Tuyển chọn các chủng vi sinh vật tạo chế phẩ m nhằm xử lý nước thải nuôi trồng thủy sản

Với mong muốn tìm ra những chủng vi sinh vật có khả năng làm s ạch môi trường nước nuôi tôm, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Tuyển chọn các chủng vi sinh vật tạo

LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới TS Bùi Thị Việt Hà –

Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, người đã tận tình dìu dắt, hướng dẫn và chỉ bảo tôi trong suốt thời gian học tâp và nghiên cứu.

Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Phòng Sau đại học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã góp ý và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và hoàn thành Luận văn

Đồng thời tôi cũng xin cảm ơn các anh chị, các bạn và các em Phòng Hóa sinh và Vi sinh môi trường đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện Luận văn.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè, những người đã tạo mọi điều kiện về vật chất và tinh thần giúp đỡ tôi hoàn thành tốt Luâṇ văn này.

Xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, tháng 12 năm 2011

Học viên

Nguyễn Thị Quỳnh Trang

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 9

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIÊU 11

1.1 Tình hình nuôi trồng thủy sản trên thế giới : 111

1.3 Những khó khăn thách thức nghề 12

1.4 Ảnh hưởng của một số điều kiện môi trường lên quá trình nuôi trồng thủy sản :14 1.4.1 Nhiê ̣t đô ̣ 15

1.4.2 Độ pH 15

1.4.3 Độ mặn 16

1.4.4 Oxy hòa tan (DO) 16

1.4.5 COD, BOD 17

1.4.6 Mâ ̣t đô ̣ vi tảo Vibrio spp và vi khuẩn tổng số 17

1.4.7 Nitơ tổng số 18

1.4.8 Photphat (PO43- ) 20

1.4.9 Sulphuahydro 20

1.5 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng biện pháp sinh học trong xử lý môi trường nước nuôi trồng thủy sản 21

1.5.1 Vai trò của các vi sinh vật trong quá trình làm s ạch nướ c nuôi tôm, cá 21

1.5.2 Biện pháp sử dụng các chế phẩm sinh học (probiotic) và vai trò của nó trong việc c ải tạo nước đầm nuôi trồng thủy sản 24

1.5.3 Ưu điểm và nhươ ̣c điểm của biê ̣n phấp sử du ̣ng vi sinh vâ ̣t trong xử lý nước nuôi trồng thủy sản ……… ……… ……… ……… …… ……….…… …… 31

Chương 2 – ĐỐI TƯ ỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 322

2.1 Đối tượng 32

2.1.1 Chủng giống 32

2.1.2 Hóa chất – thiết bi 32

2.1.3 Môi trường 32

2.2 Phương pháp nghiên c ứu 35

2.2.1 Phương pháp phân l ập vi khuẩn 35

2.2.2 Phương pháp bảo quản giống 35

2.2.3 Phương pháp xác đị nh ho ạt tính enzym và hoạt tính kháng khuẩn 35

2.2.4 Xác định sinh khối bằng phương pháp đo m ật độ quang học 36

2.2.5 Phương pháp định lượng axit lactic 36

2.2.6 Phương pháp nghiên c ứu khả năng chuyển hóa các hợ p chất chứa nitơ của tế bào 36

2.2.7 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng của vi sinh vật 38

2.2.8 Phương pháp xác đị nh một số đặc điểm sinh học của chủng lựa chọ n 39

2.3 Phương pháp ta ̣o chế phẩm 43

2.3.1 Nghiên cứu các điều kiê ̣n thić h hơ ̣p cho lên men xốp 43

2.3.2 Trô ̣n hỗn hơ ̣p giống 41

2.3.3 Bảo quản chế phẩm : 41

2.3.4 Thử nghiê ̣m chế phẩm trong xử lý nước nuôi trồng thủy sản 41

2.4 Phân lo ại vi sinh vật 42

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUÂN 45

3.1 Tuyển cho ̣n các chủng vi sinh vâ ̣t 45

3.1.1 Bacillus 45

3.1.1.1 Phân lâ ̣p và tuyển cho ̣n 45

3.1.1.2 Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thích hợ p lên khả năng sinh trưở ng và hoạt tính enzym của chủng vi Bacillus TL1 46

3.1.1.3 Một số đặc điểm sinh học của chủng nghiên cứu 51

3.1.2 Vi khuẩn Lactic 53

3.1.2.1 Phân l ập và tuyển chọn 53

3.1.2.2 Phân lo ại 53

3.1.2.3 Ảnh hưởng của một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và tổng hợ p chất kháng khuẩn của L plantarum L5 56

3.1.3 Vi khuẩn nitrat hóa 60

3.1.3.1 Phân l ập và tuyển chọn vi khuẩn nitrat hóa 60

3.1.3.2 Đặc điểm hình thái, sinh hóa của 2 chủng vi khuẩn nitrat hóa lựa chọn 62

3.2 Tạo chế phẩm 63

3.2.1 Thử tiń h đối kháng lâñ nhau của các chủng vi khuẩn 63

3.2.2 Nghiên cứu các điều kiê ̣n lên men xốp thích hơ ̣p 64

3.2.2.1 Lưạ cho ̣n môi trường lên men xốp thić h hơ ̣p 64

3.2.2.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ cám : trấu lên quá triǹ h lên men xốp 66

3.2.2.3 Ảnh hưởng của thời gian lên quá trình lên men xốp 67

3.2.2.4 Ảnh hưởng của các nhiệt độ khác nhau 68

3.2.2.5 Ảnh hưởng của độ ẩm 69

3.2.3 Sản xuất chế phẩm 70

3.2.4 Đánh giá khả năng làm sa ̣ch nước đầm nuôi thủy sản của chế phẩm vừa ta ̣o đươ ̣c 72

3.2.4.1 Giá trị pH 72

3.2.4.2 Ni tơ tổng số 73

3.2.4.3 Amôni 74

3.2.4.4 Nitrit 75

3.2.4.5 COD và BOD 76

KẾT LUẬN 79

KIẾN NGHI ̣ 79

TÀI LIỆU THAM KHẢO 80

PHỤ LỤC 87

̣ ̣ DANH MUC KÝ HIÊU VÀ CHƢƢ VIẾT TẮT

BOD Biochemical Oxygen Demand Nhu cầu oxy sinh hóa CMC Cacboxymetyl Cenlluloze Cacboxymetyl xenlulozo COD Chemical Oxygen Demand Nhu cầu oxy hóa hóa ho ̣c

