Xác định đột biến trên gen KRAS ở bệnh nhân ung thư trực tràng tại việt nam

Đồng thời các thử nghiệm lâm sàng đã khẳng định cetuximab và panitumumab những thuốc được chỉ định điều trị ung thư đại trực tràng hiện nay chỉ thật sự có tác dụng kéo dài thời gian sốn

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

-
 -

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI:

XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN TRÊN GEN KRAS

Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG TẠI VIỆT NAM

Giáo viên hướng dẫn : TS NGUYỄN HUY HOÀNG Sinh viên thực hiện : NGHIÊM THỊ BÍCH HẠNH Lớp : 11 -04, CNSH

HÀ NỘI, 5 - 2015

LỜI CÁM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Huy Hoàng

– Phó Viện trưởng, Trưởng phòng Hệ gen học chức năng, Viện Nghiên cứu hệ gen,

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam – Người thầy đã tận tình hướng

dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ và chia sẻ những khó khăn cho tôi trong

suốt quá trình thực hiện nghiên cứu và hoàn thành bài khóa luận này

Tôi cũng xin gửi lời cám ơn đặc biệt đến TS Nguyễn Thị Kim Liên - Phó

phòng Hệ gen học chức năng đã luôn theo sát giúp đỡ và chỉ bảo cho tôi trong suốt

quá trình tiến hành thí nghiệm Qua đây tôi cũng rất biết ơn tất cả các cô, các anh,

chị trong phòng đã dạy bảo tôi rất nhiều điều trong thời gian thực tập tại phòng

Tôi cũng chân thành cám ơn các thầy cô giáo giảng dạy tại Khoa Công

nghệ Sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý

báu và bổ ích trong suốt 4 năm học vừa qua

Cuối cùng tôi xin gửi lời tri ân tới bố mẹ, những người thân trong gia đình

và bạn bè xung quanh đã chia sẻ những khó khăn thử thách trong cuộc sống và công

việc để tôi có được kết quả này

Tôi xin chân thành cám ơn!

Hà Nội, ngày 22 tháng 5 năm 2015 Sinh viên

Nghiêm Thị Bích Hạnh

MỤC LỤC

LỜI CÁM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC BẢNG BIỂU vi

DANH MỤC HÌNH vii

MỞ ĐẦU 1

1.1.Ung thư đại trực tràng 4

1.1.1 Khái niệm ung thư 4

1.1.3.Các nguyên nhân và yếu tố nguy cơ dẫn đến ung thư đại trực tràng 5

1.1.4 Chẩn đoán và điều trị ung thư đại trực tràng 6

1.1.4.1 Chẩn đoán bằng lâm sàng và sinh hóa 6

1.1.4.2 Chẩn đoán bằng phương pháp sinh học phân tử 7

1.1.4.3.Điều trị bệnh ung thư đại trực tràng 7

1.1.5.2 Tình hình ung thư đại trực tràng ở Việt Nam 9

1.2 Gen KRAS 9

1.2.1 Cấu trúc gen KRAS 9

1.2.2 Chức năng, vai trò của gen KRAS trong việc đáp ứng điều trị với liệu pháp phân tử đích 11

1.2.3 Tình hình nghiên cứu về đột biến trên gen KRAS ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng trên thế giới và tại Việt Nam 12

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1.Vật liệu và hóa chất 14

2.1.1 Vật liệu 14

2.1.2 Hóachất 14

2.1.3 Thiết bị 15

2.2 Phương pháp nghiên cứu 16

2.2.1 Tách chiết DNA tổng số 16

2.2.2 Điện di DNA trên gel agarose 18

2.2.3 Đo quang phổ DNA 19

2.2.4.1 Nguyên lí kỹ thuật PCR 20

2.2.4.2.Nhân đoạn gen KRAS bằng kỹ thuật PCR 21

2.2.5.Tinh sạch sản phẩm PCR 22

2.2.6 Giải và phân tích trình tự gen KRAS 23

PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

3.1 Thu thập mẫu máu 25

3.2 Tách chiết DNA tổng số 25

3.3 Xác định nồng độ và độ tinh sạch mẫu DNA 26

3.4 Phản ứng PCR nhân gen 27

3.5 Thôi gel tinh sạch sản phẩm PCR 28

PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35

4.1 Kết luận 35

4.2 Kiến nghị 36

Epidermal growth factor receptor

Escherichia coli

Ethidium Bromide Europe, the Middle East and Africa Guanine

Guanosine-5-Diphosphate Guanosine-5-Triphosphat Kilô bazơ

Kilô Dalton Marker Polymerase chain reaction Thermus aquaticus

Nhiệt độ nóng chảy Ultraviolet

World health oganization Progression free survival Kirsten – ras/V – ki – ras 2 kirsten rat sarcomaviral oncogene homolog Optical Density

