thể cán bộ phòng Di Truyền Vi Sinh Vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận

Qua đây, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo trong khoa Công nghệ Sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội đã dạy dỗ, hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã không ngừng giúp

đỡ và chia sẻ, động viên trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện khóa luận

Hà Nội, ngày 22 tháng 5 năm 2015 Sinh viên

Đặng Duy Đức

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 GIỚI THIỆU VỀ PECTINASE 2

1.1.1 Khái niệm pectinase 2

1.1.2 Phân loại 2

1.1.3 Ứng dụng của pectinanase 5

1.1.3.1 Ứng dụng trong công nghiệp ép trái cây và rượu vang 5

1.1.3.2 Dùng làm mềm mô thực vật 5

1.1.3.3 Xử lý nước thải có chứa pectinase 5

1.1.3.4 Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất giấy 6

1.1.3.5 Ứng dụng trong quá trình trích ly dầu thực vật 6

1.1.4 Một số phương pháp thu pectinase 6

1.1.4.1 Pectinase thực vật 6

1.1.4.2 Pectin vi sinh vật 6

1.2 KỸ THUẬT METAGENOMIC 7

1.2.1 Khái niệm metagenomics 7

1.2.2 Lịch sử của metagenomics 7

1.2.3 Sự ưu việt của kĩ thuật metagenomic trong nghiên cứu quần thể vi sinh vật đất 9

1.2.4 Tách dòng gen 9

1.2.4.1 Tách dòng thực nghiệm 10

1.2.4.2 Tách dòng silicon 13

1.2.5 Một số nghiên cứu về Metagenome 14

1.2.5.1 Trên thế giới 14

1.2.5.2 Ở Việt Nam 18

CHƯƠNG II: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ HÓA CHẤT 20

2.1.1 Nguyên vật liệu 20

2.1.3 Vật tư 21

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.2.1 Tách chiết DNA metagenome theo Yeates và cộng sự 21

2.2.2 Phương pháp điện di DNA trên gel agarose 22

2.2.3 Phương pháp tinh sạch DNA metagenome bằng Troughing cải tiến 23

2.2.4 Phương pháp kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA bằng máy quang phổ 23

2.2.5 Phương pháp nhân gen bằng Polymerase chanins reaction 25

2.2.6 Phương pháp gắn gen vào vector tách dòng pJET1.2 25

2.2.7 Biến nạp plasmid vào E.coli bằng phương pháp xung điện 26

2.2.8 Tách chiết DNA plasmid 26

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 KẾT QUẢ 28

3.1.1 Tách DNA metagenomic từ đất 28

3.1.2 Phân lập gen pectinase bằng PCR 29

3.1.3 Tách dòng gen vào pJET1.2 30

IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37

4.1 KẾT LUẬN 37

4.2 KIẾN NGHỊ 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO 38

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Sơ đồ qui trình tách dòng gen 11 Hình 2.1: PCR ngược 13 Hình 3.1: Điện di DNA metagenomic của các vi sinh vật từ 2 mẫu đất khác nhau 28 Hình 3.2: Kết quả nhân gene pectinase từ DNA metagenom thu được bằng cặp mồi đặc hiệu với gen pesctinase của B subtilis 29

Hình 3.3: Các thể biến nạp E.coli DH1b mang pJET/pel trên môi trường chọn lọc

LB, 100 µg/ml ampicilin 30

Hình 3.4 : Điện di sản phẩm cắt pJET/pel bằng XhoI và XbaI 35

Hình 3.5 : Trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy diễn của gen phân lập từ

metagenomics bằng primer đặc hiệu cho gen pectinase của B subtilis 35

Hình 3.6 : So sánh trình tự amino acid của gen thu được với một số trình tự amino acid của pectinase đã biết 35

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Phân loại các enzym pectinase 3

Bảng 2.1: Hóa chất 20

Bảng 2.2: Vật tư 21

Bảng 2.3: Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng XhoI và XbaI 24

Bảng 2.4: Thành phần phản ứng PCR: 25

Bảng 3.1: Độ sạch của các mẫu DNA sau khi tinh sạch 29

Bảng 3.2: So sánh trình tự amino acid của gen thu được với các gen đã biết trên ngân hàng gen 34

