Nghiên cứu và chế phẩm nitrat hóa để xử lý nước thải nuôi trồng hải sản

Nguyên nhân chính của tình trạng này là do lượng thức ăn dư thừa và các chất thải của động vật nuôi, ngoài ra trong môi trường nuôi con giống còn chứa dư lượng kháng sinh, dược phẩm, thu

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:

NGHIÊN CỨU VÀ CHẾ PHẨM NITRAT HOÁ ĐỂ XỬ LÝ

NƯỚC THẢI NUÔI TRỒNG HẢI SẢN

Giáo viên hướng dẫn : TS Hoàng Phương Hà Sinh viên thực hiện : Trần Thị Dương

Lời cảm ơn

Đầu tiên cho tôi gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến TS Hoàng Phương Hà, người đã trực tiếp chỉ dạy và hướng dẫn tôi một cách tận tình trong suốt thời gian tôi thực hiện khóa luận này

Cho tôi gửi lời cảm ơn đến TS Đỗ Thị Tố Uyên - phó trưởng phòng, phụ

trách Phòng Công nghệ Sinh học Môi trường (Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) đã tạo mọi điều kiện tốt nhất trong suốt thời gian tôi thực tập tại phòng thí nghiệm

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến sự giúp đỡ và chỉ bảo tận tình của tập thể các cán bộ nghiên cứu khoa học tại phòng Công nghệ Sinh học Môi trường - Viện công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này

Đồng thời cho tôi gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô Khoa Công

nghệ Sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội đã truyền đạt những kiến thức bổ ích và

tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến những người thân trong gia đình, bạn bè đã luôn bên cạnh ủng hộ và giúp đỡ tôi rất nhiều về cả vật chất và tinh thần để tôi có thể hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn

Hà Nội, ngày 22 tháng 5 năm 2015

Sinh viên

Trần Thị Dương

Mục lục

Lời mở đầu 1

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Tổng quát chung về nghề nuôi trồng thủy sản của Việt Nam 4

1.2 Tình trạng ô nhiễm môi trường trong NTTS 5

1.3 Ảnh hưởng của nguồn nước bị nhiễm các hợp chất chứa nitơ tới môi trường NTTS 7

1.4 Chế phẩm vi sinh vật 8

1.4.1 Khái niệm chế phẩm sinh học 8

1.4.2 Lợi thế khi sử dụng chế phẩm sinh học trong xử lí nước 9

1.5 Chế phẩm nitrate hóa 9

1.5.1 Quá trình nitrate hóa 9

1.5.2 Hệ vi khuẩn nitrate hóa 11

1.8 Chất mang sử dụng trong chế phẩm 12

1.9 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 14

Phần 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị sử dụng 16

2.1.1 Nguyên liệu 16

2.1.2 Hóa chất, môi trường 16

2.2 Phương pháp nghiên cứu 17

2.2.1 Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật 17

2.2.2 Phương pháp cố định tế bào trên bề mặt chất mang rắn 18

2.2.3 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn trong chế phẩm [5] 20

2.2.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính nitrate hóa của chế phẩm 21

2.2.5 Phương pháp xác định độ ẩm của chế phẩm 27

2.2.6 Phương pháp đánh giá khả năng sinh trưởng và hoạt tính của vi khuẩn

nitrate hóa trên môi trường nước lợ 28

2.2.7 Phương pháp xác định khả năng xử lý amoni trên hệ lọc ở qui mô 10 lit28 Phần 3 KẾT QUẢ 29

3.1 Hoạt hóa và lựa chọn một số chủng vi khuẩn nitrate hóa có hoạt tính cao 29

3.2 Nhân nuôi vi khuẩn thu sinh khối 30

3.3.1 Ảnh hưởng của độ ẩm đến sinh trưởng của vi khuẩn trong quá trình lên men xốp 31

3.3.2 Ảnh hưởng của độ ẩm đến hoạt tính nitrate hóa của vi khuẩn trong quá trình lên men xốp 33

3.3.3 Đánh giá khả năng sinh trưởng và hoạt tính nitrate hóa của vi khuẩn trong môi trường nước lợ 37

3.4 Thử nghiệm chế phẩm trong hệ lọc dung tích 10 lit ở quy mô phòng thí nghiệm 39

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43

KẾT LUẬN 43

KIẾN NGHỊ 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO NƯỚC NGOÀI 45

Danh mục bảng viết tắt

NTTS Nuôi trồng thủy sản

Mục lục hình ảnh

Hình 1.1: Tình hình ô nhiễm môi trường nuôi tại các khu vực nuôi trồng 5

Hình 2.1: Sơ đồ tổng quan quy trình nhân giống vi sinh vật 18

Hình 2.2: Sơ đồ tổng quát quy trình tạo chế phẩm nitrate hóa 20

Hình 3.1: Biểu đồ hoạt tính của chế phẩm sau khi tạo thành 33

Hình 3.2: Hoạt tính của 4 loại chế phẩm trong 40 ngày 35

Hình 3.3 Hoạt tính của chế phẩm sau 3 tháng 36

Hình 3.4: Hoạt tính của chế phẩm tháng 4 37

Hình 3.5 Hoạt tính của chế phẩm trong môi trường chứa muối NaCl 38

Danh mục bảng

Bảng 1: Thành phần hóa học của tro trấu [ 8] 13

Bảng 2.1: Môi trường nuôi cấy vi khuẩn nitrate hóa 16

Bảng 3.1 Hoạt tính oxy hóa amoni của nhóm vi khuẩn oxy hóa amoni 29

Bảng 3.2 Hoạt tính oxy hóa nitrite của nhóm vi khuẩn oxy hóa nitrite 30

Bảng 3.3 Mật độ tê bào vi khuẩn nitrate hóa trong chế phẩm 31

Bảng 3.4 Khảo sát mật độ tế bào vi khuẩn trong chế phẩm theo thời gian 32

Bảng 3.2 Mật độ tế bào vi khuẩn của chế phẩm trong môi trường chứa muối NaCl 38

Bảng 3.5 Hiệu quả xử lí amoni của chế phẩm nitrate hóa ở mẻ thứ nhất 39

Bảng 3.6 Hiệu suất xử lí amoni của chế phẩm nitrate hóa ở mẻ thứ hai 40

Bảng 3.7 Hiệu suất xử lí amoni của chế phẩm nitrate hóa ở mẻ thứ ba 40

Lời mở đầu

Việt Nam đang bước vào thời kì công nghiệp hóa, hiện đại hóa nền kinh tế, nhằm đạt mục tiêu chiến lược là trở thành một đất nước công nghiệp tiên tiến vào năm 2020 Trong những năm gần đây, nhận thấy tầm quan trọng của nghề nuôi trồng thủy sản (NTTS), Chính phủ và Bộ thủy sản đã dành sự ủng hộ mạnh mẽ cho