 Kí hiệu viết tắt các axit amin

Alanine Axit aspartic Cysteine Glycine Lysine Methionine Threonine Valine

DANH MỤC HÌNH

Hình1 Cấu trúc của ruột già 5

Hình 2 Vị trí gen K-RAS trên nhiễm sắc thể 12 10

Hình 3 Mô hình protein KRAS với các vùng quan trọng được đánh dấu 11

Hình 4 Sơ đồ phương pháp nghiên cứu 16

Hình 5 Các bước tách chiết DNA cơ bản 17

Hình 6 Điện di kiểm tra DNA tổng số trên gel agarose 0,8% 25

Hình 7 DNA nhân bởi cặp mồi KR1có kích thước 445bp 27

Hình 8 DNA nhân bởi cặp mồi KR2 có kích thước 297bp 28

Hình 9 DNA nhân bởi cặp mồi KR3 có kích thước 375bp 28

Hình 10 Đột biến dị hợp tử M67V ở bệnh nhân KR10, 11, 12, 14, 15, 17 29

Hình 11 Đột biến dị hợp tử V103D ở bệnh nhân KR7 30

Hình 12 Đột biến dị hợp tử M111K ở bệnh nhân KR7, 9 30

Hình 13 Ảnh hưởng của các đột biến lên cấu trúc 3D của phân tử protein KRAS A: cấu trúc bình thường của protein KRAS tại vị trí 67; B: cấu trúc của protein KRAS khi bị đột biến tại vị trí M67V 32

Hình 14 Ảnh hưởng của các đột biến lên cấu trúc 3D của phân tử protein KRAS A: Cấu trúc bình thường của protein KRAS tại vị trí 103; B: Cấu trúc của protein KRAS khi bị đột biến tại vị trí V103D 32

Hình 15 Ảnh hưởng của các đột biến lên cấu trúc 3D của phân tử protein KRAS A: Cấu trúc bình thường của protein KRAS tại vị trí 111; B: Cấu trúc của protein KRAS khi bị đột biến tại vị trí M111K 33

MỞ ĐẦU

Theo báo cáo thường niên của Viện nghiên cứu ung thư Hoa Kỳ, hàng năm thế

giới có thêm khoảng 12 triệu ca ung thư mới và khoảng 7,6 triệu ca tử vong, tức

trung bình mỗi ngày có hơn 200 nghìn bệnh nhân ung thư tử vong Riêng khu vực

Đông và Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam hàng năm có thêm khoảng 3,6 triệu ca

ung thư mới với khoảng 2,5 triệu bệnh nhân tử vong [34]

Ung thư đại trực tràng (Colorectal cancer – CRC) là loại ung thư hay gặp đứng

hàng thứ 2 ở nữ và hàng thứ 3 ở nam giới trên thế giới [17] Đây là nguyên nhân

gây tử vong đứng hàng thứ 4 sau ung thư phổi, ung thư dạ dày và ung thư gan trên

thế giới [25] Là một trong những ung thư đường tiêu hóa có tiên lượng tốt Tuy

nhiên, nếu được phát hiện muộn thì cũng giống như tất cả các loại ung thư khác,

khả năng điều trị ít hiệu quả Vì vậy, cần phát hiện khi ung thư còn ở giai đoạn sớm

hoặc các tổn thương tiền ung thư [29]

Theo WHO (năm 2008), mỗi năm có khoảng 7,6 triệu người chết vì ung thư

trên toàn thế giới, trong đó có khoảng 70% các ca tử vong xảy ra ở các nước có thu

nhập thấp và trung bình, trong đó có khoảng 30% các ca ung thư có thể được ngăn

chặn

Một trong những đặc điểm nổi bật của ung thư đại trực tràng là có sự biểu hiện

cao của thụ thể tăng trưởng biểu bì (Epidermal Growth Factor Receptor – EGFR)

Nghiên cứu cho thấy việc điều hòa quá trình truyền tín hiệu từ thụ thể EGFR tới

nhân tế bào có sự tham gia rất tích cực của một nhóm protein mang hoạt tính

GTPase nổi bật là KRAS Nghiên cứu dịch tễ học cho thấy có khoảng 25 - 40%

bệnh nhân ung thư đại trực tràng mang đột biến gen KRAS Đồng thời các thử

nghiệm lâm sàng đã khẳng định cetuximab và panitumumab (những thuốc được chỉ

định điều trị ung thư đại trực tràng hiện nay) chỉ thật sự có tác dụng kéo dài thời

gian sống và thời gian sống không bệnh cho các bệnh nhân không mang đột biến

gen KRAS Điều này có nghĩa việc chẩn đoán đột biến gen KRAS là điều bắt buộc

trước khi cân nhắc chỉ định các phác đồ điều trị đích sử dụng thuốc ức chế EGFR

(cetuximab và panitumumab) cho bệnh nhân ung thư đại trực tràng [35]

