Đánh giá đặc điểm di truyền của 10 giống đậu nành rau (glycine max (l )merrill) dựa trên đặc tính nông học và dấu phân tử SSR

TÓM LƢỢC Đề tài “Đánh giá đặc điểm di truyền của 10 giống đậu nành rau dựa trên đặc tính nông học và dấu phân tử SSR” được thực thiện vào vụ Thu Đông năm 2014 tháng 8/2014 – tháng 12/201

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA 10 GIỐNG

ĐẬU NÀNH RAU (GLYCINE MAX (L.) MERRILL) DỰA

TRÊN ĐẶC TÍNH NÔNG HỌC VÀ DẤU PHÂN TỬ SSR

MSSV: 4104540 LỚP: CNSH TT36

Cần Thơ, tháng 5/2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA 10 GIỐNG

ĐẬU NÀNH RAU (GLYCINE MAX (L.) MERRILL) DỰA

TRÊN ĐẶC TÍNH NÔNG HỌC VÀ DẤU PHÂN TỬ SSR

MSSV: 4104540 LỚP: CNSH TT36

Cần Thơ, tháng 5/2015

PHẦN KÝ DUYỆT

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………

………

………

………

………

………

………

………

………

……

Cần Thơ, ngày tháng 7 năm 2015

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

(Ký tên)

LỜI CẢM TẠ

Để hoàn thành luận văn này, bên cạnh sự cố gắng, tìm tòi, nghiên cứu và kiến thức của bản thân, tôi còn nhận được sự quan tâm và sự giúp đỡ tận tình của mọi người xung quanh

Tôi xin chân thành cảm tạ và biết ơn sâu sắc đến Thầy Trương Trọng Ngôn đã tận tình dạy bảo, hướng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập

và thực hiện luận văn này

Xin cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học và Quý Thầy Cô đã quan tâm, hỗ trợ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt

đề tài luận văn tốt nghiệp

Xin cảm ơn chị Nguyễn Trí Yến Chi, anh Trần Văn Bé Năm cán bộ phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử Thực Vật- Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận văn

Cảm ơn anh Trần Võ Hải Đường, anh Lê Trọng Nam và chị Nguyễn Thị Thuý Hằng cao học Công nghệ Sinh học khóa 20 đã giúp đỡ tôi trong việc thu thập chỉ tiêu

và các công việc trong nhà lưới và trong phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử

Con xin gởi lòng tri ân sâu sắc nhất đến cha mẹ, những đấng sinh thành đã nuôi nấng, dạy bảo con nên người

Cảm ơn đến gia đình, thầy cô, anh chị cao học khóa 20 và các bạn lớp Công nghệ Sinh học Tiên tiến khóa 36 đã ủng hộ tinh thần và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Cần Thơ, ngày10 tháng 7 năm 2015

Phan Thượng Phúc

TÓM LƢỢC

Đề tài “Đánh giá đặc điểm di truyền của 10 giống đậu nành rau dựa trên đặc tính nông học và dấu phân tử SSR” được thực thiện vào vụ Thu Đông năm 2014 (tháng 8/2014 – tháng 12/2014) tại nhà lưới Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ Việc đánh giá sẽ cung cấp những dữ liệu thông tin cho việc nghiên cứu và lai tạo các giống được khảo nghiệm Trong nghiên cứu các đánh giá dựa trên các đặc tính nông học và phương pháp sinh học phân tử - sử dụng 5 dấu phân tử SSR - để đánh giá các kiểu gien của các giống đậu nành rau Phân tích phương sai (ANOVA) trên các tính trạng số lượng như chiều cao cây, số lóng trên thân, số cành hữu hiệu, số trái, khối lượng hạt,…cho sự khác biệt ở mức ý nghĩa 5%

Ở mức độ phân tử được đánh giá trên 10 giống đậu nành rau với 5 mồi Satt394, Satt398, Satt166, Satt263 và Sat_088 Có tất cả 9 alen được khuếch đại, trung bình 2 alen/locus được phát hiện với chỉ số PIC ở mức thấp (0,17)

Từ khóa: Dấu phân tử, đặc điểm di truyền, đậu nành, GCV, Glycine max, hệ số

di truyền theo nghĩa rộng, PCV, PIC, SSR

MỤC LỤC

PHẦN KÝ DUYỆT iii

LỜI CẢM TẠ iv

TÓM LƯỢC i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH BẢNG vi

DANH SÁCH HÌNH vii

CÁC TỪ VIẾT TẮT viii

CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

1 Tổng quan về cây đậu nành 3

1.1 Đặc tính nông học, sinh học cây đậu nành 3

1.2 Các giai đoạn phát triển 5

1.3 Đặc tính sinh hoá hạt đậu nành rau: .5

1.4 Tính thơm của đậu nành rau: 6

1.5 Tiêu chuẩn trong công tác chọn giống đậu nành 8

1.6 Vai trò của giống 9

2 Đặc điểm di truyền và các phương pháp đánh giá 10

2.1 Đặc điểm di truyền 10

2.2 Các phương pháp nghiên cứu đặc điểm di truyền 11

2.3 Dấu SSR 13

2.4 Một số nghiên cứu về kỹ thuật phân tử SSR trên đậu nành 14

3 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu: 16

3.1 Phân tích phương sai 16

3.2 Hệ số biến thiên 16

3.3 Hệ số biến dị kiểu gien và kiểu hình 17

3.4Hệ số di truyền theo nghĩa rộng (hb2 ) 17

CHƯƠNG III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

1. Thời gian và địa điểm 18

2 Phương tiện 18

2.1 Vật liệu 18

2.2 Phương tiện 18

2.2.1 Thiết bị và dụng cụ 18

2.2.2 Hóa chất: 19

3 Phương pháp nghiên cứu: 19

3.1 Thí nghiệm trong nhà lưới: 19

3.1.1 Bố trí thí nghiệm 19

3.1.2 Chỉ tiêu thu thập và phân tích: 20

3.2 Thí nghiệm trong phòng: 23

3.2.1 Quy trình ly trích DNA 23

3.2.2 Kiểm tra chất lượng DNA bằng phương pháp đo OD 24

3.2.3 Thử nghiệm các dấu phân tử SSR để khảo sát khác biệt di truyền của các mẫu đậu nành rau 24

3.2.4Kiểm tra sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di 26

CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

4.1 Tình hình sâu bệnh 28

4.2 Hiện tượng đổ ngã 28

4.3 Đánh giá các đặc điểm di truyền dựa trên đặc tính nông học 28

4.3.1 Đánh giá dựa vào các đặc tính hình thái 28

4.3.1.1 Màu trục hạ diệp và màu hoa 28

4.3.1.2 Màu vỏ trái chín 28

4.3.1.3 Màu lông tơ 28

4.3.1.4 Màu vỏ hạt 28

4.3.1.5 Màu tể 29

4.3.2 Đánh giá dựa trên các đặc tính nông học 29

4.3.2.1 Ngày mọc mầm (ngày) 29

4.3.2.2 Ngày trổ hoa, thời gian kéo dài trổ và thời gian tạo trái (ngày) 30

4.3.2.3 Thời gian sinh trưởng (ngày) 31

4.3.2.4 Chiều cao cây (cm) 32

4.3.2.5 Số cành hữu hiệu (cành/cây) 33

4.3.2.6 Số lóng trên thân (lóng/thân) 34

4.2.2.7 Trọng lượng hạt và các thành phần năng suất 35

4.4 Đánh giá đặc điểm di truyền dựa trên dấu phân tử SSR 40

4.4.1 Kết quả tinh sạch của DNA 40

4.4.2 Kết quả phân tích phân tử SSR 40

CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43

5.1 Kết luận 43

5.2 Kiến nghị 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

PHỤ LỤC 50

PHỤ LỤC 1 KỸ THUẬT CANH TÁC 50

PHỤ LỤC 2 PHÂN TÍCH PHƯƠNG SAI (ANOVA) 51

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1 Danh sách 10 giống đƣợc sử dụng và nguồn gốc 18