sự phát triển bền vững của ngành NTTS Một trong số các hỗ trợ đó là tăng cường nguồn kinh phí cho phát triển và nâng cấp cơ sở hạ tầng của toàn Ngành Chính vì thế ngành khai thác NTTS ở nước ta đã có những bước tiến vượt bậc Thủy sản (TS)

là một trong những ngành kinh tế mũi nhọn của Việt Nam, NTTS và sản phẩm xuất khẩu thủy sản đóng vai trò quan trọng trong việc tăng trưởng GDP của cả nước Tổng sản lượng thủy sản đạt 6,3 triệu tấn (năm 2014), tăng 4,4% so với năm 2013 Sản xuất tôm nước lợ tăng trưởng mạnh về cả diện tích lẫn sản lượng, đóng góp quan trong đưa kim ngạch xuất khẩu thủy sản năm 2014 tiếp cận mức 8 tỷ USD, tăng 16,5% so với năm 2013, mức tăng cao nhất trong vòng 3 năm trở lại đây [2] Bên canh đó, sự phát triển của ngành NTTS còn góp phần giải quyết công căn việc làm cho hàng triệu lao động trong nước Tuy nhiên ngành NTTS và xuất khẩu TS mang lại nhiều lợi nhuận nhưng cũng gặp không ít khó khăn như ô nhiễm môi trường nuôi dẫn đến dịch bệnh cho động vật nuôi, thiệt hại đáng kể đến nền kinh tế, ảnh hưởng lớn đến tình hình phát triển chung của ngành Nguyên nhân chính của tình trạng này là do lượng thức ăn dư thừa và các chất thải của động vật nuôi, ngoài

ra trong môi trường nuôi con giống còn chứa dư lượng kháng sinh, dược phẩm, thuốc trị liệu và kích thích tố… Các thành phần gây ô nhiễm chính là các hợp chất hữu cơ, các hợp chất nitơ, photpho, các thực vật phù du, các chật lắng đọng do nguồn nước đầu vào mang vào, trong đó ô nhiễm bởi các hợp chất nitơ vô cơ chiếm tới 30-40% Sự ô nhiễm nitơ, photpho và hữu cơ còn gây nên hiện tượng phú dưỡng, làm giảm lượng ôxy hòa tan trong nước ảnh hưởng trầm trọng đến sản lượng

và chất lượng con giống [4]

Hiện nay, ngoài thị trường các sản phẩm phục vụ cho ngành NTTS rất đa dạng như thuốc, hóa chất và chế phẩm sinh học Hóa chất được dùng trong NTTS thường ở các dạng: thuốc diệt nấm (antifoulants), thuốc khử trùng (disinfectants),

thuốc diệt tảo (algicides), thuốc trừ cỏ (herbicides), thuốc diệt kí sinh trùng (parasiticcides) và thuốc diệt khuẩn (antibacterials); chất kháng sinh được sử dụng trong nuôi trồng thủy sản chủ yếu để chữa các bệnh lây nhiễm hoặc phòng bệnh cho thủy sản Những hoá chất trên có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ sức khoẻ động vật thuỷ sản nếu được sử dụng đúng, nhưng sử dụng sai mục đích và lạm dụng dẫn đến những hậu quả khôn lường, gây rủi do cho người lao động, tồn dư các chất độc trong sản phẩm thuỷ sản gây hại cho người tiêu dùng, làm giảm giá trị thương phẩm và còn tạo các chủng vi khuẩn kháng thuốc trong điều trị bệnh Chính vì vậy, chế phẩm sinh học được sử dụng như một công cụ hữu hiệu để giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường trong ao nuôi, tạo nền tảng vững chắc cho phần lớn hoạt động nuôi trồng thủy sản Chế phẩm sinh học đã được chấp nhận rộng rãi để khống chế dịch bệnh, tăng sức đề kháng Khác với biện pháp hóa học và kháng sinh, chế phẩm sinh học cung cấp một phương thức an toàn bền vững đối với người nuôi và tiêu dùng

Trong số các danh mục chế phẩm sinh học phải kể đến chế phẩm nitrate hóa, chúng được sử dụng rộng rãi trong xử lý nước (nước thải công nghiệp, nước thải sinh hoạt, nước thải chế biến lương thực thực phẩm, nước nuôi trồng thủy sản…) Trong nuôi trồng thủy sản, nhóm vi khuẩn nitrate hóa tham gia vào quá trình làm sạch môi trường, giảm thiểu khả năng gây bệnh trong lĩnh vực sản xuất giống thủy sản và nuôi thủy sản thâm canh

Nitrate hóa là một quá trình quan trọng nằm trong vòng chuyển hóa nitơ Ở giai đoạn này NH4+ được oxy hóa thành NO3- thông qua NO2- với sự tham gia, của nhóm

các vi khuẩn tự dưỡng, chủ yếu thuộc chi Nitrosomonas (vi khuẩn oxy hóa amoni)

và Nitrobacter (vi khuẩn oxy hóa nitrite) [17], [22] Việc ứng dụng quá trình

chuyển hóa nitơ vô cơ này cùng với hệ vi khuẩn tham gia vào quá trình luôn mở ra nhiều hướng đi mới trong xử lí nước bị ô nhiễm amoni đạt hiệu quả và thân thiện với môi trường