Những năm gần đây với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, các bệnh

nhân ung thư ngoài việc được chữa trị bằng các phương pháp điều trị truyền thống

như phẫu thuật, hóa trị, xạ trị họ còn được hướng dẫn điều trị theo một liệu pháp

mới hiệu quả hơn, ít độc hại hơn, đó là “ liệu pháp phân tử đích” Liệu pháp mới

cho thấy có nhiều ưu điểm, đặc biệt khi bệnh nhân điều trị bằng hóa học thất bại,

liệu pháp mới này tác dụng phụ ít, khi sử dụng kết hợp liệu pháp mới với phương

pháp hóa học sẽ giúp kéo dài sự sống hơn cho bệnh nhân

KRAS là một proto – oncogene liên quan đến nhiều loại bệnh ung thư KRAS

mã hóa cho một GTPase nhỏ gồm 188 hoặc 189 aa, tham gia vào quá trình truyền

tín hiệu nội bào KRAS nằm trong con đường truyền tín hiệu của EGFR Protein

KRAS hoạt động như một công tắc phân tử trong con đường truyền tín hiệu nội bào

trong đó quy định các chức năng quan trọng cho sự tiến triển của tế bào, bao gồm cả

sự biệt hóa, sự phát triển và chết theo chu trình Các đột biến trên gen KRAS dẫn

đến hoạt động GTPase của protein KRAS bị suy giảm, GTP không bị cắt thành

GDP, khi đó hoạt động truyền tín hiệu của protein KRAS sẽ diễn ra liên tục mà

không cần tới sự có mặt các kích thích của đường truyền tín hiệu EGFR/HER [27]

Đột biến gen KRAS xuất hiện sớm trong ung thư đại trực tràng và chiếm khoảng 30

- 40% [3] Vì vậy, bệnh nhân có đột biến gen KRAS có phản ứng kém khi điều trị

với các thuốc ức chế EGFR Đột biến gen KRAS thường xuyên nhất ở các codon 12,

13, 61 và 146 [6] Các phương pháp xác định đột biến hiện nay chủ yếu là sinh học

phân tử như: tiến hành khuếch đại đoạn gen mong muốn nhờ những mồi đặc hiệu,

đọc trình tự các đoạn được nhân lên và tìm đột biến

Trong nghiên cứu của đề tài này, với mong muốn hướng tới áp dụng liệu pháp

điều trị đích cho bệnh nhân ung thư đại trực tràng trên người bệnh ở Việt Nam,

trước hết nghiên cứu cần tìm hiểu về đột biến trên gen KRAS, vùng đột biến thường

xuyên xuất hiện, kiểu đột biến, các phương pháp kỹ thuật được áp dụng để tìm đột

biến, để từ đó bác sĩ có thể đưa ra phác đồ điều trị thích hợp cho từng bệnh nhân cụ

thể giúp giảm thời gian và chi phí điều trị cho bệnh nhân

Xuất phát từ vấn đề trên, khóa luận: “Xác định đột biến trên gen KRAS ở bệnh

nhân ung thư đại trực tràng tại Việt Nam” được tiến hành với nội dung nghiên cứu

bao gồm:

- Thu thập mẫu máu của bệnh nhân bị ung thư đại trực tràng

- Tách chiết và bảo quản DNA tổng số

- Xác định đột biến trên gen KRAS bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen

- So sánh và phân tích những thay đổi nucleotide và thay đổi amino acid trên

KRAS

 Mục tiêu của đề tài: Phát hiện những đột biến trên gen KRAS ở bệnh nhân

ung thư đại trực tràng

 Ý nghĩa của đề tài: Kết quả nghiên cứu ở mức độ gen ở bệnh nhân mắc ung

thư đại trực tràng sẽ giúp các bác sĩ đưa ra hướng điều trị đúng đắn cũng như tư vấn

di truyền cho bệnh nhân

Phần I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Ung thư đại trực tràng

1.1.1 Khái niệm ung thư

Theo định nghĩa của WHO: Ung thư là một thuật ngữ chung cho một nhóm

lớn các bệnh có thể ảnh hưởng đến bất kỳ phần nào của cơ thể Các tế bào phân chia

và phát triển không kiểm soát được, hình thành các khối u ác tính và xâm nhập vào

các bộ phận ở gần hoặc xa cơ thể thông qua hệ thống bạch huyết hoặc máu của cơ

thể gọi là di căn Di căn là nguyên nhân chính gây ung thư

Ung thư phát sinh từ một tế bào đơn lẻ Việc chuyển đổi từ một tế bào bình

thường thành tế bào khối u là một quá trình nhiều giai đoạn, thường là một sự tiến

triển từ một tổn thương tiền ung thư đến các khối u ác tính Những thay đổi này là

kết quả của sự tương tác giữa các yếu tố di truyền của người và các tác nhân bên

ngoài, bao gồm:

Tác nhân vật lý, như bức xạ tử ngoại và bức xạ ion hóa

Tác nhân hóa học, như amiang, các thành phần của khói thuốc lá, aflatoxi

(chất gây ô nhiễm thực phẩm) và thạch tín (một chất gây ô nhiễm nước uống)

Tác nhân sinh học, như nhiễm trùng virut, vi khuẩn hoặc ký sinh trùng

Cũng theo WHO, ung thư là nguyên nhân hàng đầu trên thế giới dẫn đến tử

vong và chiếm 7,6 triệu ca tử vong (khoảng 13% trong tất cả các ca tử vong) năm

2008, các loại ung thư chính là:

− Phổi (1.370.000 trường hợp tử vong)

− Dạ dày (736.000 trường hợp tử vong)

− Gan (695.000 trường hợp tử vong )