Bảng 2 Mô tả các đặc tính hình thái của đậu nành 21

Bảng 3 Thành phần cho phản ứng PCR 25

Bảng 4 Quy trình phản ứng PCR: 25

Bảng 5 Danh sách các mồi dùng trong thí nghiệm 26

Bảng 6 Đặc điểm hình thái của 10 giống đậu nành rau 29

Bảng 7 Thời gian phát triển của 10 giống đậu nành rau 31

Bảng 8 Kết quả phân tích nông học về chiều cao cây, số cành và số lóng của 10 giống đậu nành rau (cm) 35

Bảng 9 Kết quả phân tích năng suất thành phần năng suất của 10 giống đậu nành rau 38

Bảng 10 Phần trăm số hạt trên trái của 10 giống đậu nành rau 39

Bảng 11 Kết đo OD và nồng độ của DNA của 10 giống đậu nành rau 40

Bảng 12 Kết quả điện di 5 mồi của dấu SSR với 10 giống đậu nành rau 40

Bảng 13 Thứ tự các giếng điện di của các giống đậu nành rau 41

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1.Tỉ lệ các loại trái của 10 giống đậu nành rau 39

Hình 2 Kết quả điện di gel sản phẩm PCR mồi Satt394 41

Hình 3 Kết quả điện di gel sản phẩm PCR mồi Satt398 41

Hình 4 Kết quả điện di gel sản phẩm PCR mồi Satt166 41

Hình 5 Kết quả điện di gel sản phẩm PCR mồi Satt163 41

Hình 6 Kết quả điện di gel sản phẩm PCR mồi Sat_088 42

CÁC TỪ VIẾT TẮT

TGST Thời Gian Sinh Trưởng

CHƯƠNG I GIỚI THIỆU

Đậu nành (Glycine max (L.) Merrill) là cây thân thảo thuộc họ đậu (Fabaceae)

đang được trồng ở nhiều quốc gia trên thế giới, là một cây ngày ngắn giàu hàm lượng đạm được trồng để làm nguyên liệu chế biến thức ăn gia súc và các sản phẩm cho người Ngoài ra đậu nành còn có vai trò quan trọng trong hệ sinh thái nông nghiệp bền vững vì ở rễ cây họ đậu có chứa những nốt sần là nơi cư trú của các vi khuẩn cố định đạm giúp gia tăng độ phì nhiêu cho đất (Smil, 1999)

Đậu nành có nguồn gốc xa xưa xuất phát từ Trung Quốc, một trong những trung tâm khởi nguyên của thế giới bao gồm trung tâm khởi nguyên của đậu nành Đậu nành được trồng từ thế kỷ 11 trước công nguyên hoặc sớm hơn một vài năm cùng với gạo, lúa mì, lúa mạch và kê được xem là 5 loại lương thực chính của Trung Quốc đến trước khi chiến tranh Trung – Nhật diễn ra (1894-95) khi Nhật nhập khẩu đậu nành làm dầu

để sử dụng như phân bón Đến năm 1908, đậu nành được nhập vào Châu Âu và thu hút được sự chú ý của thế giới và trước đó năm 1712 thông qua bảng báo cáo của một nhà thực vật học người Đức, Châu Âu đã bắt đầu biết tới đậu nành (Lance, G., and Garren, B., 2005)

Cùng với giá trị dinh dưỡng cao, hạt đậu nành còn cung cấp các chất chống oxi hoá, các loại acid béo tốt cho cơ thể đặc biệt là tim mạch, trong thời gian gần nhu cầu

sử dụng đậu nành để làm thực phẩm, chế biến công nghiệp hay làm thức ăn gia súc sẽ tăng cao, mở ra cơ hội sản xuất đậu nành qui mô lớn trong nước Với việc tăng cao nhanh chóng nhu cầu đó thì ngoài việc cải thiện các phương thức sản xuất, cơ giới hoá nông nghiệp thì nhu cầu về các giống đậu nành chất lượng cao, thích nghi tốt với điều kiện khí hậu nước ta và đáp ứng được các nhu cầu thị trường là hết sức cấp bách Việc đánh giá đặc điểm di truyền ở cây đậu nành sẽ cung cấp những dữ liệu và thông tin đầy đủ cần thiết về hình thái cũng như là kiểu gien ở cây đậu nành, nhằm hỗ trợ cho quá trình nghiên cứu và lai tạo các giống đậu nành

Bằng các phương pháp truyền thống, để đánh giá và nghiên cứu về giống mới thường dựa vào các đặc tính nông học và kiểu hình (như dựa vào các tính trạng về số lượng hay chất lượng) Tuy nhiên phương pháp này gặp phải những khó khăn nhất định trong việc tìm hiểu một cách thấu đáo về mối liên hệ giữa các kiểu gien và tác động môi trường xung quanh lên các kiểu hình Cùng với sự tiến bộ vượt trội của khoa

học kỹ thuật ngày nay đã có thể giải quyết được các vấn đề khúc mắc trên, đó là các phương pháp sử dụng kỹ thuật PCR và dấu phân tử SSR Và đây chính là công cụ hữu ích giúp các nhà khoa học, di truyền và chọn giống có được một cách nhìn chính xác hơn, đáng tin cậy và giúp tiết kiệm thời gian, chi phí liên quan trong việc đánh giá về đặc điểm di truyền và lai tạo giống

Xuất phát từ những lý do nêu trên, đề tài “đánh giá đặc điểm di truyền của 10 giống đậu nành dựa trên đặc tính nông học và dấu phân tử SSR” được hình thành nhằm

- Đánh giá các đặc điểm di truyền của các dòng đậu nành thông qua đặc tính nông học

- Đánh giá đặc điểm di truyền ở các dòng đậu nành bằng dấu phân tử SSR từ đó giúp hỗ trợ trong việc lựa chọn được các giống đậu nành có phẩm chất tốt

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

1 Tổng quan về cây đậu nành

1.1 Đặc tính nông học, sinh học cây đậu nành

Đậu nành có tên khoa học là Glycine max (L.) Merrill, thuộc thân thảo, họ đậu (Fabaceae), họ phụ cánh bướm, có bộ gien 2n = 40

Đậu nành là cây song tử diệp, nảy mầm theo kiểu thượng địa Thời gian nảy mầm phụ thuộc vào giống, thời vụ và môi trường

Màu của trục hạ diệp thường có hai màu là xanh và tím Gien qui định tính trạng của màu thân cây con liên kết với gien qui định tính trạng màu hoa như thân xanh cho hoa trắng và thân tím cho hoa tím