DO Dessolved Oxygen Oxy hòa tan

OD Optical Density Mâ ̣t đô ̣ quang ho ̣c

QCVN Quy chuẩn Viêṭ Nam

WHO World Heath Organi zation Tổ chƣƣc Y tế thế gi ới

̣ DANH MUC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của tôm , cá 15

Bảng 1.2 Tiêu chuẩn chất lươ ̣ng nước nuôi trồng thủy sản 21

Bảng 3.1: Ho ạt tính enzym của 5 chủng lựa chọn 45

Bảng 3.2: Ho ạt tính phân giải cơ chất của chủng TL1 trên 4 loại môi trường 46

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của pH lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym của chủng TL1 47

Bảng 3.4: Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp 48

Bảng 3.5: Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym của chủng TL1 49

Bảng 3.6: Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sinh trưởng và hoạt tính enzym của chủng TL1 50

Bảng 3.7: Đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa của chủng nghiên cứu 51

Bảng 3.8: Ho ạt tính ức chế các vi sinh vật kiểm định của chủng L5 53

Bảng 3.9: Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của chủng L5 53

Bảng 3.10: Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng và khả năng tổng hợp chất kháng khuẩn của L plantarum L5 57

Bảng 3.11: Ảnh hưởng của thời gian nuôi c ấy đến sự sinh trưởng và khả năng tổng hợp chất kháng khuẩn của L plantarum L5 58

Bảng 3.12: Ảnh hưởng của nồng độ muối tới khả năng sinh trưởng và tổng hợp chất kháng khuẩn của L plantarum L5 59

Bảng 3.13: Đặc điểm hình thái của các chủng oxy hóa amôni phân l ập được 60

Bảng 3.14: Đặc điểm hình thái của 10 chủng oxy hóa nitrit phân lập được 61

Bảng 3.15: Hàm l ượng nitrit tạo thành và sự sinh trưởng của 13 chủng oxy hóa amôni phân lập được 61

Bảng 3.16: Hàm l ượng nitrat t ạo thành và sự sinh trưởng của 10 chủng oxy hóa nitrit 62

Bảng 3.17: Một số đặc điểm hình thái, sinh hóa của chủng NA7 và NT2 62

Bảng 3.18: Thử tiń h đối kháng lâñ nhau của các chủng vi khuẩn 64

Bảng 3.19: Ảnh hưởng của môi trường lên men xốp lên Bacillus 65

Bảng 3.20 : Ảnh hưởng của môi trường lên me n xốp lên L plantarum L5: 65

Bảng 3.21: Ảnh hưởng của tỉ lệ cám : trấu lên Bacillus TL1 66

Bảng 3.22: Ảnh hưởng của tỉ lệ cám : trấu lên L plantarum L5 67

Bảng 3.23: Ảnh hưởng của thời gian lên men xốp lên Bacillus TL1 67

Bảng 3.24: Ảnh hưởng của thời gian lên men xốp lên L plantarum L5 67

Bảng 3.25: Ảnh hưở ng của nhiê ̣t đô ̣ lên Bacillus TL1 68

Bảng 3.26: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên L plantarum L5 69

Bảng 3.27: ảnh hưởng của độ ẩm lên Bacillus TL1 69

Bảng 3.28: Ảnh hưởng của độ ẩm lên L plantarum L5 70

Bảng 3.29: Kết quả giá tri pH sau các ngày thí nghiệm 72

Bảng 3.30: Kết quả giá tri ̣ Nitơ tổng số sau các ngày thí nghiệm 73

Bảng 3.31: Kết quả giá tri NH 3 sau các ngày thí nghiệm 74

Bảng 3.32: Kết quả giá tri nitrit sau các ngày thí nghiệm 75

Bảng 3.33: Kết quả giá tri COD và BOD sau các ngày thí nghiệm 76

Bảng 3.34: Kết quả xử lý nước đầm nu ôi thủy sản của chế phẩm 77

̣ DANH MUC CÁC HÌNH

Hình 3.1: Ho ạt tính phân giải cơ chất của chủng TL1 trên 5 loại môi trường 46

Hình 3.2: Ảnh hưởng của pH lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym của chủng TL1 48

Hình 3.3: Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym ngoại bào của chủng TL1 49

Hình 3.4: Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym của chủng TL1 50

Hình 3.5: Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym của chủng TL1 50

Hình 3.6: Trình tự nucleotit của rARN 16S của chủng L 5 50

Hình 3.7: Vị trí phân lo ại của chủng L5 và các loài có quan hệ họ hàng gần… 56

Hình 3.8: Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp chất kháng khuẩn của L plantarum L5 57

Hình 3.9: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự sinh trưởng và sinh chất kháng khuẩn của L plantarum L5 58

Hình 3.10: Ảnh hưởng của nồng độ muối tới khả năng sinh trưởng và tổng hợp chất kháng khuẩn của L plantarum L5 59

Hình 3.11: Sơ đồ quy triǹ h sản xuất chế phẩm da ̣ng rắn 71

Hình 3.12: Giá trị pH sau các ngày thí nghiệm 73

Hình 3.13: Giá trị nitơ tổng sau các ngày thí nghiệm 73

Hình 3.14: Giá trị amôni sau các ngày thí nghiệm 75

Hình 3.15 Giá trị nitrit sau các ngày thí nghiệm 76

Hình 3.16 Giá trị COD sau các ngày thí nghiệm 77

Hình 3.17: Giá trị BOD sau các ngày thí nghiệm 77

Những năm gần đây , cơ cấu chuyển dich kinh tế cùng với các chính sách củakhuyến khích của chính p hủ, phong trào nuôi trồng thủy sản ven biển ở nước tangày càng phát triển mạnh