− Đại trực tràng (608.000 trường hợp tử vong)

− Vú (458.000 trường hợp tử vong)

− Cổ tử cung (275.000 trường hợp tử vong)

Khoảng 70% của tất cả các ca tử vong do ung thư xảy ra ở các nước có thu

nhập thấp và trung bình Trường hợp tử vong từ bệnh ung thư trên toàn thế giới

được WHO dự đoán sẽ tiếp tục tăng lên hơn 13,1 triệu vào năm 2030

1.1.2 Khái niệm ung thư đại trực tràng

Ung thư đại trực tràng là ung thư phát khởi nguyên thủy từ các mô đại

tràng (phần dài nhất của ruột già) hoặc trực tràng (vài cm cuối cùng của ruột già

trước hậu môn)

Ung thư đại trực tràng có thể gặp ở bất cứ vị trí nào của đại tràng: trực tràng,

đại tràng sigma (đại tràng chậu hông), đại tràng xuống, đại tràng ngang, đại tràng

lên và manh tràng Khoảng 42% ung thư nằm tại vị trí đại tràng phải bao gồm:

manh tràng, đại tràng lên, đại tràng ngang, gần 60% ung thư nằm tại đại tràng trái

bao gồm: đại tràng xuống, đại tràng sigma và trực tràng [28]

Hình1 Cấu trúc của ruột già

Những khối u lành tính được gọi là polyp, khối u ác tính được gọi là ung thư

đại trực tràng Những khối u polyp lành tính không thể xâm lấn vào những mô lân

cận và không thể lan tràn đến những cơ quan khác trong cơ thể Những polyp này

thường có thể cắt bỏ dễ dàng trong tiến trình nội soi đại trực tràng và không nguy

hại đến đời sống bệnh nhân Nếu polyp không được cắt bỏ, nó có thể trở thành ác

tính (ung thư hóa polyp) một thời gian sau đó Ung thư đại trực tràng có thể xâm lấn

và gây tổn hại mô và cơ quan lân cận Ung thư cũng có thể lan tràn đến các cơ quan

khác trong cơ thể như phổi hay gan

1.1.3 Các nguyên nhân và yếu tố nguy cơ dẫn đến ung thư đại trực

tràng

Cho tới nay, cũng giống như nhiều loại ung thư khác người ta cũng chưa biết

được nguyên nhân gây ung thư đại trực tràng Trên 75-95% ung thư đại trực tràng

xuất hiện ở những người không có liên quan tới yếu tố về gen [24], [7]

− Các polip đại trực tràng: Phần lớn ung thư đại trực tràng xuất hiện từ các

polyp ung thư hóa Polyp tuyến là loại hay ung thư hóa khi mà kích thước >1cm

− Viêm loét đại tràng hoặc bệnh Crohn: Người đã bị một bệnh lý gây ra viêm

đại tràng (như viêm loét đại tràng hoặc bệnh Crohn) trong nhiều năm sẽ có nguy cơ

tăng cao [30]

− Tiền sử gia đình có người mắc bệnh: Những người có bố mẹ và anh chị em

ruột bị ung thư đại trực tràng thì khả năng người đó bị ung thư đại trực tràng cao

gấp 2-3 lần so với người không có tiền sử gia đình bị ung thư đại trực tràng

− Tiền sử cá nhân từng bị ung thư: Người đã bị ung thư đại trực tràng có thể

phát triển ung thư đại trực tràng lần thứ hai Ngoài ra, phụ nữ có tiển sử ung thư

buồng trứng, tử cung (nội mạc tử cung) hoặc ung thư vú có nguy cơ cao hơn bị ung

thư đại trực tràng [30]

− Giới tính: Nam giới hay bị hơn nữ giới, người lớn tuổi hay bị hơn so với

người trẻ tuổi [7]

− Tuổi: Ung thư đại trực tràng tăng dần theo tuổi.Tại Hoa Kỳ, chỉ khoảng

0,1% ung thư đại trực tràng được chẩn đoán ở tuổi 20; 1,1% ở tuổi 20-34; 4% ở tuổi

35-44%; 13,4% ở tuổi 45-54; 20,4% ở tuổi 55-64; 24% ở tuổi 65-74; 25% ở tuổi

75-84 và 25% ở tuổi 85 Như vậy 94,9% ung thư đại trực tràng được chẩn đoán ở tuổi

>45

− Các yếu tố lối sống: Chế độ ăn nhiều chất béo, ăn nhiều thịt đỏ, uống

nhiều rượu, béo phì, hút thuốc lá, ít vận động thể lực [7] Khoảng 10% số trường

hợp ung thư đại trực tràng liên quan tới ít vận động Nguy cơ ung thư đại trực tràng

tăng lên khi một ngày uống trên 2 đơn vị cồn với nam và 1 đơn vị cồn với nữ (theo

tiêu chuẩn 1 đơn vị cồn của Hoa Kỳ tương đương 14g ethnol, bằng khoảng 300ml

bia 5 độ và khoảng 120ml rượu vàng 12 độ) Ăn nhiều rau quả tươi và nhiều chất xơ

làm giảm nguy cơ ung thư đại trực tràng [24]