Đậu nành có nguồn gốc từ các tỉnh phía bắc và đông bắc Trung Quốc, kế cận Cộng hoà liên bang Nga, Triều Tiên và Nhật Bản Các giống đậu nành lâu đời trồng ở nước ta hầu hết có nguồn gốc từ Trung Quốc

Đậu nành rau có hạt to hơn được thu hoạch ở giai đoạn R6-R7 khi hạt chưa trưởng thành và vỏ quả chưa được chuyển sang vàng (Zhang et al., 2010)

Đặc tính hình thái:

Thân: có hình tròn, màu xanh hoặc tím, chuyển sang màu vàng nâu khi già Thân bao gồm đốt và giữa đốt

Rễ: rễ cọc gồm rễ cái và rễ bên Trên bộ rễ có hệ thống các nốt sần là nơi ở cộng

sinh của vi khuẩn Rhizobium japonicum có khả năng cố định đạm cho cây

Lá: cây đậu nành gồm 4 loại lá; gồm 2 lá mầm, 2 lá đơn, 3 lá chét và lá gốc Đậu nành phân nhánh nhiều hay ít tuỳ thuộc vào đặc tính của giống, kỹ thuật canh tác, mật độ gieo trồng (trồng dày sẽ ít phân nhánh hơn)

Hoa và quả: hoa dạng cánh bướm gồm 5 cánh hoa, có độ dài ngắn không bằng nhau, tràng hoa và nhuỵ hoa Hoa mọc thành chụm từ 10 – 15 hoa trên một chùm, màu trắng hoặc tím Đậu nành là cây tự thụ phấn Quả có thể thẳng hay cong, có hoặc không có lông Mỗi trái đậu nành có khoảng 1 – 5 hạt nhưng phổ biến là 2 – 3 hạt

Dạng lá và số lượng lá kép rất đa dạng tuỳ theo giống Lá có hình mũi mác, hình bầu dục… Để xác định một cách chính xác dạng lá thường sử dụng tỉ lệ giữa chiều dài và chiều rộng lá kép, của lá nằm giữa thân sau khi dứt trổ

Bảng 1 Dạng lá xét theo tỉ lệ dài trên rộng lá

International Plant Genetic Resources Instit., (IPGRI), Rome (Italy)

Hạt: hạt đậu nành không có nội nhũ, chỉ có một lớp vỏ bao quanh phôi lớn tương

tự như các cây thuộc họ đậu Hình dạng biến đổi từ cầu, dẹt, dài đến ô van Vỏ hạt có nhiều màu nâu đen, xanh vàng… Khối lượng đạt từ 20 – 40 mg/hạt

Kích thước hạt là một trong những đặc điểm di truyền của giống và thường chịu ảnh hưởng nhiều bởi điều kiện môi trường và kỹ thuật canh tác Số lượng hạt và kích thước hạt có liên hệ với nhau, thường thì cây có số hạt nhiều sẽ cho hạt có kích thước nhỏ và ngược lại

Bảng 2 Xét nhóm theo thời gian sinh trưởng

1.2 Các giai đoạn phát triển

Sự phát triển của đậu nành được chia làm hai giai đoạn: sinh trưởng sinh dưỡng

và sinh trưởng sinh dục Các giai đoạn được mô tả trên có thể áp dụng cho tất cả các giống đậu nành ở bất kỳ điều kiện môi trường nào dù là một cây đơn hay một quần thể thực vật đều chính xác và khách quan (Fehr et al 1971)

Giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng bao gồm các giai đoạn: nảy mầm, giai đoạn tử diệp và phát triển các đốt trên thân chính Các giai đoạn sinh trưởng này được đánh số dựa vào số cuống có 3 lá phát triển một cách đầy đủ (Pedersen, 2014)

Giai đoạn sinh trưởng sinh dục chia làm các giai đoạn nhỏ: bắt đầu trổ, trổ hoàn toàn, tượng trái, trái phát triển, tượng hạt, hạt phát triển, bắt đầu chín và chín hoàn toàn

Các giai đoạn sinh trưởng có thể trùng lắp lên nhau khi 50% hoặc nhiều hơn số cây nằm trong hoặc ngoài giai đoạn (Pedersen, 2014)

Đậu nành là cây ngày ngắn nên quang kỳ và nhiệt độ có sự ảnh hưởng lớn đến việc trổ hoa Ví dụ khi chúng ta nhập các loại đậu nành ở miền ôn đới vào các nước nhiệt đới sẽ bị hiện tượng trổ hoa sớm, lí do là vì quang kỳ ở vùng nhiệt đới sẽ ngắn hơn quang kỳ ở các vùng ôn đới Tức là cây ngày ngắn sẽ trổ hoa khi điều kiện quang

kỳ ngắn hơn quang kỳ tới hạn (Critical photoperiod), cụ thể quang kỳ đối với đậu nành

là 10 – 12 giờ

Những điều này cũng được nhắc tới trong thí nghiệm của A P Upadhyay khi 8 dòng thuần trong thí nghiệm được trồng trong các điều kiện nhiệt độ và quang kỳ khác nhau Theo các điều kiện cảm ứng nhiều hơn, tức là trong một nhiệt độ trung bình ấm (30°C) khi độ dài ngày thấp hơn so với giá trị tới hạn (tức là ít hơn khoảng 13 giờ), các dòng thuần nở hoa giống nhau (23-24 ngày) Tăng độ dài ngày cao hơn mức quang kỳ tới hạn sẽ từng bước làm chậm việc ra hoa đến khi thời gian thực hiện để nở hoa đạt tới mức tối đa tại quang kỳ trần (Upadhyay et al 1994)

1.3 Đặc tính sinh hoá hạt đậu nành rau:

Đậu nành rau có quả và hạt to hơn vì thế giá trị dinh dưỡng cũng lớn hơn khi so sánh với các loại đậu nành thông thường khác cộng với khả năng dễ tiêu hoá nên đậu nành rau được xem như một trong những loại thực phẩm hàng ngày (Mai Quang Vinh, 2009)

Hàm lượng protein của đậu nành rau cao hơn so với đậu xanh (P sativum)

(Masuda, 1991) 56% Rao et al (2002) báo cáo rằng hàm lượng protein của hạt đậu nành rau tươi dao động từ 33% - 39% và đối với hàm lượng dầu là 13% đến 16% tương ứng Ở các nước phát triển, giống đậu nành rau với tỷ lệ dầu thấp và hàm lượng protein tương đối cao là phổ biến hơn ở những người trẻ tìm kiếm chế độ ăn lành mạnh (Brar và Cater, 1993) Saldivar et al (2011) cho rằng hạt đậu nành rau với hơn 45% protein và dầu hạt nhỏ hơn 18% là chấp nhận được Con người có thể nhận ra bốn hương vị cơ bản tức là ngọt, chua, đắng và mặn (Defilippi et al., 2009) Đường và các thành phần dễ bay hơi được phân loại là các chất hóa học chính ảnh hưởng đến chất lượng ăn uống trái cây (Joue Quand et al, 2008.) Shanmugasundaram et al (2001) báo cáo rằng các giống đậu nành rau với mức sucrose cao là phổ biến hơn so với các giống cây trồng với mức sucrose thấp ở Nhật Bản Đối với hạt tươi của đậu nành rau, tổng hàm lượng đường hòa tan trong khoảng từ 6,0% đến 7,4% trong một nghiên cứu bốn năm tại Đài Loan (Tsou và Hồng, 1991) và 7,5% đến 12,5% trong một ba năm nghiên cứu ở Trung Quốc (Zhang et al., 2006) (Li et al., 2012)