Tuy nhiên, trong những năm gần đây ngành nuôi trồng đang phải đối mặt vớinhững khó khăn có thể dẫn đến nguy cơ thất bại ở nhiều cơ sở nuôi trồng Nguyênnhân chính là do ô nhiễm môi trường nước đầm nuôi , dịch bệ nh và hệ thống sinhthái bị phá hủy Các đầm nuôi trồng thủy sản , đă ̣c biê ̣t là các đầm quảng canh khôngcó hệ thống cấp , thoát nước và xử lí nước thải nên trong quá trình n uôi, phân sinh

vâ ̣t , thức ăn thừa , xác động vật thủy sinh , xác rong , tảo, các loại hóa chất sử dụngtrong quá triǹ h nuôi , các loại vi khuẩn gây bệnh… làm cho nước trong đầm bị ônhiêm Các chất hữu cơ tích tụ lại ở đáy đầm bị phân hủy kị khí sinh ra các sảnphẩm như : NH3, H2S, NO3 … làm cho tôm cá bi sốc hoă ̣c gây ha ̣i cho tôm cá và cácsinh vâ ̣t khác sống trong đầm Khi đầm nuôi bị ô nhiễm thì những nhóm vi sinh vậtcó hại có cơ hội phát triển mạnh mẽ, không kiểm soát được và hậu quả là vật nuôi

bị bệnh Trước đây, người nuôi thườ ng sử dụng hóa chất, kháng sinh để xử lý môitrường ao nuôi và phòng bệnh Nhưng dùng nhiều hóa chất và kháng sinh gây ảnhhưở ng lớn đến môi trường và con ngư ời Ngoài ra, việc lạm dụng thuốc kháng sinhcòn gây ra vấn đề về dư lượ ng kháng sinh trong vật nuôi và vi phạm vấn đề vệ sinh

an toàn thực phẩm Do đó, cần chọn một giải pháp thích hợp để giải quyết vấn đềnày Tr ước thực trạng đó, xử lý môi trường trong quá trình nuôi nhằm cải thiện môitrường nước, phòng bệnh cho tôm cá và an toàn với người sử dụng là vấn đề cấpthiết Tại một số nước có ngành nuôi trồng thủy sản phát triển với quy mô côngnghiệp như Mĩ, Nhật, Trung Quốc, Thái Lan,…các biện pháp sinh học được sử

dụng thay thế cho cách dùng hóa chất đã khẳng định được tính an toàn và hiệ u quảtrong nuôi trồng

Các loài vi sinh vật được dùng ngày càng nhiều trong xử lý môi trường nướcnuôi trồng thủy sản đã đem lại nhiề u lợi ích cho con người và môi trườ ng sống màcác phương pháp khác không có được như: an toàn với người và động vật, đặc hiệuđối với vật chủ, thích hợ p với các phương pháp phòng trừ khác, thời gian bán hủy

̣ ̃

ngắn nên không tồn đọng lâu để gây ô nhiễm môi trường sống, có khả năng tự nhânlên và ức chế các vi sinh vật gây bệnh cho tôm cá

Với mong muốn tìm ra những chủng vi sinh vật có khả năng làm s ạch môi

trường nước nuôi tôm, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Tuyển chọn các chủng vi sinh vật tạo chế phẩ m nhằm xử lý nước thải nuôi trồng thủy sản”.

Mục đić h của đề tài : tạo ra được chế phẩm có chứa một số chủng vi sinh vâ ̣thữu ích nhằm xử lý nước nuôi tôm và bước đầu đưa ra những kết quả thử nghiê ̣mxử lý nước nuôi trồng thủy sản bi ô nhiêm ở quy mô phòng thí nghiê ̣m

trên biển rô ̣ng hơn 1 triê ̣u km Viê ̣t Nam cũng có vùng mă ̣t nước nô ̣i đi ̣a lớn rô ̣ng

Trong thời gian qua, ngành thuỷ sản ngày càng phát triển và dần trở thànhngành kinh tế mũi nhọn của nhiều quốc gia và là nguồn cung cấp thực phẩm quantrọng cho cộng đồng các dân cư trên toàn thế giới Không những phát triển về sốlượng và giá trị, ngành thuỷ sản còn có những bước thay đổi cơ bản về cơ c ấu sảnxuất Từ một ngành thuỷ sản công nghiệp với khai thác thuỷ sản đóng vai trò chủđạo và những quốc gia có sản lượng lớn nhất là các nước phát triển có những độitàu khai thác xa bờ và một nền công nghiệp chế biến hiện đại trong những năm

trước thập kỷ 90, trong giai đoạn từ hơn mười năm trở lại đây, ngành thuỷ sản đãphát triển theo hướng nông nghiệp, nghĩa là nuôi trồng thuỷ sản (N TTS) đã tăngnhanh t ỷ lệ đóng góp của mình và các nước nông nghiệp chính là những nước cósản lượng đứng đầu thế giới Chỉ tính trong giai đoạn 10 năm từ 1993 -2003, trongkhi sản lượng khai thác hầu như đứng yên, chỉ tăng 1,2%, thì sản lượng NTTS tăngmỗi năm tới 9,4% Năm 2003, tỷ lệ của NTTS trong tổng sản lượng thuỷ sản thếgiới đã tăng lên 31,7% [8]

Theo thống kê của FAO, năm 2003, tổng sản lượng thủy sản của thế giới đạtgần 132 triệu tấn, lĩnh vực khai thác đạt 90 triệu tấn và nuôi đạt gần 42 triệu t ấn.Trong đó, lượng thuỷ sản (TS) dùng làm thực phẩm khoảng 101 triệu tấn, chiếmhơn 76,5 % [8]

Nếu phân theo môi trường nuôi, sản lượng các loài thuỷ sản nước ngọt chiếm

tỷ lệ cao hơn (năm 2003, nuôi nước ngọt đạt 25,2 triệu t ấn, chiếm 60,14% sản lượngvà 48,7% giá trị) Thuỷ sản nuôi nước mặn chiếm 36,5% sản lượng và 35,7% giá trị.Mặc dù sản lượng nuôi nước lợ chỉ chiếm 5,8% (năm 2002), nhưng l ại chiếm tới15,9% giá trị vì phần lớn là những sản phẩm giá trị cao