ĐẶT VẤN ĐỀ

Vi sinh vật trong tự nhiên rất đa dạng và phong phú, theo các nghiên cứu gần đây, các vi sinh vật nuôi cấy được chỉ chiếm khoảng 0.1 đến 1% trong tổng số loài sinh vật trong hệ sinh thái [6], do sự đa dạng về gen phần lớn nằm trong các vi sinh vật không nuôi cấy được Để tìm các enzyme có nhưng đặc tính mới thì một trong những hướng nghiên cứu hiện nay là sang lọc các gen mã hóa enzyme từ thư viên DNA genome của hệ sinh vật có trong mẫu tự nhiên (đât, bùn, nước…) không thông qua nuôi cấy Kỹ thuật này giúp chúng ta nhanh chóng tìm được nhiều gen mới do đó có khả năng tìm được nhưng gen có đặc tính quý là hoàn toàn có thể Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới, có hệ vi sinh vật vô cùng phong phú, đặc biệt là hệ vi sinh vật sống trong môi trường đất, đây là nguồn tài nguyên vô cùng quý giá để chúng ta khai thác các gen quý Pectinase là một trong những loại enzyme được sử dụng rộng rãi và quan trọng trong nhiều ngành công nhiệp như sản xuất rượu vang, sản xuất nước trái cây, sản xuất giấy, trà, cà phê, xử lý nước thải…Pectinase góp phần nâng cao chất lượng sản phẩn giảm chi phí sản xuất bảo

vệ môi trường và sức khỏe con người Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài "Cloning gen mã hóa pectinase từ cộng đồng vi sinh vật không thông qua nuôi cấy" Trong đề tài này chúng tôi trình bày kết quả cloning gen mã hóa pectinase từ cộng đồng vi sinh vật đất trong các mẫu đất được lấy từ địa bàn Hà Nội

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU VỀ PECTINASE

1.1.1 Khái niệm pectinase

Pectinase là nhóm enzyme xúc tác phân hủy polymer pectin thành acid pectinic hoặc pectin bằng phản ứng thủy phân (hydrolases), phản ứng chyển lên kết (trans-elimination), phản ứng cắt liên kết este [15]

Trong tự nhiên pectinase được tìm thấy đầu tiên ở thực vật có chức năng làm mềm thành tế bào trong quá trình chín của quả Ngoài ra pectinase còn được tạo ra bởi các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm, côn trùng, động vật nguyên sinh Pectinase ở

vi khuẩn và nấm giúp cho quá trình xâm nhiễm vào thực vật của Pectinase ở côn trùng giúp chúng dễ dàng tiêu hóa thực vật

1.1.2 Phân loại

Enzyme pectinase được phân thành 3 nhóm chính dựa vào đặc điểm cơ chất

và cơ chết phân cắt được thể hiện ở bảng 1

Pectinase có hai cơ chế phản ứng cơ bản: Thủy phân (hydrolysis) và phân cắt

chuyển liên kết (trans - element) Cơ chế thủy phân đòi hỏi sự có mặt của nước,

ngược lại cơ chế chuyển liên kết diễn ra trong điều kiện không cần nước và sản phẩm tạo ra có một liên kết đôi

Bảng 1.1: Phân loại các enzym pectinase [6]

- Protopectin

- Pectin acid

- Pectin acid

- Trigalacturonate -4:5(galacturonate)n

- Endopolygalacturonate lyases

- Exopolygalacturonate lyases

- Oligogalacturonate lyases

4.2.2.2 4.2.2.9 4.2.2.6

-Phân cắt chuyển liên kết

- Phân cắt chuyển liên kết

- Phân cắt chuyển liên kết

1.1.3 Ứng dụng của pectinanase

1.1.3.1 Ứng dụng trong công nghiệp ép trái cây và rượu vang

Pectinase được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp ép trái cây và sản xuất rượu vang nhằm tăng hiệu quả trích li của quá trình ép và làm trong nước quả, rượu vang Nhờ khả năng phân hủy pectin để phá vỡ cấu trúc thành tế bào Đồng thời phân hủy pectin sót lại trong quá trình ép, trích ly chính là nguyên nhân làm đục nước quả trong, rượu vang [3]

1.1.3.2 Dùng làm mềm mô thực vật

Trong các thao tác gen truyền thống rất khó có thể đưa các gen mong muốn vào

tế bào có quan hệ xa nhau do một số trở ngại về lai xa làm giảm nguồn biến dị truyền cần thiết cho cải thiên giống cây trồng Ngày nay người ta sử dụng phương pháp giúp khắc phục được trở ngại đó rất hiệu quả với tế bào bậc cao là dung hợp protoplast (dung hợp tế bào trần) cô lập từ tế bào soma (tế bào sinh dưỡng) trong điều kiện invitro

và phát triển thực vật lai Kỹ thuật này cần phải phá vỡ thành tế bào thực vật biết tế bào hoàn thiện thành protoplast (tế bào trần)

Đầu tiên sử dụng pectinase 0.5% (W/V) phân hủy pectin trên thành tế bào làm mềm tế bào, sau đó tiếp tục xử lý với cellulose 5% (W/V) Chỉnh pH 5.6 nhờ HCl 2N phá hủy hoàn toàn thành tế bào [16]