Đề tài: “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm nitrate hóa để xử lí môi trường hải

sản” góp phần tạo thêm một chế phẩm sinh học để xử lý môi trường nuôi cho

Mục tiêu cần đạt được của đề tài:

Tạo chế phẩm nitrate hóa bằng quá trình lên men xốp để ứng dụng trong xử lí nước bị ô nhiễm các hợp chất nitơ vô cơ tại các ao nuôi hải sản

Nội dung nghiên cứu:

- Hoạt hóa một số chủng vi khuẩn nitrate hóa sẵn có cho mục tiêu nhân nuôi tạo sinh khối

- Nghiên cứu quá trình lên men xốp đối với vi khuẩn nitrate hóa

- Nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm trong quá trình lên men tạo chế phẩm sinh học

có mật độ vi khuẩn và hoạt tính nitrate hóa tốt nhất

- Đánh giá ảnh hưởng của muối NaCl đến khả năng sinh trưởng và hoạt tính của vi khuẩn nitrate hóa trong chế phẩm

- Xác định mật độ vi khuẩn và hoạt tính nitrate hóa của chế phẩm theo thời gian

- Ứng dụng thử nghiệm chế phẩm sinh học nitrate hóa trên hệ lọc ở qui mô phòng thí nghiệm

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quát chung về nghề nuôi trồng thủy sản của Việt Nam

Việt Nam là một nước có vị trí địa lí và điều kiện tự nhiên thuận lợi cho việc phát triển ngành thủy sản, với bờ biển dài trên 3200 km, khoảng 3000 hòn đảo lớn nhỏ, có vùng mặt nước nội địa rộng lớn hơn 1.4 triệu ha nhờ hệ thống sông ngòi, đầm phá dầy đặc Điều kiện đất đai, khí hậu nhìn chung rất thuận lợi, khiến Việt Nam từ lâu đã trở thành một trong những quốc gia sản xuất và xuất khẩu thủy sản hàng đầu khu vực Chính vì vậy ngành nuôi trồng thủy sản của nước ta đã và đang phát triển Xuất khẩu thủy sản đóng vai trò quan trọng trong việc tăng thu nhập ngoại tệ mạnh cho đất nước Năm 2014 xuất khẩu thủy sản lần đầu vượt mốc 7 tỷ USD, dự báo đạt mức kỷ lục với giá trị xuất khẩu đạt 7,84 tỷ USD, tăng 16,5% so với năm 2013 Mặt hàng xuất khẩu thủy sản của Việt Nam gồm nhiều loại như tôm,

cá tra, cá ngừ, mực, bạch tuộc,…tuy nhiên tôm và cá tra là hai mặt hàng chủ lực Theo Hiệp hội thủy sản Việt Nam, trong 8 tháng đầu năm 2014, mặt hàng tôm đã đóng góp 50,1% và cá tra đóng góp 21,6% vào tổng giá trị xuất khẩu Đây là ngành hàng xuất khẩu chủ lực trong lĩnh vực xuất khẩu thủy sản Việt Nam [2]

Thuỷ sản đóng vai trò quan trọng trong việc cung cấp thực phẩm cho nhân loại Thực phẩm thuỷ sản có giá trị dinh dưỡng cao rất cần thiết cho sự phát triển của con người Không những thế nó còn là một ngành kinh tế tạo công ăn việc làm cho nhiều người đặc biệt ở những vùng nông thôn và ven biển Trong những năm tới, do nhu cầu mặt hàng thủy sản trên thế giới tăng cao, thị trường được mở rộng nên ngành khai thác, nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam càng có tiềm năng phát triển Mặc

dù vậy, nghề nuôi trồng thủy sản ở nước ta cũng gặp không ít khó khăn trong quá trình nuôi con giống như quản lí chất lượng ao nuôi, kiểm soát dịch bệnh, kĩ thuật

ao nuôi, nguồn giống do vậy việc cung cấp con giống khỏe mạnh, đạt tiêu chuẩn chất lượng là nhu cầu thiết yếu đối với các trang trại nuôi Trong quá trình nuôi con giống (tôm, cá) do lượng thức ăn dư thừa và chất thải của con giống đã gây ô nhiễm môi trường dẫn đến dịch bệnh ảnh hưởng lớn đến chất lượng giống Trong quá trình nuôi thâm canh tôm, chỉ có 15 – 20% thức ăn được dùng vào việc phát triển mô động vật, 15% tổng lượng thức ăn bị hao hụt do không ăn hết và thất thoát, chỉ có

40 – 45% là được sử dụng cho quá trình chuyển hóa bình thường, duy trì và lột vỏ [4]

1.2 Tình trạng ô nhiễm môi trường trong NTTS

Tình trạng ô nhiễm môi trường đang xảy ra nghiêm trọng trong nuôi NTTS

do phần lớn các chất hữu cơ dư thừa từ thức ăn, phân và các rác thải khác đọng lại dưới đáy ao nuôi Ngoài ra, còn các hóa chất, dư lượng kháng sinh được sử dụng trong quá trình nuôi còn lại mà không được xử lý Việc hình thành lớp bùn đáy do tích tụ lâu ngày của các chất hữu cơ, cặn bã và là nơi sinh sống của các vi sinh vật gây thối, các vi sinh vật sinh khí độc như NH3, NO2, H2, H2S, CH4, Các vi sinh

vật gây bệnh phần lớn thuộc các chi: Vibrio, Aeromonas, Ecoli, Pseudomonas,

Hình 1.1: Tình hình ô nhiễm môi trường nuôi tại các khu vực nuôi trồng

Trong những năm gần đây, tình hình dịch bệnh đối với ngành NTTS đang diễn ra khá phức tạp Chỉ tính riêng tỉnh Quảng Ninh, trong năm 2014 dịch bệnh đã xẩy ra và gây thiệt hại nghiêm trọng đối với tôm sú và tôm thẻ chân trắng tại các địa phương Quảng Yên, Tiên Yên, Móng Cái với diện tích mắc bệnh là 634 ha/tổng diện tích nuôi thủy sản là 20100 ha Tại Vân Đồn, Hải Hà tu hài và cá song chết rải rác thiệt hại trên 200 tỷ đồng, nguyên nhân gây chết là do chúng bị các bệnh như đốm trắng, bệnh còi tôm, hoại tử gan tụy đầu vàng, taura, với tu hài thì bị bệnh sưng

vòi, rìa vỏ thâm đen, bệnh do vi khuẩn Vibrio spp và nội ký sinh Perkinsus spp

gây nên [12]