1.2 Tình hình nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam

Với đường bờ biển dài hơn 3200km; Viê ̣t Nam có vùng đă ̣c quyền kinh tế

2

hơn 1,4 triê ̣u ha nhờ hê ̣thống sông ngòi , đầm phá dày đă ̣c Vị trí địa lý và điều kiện

hàng đầu khu vực cùng với Indon esia và Thái Lan Xuất khẩu thủy sản trở thành

mô ̣t trong những liñ h vưc ̣ quan tro ̣ng của nền kinh tế [6]

Theo số liê ̣u thống kê , 11 tháng đầu năm 2009, kim nga ̣ch xuất khẩu thủysản đạt 3.928 triê ̣u đôla, bằng 93,8% so với cùng k ỳ năm ngoái ; chiếm 7,6% tổngkim nga ̣ch xuất khẩu cả nước [6]

Viê ̣t Nam có hơn 1 triê ̣u km đường bờ biển và 1,4 triê ̣u hecta mă ̣t nước nô ̣iđia vì vâ ̣y nguồn cung thủy hải sản rất dồi dào và ổn đinh Trữ lươ ̣ng hải sản ở Viê ̣ tNam ước tính có khoảng 4,2 triê ̣u tấn và nguồn tái ta ̣i là khoảng 1,73 triê ̣u tấn Mở

rô ̣ng diê ̣n tích nuôi trồng thủy sản và cải thiê ̣n khả năng khai thác đánh cá xa bờ đãgiúp sản lượng thủy hải sản Việt Nam không ngừng tăng trong những năm qua Mức tăng trưởng trung biǹ h từ năm 2006 - 2008 là khoảng 11% Đến hết tháng 11năm 2009, sản lượng thủy sả n đã đa ̣t hơn 4,4 triê ̣u tấn [6]

Trong những năm gần đây , các sản phẩm mặt hàng thủy sản của Việt Namngày càng được đa dạng hóa Các sản phẩm như tôm ,cá tra, cá ngừ , hàng khô , mưc ̣ ,bạch tuộc chiếm tỉ trọng lớn nhất trong kim ngạch xuất khẩu thủy sản Trong đó ,tôm đứng đầu về kim nga ̣ch xuất khẩu , chiếm 38,4 %

1.3 NhƣƢng khó khăn thách thƣƣc nghê

Theo đánh giá của FAO , thủy sản và các sản phẩm là các sản phẩm được

phát triển nhanh nhất trong các mă ̣t hàng thưc ̣ phẩm hiê ̣n nay nói chung Lơ ̣i thế củanuôi trồng thủy sản là có thể thưc ̣ hiê ̣n đươ ̣c kế hoa ̣ch phát triển sản xuất thủy sản ,gia tăng sản lươ ̣ng nhằm đáp ứng nhu cầu của thi trường tiêu thu ̣ , không bi phu ̣thuô ̣c vào mùa vu ̣ khai thác như nguồn lơ ̣i tư ̣ nhiên

Tuy nhiên , ngoài những thuận lợi đó , nuôi trồng thủy sản ở Viê ̣t Nam cũngđã và đang phải đối mă ̣t với nhiều khó khăn như điều kiê ̣n môi trường , khí hậu ,nguồn nước , ô nhiêm nước thải , nguồn giống , thức ăn , dịch bệnh , thời tiết… Ha ̣nchế trong nuôi trồng thủy sản ở Viê ̣t Nam là tiń h rủi ro còn cao do những nguyênnhân chủ quan và khách quan Về mă ̣t chủ quan , còn có nhiều vấn đề kĩ thuật và phi

kĩ thuật mà chúng ta chưa làm chủ được Trong điều kiê ̣n nuôi trồng thủy sản hiê ̣nnay, các đ ầm nuôi thường bị phú dưỡng Nguyên nhân là do chúng ta đưa vào đầmnuôi lươ ̣ng thức ăn tổng hơ ̣p rất lớn mà chỉ có phần rất nho (khoảng 17%) lươ ̣ngthức ăn đươ ̣c tôm sử du ̣ng , còn lại là hòa tan trong nước hoặc bài tiết ra ng oài môi

bị thất bại là do đầm nuôi bị nhiễm bẩn Do chưa có kinh nghiệm trong phòng

chống bê ̣nh cho tôm nên sử du ̣ng thuốc chữa bê ̣nh không hơ ̣p lí đã làm tăng khảnăng hinh thành dich bê ̣nh vùng nuôi Khả năng theo dõi , cảnh báo môi trường đềphòng dịch bệnh còn hạn chế cũng là nguy ên nhân gây tổn thất không nho Bêncạnh đó , sư ̣ ô nhiêm còn do tác đô ̣ng qua la ̣i giữa các ngành sản xuất khác nhau ,chẳng ha ̣n sư ̣ ô nhiêm các vưc nước tư ̣ nhiên từ nguồn phân bón , thuốc trừ sâu , chấtthải công nghiệp cũng là m ảnh hưởng đến cá c vùng nuôi trồng thủy sản [12], [18],[21]

Trong nuôi trồng thủy sản thường phải sử du ̣ng các loa ̣i hóa chất , kháng sinh ,thuốc diê ̣t nấm để tri bê ̣nh Tuy nhiên , chúng phải được dùng với liều lượng thíchhợp và theo quy định hợp lí Nếu không , viê ̣c sử du ̣ng thuốc kháng sinh bừa baĩ sẽgây hiê ̣n tươ ̣ng kháng thuốc và gây cho người sử du ̣ng những rủi ro tiềm ẩn nhưtăng mâñ cảm với dư lươ ̣ng thuốc hoă ̣c xuất hiê ̣n hê ̣vi khuẩn đườ ng ruô ̣t kháng la ̣icác chất kháng khuẩn Rất nhiều nước trên thế giới đã có những thay đổi hoă ̣c thắtchă ̣t các quy đinh của quốc gia về viê ̣c sử du ̣ng thuốc tri bê ̣nh trong nuôi trồng , đă ̣cbiê ̣t là kháng sinh , đây cũng là yêu cầu nghiêm ngă ̣t của nhiều nước trong đó có cảcác nước nhập khẩu [7], [26]