1.1.3.3 Xử lý nước thải có chứa pectinase

Trong công nghiệp sản xuất các sản phẩm từ nguyên liệu chứa tinh bộ và hoa quả Thành phần rất giàu pectin là nguyên nhân gây ô nhiễm cho các nguồn nước quanh nhà máy sản xuất Tanabe và cộng sự thử nghiệm bằng một quá trình xử lý nước

thải sử dụng chủng Bacillussp.(GIR 612) được phân lập từ đất có khả năng sản xuất

enzyme endonpectat lyase ngoại bào trong môi trường pH 10 Người ta đã chứng minh rằng vi khuẩn này có khả năng loại hiệu quả pectin ra khỏi nước Tuy nhiên vì vi khuẩn này có khả năng gây bệnh cho thực vật nên ngày nay người ta xử lý gián tiếp pectin bằng enzyme được sản xuất từ vi sinh vật này

1.1.3.4 Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất giấy

Việc làm giấy là một quá trình lọc liên tục huyền phù và các phần mịn của sợi, các chất độn vô cơ như đất sét, canxi cacbonat để tạo thành các phiễn giấy Hiệu suất của quá trình lọc sẽ bị giảm theo thời gian do việc thoát nước qua các phiễn lọc bị hạn chế Để hạn chế điều này người ta sử dụng các khung có kích thước đủ lớn nhưng việc này cũng làm cho các phần mịn và chất độn có thể đi qua gây thất thoát

Trong công nghiệp sản xuất giấy hiện đại Pectinase được thêm vào bột giúp nước có thể đi qua dễ dàng đồng thời tăng khả năng giữu lại phần bột mịn và chất độn làm tăng hiệu suất cũng như giảm thất thoát của quá trình sản xuất [16]

1.1.3.5 Ứng dụng trong quá trình trích ly dầu thực vật

Trước đây, quá trình sản xuất dầu thực vật truền thống thường sử dụng các dung môi hữu cơ để trích ly dầu từ hạt hoặc quả chứa dầu Dung môi thường sử dụng là hexan, một chất có khả năng gây ung thư Để giải quyết vẫn đề đó ngày nay, người ta

sử dụng hệ enzyme pectinase gúp hóa lỏng thành phẩn cấu trúc của vách tế bào cây chứa dầu và trích ly trong nước [16]

1.1.4 Một số phương pháp thu pectinase

Có thể thu pectinase từ 2 nguồn là thực vật và vi sinh vật

1.1.4.1 Pectinase thực vật

Trong thực vật ở hầu hết các cây cho trái như cà chua, chanh hoặc khoai tây… đều chứa pectinase Enzyme tồn tại dưới nhiều hình thức khác nhau chủ yếu nằm trong phần vỏ tế bào Pectinase thực vật nói chung có hoạt độ tối ưu nằm trong khoảng pH hơi kiềm Các cation kim loại nồng độ thấp như Ca2+ có khuynh hướng là tăng nồng độ của enzyme Các pectinase hoạt động bằng cách hình thành các khối pectin chứa nhóm cacboxynlate dọc theo mạch pectin

1.1.4.2 Pectin vi sinh vật

Nhiều vi sinh vật trong đất, nước đều có khả năng phân giải pectin Chúng không chỉ có ý nghĩa trong vòng tuần hoàn carbon tự nhên mà còn rất quan trong cho một số ngành công nghiệp (da, sản xuất bia, là giấy…) Một số vi sinh vật có khả năng sản sinh pectinase mạnh mẽ như:

Nấm mốc: Aspergillus sp., Botrytis cinerea, Fusarium moniliforme, Rhizopus

Nấm men: sac Elilpsoideus, sac Fragilis, sac Ludwigii…

Vi khuẩn: Bac Polymixa, Bac Felseneus, Clostridium roseum

1.2 KỸ THUẬT METAGENOMIC

1.2.1 Khái niệm metagenomics

Thuật ngữ “metagenomics” lần đầu tiên được sử dụng bởi Jo Handelsman, Jon

Clardy, Robert M Goodman cùng các tác giả khác và được xuất bản vào năm 1998 Metagenomics là ngành khoa học nghiên cứu về đa hệ gen (metagenome) – nguyên liệu di truyền được thu trực tiếp từ các mẫu môi trường Metagenome còn được gọi là

“hệ gen cộng đồng” (community genomics) hay “hệ gen môi trường” (enviromental genomics) Kỹ thuật metagenomic là các phương pháp nghiên cứu về metagenome cho phép khai thác được tối đa các gen của vi sinh vật không nuôi cấy hoặc không có khả năng nuôi cấy trong các quần thể sinh vật Tùy vào từng mẫu môi trường khác nhau mà

số lượng vi sinh vật không nuôi cấy được dao động từ 99 đến 99,7% Nếu tất cả các gen của vi sinh vật trong mẫu môi trường được tập hợp lại sẽ là nguồn nguyên liệu vô cùng phong phú cho việc khai thác gen, cũng như tìm hiểu cơ chế tác động giữa các vi sinh vật đảm bảo sự ổn định, phát triển chung của hệ sinh thái [19]