Tại khu vực châu Á ở các nước Trung Quốc, Thái Lan, Malayxia, Việt Nam, dịch hội chứng tôm chết sớm (EMS) hay hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính (AHPNS) ở tôm đang lan rộng và gây thiệt hại lớn cho ngành NTTS Theo ước tính của Liên minh NTTS toàn cầu (GAA), thiệt hại do dịch EMS của châu Á lên tới 1

tỷ USA/năm Theo nguồn tin từ FAO, các nhà khoa học của đại học Arizona mới

chỉ xác định được nguyên nhân gây bệnh này là do vi khuẩn Vibrio

Tất cả các nguyên nhân dẫn đến dịch bệnh của ngành nuôi thủy sản đều do môi trường nuôi con giống bị ô nhiễm

Vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) là vùng đất ngập nước điển hình

có chế độ ngập lũ theo mùa mưa, ngập mặn ven biển theo thủy triều với trên 90% diện tích đất tự nhiên, tạo ra các lợi thế tự nhiên rất cơ bản trong phát triển nuôi trồng và chế biến thủy sản Ngành NTTS ở khu vực ĐBSCL đã có một bước phát triển với diện tích và sản lượng nuôi trồng với quy mô lớn: Năm 2005 toàn khu vực ĐBSCL có diện tích nuôi trồng thủy sản là 680.200 ha, năm 2012 là 2.221.182 tấn, trong đó cá nuôi là 1.770.509 tấn và tôm nuôi là 357.772 tấn (Niên giám thống kê 2012) Sản lượng thủy sản nuôi trồng của ĐBSCL chiếm 70,94% tổng sản lượng nuôi trồng thủy sản trong toàn quốc với mức tăng trưởng hàng năm khoảng 17,8 %/năm Cùng với đó là sự phát triển của các cơ sở chế biến thủy sản với tổng

số các cơ sở chế biến xuất khẩu trong toàn vùng là 206 cơ sở, trong đó 188 cơ sở đông lạnh và 18 cơ sở là các loại hình hàng khô và đồ hộp… với tổng công suất chế biến khoảng 780.000 - 950.000 tấn/năm Các tỉnh: Cà Mau, Cần Thơ, Tiền Giang, Kiên Giang, An Giang là những địa phương có số nhà máy chiếm trên 53% tổng số nhà máy chế biến thủy sản toàn vùng ĐBSCL Thị trường tiêu thụ bao gồm 29 quốc gia thuộc Bắc Mỹ, EU, châu Á, châu Đại Dương và Trung Đông với các mặt hàng chế biến cá tra và tôm…với tổng kim ngạch xuất khẩu đạt khoảng 4 tỷ USD/năm Với lợi thế như vậy nhưng trong quá trình chế biến thủy sản nguồn nước thải từ nước rửa nguyên liệu, sơ chế nguyên liệu, chế biến sản phẩm, các nguồn nước vệ sinh nhà xưởng sản xuất, nước rửa máy móc thiết bị, dụng cụ sản xuất trong các phân xưởng nhà máy chế biến thủy sản chứa nhiều thành phần gây ô nhiễm như: BOD5 khoảng 800 - 2.000 mg/l, có lúc đạt đến 4.500 mg/l COD khoảng 1.000 - 2.500 mg/l, có lúc đạt đến 5.000 mg/l, chất rắn lơ lửng (SS) khoảng 300 - 600 mg/l, nitơ tổng số (Nt) khoảng 100 - 150 mg/l, photpho tổng số (Pt) khoảng 20-50 mg/l, đặc biệt vi sinh Coliforms thường lớn hơn 1.105 MPN/100ml, với lưu lượng khoảng

20 - 35 m3/tấn sản phẩm, đây là nguồn gây ô nhiễm môi trường rất nghiêm trọng cần phải được xử lý đáp ứng quy chuẩn môi trường quy định 14].

1.3 Ảnh hưởng của nguồn nước bị nhiễm các hợp chất chứa nitơ tới môi trường NTTS

Trong môi trường NTTS, thành phần gây ô nhiễm chính trong các bể nuôi thường là các hợp chất nitơ và một số hợp chất hữu cơ, tuy mức độ ô nhiễm nitơ không cao như các loại nước thải khác nhưng dễ dẫn đến ấu trùng con giống bị ngộ độc, làm giảm khả năng sinh trưởng và phát triển của con giống dẫn đến năng suất thu hoạch kém Khí NH3 là yếu tố gây độc đến tỉ lệ sống và sinh trưởng đối với thủy sinh, NH3 được hình thành từ quá trình phân hủy protein, xác bã động vật phù du, sản phẩm bài tiết của các động vật hay từ phân bón vô cơ, hữu cơ Đối với loái giáp xác, ở nồng độ 0,09 mg/L NH3 làm giảm sự sinh trưởng của tôm càng xanh

(Macrobrachium rosenbergii), ở hàm lượng 0,425 mg/l làm giảm 50% sự sinh trưởng của các loài tôm hẹ Đối với tôm sú hậu ấu trùng (Penaeus monodon) có tỉ lệ