Ngoài ra đậu nành còn cho thấy sự khác biệt với khả năng cung cấp tất cả 10 acid amin cần thiết, chính đặc tính quí này giúp đậu nành đáp ứng khoảng 30% nhu cầu dầu thực vật của thế giới Bên cạnh đó trong đậu nành còn có đường lactose không chứa acid béo, các chất chống oxi hoá như vitamin C, K và D và acid folic, các vitamin nhóm B, acid nicotinic (23 µg/g), acid pantothenic (15µg/g), thiamine (12µg/g), pyridoxine (8µg/g), riboflavin ( 3,5µg/g) và vitamin H – biotin (0,7µg/g) các hợp chất isoflavones như genistein và daidzein (Mathur, 2004)

1.4 Tính thơm của đậu nành rau:

Người tiêu dùng ở châu Phi và Nam Á đã bày tỏ sự không thích thú cho hương vị 'beany' của đậu nành rau, cho thấy cần phải cải thiện hương vị trước khi giới thiệu rộng rãi ở Ấn Độ Giống Dadachamame hạt nâu có mùi thơm của gạo thơm hấp dẫn hơn với người tiêu dùng Nghiên cứu để chuyển giao "hương vị Basmati" cho giống với đậu xanh, màu vàng và màu đen đang được tiến hành (Shanmugasundaram 2004) Các hợp chất hóa học chủ yếu liên quan đến mùi vị là sucrose, axit glutamic và alanin (Masuda, 1991) Những đặc điểm không thể chấp nhận như vị đắng, chát và phi hương

vị đã được quy cho saponin và isoflavones Đun sôi đậu nành rau giúp tăng hương vị

đặc trưng của nó vì ketones và furan cảm ứng nhiệt cùng với việc làm vỡ các tế bào và

mô giải phóng các hợp chất bay hơi Trong đậu nành rau luộc, các thành phần của các hương vị giống như hoa đến từ cis Jasmine, (Z) -3-hexenyl-acetate, linalool và acetophenone Các thành phần của hương vị beany, 1-octen-3-ol, 1-hexanol, hexanal, 1-pentanol, (E) -3-Hexen-1-ol, 2-hepta-none và 2-pentylfuran cũng được phát hiện Đông lạnh làm vỡ tế bào tạo ra hương vị không mong muốn từ peroxit lipid (Masuda 1991)

Trong gạo, mùi thơm được coi là một tính trạng đặc biệt quyết định cho gạo thơm như các loại Jasmine của Thái Lan và gạo Basmati của Ấn Độ và Pakistan Tương tự như vậy, trong đậu nành rau, hạt non được tiêu dùng như một loại rau hoặc món ăn vặt gọi là 'Edamame', và hương thơm đóng một vai trò quan trọng ảnh hưởng đến sở thích và sự chấp nhận của người tiêu dùng “Chamame”, một nhóm đặc biệt của

“Edamame” có một hương thơm dễ chịu do sự hiện diện của 2AP (Fushimi và Masuda, 2001), được ưa chuộng bởi người tiêu dùng và có thể có giá cao hơn 2-Acetyl-1-pyrroline (2AP) là một hợp chất dễ bay hơi sản sinh ra hương thơm mạnh có mùi giống bỏng ngô hoặc lá dứa được tìm thấy rộng rãi trong các sản phẩm ngũ cốc và các sản phẩm có nguồn gốc từ thực vật và động vật (Adams và De Kimpe, 2006) Thành phần hương thơm này là một giá trị gia tăng đặc trưng và thoã mãn sở thích của người tiêu dùng một cách tích cực (Fitzgerald et al., 2009)

Ngoài ra trong nghiên cứu này Arikit et al (2010) cũng đã khẳng định vai trò của hợp chất 2AP như sau:

Mười giống đậu nành bao gồm cả 2 loại thơm và không thơm đã được lựa chọn

để thử nghiệm hoạt động của enzyme AMADH trong hạt non Các đặc trưng hương vị của mười giống đã được xác nhận bằng cách đo hàm lượng 2AP trong hạt bằng sắc ký khí khoảng trống (HSGC) 2AP đã được phát hiện trong tất cả năm giống thơm nhưng trong các giống không thơm thì không Kết quả này cho thấy rằng 2AP là yếu tố quyết định kiểu hình thơm của đậu nành

Plonjarean et al (2007) đã nhắc tới tính thơm của đậu nành rau thông qua một

nghiên cứu đối với giống chakaori, là một giống đậu nành rau có mùi thơm được trồng khá phổ biến tại Thái Lan vào thời gian đó Bằng phương pháp sắc ký khí – khối phổ tác giả đã đi đến kết luận rằng 27 hợp chất tạo mùi đã được phát hiện bao gồm 2

acetylpyrrole được xác định lần đầu tiên trong đậu nành Các hợp chất tạo hương vị phổ biến nhất được phát hiện là n-hexane (0,91%), 1-hexanol (1,79%), 2-hexanal (0,48%), 3-hexene-1-ol (0,49%) và rượu phenylethyl (0,40%)

Cơ chế hình thành tính thơm:

Việc thiếu hụt amino aldehyde dehydrogenase (AMDH) trước đó đã được chứng

minh là nguyên nhân tạo ra quá trình sinh tổng hợp 2AP trên lúa (Oryza sativa L.)

(Vanavichit et al., 2008) Một khảo nghiệm hoạt động của AMADH trong đậu nành cho thấy hợp chất thơm của đậu nành, có chứa 2AP, cũng được sinh tổng hợp trong điều kiện enzyme AMADH bị bất hoạt Hai gien đặc trưng GmAMADH1 và GmAMADH2, tương đồng với gien Os2AP trên gạo mã hóa enzyme AMADH Mức

độ sao chép của gien GmAMADH2 ở giống thơm thấp hơn so với các giống không thơm, trong khi sự biểu hiện của gien GmAMADH1 là không thay đổi Đột biến mất một cặp nucleotide (TT) ở exon 10 của gien GmAMADH2 được tìm thấy trong tất cả các giống thơm Sự biến đổi này gây ra một đột biến dịch khung và tạo một mã kết thúc sớm Sự bất hoạt GmAMADH2 bằng cách đưa một cấu trúc GmAMADH2-RNAi vào trong mô sẹo của hai giống hoang dại không thơm ức chế sự tổng hợp của AMADH và cảm ứng sinh tổng hợp các hợp chất 2AP Những kết quả này gợi ý rằng việc thiếu hụt sản phẩm của gien GmAMADH2 - enzyme AMADH - đóng một vai trò tương tự trong đậu nành như gạo, đó là thúc đẩy sinh tổng hợp hợp chất 2AP Hiện

tượng này có thể là một cơ chế bảo tồn của các loài thực vật (Arikit et al., 2011)

Dựa vào cơ chế này hai cặp mồi Normal-U/L và Chamame-U/KAORI-L đã thiết kế được bởi Nguyễn Lộc Hiền et al (2012) giúp nhận