1.2.2 Lịch sử của metagenomics

Việc giải trình tự theo kiểu truyền thống thường bắt đầu bằng việc nuôi cấy các

tế bào giống hệt nhau để làm nguồn phân lập DNA Các nghiên cứu metagenome đã cho thấy vẫn còn rất nhiều nhóm vi sinh vật trong tự nhiên mà chúng ta không thể phân lập và nuôi cấy được, và vì vậy không thể giải trình tự của chúng được Những nghiên cứu đầu tiên về metagenome tập trung vào đoạn trình tự của rRNA 16S (16S ribosomal RNA), là đoạn trình tự tương đối ngắn, bảo thủ và đặc trưng cho mỗi loài Từ đó người

ta đã phát hiện ra rất nhiều đoạn trình tự rRNA 16S mới, không giống bất cứ một loài

đã biết nào Những khảo sát về gen trên rRNA thực hiện trực tiếp từ môi trường đã cho thấy, số lượng loài vi khuẩn và vi khuẩn cổ (archaea) đã tìm thấy trước đây bằng

phương pháp giải trình tự theo kiểu truyền thống chỉ tương đương khoảng 1% số lượng thực của chúng trong môi trường

Những nghiên cứu đầu tiên ở mức độ phân tử đã được thực hiện bởi Norman R Pace và các cộng sự Họ sử dụng PCR để khám phá ra sự đa dạng của các trình tự rRNA [20] Với những kết quả của nghiên cứu này, vào năm 1985 Pace đã đề xuất ý tưởng nhân dòng DNA trực tiếp từ môi trường [21] Tới năm 1991 ông và cộng sự tại Khoa Sinh học, trường đại học Indiana đã có báo cáo đầu tiên về nhân dòng một lượng lớn DNA từ môi trường Nghiên cứu của họ đã khẳng định rằng không hề có lỗi trong quá trình thực hiện PCR và những loài mới trong quần xã vi sinh vật là thực sự tồn tại Mặc dù chỉ thực hiện với đoạn trình tự bảo thủ và không mã hóa, công trình trên đã chứng minh và giải thích tại sao các nghiên cứu về đa dạng sinh học trước đây bằng phương pháp hình thái học thường mang lại nhiều kết quả hơn so với phương pháp phân tích qua phân lập và nuôi cấy Ngay sau đó, vào năm 1995 Healy đã công bố kết quả phân lập metagenomic của các gen chức năng trong "thư viện động vật" xây dựng

từ hệ sinh vật tự nhiên trên cỏ khô trong phòng thí nghiệm [22] Sau khi rời phòng thí nghiệm của Pace, Edward DeLong tiếp tục nghiên cứu về lĩnh vực này và đã xuất bản công trình làm nền móng cho phân loại sinh vật môi trường dựa trên trình tự 16S, đó là thành lập thư viện trình tự của các mẫu lấy từ biển [23]

Vào năm 2002, Mya Breitbart, Forest Rohwer và các cộng sự đã sử dụng phương pháp shotgun sequencing để chứng minh rằng trong 200 lít nước biển có chứa trên 5000 loài virus khác nhau [24] Nghiên cứu sau đó đã tìm ra khoảng hơn 1000 loài virus trong phân người và khoảng 1 triệu virus trong mỗi kilogam trầm tích biển, trong

đó có rất nhiều thể thực khuẩn Năm 2004 Gene Tyson, Jill Banfield và cộng sự tại trường đại học California, Berkeley và Joint Genome Institute đã giải mã DNA từ mẫu môi trường bị axit hóa do khai khoáng (acid mine drainage, AMD) Nghiên cứu đã tìm

ra một số nhóm vi khuẩn và vi khuẩn cổ mà trước đó chưa thể phân lập được [25]

Năm 2005, Stephan C Schuster ở trường đại học Penn State University và các cộng sự đã công bố những trình tự đầu tiên giải bằng phương pháp hiện đại (kỹ thuật Pyrosequencing phát triển bởi 454 Life Sciences) [26] Năm 2006 Robert Edward,

Forest Rohwer và cộng sự ở San Diego State University cũng đã công bố thêm một công trình thuộc lĩnh vực này [27].