Mô ̣t khó khăn nữa đối với ngành nuôi trồng thủy sản đó là dich bê ̣nh , đă ̣cbiê ̣t là đối với tôm Cùng với việc tăng sản lượng tôm thì bệnh tôm ngà y càng pháttriển nhiều và xuất hiê ̣n nhiều bê ̣nh la ̣ mà chưa có giải pháp điều tri ̣ Gần 30 bê ̣nhvà hội chứng bệnh của tôm nuôi với 2 nguyên nhân nhiêm trùng và không nhiêmtrùng đã được một số tài liệu gần đây nhắc đến nhưng sư ̣ hiểu biết về chúng còn rất

ít Mô ̣t số tác nhân gây bê ̣nh quan tro ̣ng nhất cho tôm cá, cũng như các thủy hải sảnkhác là vi sinh vật ( vi khuẩn , vi rút , nấm và nguyên sinh đô ̣ng vâ ̣ t) hay do môitrường, đô ̣c tố [30]

Các vi sinh vâ ̣t gây bê ̣nh gây ra các bê ̣nh nghiêm tro ̣ng cho thủy hải sản Vídụ đối với tôm , chúng gây bệnh đốm trắng , bê ̣nh đầu vàng , bê ̣nh phát sáng… Nếumôi trường tiếp tu ̣c xấu đi hay số lươ ̣ng vi khuẩn gây bê ̣nh tăng ma ̣nh , tôm sẽ chếtnhiều trong mô ̣t thời gian ngắn hoă ̣c bê ̣nh sẽ chuyển thành da ̣ng nhiêm khuẩn mantính và rất khó chữa Những bê ̣nh này chỉ mang tính chất cơ hô ̣i khi nước bi ộ

nhiêm, đă ̣c biê ̣t là nước bi ô nhiêm hữu cơ hoă ̣c tôm cá chi ̣ u tinh tra ̣ng sốc do mô ̣t

trong các điều kiê ̣n gây ra như sư ̣ thay đổi nhiê ̣t đô ̣ , pH, mâ ̣t đô ̣ thả quá dày , sư ̣ thayđổi về đô ̣ mă ̣n của nước

• Vi khuẩn Vibrio gây bê ̣nh cho tôm

Các vi sinh vật gây bệnh luôn tồn t ại trong môi trườ ng sinh sống c ủa tôm(đất, nước, không khí, thức ăn…) và tồn tại ngay trong cơ thể vật chủ Một trong số

các vi khuẩn gây bệnh nguy hại phổ biến cho tôm là Vibrio spp Đây là chủng vi

khuẩn Gram âm, có khả năng chuyển động, có hoạt tính oxidaza, hình que hoặc

hình dấu phẩy, kị khí không bắt buộc, không hình thành bào tử, có thể cư trú trongnước với các độ mặn khác nhau Nhóm vi khuẩn này tồn tại trong môi trường nướcnuôi như một thành phần của quần thể vi sinh vật tự nhiên trong đầm nuôi nhưng

khi gặp điều kiện bất lợi cho tôm, chúng trở thành vi khuẩn có khả năng gây bệ nh,

vì vậy chúng được xếp vào loại vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên tôm) [49] Vibrio spp rất phổ biến trong nước mặn, một số loài có khả năng gây bệ nh cho tôm (V.

cholera, V parahaemolyticus, V alginolyticus, V vulnificus, V urnissii …) Chúng

thườ ng gây ra các bệnh nghiêm trọng cho tôm như bệnh đốm trắng, bệnh đầu vàng,bệnh phát sáng… Khi bị nhiễm vi khuẩn này, lúc đầu, một số nơi trên cơ thể tôm sẽ

bị tiêu hủy như phần đuôi ho ặc phần lưng rồi dần dần làm bế t ắc hệ thống lưu thôngcủa máu [38] Tôm thay đổi tập tính như bơi ven bờ hay gần mặt nước, lờ đờ, bo ăn,đổi màu đo hoặc xanh Nếu môi trường tiếp tục xấu đi hay số lượng vi khuẩn gây

bệnh tăng mạnh, tôm sẽ chết nhiều trong một thời gian ngắn ho ặc bệnh sẽ chuyể nthành dạng nhiễm khuẩn mãn tính Những bệnh này chỉ mang tính chất cơ hội khi

nước bị ô nhiễm, đ ặc biệt là nước bị ô nhiễm hữu cơ ho ặc tôm cá chị u tình trạng sốc

do một trong các điều kiện gây ra như sự thay đổi nhiệt độ, pH, mật độ thả quá dày,

sự thay đổi về độ mặn của nước

Vi khuẩn Vibrio spp trong các đầm nuôi tôm rất phong phú và có xu hướ ng

tăng dần theo thời gian nuôi, số lượng đạt cực đại vào cuối vụ Kết quả nghiên cứucủa Nguyễn Trọ ng Nho và ctv (1996) [21] đầm tôm ở các tỉnh Nam Trung Bộ bị

bệnh có số lượng vi khuẩn Vibrio tổng số từ 110-1500 tế bào/ml Theo Phan Lương

Tâm và ctv (1998) [29], Nguyễn Việt Thắng (1998) [33] khảo sát các nguyên nhângây chết tôm ở các tỉnh phía Nam cho rằng trong các đầm nuôi tôm bị chết, số