KAORI-diện được 5 giống đậu nành rau có tính trạng thơm (Takihime, Fusanari Chamame, Fukunari, Yuagari musume và Natsunokoe) trên tống số 22 giống đậu nành rau Nhật Bản được nghiên cứu

1.5 Tiêu chuẩn trong công tác chọn giống đậu nành

Tuỳ theo quan điểm và mục đích của người chọn giống mà có các đánh giá tiêu chuẩn trong công tác chọn giống khác nhau Về cơ bản một số tác giả như Trần Thượng Tuấn (1983), Ciramgil (1984), Đào Thế Tuấn (1975) có sự thống nhất ở một

số chỉ tiêu như:

- Năng suất cao, ổn định và có phẩm chất tốt

- Có khả năng chịu bệnh, kháng sâu cao

- Thích nghi cao với điều kiện khí hậu và ngoại cảnh như khô hạn, đất có thành phần cơ giới nặng hay chua phèn

- Thời gian sinh trưởng ngắn (<90 ngày)

Những đặc điểm này cũng được đề cập đến trong Nghiên cứu xác định các phương pháp tạo giống mới, Luyện Hữu Chi và Trần Như Ngôn (1982)

Ngoài ra theo Trần Thượng Tuấn (1983) còn có các tiêu chuẩn đáng chú ý như:

- Khó đổ ngã, khả năng cộng sinh với các dòng vi khuẩn Rhizobium japonicum để tạo nốt sần cố định đạm cao

- Ít quang cảm giúp khả năng thích nghi rộng để trồng được ở nhiều địa phương khác nhau

Riêng đối với đậu nành rau cần có thêm các tiêu chuẩn như:

- Kích thước hạt tươi lớn, số hạt nhiều

- Năng suất cao, phẩm chất hạt tốt đặc biệt là phải có vị thơm ngọt

1.6 Vai trò của giống

Giống là thuật ngữ dùng để chỉ một quần thể các sinh vật cùng loài có cùng đặc điểm di truyền Hầu hết các đặc tính nông học thể hiện ra bên ngoài như năng suất, trọng lượng hạt, chiều cao cây đều do sự tác động qua lại giữa kiểu gien và đặc điểm môi trường xung quanh Hiện nay, khoa học kỹ thuật phát triển đã làm cho các phương pháp và kỹ thuật canh tác gần như đạt tới ngưỡng nhất định Hay nói cách khác nếu các yếu tố đầu vào sản xuất khác như: phân bón, nước tưới, chăm sóc được đáp ứng đầy đủ thì giống cũng không thể vượt qua được ngưỡng tiềm năng năng suất vốn có của nó Vì vậy chỉ có thể bằng sự đột phá về giống tức là phá vỡ ngưỡng tiềm năng vốn có mới có thể giúp mang lại cây trồng với năng suất cao hơn cùng các phẩm chất tốt hơn Ngoài ra một số phẩm chất chất lượng như tính kháng bệnh, màu hoa, màu trái hầu như phụ thuộc rất lớn vào kiểu gien của giống, vì vậy chỉ có việc cải thiện giống mới giúp đa dạng và phong phú các đặc điểm quý

Giống nhập nội: là các giống có nguồn gốc từ nhiều nơi trên thế giới được nhập vào nước ta với mục đích nghiên cứu, lai tạo và cải thiện giống địa phương, cho ra các

giống mới có năng suất cao và phẩm chất tốt Vì đặc điểm là từ nhiều nguồn khác nhau nên giống nhập nội có sự đa dạng rất lớn với các kiểu gien và các kiểu hình khác Giống địa phương: là nhóm giống được trồng lâu đời tại các vùng miền khác nhau trên cả nước nên có khả năng thích nghi cao với thổ nhưỡng và khí hậu tại nước

ta Thường thì các giống địa phương được sử dụng như nguồn lai tạo với các giống nhập nội, ngoài ra cũng là nguồn bổ sung các gien quý và đặc tính quý cho công tác lai tạo giống mới

2 Đặc điểm di truyền và các phương pháp đánh giá

2.1 Đặc điểm di truyền

Hiện nay có rất nhiều định nghĩa về đặc điểm di truyền và theo trang web của Tổng cục môi trường, cục bảo tồn đa dang sinh học định nghĩa đặc điểm di truyền là tất cả biểu hiện của sự đa dạng về mặt di truyền được thể hiện thông qua các kiểu hình Như vậy khi xét đến sự đặc điểm di truyền được biểu hiện thông qua các kiểu hình hay đơn giản hơn là kiểu hình đó kết quả của sự tác động qua lại giữa kiểu gien

và môi trường Nói một cách cụ thể hơn là nếu như các cây có cùng kiểu gien nếu sống trong các điều kiện môi trường khác nhau thì sự biểu hiện kiểu hình ra bên ngoài sẽ không giống nhau hoàn toàn, và các cây nếu có kiểu hình giống nhau cùng sống chung trong một môi trường chưa chắc là có cùng kiểu gien

Các đặc điểm di truyền như màu lông tơ, dạng lá và thân cùng với màu hoa và trái là một công cụ hữu ích cho việc xác định các kiểu gien của đậu nành Thành phần năng suất, chiều cao cây, số lóng trên thân, cấu tạo và dạng hạt có thể khác nhau giữa các giống nhưng hầu như sự khác biệt là không có ở các đặc điểm vỏ hạt, màu tể hay màu trục hạ diệp (Elemary et al., 1998)

Việc đánh giá 10 giống chỉ ra rằng mỗi loại dạng thân gồm hữu hạn, vô hạn và bán hữu hạn đóng góp lần lượt 72,8% 80,8% và 79,93% vào tổng năng suất giống Tổng số trái trên cây, chiều cao cây, mức độ đổ ngã, số lóng trên cành cấp 1, ngày trổ hoa đầu tiên và ngày dứt trổ trên cành chính, số ngày trổ hoa kéo dài trên thân chính và trên cành, số lóng trên thân chính đóng góp tới 90,12% vào năng suất của giống Trong khi 87,11% năng suất của giống được đóng góp bởi tổng số trái trên thân, số ngày trổ hoa, số lóng trên cành cấp 1 và mức độ đổ ngã Nhưng trong các phân tích chung, tính không tương ứng của tập quán phát triển (irrespective of growht habit), tổng số trái

trên cây, ngày chín, số ngày trổ hoa kéo dài, số lóng trên cành và chiều cao cây ảnh hưởng trới 82,16% năng suất giống (Bhattacharya và Tam, 1998)

2.2 Các phương pháp nghiên cứu đặc điểm di truyền

- Dựa vào tính trạng số lượng

Tính trạng số lượng (quantitative traits) hay còn được gọi là tính trạng đo lường

vì sự nghiên cứu các đặc tính này hầu hết phụ thuộc vào đo lường và các đặc điểm này hầu hết là khó tách rời, khó phân thành từng nhóm Không giống như tính trạng chất lượng các tính trạng này chịu sự chi phối của nhiều gien, mỗi gien đóng góp một ít vào tính trạng chung Vì vậy sự biểu hiện của chúng thường là có tính liên tục với các giá trị từ thấp đến cao, ít đến nhiều, có nhiều dạng trung gian và thường chịu sự tác động lớn của môi trường