1.2.3 Sự ưu việt của kĩ thuật metagenomic trong nghiên cứu quần thể vi sinh vật đất

Hiện nay, chúng ta có rất ít thông tin về đại đa số các vi sinh vật hiện diện trong các môi trường khác nhau trên trái đất, chủ yếu là do chúng ta không thể nuôi cấy chúng trong phòng thí nghiệm Người ta ước lượng được rằng, chỉ có dưới 1% vi khuẩn được nuôi cấy Trong thời gian qua, chúng ta không nuôi cấy các vi sinh vật được là do thiếu kiến thức về sinh lý học của chúng và các tín hiệu môi trường mà dựa vào đó chúng ta có thể thiết kế môi trường nuôi cấy phù hợp, tuy nhiên các công nghệ nuôi cấy mới bắt đầu giải quyết những vấn đề này [13] Hầu hết tri thức của chúng ta được thu lượm từ một phần nhỏ vi sinh vật được phân lập Metagenomics cho phép chúng ta nghiên cứu các vi sinh vật bằng cách giải mã thông tin di truyền của chúng từ DNA được thu trực tiếp từ các cộng đồng của các vi sinh vật môi trường, do đó từng bước vượt qua sự cần thiết của việc phân lập hay nuôi cấy Kỹ thuật này được xây dựng trên những thành công của các cuộc nghiên cứu 16S rRNA các mẫu môi trường nuôi cấy độc lập [14] Nó cung cấp những hiểu biết về lịch sử tiến hóa cũng như các khả năng chưa biết từ trước của cộng đồng vi sinh không nuôi cấy sống trong môi trường tự nhiên Đó là, các câu hỏi sau có thể được giải đáp “vi sinh vật nào ở đó?”, “vi sinh vật đang làm gì?” và “vi sinh vật hoạt động như thế nào?” Kết quả phong phú của gene và cấu trúc phân tử được giải mã từ các vi sinh vật không thông qua nuôi cấy có tiềm năng to lớn trong sự phát triển chất xúc tác sinh học (biocatalysts) mới cho ứng

dụng công nghiệp và dược phẩm Dữ liệu và siêu dữ liệu metagenome có thể được tận

dụng để thiết kế các thí nghiệm thông lượng cao và thông lượng thấp, các thí nghiệm này tập trung vào việc xác định vai trò của các gen và các vi sinh vật trong việc thành

lập cộng đồng vi sinh vật động

1.2.4 Tách dòng gen

Tách dòng gen là tập hợp các kĩ thuật sinh học phân tử nhằm đưa gen mong

mang một đoạn DNA mong muốn, tạo nên một dòng tế bào tái tổ hợp mang gen cần tách dòng [17] Có hai phương pháp tách dòng sử dụng trong công nghệ sinh học là tách dòng thực nghiệm (cloning in vitro) và tách dòng ảo (cloning in silicon)

1.2.4.1 Tách dòng thực nghiệm

Tách dòng thực nghiệm là phương pháp tách dòng thực hiện từ các mẫu sinh học (tế bào, mô, dịch sinh sản…) mang gen cần tách dòng hoặc tổng hợp nhân tạo các gen cần tách dòng Tách dòng thực nghiệm gồm nhiều phương pháp khác nhau, có thể tách dòng từ DNA, ARN hoặc dựa trên cơ sở trình tự chuỗi acid amin

- Tách dòng gen từ DNA

Thường được sử dụng với các đối tượng là vi sinh vật nhân sơ cấu trúc của AND không tồn tại các vùng không mã hóa intron

Các bước tách dòng gen từ DNA

Bước 1: Chuẩn bị gen cần tách dòng (gen đích-target gen) và chọn vector tách dòng

- Chuẩn bị gen tách dòng

Trong phòng thí nghiệm gen đích thường được chuẩn bị từ mẫu sinh học Phương pháp tổng hợp nhân tạo rất ít được sử dụng do kĩ thuật phức tạp, tốn kém và độ chuẩn xác không cao

Trường hợp có trình tự gen đích thì dựa vào trình tự thiết kế mồi đặc hiệu thực hiện PCR để nhân gen đích lên

Trường hợp chưa biết trình tự của gen đích cần tách chiết bộ gen, thực hiên PCR nhân gen, sử dụng enzyme giới hạn cắt bộ gen thành những đoạn nhỏ, điện di trên gel agrose Từ kết quả điện di, dựa vào kích thước gen cần tách dòng để lựa chọn đoạn DNA chứa gen cần tách

Hình 1.1: Sơ đồ qui trình tách dòng gen

- Chọn vectơ tách dòng

Dựa vào kích thước của gen cần tách dòng hoặc mục đích tách dòng mà chúng

ta cho vector có thể là platmid, phage, nhiễm sắc thể nhân tạo…

Bước 2: Tạo vectơ tái tổ hợp

Sử dụng enzyme giới hạn phù hợp cắt vector tách dòng và gen tách dòng tại những vị trí đặc hiệu giống nhau, tạo điều kiện thích hợp cho quá trình tái tổ hợp giữa vector tách dòng và DNA inset Sử dụng enzyme nối DNA ligase nối vector tách dòng

và gen cần tách dòng tạo nên vector tái tổ hợp

Để tăng hiệu quả tạo vector tái tổ hợp cần chú ý tỉ lệ giữa vector tách dòng và DNA inset Đồng thới bổ sung loại DNA ligase thích hợp và nồng độ phù hợp với phản ứng Enzyme nối thường hay được sử dụng nhất T4 Ligase có khả năng xúc tác hình thành liên kết phosphoeste nối các đoạn DNA cắt đầu bằng với nhau