1.1.4 Chẩn đoán và điều trị ung thư đại trực tràng

1.1.4.1 Chẩn đoán bằng lâm sàng và sinh hóa

- Xét nghiệm máu trong phân: Đôi khi các ung thư hay các u thịt (các polip)

gây chảy máu, và xét nghiệm phân có thể phát hiện một lượng nhỏ máu Nếu xét

nghiệm này cho thấy có máu, khi đó các xét nghiệm khác là cần thiết để tìm nguồn

gốc của máu Các tình trạng lành tính (như bệnh trĩ), cũng có thể gây ra máu trong

xét nghiệm này

- Sự bơm thụt bari tương phản kép: Thủ thuật này liên quan đến việc làm đầy

đại tràng và trực tràng với một chất lỏng màu trắng (Bari) để nâng chất lượng các

hình ảnh X-quang Các bất thường (như các bướu thịt- polip) có thể được nhìn thấy

rõ ràng

- Soi đại trực tràng sigma: Bác sĩ kiểm tra trực tràng và phần dưới của đại

tràng với một ống sáng (ống soi đại trực tràng sigma) Sự phát triển tiền ung thư và

ung thư trực tràng và phần dưới của đại tràng có thể được tìm thấy và hoặc được lấy

ra hoặc được sinh thiết

- Nội soi ảo đại tràng: Trong xét nghiệm này, thiết bị X-quang đặc biệt được

sử dụng để đưa ra các hình ảnh của đại tràng và trực tràng Một máy tính tập hợp

những hình ảnh này thành các hình ảnh chi tiết mà nó có thể hiển thị các bướu thịt –

polip và các bất thường khác [31]

1.1.4.2 Chẩn đoán bằng phương pháp sinh học phân tử

Nền tảng của phương pháp này là kỹ thuật PCR dùng những cặp mồi đặc hiệu

để nhân đoạn gen mong muốn, từ đó giải trình tự tìm ra đột biến Những đoạn gen

thường dùng để chẩn đoán ung thư đại trực tràng là KRAS, p53 và APC Thêm vào

đó, ưu điểm của phương pháp này là phát hiện trực tiếp được cũng như kiểm tra

được khả năng mắc bệnh ngay từ bố mẹ để từ đó dự đoán khả năng mắc bệnh ở con

cái Trong khóa luận này, chúng tôi sẽ tập trung vào nghiên cứu trên gen KRAS

1.1.4.3 Điều trị bệnh ung thư đại trực tràng

Phẫu thuật cắt bỏ khối u vẫn là phương pháp điều trị hiện nay, bên cạnh đó các

phương pháp hóa trị, xạ trị và liệu pháp phân tử đích cũng đang trở thành một phần

không thể thiếu trong điều trị ung thư đại trực tràng Điều trị đích ung thư đại trực

tràng dựa trên sự phát hiện các đột biến gen Những đột biến liên quan đến các gen

như KRAS, BRAF, PIK3CA đã được phát hiện [4], [10], [22] Trên gen KRAS các

đột biến thường xảy ra nhất ở các codon 12, 13, 61, và 146 xảy ra ở 25 – 40% bệnh

nhân [5] Hiện nay, ngày càng nhiều nhà khoa học công nhân rằng một số gen bị đột

biến có thể trở thành đích để phát triển các thuốc điều trị đích ung thư đại trực tràng

[10],[9],[24] Điều trị đích chống lại EGFR có cetuximab và panitumumab Đột

biến điểm ở codon 12, 13 cũng được xác định là gây ra đáp ứng thấp với việc điều

trị bằng cetuximab và panitumumab ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng [6] Khoảng

4/10 số bệnh nhân mắc ung thư đại trực tràng có đột biến gen KRAS đã làm cho các

loại thuốc này không hiệu quả Các bác sĩ hiện nay thường kiểm tra các đột biến này

và chỉ sử dụng loại thuốc này ở những người không có đột biến gen Trong ung thư

có thể có rất nhiều gen đột biến và loại đột biến khác nhau Tuy nhiên, không phải

bất kỳ đột biến nào ở các gen có liên quan đến ung thư cũng ảnh hưởng đến hiệu

quả điều trị đích Vì vậy, việc xác định các đột biến trên các gen có liên quan đến

ung thư là yếu tố quyết định cho điều trị đích thành công [36]

Liệu pháp phân tử đích là liệu pháp được sử dụng rộng rãi trong điều trị ung

thư, dùng các loại thuốc sinh học để khóa sự tăng trưởng và lan tràn của ung thư,

can thiệp vào các phân tử đặc hiệu trong cơ chế sinh ung thư và sự tăng trưởng của

khối u.Kháng thể đơn dòng chống EGFR là cetuximab (ErbituxTM, imclone

systems) và panitumumab (VectibixTM, Amgen) đã được FDA ( cục quản lý thực

phẩm và dược phẩm) chấp nhận cho điều trị ung thư đại trực tràng vào năm 2004 và

2006 [14]