Chúng ta có thể dễ dàng nhận thấy các tính trạng về năng suất, phẩm chất, thời gian sinh trưởng v.v… là tính trạng số lượng và chúng chịu sự tác động của môi trường Ví dụ như việc nhiệt độ xuống thấp có thể ảnh hưởng đến thời gian ra hoa của các loại mai, cường độ chiếu sáng và thời gian chiếu sáng có thể ảnh hưởng đến năng suất lúa

- Dựa vào tính trạng chất lượng

Tính trạng chất lượng (qualitative traits) còn gọi là những tính trạng Mendel, là những tính trạng khi nghiên cứu có thể dễ dàng nhìn thấy và đánh giá bằng mắt thường, những tính trạng do một hay một vài gien chính điều khiển, và có kiểu hình tương tự nhau bất kể sự khác biệt của môi trường

Các đặc điểm liên quan đến tính trạng chất lượng có thể dễ dàng tìm thấy ở cây đậu nành như: màu thân cây con, màu hoa, màu vỏ trái, màu vỏ hạt, màu tể… Các đặc điểm này có thể dễ dàng phân chia thành từng nhóm, từng loại riêng biệt nên các đặc tính này có thể giúp đỡ trong việc đánh giá đặc điểm di truyền và phân loại giống

- Kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR là một kỹ thuật thuộc lĩnh vực sinh học phân tử, do Kary Mullis – nhà khoa học người Mĩ sáng chế ra vào năm 1985, được sử dụng khá phổ biến hiện nay Mục đích chính là giúp tạo ra càng nhiều bản sao (copies) một đoạn DNA của tế

bào sống trong môi trường in-vitro – môi trường giả lập trong phòng thí nghiệm –

tương tự như việc tổng hợp DNA của tế bào sống PCR được ứng dụng thành công

trong rất nhiều các lĩnh vực khác nhau như giúp đánh giá đa dạng, nghiên cứu lai tạo

và chọn giống, giúp nhận dạng sinh vật Hơn thế nữa PCR là một kỹ thuật nền cơ bản cho các nghiên cứu cấp cao hơn về di truyền phân tử ( như xác định trình tự gien, tính

đa hình của DNA, xác định các dấu phân tử – marker v.v…), phát hiện các bệnh di truyền nhận dạng, chẩn đoán những bệnh nhiễm trùng, tách dòng gien và xác nhận huyết thống

Các thành phần cần có của một phản ứng PCR là DNA mạch khuôn (DNA template) chứa mẫu DNA cần khuếch đại, cặp mồi (primer) để nhận diện vùng bắt đầu

và kết thúc của vùng cần khuếch đại, DNA polymerase enzyme (dạng phổ biến là Taq polymerase) xúc tác cho quá trình PCR, dNTP (các nucleotides) là nguyên liệu cho DNA-polymerase để xây dựng nên DNA mới, dung dịch đệm (buffer) cung cấp môi trường hoá học để DNA-polymerase hoạt động Để có thể thao tác tốt kỹ thuật PCR đòi hỏi một sự hiểu biết nhất định về các trình tự nucleotide ở hai đầu của đoạn DNA cần khuếch đại, đoạn mồi được thiết kế nhằm tạo nên liên kết đơn với các đoạn DNA đơn Sau khi đoạn mồi được tổng hợp và cho gắn lên các sợi đơn, các DNA-polymerase sẽ sử dụng dNTP làm nguyên liệu tổng hợp nên đoạn DNA mục tiêu Quá trình phản ứng PCR trải qua khoảng 32-35 chu kỳ bao gồm 3 giai đoạn: + Giai đoạn biến tính DNA (denaturation): nhiệt độ được tăng lên cao trong khoảng 940

C – 960C Khi đó các liên kết hydro giữa hai mạch DNA bị phá vỡ giúp cho hai mạch tách rời nhau Giai đoạn này thường kéo dài 1-2 phút tuỳ đoạn DNA và các nhân tố ảnh hưởng

+ Giai đoạn gắn mồi (annealing): nhiệt độ gắn mồi khoảng 400C – 700C, khi đó cặp mồi bắt cặp với mạch khuôn DNA ở các đầu 3‟ theo nguyên lý Chargaff Giai đoạn này kéo dài khoảng 30 – 60 giây tuỳ thuộc cặp mồi và các yếu tố khác

+ Giai đoạn kéo dài (extension): nhiệt độ 700C – 720C, nhờ enzyme polymerase xúc tác gắn các nucleotide tự do vào mạch khuôn tiếp theo sau cặp mồi theo nguyên tắc bổ sung Nhờ quá trình này, các mạch đơn DNA mới được hình thành Tuỳ theo kích thước đoạn DNA mà thời gian của giai đoạn kéo dài có thể từ 30 giây đến vài chục phút

DNA-Mỗi phản ứng PCR sẽ có những đặc trưng riêng và cần có các điều kiện nhất định để đạt được hiệu suất tốt nhất Do đó mỗi phản ứng sẽ có qui trình riêng biệt tuỳ

thuộc vào tính chất của từng đoạn mồi, mạch khuôn Vì vậy, trong những phản ứng PCR đôi khi sẽ xảy ra những vấn đề không mong muốn như:

Không có sản phẩm hoặc lượng sản phẩm quá thấp

Vệt smear kích lớn hơn sản phẩm mong muốn

Các băng sản phẩm (band) phụ lại rõ nét với kích thước thấp hơn sản phẩm mong muốn (Đoàn Ngọc Phú, 2013)

Khi gặp các trường hợp này, cần phải rà soát lại tất cả những thành phần tham gia phản ứng, các bước thao tác để tìm ra những nhân tố tác động như nhiệt độ, thời gian của từng giai đoạn, nồng độ của các enzyme, dNTPs, dung dịch đệm; tính đặc hiệu của cặp mồi, độ tinh sạch, DNA khuôn… Tuỳ vào từng vấn đề sẽ có cách xử lý cụ thể

2.3 Dấu SSR

Ngày nay với việc hỗ trợ của khoa học kỹ thuật, các nhà khoa học đã sử dụng một cách thành công phương pháp dùng các dấu phân tử, trong đó phổ biến nhất là dấu SSR, để nghiên cứu về di truyền ở thực vật

Kỹ thuật SSR được Litt và Luty phát triển vào năm 1989 dựa trên các nguyên tắc của kỹ thuật PCR nhằm mục đích nhận diện các trình tự lặp đơn giản này do tính phổ biến ở hầu hết các loài và tính đặc trưng đại diện cho loài SSR sử dụng các trình tự lặp lại đơn giản (Simple Sequence Repeat) còn được gọi là kỹ thuật microsatellite (vi

vệ tinh) là những đoạn ngắn của của DNA có chứa 2 – 6 nucleotide có trình tự lặp lại liên tục và số lần lặp lại dao động từ 2 – 40 lần (Schlotterer, 2000) Ví dụ như (AT)n, (AG)n, (AGTC)n Về cơ bản kỹ thuật SSR trải qua các bước như sau:

Nhận dạng các trình tự lặp lại đơn giản

Xác định trình tự của DNA và thiết kế mồi

Các trình tự gần kề và trình tự lặp sẽ tạo nên SSR

Đoạn mồi được thiết kế dựa trên vùng cận kề ở hai đầu đoạn SSR Hầu hết các trình tự lặp có sự xuất hiện của vùng dị nhiễm sắc trên mỗi nhiễm sắc thể, hỗ trợ cho việc điều hoà hoạt động của gien, góp phần tăng cường tính ổn định về mặt cơ học cho nhiễm sắc thể trong phân bào; nó có thể mang thông tin di truyền đóng góp vào vai trò xác định giới tính ở cả động vật và thực vật Với số lần lặp lại nhiều dẫn đến các đoạn DNA có độ dài khác nhau hay sự khác nhau về số lượng nucleotide trong mỗi đơn vị

lặp lại dẫn tới tính đa hình về độ dài của SSR được nhân bản và mức độ của sự đa hình

sẽ được xác định bằng phương pháp chụp UV sản phẩm điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamide… SSR được phân tích trên nền tảng kỹ thuật PCR vì thế không đòi hỏi nhiều về mạch khuôn DNA hay chúng ta có thể sử dụng kỹ thuật SSR chỉ với một lượng nhỏ mẫu DNA Cặp mồi SSR có từ 1- 12 locus (tuỳ loài) được tổ hợp trong một ống PCR do vậy cho phép ghi nhận một cách đồng thời các kiểu gien có nhiều locus, giúp tiết kiệm thời gian Cặp mồi trong kỹ thuật SSR có khả năng phát hiện tính

đa hình rất cao, có thể phân biệt được các sự sai khác rất nhỏ cộng với việc cặp mồi của SSR dựa trên trình tự đặc trưng nên kết quả cho ra có độ chính xác cao và đáng tin cậy đặc biệt trong việc phát hiện sự thay đổi các trình tự hiếm Ngoài ra SSR là loại marker đồng trội cùng với việc phản ứng không quá tốn kém, nhanh chóng giúp tiết kiệm thời gian đã biến SSR thành công cụ hữu hiệu trong các ứng dụng chọn giống thực vật, nghiên cứu di truyền, nghiên cứu một số tính trạng liên quan đến năng suất, bệnh hại, xác định giới tính, lập bản đồ gien…

Nhược điểm của phương pháp này là sự phức tạp trong thiết kế mồi và quá trình thiết kế rất đắt đỏ, mỗi loại mồi lại chỉ đặc trưng cho mỗi locus đa hình ngoài ra việc hạn chế trong số lượng cặp mồi thiết kế dành cho cây trồng các loại cũng là một trở ngại đáng kể trong việc lập bảng đồ gien khi sử dụng SSR Và để xây dựng được các cặp mồi đặc hiệu cần tách dòng và đọc một số lượng lớn các đoạn DNA có chứa SSR Một vấn đề khác thường gây khó khăn trong sử dụng đó là việc xác định quan hệ giữa các allel với các marker phân tử Khi phân tích di truyền và nghiên cứu quần thể việc

sử dụng các đầu dò nhiều locus là rất khó vì SSR có thể được phân bố ngẫu nhiên trong bộ gien nhưng cũng có khi lại tập trung ở tâm động hay eo thứ cấp của nhiễm sắc thể (Singh et al., 2000)

2.4 Một số nghiên cứu về kỹ thuật phân tử SSR trên đậu nành

Geraldo et al (2004) đã sử dụng quần thể lập bản đồ A BC1 F2 bắt nguồn từ việc lai chéo giữa Hartwig (đề kháng) và các dòng đậu nành của Brazil Y23 (nhạy cảm) để xác định các microsatellite marker liên kết với một gien kháng Heterodera glycines Ichinohe (U nang tuyến trùng ở đậu tương - SCN) ở giống đậu nành Hartwig Khoảng

200 cặp mồi SSR đã được thử nghiệm trong một phân tích segregant bulked (BSA) Những cặp mồi cho thấy tính đa hình rõ ràng đã được khuếch đại trong quần thể BC1

F2, đã được đánh giá trước đó về tính kháng/nhạy cảm với SCN Race 3 Ba dấu SSR liên quan đến kháng SCN đã được phát hiện trong quần thể Hai trong số đó, Satt 038

và Satt 163, liên kết một gien kháng trội (d/a = -0,90), giải thích cho 37% phương sai kiểu hình

Nguyễn Lộc Hiền (2012) đã sử dụng 26 mồi SSR cùng kết hợp với dấu RAPD để đánh giá đa dạng di truyền ở 22 giống đậu nành rau Nhật Bản từ đó chọn ra được bốn

giống Wase edamame, Fusanari chamme, Chuse edamame và Yuusuzumi có quan hệ

xa về mặt di truyền so với các giống khác để làm nguồn vật liệu cho lai tạo trong tương lai

Nghiên cứu của Vilram Dayaman (2007) cho thấy hơn 22 tính trạng nông học của đậu nành được qui định bởi các loci liên kết chặt chẽ với 13 mồi SSR Cụ thể hơn các loci Satt371.5, Satt33.1.2, Satt367.3 và Satt212.1 liên kết với tính trạng màu lông tơ; Satt268.2, Satt331.1.3.4.5 liên kết với tính trạng kích thước lá; Satt331.5 có liên quan với tính trạng chiều cao cây và Satt414.3 gắn kết với tính trạng màu tể hạt

Bệnh gỉ đậu tương châu Á là một mối đe dọa lớn đối với việc sản xuất đậu tương

(Glycine max) ở nhiều vùng trên thế giới, trong đó có Hoa Kỳ Chỉ có năm nguồn

kháng đã được xác định (kháng Phakopsora pachyrhizi1 [Rpp1], Rpp2, Rpp3, Rpp4,

và Rpp5) Rpp4 trước đó đã được xác định trong kiểu gien kháng của PI459025B và đánh dấu trong 2 centimorgans của locus Satt288 trên nhiễm sắc thể số 18 (nhóm liên kết G) Sử dụng dấu SSR, chúng tôi phát triển một nhiễm sắc thể vi khuẩn nhân tạo contig cho locus Rpp4 trong thụ thể cv Williams82 (Wm82) Giải trình tự vùng gien này xác định ba gien Rpp4 có khả năng kháng bệnh (Rpp4C1-Rpp4C3 [Wm82]) với

sự tương đồng lớn nhất đối với các gien kháng bệnh trên vùng có nhiều trình tự leucine lặp cuộn lại của họ rau diếp RGC2 (Lactuca sativa) Cấu trúc chứa đựng những vùng gien Wm82 Rpp4 đã được sử dụng cho các thí nghiệm làm bất hoạt gien virus gây ra để tạo tính kháng trong PI459025B, khẳng định rằng gien orthologous có tính kháng Sử dụng đoạn mồi được phát triển từ các trình tự bảo tồn trong các gien ứng cử viên Wm82 Rpp4, chúng tôi xác định năm gien ứng cử viên của Rpp4 (Rpp4C1-Rpp4C5 [PI459025B]) từ kiểu gien kháng

Các dấu bổ sung phát triển từ Wm82 Rpp4 khuẩn nhiễm sắc thể nhân tạo contig xác định thêm các vùng có chứa Rpp4 và loại bỏ Rpp4C1 (PI459025B) và Rpp4C3