lượng vi khuẩn Vibrio spp tổng số cũng rất cao Sự xuất hiện, phân bố của các

chủng Vibrio là theo mùa và phụ thuộc vào chế độ dinh dưỡ ng c ủa nước Hiện

tượng bùng nổ Vibrio xảy ra trong các trường hợp nước bị phú dưỡ ng Việc định

̃ ̣

̃ ̣

lượng vi khuẩn Vibrio spp r ất quan trọng để chủ động kiểm tra chất lượng nước,

xác đị nh khả năng bệnh lí có thể xảy ra trong đ ầm nuôi tôm

1.4 Ảnh hưởng của một số điêu kiện môi trường lên quá trình nuôi trồng thủy sản

Dạng thức ăn sử dụng nuôi tôm ảnh hưởng rấ t lớn đến môi trường đầm nuôi Trong thời gian đầu , đa số các loài nuôi đều cho năng suất cao nhưng chỉ sau mô ̣tthời gian sử du ̣ng thức ăn , đă ̣c biê ̣t là thức ăn tu ơi thì chất lươ ̣ng nước suy giảm mô ̣tcách nhanh chóng Khi hàm lươ ̣ ng các chất hữu cơ và các chất chứa ni tơ tăng lênthì hàm lượng oxy hòa tan giảm Sư ̣ nh iêm bẩn môi trường nước nuô i trồng thủysản được bắt đầu bằng sự tích tụ các sản phẩm thức ăn dư thừa và các chất thải củatôm cá Khi đó , quá trình sinh trưởng và phát triển của các loài thủy sản bị đình trệ ,

mô ̣t trong số trường hơ ̣p có thể dân đến hiê ̣n tươ ̣ng tôm cá bi chết hàng loa ̣t , gâythiê ̣t ha ̣i lớn cho sản xuất

1.4.1 Nhiê ̣t đô ̣

Nhiê ̣t đô ̣ là điều kiê ̣n xác đinh đă ̣c điểm các quá trình sinh ho ̣c , lí học , hóahọc… diễn ra trong nước Tôm cá là các đô ̣ng vâ ̣t biến nhiê ̣t Nhiê ̣t đô ̣ là yếu tố sinhthái quan trọng ảnh hưởng tới nhiều phương diện trong đời sống của tô m cá như : hôhấp, tiêu thu ̣ thức ăn , đồng hóa thức ăn , tăng cường miên dich đối với bê ̣nh tâ ̣t , sư ̣tăng trưởng… nhiê ̣t đô ̣ thay đổi theo mùa nên ở miền Nam Viê ̣t Nam có thể nuôitôm cá quanh năm trong khi ở miền Bắc chỉ khai thác đ ược chủ yếu vào mùa cónhiê ̣t đô ̣ ấm áp Ở Việt Nam , nhiê ̣t đô ̣ thić h hơ ̣p cho tôm cá là 28-36oC [27]

Bảng 1.1 Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của tôm , cá

(Lương Đưưc Phẩm , 2002) [24]

Đặc điểm môi trường pH Gi ới ha ̣n thi ưch nghi của tôm, cá

axit ma ̣nh 4 điểm chết đối với tôm, cá

axit yếu 5-6 tôm cá không sinh sản hoă ̣c khó sinh sản

trung ti ƣnh 7-8 môi trường thić h hơ ̣p cho tôm cá

kiêm yếu 9 giới ha ̣n cuối cùng cho tôm cá

kiêm 10 tôm cá không lớn

kiêm manh > 10 điểm chết đối với tôm cá

1.4.3 Độ mặn

Độ mặn được tính dựa trên tổng nồng độ các ion hòa tan trong nước , có quan

hê ̣mâ ̣t thiết với đời sống của thủy sinh vâ ̣t Nhu cầu về đô ̣ mă ̣n thay đổi tùy theotừng loa ̣i tôm cá và thời điểm trong chu trình sống của mỗi loại Đối với tôm sú , đô ̣

mă ̣n thić h hơ ̣p là 15-35‰ NaCl, đô ̣ mă ̣n tối ưu là 29 -30‰ NaCl Tôm sú sinhtrưởng châ ̣m và năng suất thấp khi nuôi ở đô ̣ mă ̣n cao hơn 35‰ [21]

1.4.4 Oxy hòa ta n (DO)

Oxy hòa tan trong nước có ý nghiã rất lớn t rong viê ̣c đánh giá tra ̣ng thái củanước và đô ̣ giảm của nó cho thấy sư ̣ thay đổi ma ̣nh mẽ của các quá triǹ h sinh ho ̣c ,quá trình tự làm sạch , sư ̣ nhiêm bẩn của nguồn nước Nồng đô ̣ oxy hòa tan phụthuô ̣c vào mô ̣t loa ̣t các yếu tố tư ̣ nhiên như : áp suất , nhiê ̣t đô ̣ nước , nồng đô ̣ cácmuối hòa tan trong nước Khi nuôi tôm , cá, giữa mâ ̣t đô ̣ tôm , cá với hàm lượng oxyhòa tan có mối quan hệ qua lại với nhau Oxy đươ ̣c tôm, cá sử dụng vào quá trình

hô hấp , đồng thời oxy đươ ̣c tiêu thu ̣ làm phân hủy mô ̣t lươ ̣ng chất thải và thức ăn dưthừa của tôm , cá Do đó , oxy là yếu tố quan trọng trong nước nuôi , hỗ trơ ̣ cho tôm ,cá phát tri ển Nước nuôi đủ tiêu chuẩn để nuôi tôm cá có nồng đô ̣ oxy hòa tan là : 5-8mg/l Trong đầm nuôi , lươ ̣ng oxy hòa tan thấp sẽ làm tôm chậm lớn , có thể chếthàng loạt Mức gây ha ̣i tùy thuô ̣c vào lươ ̣ng oxy hòa tan có trong đầm và giời giantôm, cá phải chịu đựng Chanratchakool P (1995) [44] cho rằng hàm lươ ̣ng oxy hòatan trong nước < 4mg/l làm cho tôm , cá sử dụng thức ăn kém , dễ nhiêm bê ̣nh ChiuLiao P (1992) [45] nhâ ̣n thấy rằng lươ ̣ng oxy hòa tan nho hơ n 3,5 mg/l sẽ gây chếttôm, cá Lươ ̣ng oxy hòa tan còn liên quan đến độ mặn và nhiệt độ nước của đầmnuôi Khi nhiê ̣t đô ̣ , đô ̣ mă ̣n tăng thì khả năng hòa tan oxy trong nước giảm