Bước 3: Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào chủ

Có thể dùng nhiều phương pháp khác nhau để biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào chủ như: vi tiêm, sốc nhiệt, siêu âm, bắn gen… Nhưng đối với vi khuẩn thường sử dụng phương pháp sốc nhiệt vì phương pháp này có hiệu quả cao đối với vi khuẩn và đơn giản Với tế bào chủ là nấm men có thể sử dụng phương pháp xung điện và súng bắn gen Phương pháp vi tiêm thường được sử dụng cho các tế bào có kích thước lớn như thế bào sinh dục hoặc hợp tử của sinh vật nhân thực

Bước 4: Sàng lọc dòng tế bào tái tổ hợp

Sàng lọc nhằm mục đích chọn ra được những tế bào mang vector tái tổ hợp trong quần thể Qúa trình sàng lọc phải dựa trên gen chỉ thị (marker) có trong vectơ tách dòng có thể là: gen kháng kháng sinh, gen chỉ thị màu

Bước 5: Nuôi cấy dòng tế bào tái tổ hợp

Nuôi các tế bào đã được chọn lọc trong môi trường dinh dưỡng và điều kiện phù hợp, khi mật độ tế bào đạt 108 đến 109 tế bào/1ml có thể thu sinh khối, thu porotein tái

tổ hợp hoặc bảo quản tùy vào mục đích

- Tách dòng từ RNA thông tin (mRNA)

Đối với các sinh vật nhân chuẩn phức tạp, cấu trúc gen gồm các vùng mã hóa cho protein (Exon) xen kẽ với các vùng không mã hóa cho protein (Intron) Vì vậy chúng ta không thể sử dụng trực tiếp DNA của sinh vật để làm DNA inset Vì vậy buộc chúng ta phải sử dụng phương pháp tách dòng từ mRNA hoàn thiện (mRNA đã loại bỏ các trình

tự không mã hóa và gắn đuôi poly A)

Bước 1: Tách chiết mRNA

RNA thông tin được tách chiêt theo các protocol thông dụng trong phòng thí nghiệm Có thể sử dụng sắc ký ái lực với bi từ có mang oligo nucleotid T Các phân tử mRNA có đuôi poly A sẽ liên kiết với bi từ gắn T làm cho các RNA thong tin bám vào các bi từ Sử dụng phương pháp ly tâm phân đoạn để tách RNA thông tin ra khổi bi từ

để thu lại RNA thông tin Có thể bảo quản sản phẩm ở -850C để nghiên cứu

Bước 2: Tổng hợp cDNA mạch kép

Sử dụng kỹ thuật PCR ngược có sự tham gia của enzyme phiên mã ngược (revense transcriptase ezyme) để tổng hợp mạch cDNA dựa trên mạch khuôn mARN

Thủy phân mạch khuôn mARN bằng enzyme RNase H Sau đó bổ sung AND polymenase và dNTP để tổng hợp mạch bổ sung dựa trên mạch khuôn cDNA thứ nhất tạo thành phân tử cDNA kép

Các bước còn lại giống với quy trình tách dòng gen từ AND

để lựa chọn DNA hoặc một gen cần thiết

Kết quả của kĩ thuật tách dòng ảo cho phép lựa chọn phương án thiết kế vectơ tái tổ hợp có hiệu quả, dự đoán trước kết quả tách dòng cũng như hiệu quả biểu hiện gen và mức độ thành công của thực nghiệm

1.2.5 Một số nghiên cứu về Metagenome

of Japan: tại http://www.ddgj.nig.ac.jp)

Ở các nước châu Âu và Mĩ đã cho ra đời các ngân hàng dữ liệu như; NCBI – Trung tâm quốc gia về Thông tin Công nghệ sinh học (National Centrer for Biotecchology tại:http://www.ncbi.nlm.nih.gov) của Mỹ; EMBL – Phòng thí nghiệm sinh học phân tử (European Molecular Biology Laboratory: http://www.embl.org ) của châu Âu hoặc một phần của nó là EBI – Viện Sinh tin học châu Âu đặt ở Anh (European Bioinformatics tại: http://www.ebi.ac.uk/)