(PI459025B) như các gien ứng cử viên Xác định trình tự của phiên mã ngược các sản phẩm PCR tiết lộ rằng Rpp4C4 (PI459025B) có tính biểu hiện cao trong các kiểu gien kháng, trong khi biểu hiện của gien ứng cử viên khác là gần như không thể phát hiện Những dữ liệu này hỗ trợ gien Rpp4C4 (PI459025B) như gien ứng cử viên duy nhất cho gien kháng Rpp4 trên bệnh gỉ đậu tương châu Á (Meyer et al., 2009)

3 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu:

- Microsoft Excel: xử lý số liệu thô, phân tích thống kê, chỉ số đa dạng Shannon

- Phần mềm SPSS : phân tích phương sai và đặc số thống kê của các đặc tính nông học, năng suất và thành phần năng suất

- Các số liệu từ các tính trạng như: thời gian sinh trưởng, chiều cao lúc trổ, chiều cao lúc chín, số cành hữu hiệu, số trái trên cây, số hạt trên cây và trọng lượng hạt trên cây được đưa vào phân tích bằng phần mềm ANOVA Sự khác biệt có ý nghĩa giữa các dòng đậu nành được kiểm tra bởi phép thử “Duncan” ở mức ý nghĩa 1% và 5 %

- Sự hiện diện hoặc không hiện diện của các băng ghi nhận khi chụp hình gel dưới tia UV được kí hiệu theo số liệu hệ nhị phân 0 và 1 (trong có 0 = không có băng

và 1 = có băng) và tổng hợp thành một ma trận Thông số đa hình tại mỗi locus SSR

được tính theo chỉ số PIC (Polymorphic Information Content) (Smith et al, 2000)

3.1 Phân tích phương sai

Phương sai (Variance) là tham số đặc trưng tiêu biểu nhất cho tính chất phân tán của tổng thể

Công thức tính phương sai:  1  X X2

X

SD CV

CV (coefficient of variation): hệ số biến thiên; SD (Standard Deviation): độ lệch chuẩn; X: giá trị trung bình Hệ số biến thiên thể hiện mức độ biến động của một tính trạng Tính trạng mong muốn là tính trạng có hệ số biến động thấp Hệ số biến động mang ý nghĩa trong công tác chọn giống

3.3 Hệ số biến dị kiểu gien và kiểu hình

Hệ số biến dị kiểu gien và kiểu hình được tính theo công thức của Burton (1952)

và được chia thành ba mức: thấp (<10%), trung bình (10-15%) và cao (>15%) trong đó:

Vg: phương sai kiểu gien; Vp: phương sai kiểu hình; : trung bình chung

3.4 Hệ số di truyền theo nghĩa rộng (h b 2 )

Hệ số di truyền theo nghĩa rộng được tính dựa trên tỉ số của phương sai kiểu gien

và phương sai kiểu hình theo giá trị phần trăm (Allard, 1960)

Vg: phương sai kiểu gien; Vp: phương sai kiểu hình Hệ số di truyền được đánh giá thấp (<30%), trung bình (30%-70%) và cao (>70%) Hệ số di truyền (hb

2

) của một tính trạng cao cho thấy tính trạng do gien quy định ít chịu ảnh hưởng điều kiện môi trường

CHƯƠNG III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 Thời gian và địa điểm

Các giống được gieo trồng từ tháng 8/2014 đến tháng 12/2014 tại nhà lưới và các thí nghiệm như ly trích DNA, đo OD, điện di kiểm tra DNA, PCR, điện di với DNA đã được khuếch đại được thực hiện tại phong thí nghiệm Sinh học phân tử thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ từ tháng 8 đến tháng 12/2014

2 Phương tiện

2.1 Vật liệu

Thí nghiệm được tiến hành trên 10 giống đậu nành rau nhập nội từ AVRDC (2013)

Bảng 3 Danh sách 10 giống được sử dụng và nguồn gốc

2.2 Phương tiện

Thiết bị: sử dụng các thiết bị trong nhà lưới Viện và phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học thuộc trường Đại học Cần Thơ

2.2.1 Thiết bị và dụng cụ

Micropippet các loại (2-20 µl, 10-100µl, 100-1000µl); Đầu cone (loại 10µl, 200µl, 1000µl); Găng tay; Tube Eppendorf 2.2ml và 1.5ml; Cối và chày; Bể ủ nhiệt (Thermomixer comport), Máy PCR (Bio- Rad C1000, nước sản xuất: Mỹ); Máy nghiền Retsch MM200; Máy ly tâm Eppendorf Concentrator 5417C; Khuôn, lược đổ gel; Bộ điện di 1 chiều (Bio-Rad, nước sản xuất: Mỹ); Máy đo quang phổ; Máy chụp

UV (Bio-Rad 2000, nước sản xuất: Mỹ); Máy sấy chân không Eppendorf Concentrator 5301; Lò vi sóng; Nồi khử trùng nhiệt ướt; Cân điện tử; Tủ lạnh -200C (Akira, nước sản xuất: Nhật Bản); Tủ mát 4-100C (Alaska, nước sản xuất: Nhật Bản)

- CTAB buffer; Chloroform; isoamyalcohol

 Hóa chất sử dụng để khuếch đại DNA:

- BSA; Buffer (Tag buffer + KCl, - MgCl2); MgCl2 1,5 mM; Agarose

- Taq DNA polymerase; Thang chuẩn:

3 Phương pháp nghiên cứu:

3.1 Thí nghiệm trong nhà lưới:

3.1.1 Bố trí thí nghiệm

Mỗi giống được trong thành luống, mỗi luống có chiều dài 1,5m với 10 hốc mỗi hốc gieo 2 hạt, khoảng cách giữa 2 luống gần nhất là 0,4m

3.1.2 Chỉ tiêu thu thập và phân tích:

Các dữ liệu thu thập về chỉ tiêu về tính trạng số lƣợng và chất lƣợng của đậu nành từ bảng mô tả của National Bureau of Plant Genetic Resources (NBPGR)

 Chỉ tiêu hình thái

Bảng 4 Mô tả các đặc tính hình thái của đậu nành

1 Màu trục hạ

diệp Đánh giá khi lá đầu tiên xoè rộng ra

Xanh (Green) Tím (Purple)

2 Màu lông tơ Đánh giá giai đoạn 25-30 NSKG

Xám (Gray) Nâu Nhạt (Light Brown) Nâu (Brown)

3 Màu hoa Đánh giá khi thấy 50% cây trong lô bắt đầu

trổ

Tím (Purple) Trắng (White)

4 Màu vỏ trái

chín Đánh giá khi thu hoạch, thu hạt

Nâu vàng (Tan) Nâu (Brown) Đen (Black)

5 Màu vỏ hạt Đánh giá khi thu hoạch, thu hạt

Vàng nhạt (Yellow White) Vàng (Yeallow) Xanh (Green) Nâu Nhạt (Light Brown) Nâu (Brown) Xám (Gray) Đen không hoàn toàn (Đen che vàng)

Đen (Black) Khác (Other)

Vàng (Yeallow)

Da Trâu (Buff) Nâu (Brown) Xanh (Green) Xám (Gray) Đen không hoàn toàn (Imperfect

Black) Đen (Black) Khác (Other)

Nguồn: minimal descriptor NBPGR

 Chỉ tiêu nông học