(Gaudiosa, 1975) [50]

phát triển tế bào m ới +n O2Năng lươ ̣ng ánh sáng

Trong môi trường đầm nuôi tôm cá, hai chỉ tiêu nghiên cứu chất lươ ̣ng nướcCOD và BOD đươ ̣c dùng để đánh giá mức đô ̣ nhiêm bẩn , phú dưỡng hóa đồng thờicòn cho biết sự phát triển c ủa sinh vật trong thủy vực [15] COD phản ảnh lươ ̣ngtiêu hao oxy do quá trình biến đổi các chất hữu cơ (biến đổi hóa học), do đó giá trịCOD phản ánh mức đô ̣ gia tăng chất hữu cơ có trong đầm như thức ăn thừa , sảnphẩm bài tiết của tôm và xác sinh vâ ̣t chết Sư ̣ biến đổi COD trong đầm nuôi tômtăng dần từ đầu vu ̣ tới cuối vu ̣ , thường đầu vu ̣ hàm lươ ̣ng COD thấp từ 0,5 –1,2mg/l, cuối vu ̣ nuôi có thể lên tới 10 - 12 mg/l [23] Trong đầm nuôi , COD thườngbiến đổi từ 1,9 - 6,5 mg/l tuy giá tri ợ ̉ mức trung biǹ h cao nhưng phù hơ ̣p cho tômcá phát triển [23] BOD phản ánh lươ ̣ng các chất hữu cơ dễ bi phân hủy sinh ho ̣c cótrong nước Giá trị BOD càng lớn nghĩa là mức độ ô nhiễm hữu cơ càng cao Tiêuchuẩn nước thủy sản của FAO quy đinh giá tinh BOD < 10 mg/l, giới ha ̣n thich hơ ̣pcủa BOD từ 4 -8 mg/l [23]

Trong đầm nuôi trồng thủy sản , các thông số BOD , COD càng giảm càng tốtvì điều đó chứng to rằng trong đầm không phải tiêu thụ một lượng lớn oxy hòa tan(DO) trong nước để oxy hóa các chất cặn bã ở đáy đầm Khi COD , BOD giảm thì

DO trong nước tăng lên , làm cho nước đầm nuôi trồng thủy sản trong lành và sạch

sẽ hơn Cả hai thông số BOD và COD đều xác định lượng chất hữu cơ có khả năng

bị oxy hóa có trong nước nhưng chúng khác nhau về ý nghĩa BOD chỉ để thể hiê ̣nlươ ̣ng chất hữu cơ dễ bi phân hủy sinh ho ̣c nghia là các chất hữu cơ bi ̣ oxy hóa nhờ

vi sinh vâ ̣t COD thể hiê ̣n toàn bô ̣ các chất hữu co có thể bị oxy hóa bằng các tácnhân hóa ho ̣c Do vâ ̣y , tỉ số BOD / COD luôn nho hơn 1, chỉ số này cao chứng tomôi trường đầm nuôi bi ô nhiêm bởi các chất hữu cơ sinh ho ̣c dễ tan , dễ phân hủy(thức ăn thừa , chất thải của tôm , cá, xác thủy sinh vâ ̣t ch ết ) [37]

1.4.6 Mâṭ đô ̣ vi tảo , Vibrio spp và vi khuẩn tổng sô

Vi khuẩn lam và các loài vi tảo là nhóm sinh vâ ̣t đơn giản nhất có khả năngquang hơ ̣p Chúng sử dụng cacbonic hoặc cacbonat là nguồn cabon và sử dụng cácmuối photpho và nitơ vô cơ để phát triển theo sơ đồ [37]:

CO2 + PO4 +nNH3

Ammon là sản

Các kết quả phân tích các mẫu thực vật nổi vùng nước cửa sông ven biển đãxác định được 72 loài thuộc các ngành Tảo silic , vi khuẩn lam , t ảo lục và tảo mắt Số lươ ̣ng các loài kể trên còn thấp hơn nhiều so với số thực có trong mặt nước tự

nhiên Trong số thành phần loài đã xác đinh đươ ̣c , tảo silic có 62 loài, chiếm ưu thếvề số lươ ̣ng loài (86,1% tổng số loài ) Hầu hết các loài trong ngành tảo silic là

những loài nhiê ̣t đới trong nhóm sinh thái xa bờ , thích nghi với độ muối rộng Ởnhững thủy vưc ̣ có đô ̣ muối cao, tảo silic chiếm ưu thế gần như tuyệt đối Tảo siliclà thức ăn quan trọng cho động vật phù du (zooplankton) và tôm Ở vùng nước nằmsâu trong sông có đô ̣ mă ̣n thấp hoă ̣c ngo ̣t hoàn toàn thì ngành tảo lam chiếm ưu thế[11] Mâ ̣t đô ̣ tảo là cơ sở cho chuỗi thức ăn ở nước Giữa năng suất tôm và mâ ̣t đô ̣tạo có sự liên hệ vô cùng quan trọng Mă ̣t nước có mâ ̣t đô ̣ tảo thấp là mă ̣t nước chếtvề phương diê ̣n sản xuất Tuy nhiên , đầm nuôi có mâ ̣t đô ̣ tả o quá lớn cũng gâynhiều bất lươ ̣ng cho năng suất và môi trường [37], [38] Mâ ̣t đô ̣ tảo cũng là chỉ thị ônhiêm nước do phú dưỡng hóa trong đầm nuôi thủy sản

Vi khuẩn Vibrio spp t rong các đầm nuôi rất phong phú , có xu hướng t ăng

dần theo thời gian nuôi , đa ̣t giá tri c ̣ ưc ̣ đa ̣i vào cuối mùa vu ̣ Kết quả nghiên cứu củaNguyên Tro ̣ng Nho và ctv (1996) [23] ở các tỉnh Nam Trung Bộ , đầm nuôi bi bê ̣nh

có số lươ ̣ng vi khuẩn Vibrio spp tổng số từ 110 – 1500 tế bào/ml Viê ̣c đinh lươ ̣ng

vi khuẩn Vibrio sp r ất quan trọng để chủ động kiểm tra chất lượng nước cũng như

xác định khả năng bệnh lí có thể xảy ra trong đầm nuôi tôm

Lươ ̣ng vi khuẩn tổng số là chỉ tiêu xác đinh điều kiê ̣n v ệ sinh cũng như mức

đô ̣ nhiêm bẩn do các hơ ̣p chất hữu cơ , chất thải của tôm cá, thức ăn thừa , xác thủysinh vâ ̣t chết đồng thời dư ̣ báo tinh hinh dich bê ̣nh trong đầm nuôi và nguồn nướccung cấp cho đầm nuôi Lươ ̣ng vi khuẩn tổng số có chiều hướng tăng dần theo thờigian nuôi , đă ̣c biê ̣t vào thời gian có lươ ̣ng mưa lớn , nguồn nước bi ô nhiêm từ cáccon sông đổ ra Lươ ̣ng vi khuẩn tổng số ở nguồn nước cung cấp cho đầm nuôi tômcao hơn nhiều so với tr ong đầm nuôi Môi trường nước có mâ ̣t đô ̣ vi khuẩn cao hơn