LC50/24 giờ là 5,71 mg/l [9] NH3, NH4+ trong nước rất cần thiết cho sự phát triển của vi sinh vật, là nguồn thức ăn tự nhiên, nhưng nếu hàm lượng NH4+ quá cao sẽ làm cho động vật phù du phát triển quá mức không có lợi cho tôm, cá (thiếu oxy,

pH dao động ), ngoài ra ở hàm lượng amoni cao vượt mức cho phép sẽ gây độc trực tiếp đến hệ hô hấp của cá hoặc tôm, gây mất cân bằng về mặt sinh lí, làm giảm sức đề kháng và dẫn đến chết Khi trong môi trường xuất hiện amoni, vi khuẩn oxy hóa amoni sẽ chuyển hợp chất này thành nitrie, nitrite còn được hình thành từ quá trình khử nitrate Đây là hợp chất vô cơ cực kì độc cho động vật thủy sinh đặc biệt

là các ấu trùng nuôi, chỉ với hàm lượng nitrite vượt quá 0,3 mg/l sẽ ức chế vận chuyển oxy trong máu gây ngộ độc cao cho động vật nuôi

Chính vì vậy tại các cơ sở nuôi giống hải sản, để cải thiện môi trường nuôi thì việc sử dụng các công nghệ xử lí nước bằng biện pháp sinh học luôn được đặt lên hàng đầu để ngăn cản và kiểm soát được các dịch bệnh Hiện nay các nhà nghiên cứu đã chứng minh được việc sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản đã cải thiện được chất lượng nước, làm cân bằng quần thể vi sinh vật trong nước và giảm thiểu lượng vi sinh vật gây bệnh Sử dụng sản phẩm probiotic là bổ sung vi khuẩn có ích vào môi trường thay thế cho các loại vi khuẩn có hại Từ những tiêu

chí đó mà hiện nay người ta đã sử dụng các chế phẩm vi sinh vật trong đó phải kể đến chế phẩm chứa nhóm vi khuẩn nitrate hóa để xử lí các hợp chất nitơ vô cơ, loại ngay những nguy cơ ban đầu dẫn đến dịch bệnh

Việc sử dụng chế phẩm vi sinh vật trong xử lí nước bị ô nhiễm ngày càng phổ biến do lợi thế của chúng làm tăng cường khả năng phục hồi và thúc đẩy quá trình tự làm sạch trong các hệ tái sử dụng nước và ao đầm nuôi hải sản, bên cạnh đó còn có tính ổn định cao và thân thiện với môi trường

1.4 Chế phẩm vi sinh vật

1.4.1 Khái niệm chế phẩm sinh học

Chế phẩm sinh học lần đầu được giáo sư Fuller R (1989) định nghĩa: thành phần thức ăn có cấu tạo từ những vi khuẩn sống và có tác động hữu ích lên vật chủ qua việc làm cải thiện sự cân bằng vi khuẩn đường ruột của nó Định nghĩa này có thể mở rộng như sau: sự nuôi dưỡng các vi sinh vật hoàn toàn tự nhiên và tác động tích cực khi đưa vào điều kiện môi trường sống [20]

Ngày nay có thể hiểu, chế phẩm vi sinh vật là hỗn hợp hoặc riêng biệt từng chủng vi sinh vật có hoạt tính sinh học cao đã được tuyển chọn, chúng được tồn tại

và phát triển trong môi trường chứa chất mang được lựa chọn làm cơ chất Các chế phẩm của vi sinh vật có trong chế phẩm nhằm mục đích cải thiện sức khỏe con người và vật nuôi, cây trồng và chất lượng môi trường

Chế phẩm sinh học được hình thành phải đạt được các tiêu chuẩn sau đây:

- Thứ nhất: Làm cân bằng hệ vi sinh vật trong nước, ức chế sự phát triển quả mức của các nhóm vi sinh vật gây hại, đưa về ngưỡng an toàn cho các động vật thủy sinh

- Thứ hai: Các vi sinh vật có lợi trong chế phẩm sinh học phải đủ lớn để khi đưa vào môi trường ao nuôi có hiệu quả nhanh và mạnh giảm thiểu ô nhiễm môi trường, hạn chế dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản

- Thứ ba: các vi sinh vật trong chế phẩm phải có khả năng phân giải các chất vô cơ, hữu cơ trong ao nuôi làm giảm thiểu các nguồn gây ô nhiễm từ nitơ như NO2, NH3,

NO3-…từ đó cải thiện chất lượng nước đáng kể

- Thứ tư: Cung cấp nguồn dưỡng chất cần thiết cho cá, tôm, hệ vi sinh vật trong nước phát triển như cung cấp dinh dưỡng khoáng thiết yếu, các acid amin, vitamin…

1.4.2 Lợi thế khi sử dụng chế phẩm sinh học trong xử lí nước

Ở nước ta trong những năm gần đây, việc sử dụng chế phẩm sinh học để xử lí nước ngày càng phổ biến và đang được ứng dụng một cách có hiệu quả, do đó nó có nhiều bước tiến Chế phẩm sinh học được coi là một công cụ hữu hiệu để giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường trong ao nuôi, tạo nền tảng vững chắc cho phần lớn hoạt động nuôi trồng thủy sản trên thế giới Chế phẩm sinh học đã được chấp nhận rộng rãi để khống chế dịch bệnh, tăng sức đề kháng, khác với biện pháp hóa học và kháng sinh, chế phẩm sinh học cung cấp một phương thức an toàn bền vững đối với người nuôi và người tiêu dùng Các chế phẩm sinh học trong nuôi tôm có một vai trò cực kì quan trọng để phân hủy các chất hữu cơ và tác động làm giảm đáng kể lớp bùn nhớt trong ao Kết quả là cải thiện chất lượng nước trong ao nuôi, giảm tỉ lệ mắc bệnh, tăng số lượng vi sinh vật phù du, giảm mùi hôi và sau cùng là tăng sản lượng nuôi [11]

Việc sử dụng các vi sinh vật hữu ích nhằm cạnh tranh với các vi khuẩn gây bệnh đã được ứng dụng rộng rãi trong chăn nuôi, thay thế cho việc sử dụng hóa chất, kháng sinh là một giải pháp quan trọng kiểm soát bệnh trong nuôi trồng thủy sản