Hai tác nhân sinh học này là các kháng thể đơn dòng nhắm mục tiêu là thụ thể

yếu tố tăng trưởng biểu bì (epidermal growth factor receptor-EGFR) Cetuximab

(Erbitux) là một kháng thể khảm đơn dòng (chimeric monoclonal antibody) đã được

phê duyệt như đơn trị liệu hoặc kết hợp với irinotecan (camptosar) ở những bệnh

nhân ung thư đại trực tràng di căn không đáp ứng với điều trị fluoropyrimidine và

oxaliplatin Panitumumab (vectibix) là kháng thể đơn dòng hoàn toàn của người

hiện nay được chỉ định như một đơn trị liệu cho bệnh nhân ung thư đại trực tràng

không thành công hoặc không dung nạp với hóa trị liệu kết hợp Một thử nghiệm

gần đây của Hecht và cộng sự [32], đánh giá panitumumab phối hợp với

becvacizumab và hóa trị liệu (dựa trên oxaliplatin và irinotecan) như điều trị bước

đầu cho ung thư đại trực tràng di căn đã kết luận rằng việc bổ sung panitumumab

gây tăng độc tính và giảm tỷ lệ sống còn không diễn tiến bệnh

1.1.5.1 Tình hình ung thư đại trực tràng trên thế giới

Theo Tổ chức Y tế thế giới, trong năm 2012, trên thế giới có 1,4 triệu người

được chẩn đoán bị ung thư đại trực tràng, chiếm 9,7% tổng số các loại ung thư, là

loại ung thư phổ biến thứ ba trên thế giới sau ung thư phổi (1,8 triệu, 13%) và ung

thư vú (1,7 triệu, 11,9%)

Theo số liệu thống kê của Globocan 2008, ung thư đại trực tràng là bệnh ung

thư phổ biến thứ ba ở nam giới (chiếm 10% tổng các loại ung thư) và thứ hai ở nữ

giới (chiếm 9,4% tổng các loại ung thư) Gần 60% các trường hợp ung thư đại trực

tràng xảy ra ở các nước phát triển (tỷ lệ mắc bệnh cao gấp 10 lần ở cả hai giới so

với toàn thế giới, đứng thứ hai chỉ sau ung thư phổi) Ở các nước đang phát triển tỷ

lệ mắc bệnh đứng hàng thứ 8.Tỷ lệ mắc bệnh cao nhất ước tính ở Australia/New

Zealand và Tây Âu, thấp nhất ở châu Phi (ngoại trừ Nam Phi) và Nam-Trung Á Có

khoảng 608.000 ca tử vong do ung thư đại trực tràng trên toàn thế giới, chiếm 8%

các ca tử vong do ung thư nói chung

1.1.5.2 Tình hình ung thư đại trực tràng ở Việt Nam

Việt Nam là một trong những nước có tỷ lệ ung thư nhiều nhất thế giới Mỗi

năm cả nước có thêm khoảng 150.000 ca mắc mới các bệnh ung thư và 75.000 ca tử

vong do ung thư, đứng thứ 2 chỉ sau bệnh tim mạch (Hiệp hội ung thư Việt Nam) 5

loại ung thư hàng đầu ở nam giới là phổi, gan, đại trực tràng, dạ dày và vòm hầu

(chiếm 58%); còn ở nữ giới là vú, cổ tử cung, đại trực tràng, phổi và tuyến giáp

(chiếm 63%) Đặc biệt, ở nữ giới có sự gia tăng tỉ lệ ung thư vú, đại trực tràng và

tuyến giáp Như vậy, ở Việt Nam ung thư đại tràng cũng được xếp đứng thứ ba ở cả

nam và nữ Việc điều trị có hiệu quả bệnh ung thư phụ thuộc rất nhiều vào sự đáp

ứng của mỗi bệnh nhân đối với liệu pháp sử dụng, do đó cần có những nghiên cứu

sâu về mặt di truyền những yếu tố có ảnh hưởng đến quá trình điều trị

1.2 Gen KRAS

1.2.1 Cấu trúc gen KRAS

KRAS là thành viên của gia đình gen RAS mã hóa cho protein G với hoạt động

GTPase nội bào KRAS nằm trong con đường truyền tín hiệu của EGFR Protein

KRAS hoạt động như một công tắc phân tử trong con đường truyền tín hiệu nội bào

trong đó quy định các chức năng quan trọng cho sự tiến triển của tế bào, bao gồm cả

sự biệt hóa, sự phát triển và chết theo chu trình [3]

Gen KRAS có tên chính thức là sarcoma rat kirsten virus homolog oncogene,

được xác định vào năm 1975 từ các nghiên cứu của loại virus gây ung thư là virus

sarcoma kirsten bởi Scolnick và cộng sự [ 3] Gen K-RAS nằm trên cánh ngắn của

nhiễm sắc thể 12, ở vị trí 12.1: (12p12.1) Cụ thể là các gen K-RAS nằm từ nucleotid

25358179 đến nucleotid 25403853 trên nhiễm sắc thể 12

Hình 2 Vị trí gen K-RAS trên nhiễm sắc thể 12 ( McGrath J.P (1983))