Đồng thời với sự ra đời của hàng loạt ngân hàng dữ liệu thì hàng loạt các phần mềm xử lý các trình tự sinh học DNA và protein cũng được ra đời như: Align (so sánh từng cặp trình tự DNA hoặc protein); CENSOR (sàng lọc các trình tự và các đoạn DNA tương đồng); ClustalW2, Kalign, T-coffee, MAFT, MUSCLE (so sánh cùng một thời điểm nhiều đoạn trình tự DNA hoặc protein); BLAST (tìm trên cơ sở dữ liệu ngân hàng gen trình tự DNA/protein tương đồng với trình tự cần phân tích); CpG Gene Wise (so sánh protein với DNA); PromoterWise (so sanh 2 trình tự DNA (thường là promoter) có tính đến trường hợp đảo đoạn hoặc chuyển đoạn); Transeq, ChromasPro(dịch mã trình tự DNA sang protein); Plot/CpGreport (dò tìm đảo CpG); Dna Block Aligner From (phân tích promoter0;); WebPRANK (so sánh nhiều trình tự DNA cùng với sự nghiên cứu mất đoạn, thêm đoạn để tìm hiều thông tin về sự tiến hóa

và phát sinh loài Hầu hết các phầm mềm tin sinh được cũng cấp miễn phí trên những trang wep xuất xứ từ Bắc Mỹ và châu Âu [1, 9] Sự kết hợp của công cụ tin sinh và ngân hàng dữ liệu giúp lĩnh vực nghiên cứu metagenomics thành công trên thế giới

trong suốt 20 năm qua và được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực: khoa học trái đất, khoa học sự sống, khoa học y sinh, năng lượng, xử lý môi trường, nông nghiệp, công nghệ sinh học và bảo vệ sinh học… [4, 9] Trong một số năm trở lại đây với khả năng giải trình tự ngày càng nhanh chóng và chính xác, chi phí thấp kỹ thuật metagenomics đang làm bùng nổ cuộc cách mạng về số liệu di truyền dựa trên việc phân tích trình tự bộ gen Dữ liệu và siêu dữ liệu metagenomics không chỉ dừng lại ở việc mô ta sự phát sinh loài hay một số đặc điểm của thông tin qua hệ thống di truyền 16S Dựa trên số liệu về metagenomics của cộng đồng vi sinh vật có thể có thông tin của toàn bộ chức năng gen, mỗi quan hệ giữa các gen trong một nhóm vi sinh vật và giữa các nhóm vi sinh vật đều được làm sáng tỏ rõ ràng Các thí nghiệm này tập trung vào việc xác định vai trò của các gen và các vi sinh vật trong việc thành lập cộng đồng vi sinh vật động [9] Mặt khác, dữ liệu này còn được ứng dụng trong thực tế để năng cao kiến thức trong nhiều lĩnh vực và giải quyết những thách thức trong y học, khoa học kĩ thuật, phát triển bền vững sinh thái, nông nghiệp… [2, 12] Các nhà khoa học của bộ Bộ Nông nghiệp Mỹ đã sử dụng công cụ metagenomics để xác định nguyên nhân của việc giảm trọng lượng, gây tử vong ở gà là do chúng nhiễm virus dẫn đến các hội chứng hoại tử đường ruột suy nhược và còi cọc Bên cạnh những virus thường gặp ở gia cầm như astrovirus, reovirus, rotavirus và virus RNA thuộc nhóm Picornaviridae, họ đã phát hiện ra những virus hoàn toàn mới mà trước đây chưa được biết đến như: Picobirnavirus – một virus liên quan đến bệnh đường ruột ở các vật nuôi khác; Calicivirus – một loại virus có liên quan đến bệnh đường ruột của con người [11] Bằng cách sử dụng kĩ thuật metagenomic, Lazlo Zsak - người chủ trì nghiên cứu tại đơn vị nghiên cứu bệnh do virus đặc thù ở gia cầm tạ phòng thí nghiệm nghiên cứu gia cầm khu vực Đông Nam (Athens), đã phát hiện ra một loài virus mới có khả năng sản xuất một loại kháng sinh trong tương lai Zsak và nhà sinh vật học Michael Day đã tìm thấy một chuỗi DNA của các virus mới và đã xây dựng một kỹ thuật để lập trình tự toàn bộ hệ gen của nó Virus này được gọi là “phi CA82” – là là loại virus giết chết vi khuẩn Đây là một phương pháp mới để thay thế sử dụng thuốc kháng sinh cổ điển và

đa dạng của các sinh vật nhân sơ (prokaryote) được phát hiện ở sâu hơn 1km dưới tầng đất đá của đáy biển Phần lớn những sinh vật này không thể nuôi cấy và có quan hệ rất