1.5 Chế phẩm nitrate hóa

Chế phẩm nitrate hóa được hình thành dựa trên nguyên lí hoạt động của nhóm

vi khuẩn nitrate hóa tham gia vào quá trình nitrate hóa

1.5.1 Quá trình nitrate hóa

Quá trình nitrate hóa là quá trình chuyển hóa amoni (NH4+) thành nitrate (NO3-) bởi tác động của các vi khuẩn hiếu khí Trước hết NH4+ được chuyển hóa thành NO2- bởi các vi khuẩn oxy hóa amoni (chủ yếu vi khuẩn thuộc chi

tục chuyển hóa NO2- thành NO3- với sự xúc tác của enzyme nitrite oxidase NO3- có thể được các thực vật thủy sinh sử dụng như là một nguồn dinh dưỡng hoặc có thể

bị chuyển hóa tiếp thành khí nitơ (N2) thông qua hoạt động của các vi khuẩn yếm

khí như Pseudomonas Các quá trình chuyển hóa NH4+ xảy ra phụ thuộc vào nồng

độ oxy hòa tan và độ kiềm của nước Quá trình nitrate hóa gồm 2 giai đoạn được thực hiện bởi hai nhóm vi khuẩn nối tiếp nhau Hai nhóm vi khuẩn này có mối quan

hệ mật thiết với nhau, chúng phân bố rộng rãi trong tự nhiên: môi trường đất, nước Môi trường thích hợp cho cả 2 loại này phải có pH trong khoảng 6 - 8 (tối ưu ở pH= 7,5)

- Giai đoạn nitrite hóa: Chuyển hóa NH4+ thành NO2- bởi nhóm vi khuẩn nitrite hóa

NH4+ + 1,5 O2 → NO2 + 2H+ + H2O (1)

Vi khuẩn tham gia vào quá trình này chủ yếu là vi khuẩn tự dưỡng, hiếu khí bắt buộc, Gram âm Năng lượng sinh ra từ quá trình chuyển hóa NH4+ thành NO2- sẽ được các vi khuẩn nitrite hóa sử dụng cho hoạt động sống của mình Sự có mặt của các nhóm vi khuẩn nitrite hóa giúp loại bỏ được NH4+, khi hàm lượng NH4+ trong nước giảm phương trình phản ứng (1) sẽ dịch chuyển theo chiều thuận dẫn đến giảm hàm lượng NH3 trong nước, giảm khả năng gây độc đối với tôm cá

Cho đến nay người ta đã phát hiện được các vi khuẩn tham gia vào quá trình

nitrate hóa thuộc các chi: Nitrosococcus, Nitrosomonas, Nitrosopira, Nitrosocystis,

nhưng khác nhau về đặc điểm hình thái và cấu trúc tế bào

- Giai đoạn nitrate hóa: Chuyển NO2- thành NO3-

NO2 + 0,5O2 → NO3 + 73kJ (2)

Giai đoạn tiếp theo của quá trình nitrite hóa là sự chuyển hoá NO2- thành

NO3- với sự tham gia của các vi khuẩn oxy hóa nitrite trong điều kiện hiếu khí Vi khuẩn tham gia vào quá trình này cũng là vi khuẩn hóa tự dưỡng, chúng chủ yếu

thuộc các chi: Nitrobacter (Nitrobactervinogradskii, Nitrobacter agilis), Nitrospina

1.5.2 Hệ vi khuẩn nitrate hóa

Hệ vi khuẩn nitrate hóa luôn tồn tại trong đất và nước ngọt, môi trường biển, nước lợ, chúng là nhóm vi khuẩn tự dưỡng lấy năng lượng và lực từ quá trình oxy hóa, khi đó chúng sẽ phân giải NH3 (là sản phẩm cuối của quá trình amon hóa) thành nitrite, nitrate Nitrate được hình thành thích hợp cho cây trồng sử dụng, hoặc

là cơ chất cho nhóm vi khuẩn khử nitrate, sản phẩm cuối tạo khí nitơ (N2) tự do Đồng thời do khả năng linh hoạt trong việc oxy hóa các hợp chất nitơ (N2O, NO,

NO2-, NO3-) nên một thời gian dài người ta xem hệ vi khuẩn này xuất phát chỉ từ

một nhóm thuộc họ Nitrobacteriaceae [25] Sau đó dựa vào khả năng oxy hóa các

hợp chất vô cơ của vi khuẩn nitrate mà người ta đã chia nhóm vi khuẩn này thành 2 nhóm, nhóm vi khuẩn oxy hóa amoni và nhóm vi khuẩn oxy hóa nitrie

Đặc trưng của hệ vi khuẩn nitrate hóa là chúng sống được trong môi trường khoáng vô cơ và oxy hóa chuyên biệt amoni, nitrite hoặc nitrate, không sử dụng glucose, peptone hay các chất hữu cơ khác để thu năng lượng Vì vậy, các nhà khoa học xếp chúng vào nhóm khoáng vô cơ tự dưỡng (lithoautotropic) để phân biệt với nhóm heterotropic Bên cạnh đó, hệ vi khuẩn nitrate hóa luôn tồn tại song song với nhau và có mối quan hệ tương hỗ để hỗ trợ nhau trong quá trình sinh tồn, sản phẩm của quá trình này (nitrite) là cơ chất chuyển hóa tiếp cho quá trình tiếp theo Chính

vì vậy hệ vi khuẩn này tồn tại trong môi trường sống rất lâu, ngay cả trong các điều kiện khắc nghiệt.Vi khuẩn thuộc nhóm heterotropic sống trong môi trường hữu cơ,

chúng bao gồm các loài nấm (Aspergillus), vi khuẩn dị dưỡng (Bacillus,

hay nitrite để thu năng lượng, nhưng hoạt tính rất thấp [25]

1.6 Nuôi cấy thu sinh khối vi khuẩn

Do là nhóm vi khuẩn tự dưỡng, nên vi khuẩn nitrate hóa sinh trưởng chậm, nên có đã nhiều nghiên cứu để tìm được các điều kiện tối ưu cho sinh trưởng và phát triển của nhóm vi khuẩn này Trong đó đã có một số nghiên cứu chứng minh rằng các nhóm vi khuẩn này sinh trưởng tốt hơn trong điều kiện có chất mang [1] Như vậy, để làm tăng mật độ tế bào của nhóm các vi khuẩn này thì quá trình lên men xốp có thể phù hợp và đạt hiệu quả hơn