Sản phẩm của gen KRAS là protein KRAS chứa 188 amino acid có khối lượng

phân tử 21,6 kD, và tham gia dẫn truyền tín hiệu nội bào [19] Có hai vùng quan

trọng là Switch 1 (30-38 aa) và Switch 2 (59-67 aa) hình thành nên vòng phản ứng

lại kích thích, điều khiển bởi đặc trưng liên kết của GTPase với phân tử phản ứng

kích thích của nó Vùng Switch I và II đóng vai trò quan trọng trong liên kết của

yếu tố điều hòa và yếu tố ảnh hưởng

Hình 3 Mô hình protein KRAS với các vùng quan trọng được đánh dấu

1.2.2 Chức năng, vai trò của gen KRAS trong việc đáp ứng điều trị với

liệu pháp phân tử đích

Gen K-RAS là gen sinh ung thư, gen K-RAS mã hóa cho protein KRAS tham gia

chủ yếu trong việc điều hành phân chia tế bào Thông qua một quá trình truyền tín hiệu

(transduction), protein truyền tín hiệu từ ngoài tế bào vào đến nhân tế bào Các tín hiệu

này kích hoạt tế bào để phát triển và phân chia hoặc trưởng thành với những chức năng

chuyên biệt Protein K-RAS là một GTPase, enzym có chức năng chuyển đổi phân tử

GTP (Guanosine-5,-Triphosphate) thành phân tử GDP (Guanosine-5,-Diphosphate)

Protein K-RAS hoạt động như một chuyển đổi, nó có thể hoạt động (kích hoạt) hay yên

nghỉ (bất hoạt) Để truyền tín hiệu, protein K-RAS phải được kích hoạt bằng cách gắn

vào một phân tử của GTP Protein K-RAS bị bất hoạt khi nó chuyển đổi các GTP tới

GDP, khi protein kết hợp với GDP, nó không truyền tín hiệu tới nhân tế bào Những

sản phẩm protein của gen K-RAS đóng vai trò quan trọng trong phân bào, sự khác

biệt tế bào và sự chết tế bào theo chương trình (apoptosis)

Trong tế bào, protein KRAS được giữ cân bằng thông qua sự hình thành 2

phức hợp tương ứng với các trạng thái của protein KRAS: Phức hợp KRAS-GTP

(Protein KRAS được hoạt hóa) và phức hợp KRAS-GDP (Protein KRAS bị bất

hoạt) Protein KRAS được hoạt hóa nhờ yếu tố chuyển nucleotide guanine (guanine

nucleotide exchange factors (GEFs)) Việc truyền tín hiệu của protein KRAS bị ức

chế khi phức hợp KRAS-GTP bị phân hủy thành phức hợp KRAS-GDP nhờ một

loại protein có chức năng hoạt hóa GTPase (GAPs) Ở điều kiện sinh lý bình

thường, nồng độ KRAS-GTP trong cơ thể được kiểm soát chặt chẽ nhờ sự hoạt

động nhịp nhàng của 2 yếu tố GEFs và GAPs

Khi gen KRAS bị đột biến sẽ mã hóa cho những protein KRAS mới có khả

năng chống lại hoạt tính GTPase của GDPs Do đó, những protein KRAS đột biến

này luôn luôn tồn tại ở trạng thái hoạt hóa KRAS-GTP Protein KRAS ở trạng thái

bình thường luôn bị bất hoạt sau một khoảng thời gian rất ngắn, các protein KRAS

đột biến có khả năng kích hoạt vĩnh viễn các con đường truyền tín hiệu nằm xuôi

dòng nó bất kể có sự hoạt hóa của thụ thể EGFR/HER nào hay không Đây chính là

cơ chế phân tử lý giải cho tình trạng kháng thuốc điều trị đích ở bệnh nhân ung thư

đại trực tràng có đột biến trên gen KRAS [3]

1.2.3 Tình hình nghiên cứu về đột biến trên gen KRAS ở bệnh nhân ung

thư đại trực tràng trên thế giới và tại Việt Nam

Trên thế giới, có nhiều nghiên cứu cho thấy đột biến trên gen KRAS có ảnh

hưởng đến hiệu quả điều trị bằng liệu pháp phân tử đích Đột biến trên gen KRAS

xảy ra với tần xuất 17 – 25% ở tất cả các loại ung thư [3] Tuy nhiên, tần xuất này

thay đổi ở mỗi loại bệnh ung thư bao gồm: 36% bệnh nhân ung thư đại trực tràng,

20% bệnh nhân ung thư phổi và 65 – 100% bệnh nhân ung thư tuyến tụy [20] Tỷ lệ

này được xác định là 30 – 60% bệnh nhân ung thư đại trực tràng, 60% bệnh nhân

ung thư tuyến tụy, 33% bệnh nhân ung thư mật, 17% bệnh nhân ung thư buồng

trứng, 15% bệnh nhân ung thư màng trong dạ con và 30 – 40% bệnh nhân ung thư

phổi các loại [28]

Gần 90% đột biến làm mất hoạt tính của protein KRAS là đột biến tại codon

12 – 13 trên exon 1 và 5% là đột biến tại codon 61 trên exon 2 Amino acid 12 và

13 là vị trí GTP-binding P-loop và amino acid 61 nằm trên vùng switch-I [21]