ít với hệ vi sinh vật bên trên bề mặt Người ta chỉ biết được chúng thông qua nhưng DNA đặc trưng nhờ kỹ thuật metagenomic Wei Xei và CS (2014) cũng đã tìm hiểu được nguồn năng lượng giúp duy trình những hệ sinh thái chôn vùi này Việc giải trình

tự metagenome có ý nghĩa rất lớn trong nghiên cứu quần xã virus, do virus không có marker để phân loại (như 16S RNA đối với vi khuẩn và cổ khuẩn, 18S RNA đối với các sinh vật nhân chuẩn) nên cách duy nhất để nghiên cứu đa dạng di truyền và tiến hóa của virus là thông qua metagenomics [7, 9]

Trong y học:

Cộng đồng vi khuẩn đóng một vai trò quan trọng trong việc bảo vệ sức khỏe con người Tuy nhiên thành phần và cơ chế hoạt động của chúng còn rất nhiều bí ẩn Dự án của “Human Microbiom” bước đầu đã sử dụng trình tự metagenome của cộng đồng vi khuẩn ở 15-18 vị trí khác nhau trên cơ thể của ít nhất 250 người để đánh giá sự thay đổi và mỗi quan hệ của chúng đối với sức khỏe con người Một nghiên cứu khác của

dự án MetaHit (Metagenomics of the Human Intestinal Tract) tiến hành từ 124 cá nhân

từ Đan Mạch và Tây Ban Nha mắc bệnh đường ruột, thừa cân và cáu kỉnh đã công bố thông tin về sự đa dạng của các loài vi khuẩn tiêu hóa Nghiên cứu đã chứng minh rằng hai ngành vi khuẩn Bacteroidetes và Firmicutes chiếm hơn 90% các loài vi khuẩn được biết đến đang thống trị đường ruột Sử dụng tần số gen liên quan được tìm thầy trong ruột đã xác định 1244 cụm gen của metagenomics là cực kì quan trọng cho sức khỏe đường ruột Bệnh nhân bị hội chứng ruột kích thích chỉ có 75% các gen trên và tính đa dạng vi khuẩn thấp hơn so với các cá nhân không bị hội chứng ruột kích thích Nghiên

cứu cũng cho thấy sự thay đổi đa dạng của quần xã vi sinh vật có thể liên quan với bệnh đường ruột và béo phì Trên cơ sở các nghiên cứu về metagenomics của hệ sinh vật hoạt động ở cơ thể người để phát trển các công cụ và công nghệ sinh học mới hỗ trợ các mục tiêu y học Một số nghiên cứu khác về metagenomics cho phép phát hiện virus – nguyên nhân gây ra một số bệnh ung thư ở người [18]

Trong sản xuất nhiên liệu sinh học:

Ở quy mô công nghiệp việc sản xuất nguyên liệu sinh học đòi hỏi các enzyme mới có năng suất cao và chi phí thấp hơn Phương pháp tiếp cận metagenomics phân tích các cộng đồng vi sinh vật tự nhiên phức tạp, cho phép chọn lọc các enzyme có hiệu quả cao để ứng dụng vào ngành công nghiệp sản xuất nhiên liệu sinh học.Trong thực tế rất nhiều kết quả đã được công bố về phân tích và so sánh metagenome giữa các hệ thống vi sinh vật trong lên men khí sinh học, trong đường tiêu hóa của các động vật ăn cỏ như côn trùng, thú ăn cỏ hoặc nấm Trên thế giới đã công bố khoảng 75 triệu gen có sẵn của các loài vi sinh vật giữ vai trò quan trọng trong quá trình sản xuất nguyên liệu sinh học Trong đó có 21 bộ gen của vi khuẩn cổ methan, 24 bộ gen của vi khuẩn sản xuất hydro hoặc điện năng và 30 bộ gen của cyanobacteria vốn là sinh vật diesel sinh học tiềm năng Ít nhất một nửa bộ gen vi khuẩn hoàn thiện có liên quan đến năng lượng sinh học tạo ra trong 2 năm qua, trên 80 bộ gen liên quan đến năng lượng sinh học đang được thiết lập trình tự [11] Quỹ thông tin về hệ gen ngày càng phát triển, sẽ cung cấp nhiều mục tiêu phân tử di truyền và hậu di truyền, mang lại nhiều thông tin thiết yếu về các loài vi sinh vật có trong cộng đồng, cũng như các phản ứng trao đổi chất mà chúng thực hiện Hệ gen cùng với ngành khoa học sắp xếp trình tự DNA và nghiên cứu protein sẽ làm tăng hiểu biết của chúng ta về các vi sinh vật sản xuất năng lượng sinh học

Trong xử lí môi trường:

Các số liệu về metagenome của cộng đồng vi sinh vật khi sử dụng kĩ thuật metagenomic có thể cải thiện các chiến lược để theo dõi tác động của các chất gây ô nhiễm hệ sinh thái và làm sạch môi trường bị ô nhiễm [4] Tăng hiểu biết về cách mà