Lên men xốp: là thuật ngữ dùng cho các quá trình mà trong đó các vi khuẩn

được sinh trưởng bằng cách sử dụng các vật liệu không tan trong nước Trong quá trình lên men xốp, nước là yếu tố thiết yếu nhưng độ ẩm không vượt quá hàm lượng bão hòa của cơ chất xốp Ưu điểm của kĩ thuật lên men xốp là môi trường nuôi cấy đơn giản, lượng chất thải sinh ra ít hơn so với lên men dịch thể, enzyme tạo ra từ quá trình lên men xốp ít nhạy cảm hơn với các chất kìm hãm hoặc ức chế trao đổi chất, thu hồi sản phẩm tốt hơn, không phải phá bọt Quá trình lên men xốp là sử dụng cơ chất phù hợp cho vi khuẩn nitrate hóa bám dính Một ưu điểm khác mang tính lợi thế là các cơ chất sử dụng cho lên men xốp luôn có sẵn và rẻ, được thu nhập

từ các phế phẩm công, nông nghiệp (như trấu, cám gạo, bã mía, bã cà phê, bã nho, cùi dừa…) hoặc các nguyên liệu tro (các loại nhựa trao đổi ion) Các chất thải nông nghiệp không những rẻ mà còn là một nguồn cơ chất giàu dinh dưỡng Sử dụng các

cơ chất có sẵn này còn góp phần làm sạch môi trường sinh thái [10]

1.7 Cố định tế bào vi sinh vật trên bề mặt chất mang

Khái niệm: kĩ thuật cố định tế bào được định nghĩa là: “Kĩ thuật bao bọc hoặc định vị các tế bào còn nguyên vẹn lên một vùng không gian nhất định nhằm bảo vệ các hoạt tính xác tác mong muốn” (Karel et al., 1985)

Cố định thường là sự bắt trước các hiện tượng xảy ra trong tự nhiên do các tế bào có thể phát triển trên bề mặt hoặc bên trong các cấu trúc của nguyên liệu có trong tự nhiên Nhiều vi sinh vật tự nó có khả năng gắn trên những bề mặt khác nhau trong tự nhiên Nhiều công trình xử lí nước thành công hơn nhờ kĩ thuật cố định tế bào Từ đó đã dẫn đến các nghiên cứu của các chất mang khác nhau phù hợp cho mỗi nhóm vi sinh vật và công nghệ sẽ áp dụng Những kĩ thuật cố định tế bào này có thể chia thành 4 nhóm chính như: cố định trên bề mặt chất mang rắn, nhốt trong khung mạng xốp, kẹo tụ tế bào (tạo hạt), nhốt bằng phương pháp cơ học trên khung một màng chắn [23]

1.8 Chất mang sử dụng trong chế phẩm

Có nhiều loại chất mang được sử dụng trong kĩ thuật cố định tế bào vi sinh vật, chúng được phân loại theo các nhóm sau: chất mang có nguồn gốc hữu cơ, chất mang có nguồn gốc vô cơ, chất mang có nguồn gốc tự nhiên và hệ thống màng [6]

Điều kiện lựa chọn chất mang:

- Có tính chất cơ lí bền vững, không tan trong môi trường phản ứng

- Phù hợp với sự sinh trưởng của vi sinh vật

- Phù hợp hình dạng thiết bị phản ứng sinh học

- An toàn cho môi trường sống

- Chất mang có cấu trúc siêu lỗ

- Giá thành chất mang rẻ

• 1.8.1 Tro trấu

Các nhà nghiên cứu đã phát hiện ra những công dụng đặc hiệu của các phế phụ phẩm trong đó phải kể đến tro trấu với các ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau Trong những năm gần đây việc ứng dụng tro trấu vào sản xuất vật liệu xây dựng nhằm giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường, góp phần xây dựng một nền sản xuất nông nghiệp bền vững là một trong những mục tiêu đang được các nhà nghiên cứu quan tâm Gần đây các nghiên ứng dụng từ tro trấu cũng đã được tiến hành như nghiên cứu quy trình thu hồi Silica từ tro trấu, ứng dụng tổng hợp phụ gia cho xi măng mác cao [3], nghiên cứu tạo bê tông từ tro trấu và các vật liệu siêu dẻo [8]

- Thành phần hóa học của tro trấu

Tro trấu có dạng hạt dẹt nhiều góc cạnh, cỡ hạt trung bình khoảng 17µm, có nhiều lỗ xốp, màu đen Vỏ trấu sau khi đốt cháy thành tro, các thành phần hữu cơ sẽ chuyển hóa thành các oxit kim loại, silic oxit là chất có tỉ lệ phần trăm cao nhất chiếm 80 – 90% Các thành phần oxit có trong tro được thể hiện trong bảng 1 và các thành phần này có thể thay đổi tùy thuộc vào giống cây lúa, điều kiện khí hậu đất đai,…

Bảng 1: Thành phần hóa học của tro trấu [8]