Đối với bệnh ung thư đại trực tràng, đột biến ở codon 12 và 13 trên gen KRAS

xảy ra ở 25 – 40% bệnh nhân [4] Đột biến điểm ở codon 12 và 13 cũng được xác

định là gây ra đáp ứng thấp với việc điều trị bằng cetuximab và panitumumab ở

bệnh nhân ung thư đại trực tràng [6] Vì vậy, đột biến này là một chỉ thị phân tử

quan trọng cho việc sử dụng liệu pháp phân tử đích với chất ức chế thụ thể EGFR

Ở Việt Nam, cũng đã có nhiều nghiên cứu về ung thư đại trực tràng, nhưng

chủ yếu về đặc điểm lâm sàng, hình ảnh nội soi và mô bệnh học, còn ít thấy có

những nghiên cứu về đột biến gen trong ung thư đại trực tràng và trên mẫu máu

Theo nghiên cứu GS.TS Tạ Thành Văn – Trường Đại Học Y Hà Nội với đề

tài: “Nghiên cứu xác định đột biến gen quyết định tính đáp ứng thuốc trong điều trị

ung thư đại trực tràng và ung thư phổi”.Đề tài nghiên cứu nhằm thực hiện các mục

tiêu: xác định tỷ lệ đột biến EGFR, KRAS đối với bệnh nhân ung thư phổi không tế

bào nhỏ và gen KRAS và BRAF đối với bệnh nhân ung thư đại trực tràng: thiết lập

bản đồ đột biến gen, công bố các dạng đột biến và các vùng đột biến trọng điểm,

đánh giá hiệu quả điều trị ung thư ở hai nhóm bệnh nhân sử dụng liệu pháp điều trị

đích và liệu pháp hóa hoặc xạ trị, chế tạo thử nghiệm được 2 bộ kit (mỗi bộ 100

test) chẩn đoán nhanh đột biến gen EGFR, KRAS ở các bệnh nhân ung thư phổi

không tế bào nhỏ và ung thư đại trực tràng ở Việt Nam [33]

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu và hóa chất

2.1.1 Vật liệu

Vật liệu là 15 mẫu máu của bệnh nhân mắc bệnh ung thư đại trực tràng được

thu thập từ Bệnh viện Hòe Nhai và Bệnh viện Đại học Y Hà Nội

2.1.2 Hóachất

Các hóa chất chính được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm :

• Bộ KIT GeneJET Whole Blood Genomic DNA purification Minikit của

hãng Thermo (Mỹ) dùng để tách chiết DNA tổng số

• Bộ KIT GeneJET Gel Extraction của hãng Thermo (Mỹ) dùng để tinh

• Và một số hóa chất khác như nước cất một lần, ethanol,

Các cặp mồi dùng trong phản ứng PCR nhân đoạn exon trên gen KRAS được

tổng hợp ở HãngIDT (Mỹ) (bảng 1)

Bên cạnh đó, dựa vào trình tự DNA chuẩn của đoạn gen KRAS, 3 cặp mồi xuôi

và ngược được thiết kế để nhân những đoạn exon của gen KRAS nhờ kỹ thuật PCR

Bảng 1: Trình tự 3 cặp mồi dùng cho PCR

1 KR1F 5’-A GAC CAT GCT CAG ATC TTC CAT-3’ 445bp

2 KR1R 5’-G CAA AGT TCA TTA GAA CTG ATC-3’

3 KR2F 5’-TA ATG GAT CAT GGG CCA TGT-3’ 297bp

4 KR2R 5’-AGG ACA GGA GTA CCA AGA AGT GAG-3’

5 KR3F 5’-TA ATG GAT CAT GGG CCA TGT-3’ 375bp

6 KR3R 5’-AC AGT GTT GAA TGT GGT GCA-3’

- Cân điện tử Precisa (Thụy Sỹ);

- Máy chu trình nhiệt GeneAmp PCR System 9700 (Mỹ);

- Máy chụp gel BioRad (Đức);

- Tủ lạnh Toshiba (Nhật Bản);

- Máy điện di Mupid -2plus (Nhật Bản);

- Máy spin Picofuge (Mỹ);

- Pipette Gilson (Pháp);

- Bể ổn nhiệt Memmert (Hàn Quốc);

- Bộ dụng cụ điện di (Đài Loan);

- Máy đo quang phổ (Đức)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Hình 4 Sơ đồ phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Tách chiết DNA tổng số

Quá trình tách chiết DNA tổng số từ mẫu máu theo phương pháp tách DNA

được mô tả bởi Sambrook và cộng sự [22] Phương pháp này bao gồm những bước

chính sau:

Thu thập mẫu máu bệnh nhân

Tách chiết DNA tổng số từ mẫu máu

Nhân DNA bằng những cặp mồi đặc hiệu nhờ kỹ thuật PCR

Thôi gel, tinh sạch sản phẩm PCR

Phân tích, so sánh với trình tự KRAS chuẩn Giải trình tự các exon trên gen KRAS