Thành phần hóa học của tro trấu % SiO2 Al2O3 Fe2O3 CaO MgO K2O Na2O MKN

1.9 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

Năm 2009, Manju và cộng sự đã nghiên cứu và đưa ra quy trình cố định hệ

vi khuẩn nitrate hóa lên bột gỗ của cây thân thảo Ailantus altissima (300 - 1500µm) nhằm chuyển hóa lượng amoni trong nước nuôi tôm sang nitrate [24] Chế phẩm có tên thương mại là TANOX (Total Amoni Oxidizer), giống vi sinh được phân lập từ trong các bể nuôi tôm, được Achuthan và cộng sự tuyển chọn trong một công trình nghiên cứu vào năm 2006 [18] Quá trình nuôi thu sinh khối các chủng vi khuẩn nitrate hóa trong cùng một thiết bị, sau đó tiến hành bẫy - hấp thụ với bột gỗ Thời gian cố định vi khuẩn theo phương pháp này là 72h thì chế phẩm có hoạt lực nitrate hóa cao nhất Kết quả đã cho thấy, với nồng độ ban đầu 105 tế bào/ml thì 1 gram chế phẩm sau cố định trong 3 ngày sẽ có hoạt lực nitrate hóa cao nhất Dùng 0,2 g chế phẩm ứng với 20L nước biển cần xử lí, mức độ chuyển hóa amoni đạt trung bình 2,4 mg/l.ngày trong 3 ngày đầu tiên Ngoài việc gắn vi khuẩn lên bột gỗ thì tác giả Shan và Obbard (2001) nghiên cứu quy trình bẫy vi khuẩn nitrate hóa vào đất sét nhằm tạo chế phẩm có hoạt lực phân giải amoni cao [25] Giống vi khuẩn được phân lập từ hệ vi sinh vật bản địa có sẵn trong bùn ở các bể nuôi tôm và trải qua một số quy trình hoạt hóa, do vậy hoạt lực phân giải rất cao, lên đến 200 mg/l Giá thể để bẫy hấp phụ là các hạt đất sét, có nhiều lỗ xốp, diện tích bề mặt là 1,3 – 3,4

m2/g, được xử lí thành dạng viên có đường kính 1cm, nặng 1g Theo kết quả đạt được, chỉ cần 1g hạt có thể xử lí được 10 lít nước thải ( tỉ lệ 1:1000) với hiệu quả phân giải TAN đáng kể (khoảng 3,2 mg N-NH4+/l.ngày)

Tại Việt Nam theo danh mục các sản phẩm xử lí, cải tạo môi trường nuôi trồng thủy sản được phép lưu hành tại Việt Nam của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, trong số các sản phẩm sản xuất trong nước, có nhiều sản phẩm chứa các chủng vi sinh vật có lợi trong đó có một số sản phẩm chứa các chủng vi khuẩn

thuộc chi Nitrosomonas và Nitrobacter thường dùng cho các ao nuôi tôm, cá giống

Một số nghiên cứu của các trường Đại học Bách Khoa Hà Nội như nghiên cứu ứng dụng công nghệ vi sinh để xử lí nước thải sinh hoạt đô thị Trường Đại học Quốc gia Hà Nội, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học có nghiên cứu điều kiện thích hợp cho sinh trưởng của vi khuẩn nitrate hóa trong quá trình lên men…, nhưng các

của các cơ sở ươm giống hải sản Các nghiên cứu cơ bản trước đây của chúng tôi về nhóm vi khuẩn nitrate hóa về tính chất sinh học cũng như vai trò của nó trong quá trình xử lí nước bị ô nhiễm amoni đã thu được những kết quả khả quan về định hướng ứng dụng ngoài thực tế Để tiếp tục nghiên cứu về nhóm vi khuẩn nitrate hóa này, chúng tôi đề xuất các nghiên cứu sản xuất chế phẩm nitrate hóa để ứng dụng cho các công nghệ xử lí nước nuôi trồng hải sản bị nhiễm amoni

Việc nghiên cứu chế phẩm ở dạng khô kết hợp với kĩ thuật lên men xốp phù hợp cho đặc tính của nhóm vi khuẩn này tạo điều kiện thích hợp và sự sinh trưởng của chúng là một việc cực kì quan trọng và cần thiết Bên cạnh đó, chế phẩm nitrate hóa dạng khô có tính ưu việt cao trong việc bảo quản, vận chuyển và dễ dàng sử dụng Việc sử dụng nguồn cơ chất tro trấu có thành phần hóa học phù hợp đối với các nhóm vi khuẩn nitrate hóa

Phần 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị sử dụng

2.1.1 Nguyên liệu

Các chủng vi khuẩn nitrate hóa được cung cấp từ kho giống của phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Môi trường, viện Công nghệ sinh học

Chất mang dùng làm chế phẩm: tro trấu

2.1.2 Hóa chất, môi trường

- Hóa chất: các hóa chất thông dụng có nguồn gốc từ Trung Quốc, Mỹ, Đức…

- Thiết bị: các thiết bị trong phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học môi trường và thiết

bị của phòng thí nghiệm trọng điểm của Viện Công nghệ sinh học bao gồm tủ nuôi cấy

vi sinh, máy quang phổ, máy ly tâm, máy sấy, nồi hấp khử trùng…

- Môi trường nuôi cấy

Bảng 2.1: Môi trường nuôi cấy vi khuẩn nitrate hóa

Môi trường Winograskyi I cải

2 0,4 7,5±0,2

2 0,4 7,5±0,2 Môi trường đặc là các thành phần hóa chất giống môi trườngWinograski I, II bổ sung

20 g/l Agar

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật

Hoạt hóa các chủng vi khuẩn nitrate hóa từ tập đoàn chủng giống trên môi trường Winograski tương ứng, sau đó thử hoạt tính nitrate hóa của các chủng vi khuẩn Trong cùng một điền kiện nuôi cấy như nhau, vi khuẩn được lựa chọn dựa vào khả năng chuyển hóa amoni hoặc nitrite cao hơn

Các chủng vi khuẩn lựa chọn được lên men thu sinh khối sử dụng cho mục đích nghiên cứu tạo chế phẩm nitrate hóa

Hình 2.1: Sơ đồ tổng quan quy trình nhân giống vi sinh vật

2.2.2 Phương pháp cố định tế bào trên bề mặt chất mang rắn

• Nguyên tắc: phối trộn tế bào vi khuẩn vào chất mang theo phương pháp hấp phụ trong điều kiện phù hợp pH, lực ion, độ ẩm, nhiệt độ v.v…, hỗn hợp được lên men trong điều kiện thích hợp

• Chuẩn bị vật liệu làm chất mang: Trấu được thu thập, sơ chế để loại bỏ các tạp chất sau đó đốt cháy hoàn toàn thành tro

• Tiến hành tạo chế phẩm:

- Sinh khối vi khuẩn Nitrosomonas và Nitrobacter sau khi được nhân nuôi đạt

ml môi trường dinh dưỡng + 50 ml sinh khối vi khuẩn nitate hóa