107 tế bào/ ml có dấu hiê ̣u bi ô nhiêm nhe ̣ , dịch bệnh có thể phát sinh [2]

1.4.7 Nitơ tổng sô

Trong nước , ammon thường tồn ta ̣i ở da ̣ng NH 3 và NH 4+

phẩm k hoáng hóa đầu tiên của các chất hữu cơ , có thể được thực vật phù du hấp thụtrong quá triǹ h quang hơ ̣p hoă ̣c bi ̣ oxy hóa tạo thành muối nitrit và nitrat dưới tácdụng của vi sinh vật , quá trình này được gọi là quá trình n itrat hóa Amôni ở dạng

Nitrit (NO2- ) rất cần thiết cho hoa ̣t đô ̣ng của thưc ̣ vâ ̣t phù du NO2- thườngtồn ta ̣i ở da ̣ng trung gian và hàm lươ ̣ng trong nước rất thấp Ngoài ra , NO2- còn làchỉ t iêu vê ̣si nh, yếu tố chỉ thi của quá trinh tư ̣ làm sa ̣ch nước trong tư ̣ nhiên [1].Dạng nitrit thường vô hại nhưng trong môi trường nước mà hàm lượng chlorinity

(chlorinity là khối lươ ̣ng của clo tính bằng gram chứa trong 1 kg nước biển sau khibromua và iod đươ ̣c thay thế bằng cloride Chlorinity đươ ̣c xác đinh bằng phươngpháp chuẩn độ , đây là mô ̣t trong những phương pháp xác đinh nồng đô ̣ muối củanước biển ) thấp thì nitrit sẽ gây đô ̣c cho tôm cá Nitrit gây đô ̣c cho tôm , cá là vìchúng tạo thành chất methemoglobin làm giảm quá trình vận chuyển oxy tới tế bào Nitrit cũng có thể kết hơ ̣p với hơ ̣p chất mang gốc CN - và giải phóng gốc này ra khoiphức chất xianua gây đô ̣c ma ̣nh ch o đầm nuôi

Nitrat (NO3- ) là sản phẩm của sự khoáng hóa các chất hữu cơ chứa nitơ , cầnthiết cho sư ̣ p hát triển của thực vật phù du Tuy nhiên , nếu hàm lươ ̣ng nitrat trongđầm tôm cá vươ ̣t quá 7 mg/l thì môi trường bi phú dưỡ ng và bi nhiêm bẩn [2]

Trong môi trường nước , mối quan hê ̣giữa NH

liên tu ̣c và liên quan chă ̣t chẽ với nhau

hơ ̣p cho đầm nuôi là0,5 mg/l [38].

Trong nước , tảo sử dụng CO 2, nitơ vô cơ , orthophotphat và các chất dinhdưỡng khác để phát tri ển Tuy nhiên , khi nồng đô ̣ amôni a và photphat cao , rong tảophát triển mạnh tạo sinh khối tới mức động vật phù du và tôm cá trong đầm khôngthể tiêu thu ̣ hết sẽ dâñ đến tiǹ h tra ̣ng bùng nổ các loa ̣i rong , tảo Tình trạng này kéodài sẽ làm cho đầm , hồ bi phú dưỡng hóa , nước đu ̣c và có că ̣n lắng , có mùi khó chịu

do tảo bi phân hủy , gây giảm oxy trong nước Trong điều kiê ̣n đó thì tôm , cá sẽ sinhtrưởng châ ̣m và dễ mắc bê ̣nh [37]

1.4.9 Sulphuahydro

Sulphuahydro trong thủy vưc ̣ đươ ̣c hiǹ h thành do hoa ̣t đô ̣ng phân hủy chấthữu cơ của vi khuẩn trong điều kiê ̣n yếm khí và vi khuẩn lưu huỳnh kh ử sulphattrong nước nơi có nhiều sulphat [31] Trong môi trường nước các đầm nuôi trồngthủy sản , sulphuahydro thường tồn ta ̣i ở mô ̣t số da ̣ng như : H2 S, HS-, S2- Tuy nhiên ,trong các da ̣ng trên chỉ có da ̣ng H 2S là gây đô ̣c cho các thủ y sinh vâ ̣t , mức đô ̣ gây

đô ̣c có liên quan đến nhiê ̣t đô ̣ và pH của đầm nuôi pH và nhiê ̣t đô ̣ thấp ( nhiê ̣t đô ̣

200C và pH = 5) tồn ta ̣i tới 99% là H 2S gây đô ̣c [48] Các giai đoạn biến đổi tạo ra

Vì vậy , môi trường axit cung cấp nhiều ion H + phản ứng phân hủy chất hữu

cơ trong nước luôn t ạo ra H 2S gây đô ̣c cho tôm cá và các thủy sinh vâ ̣t khác Theo

chỉ tiêu gi ới ha ̣n

Bảng 1.2 Tiêu chuẩn chất l ươ ̣ng nước nuôi trồng thủy sản

(Khoa thủy sản , trường đa ̣i ho ̣c Cần Thơ , 2000) [16]

1.5 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng biện pháp sinh học trong xử lý môi trường nước nuôi trồng thủy sản

1.5.1 Vai trò c ủa các vi sinh vật trong quá trình làm sạch nước nuôi tôm , cá

Đầm nuôi tôm, cá là những hệ sinh thái nước không đặc trưng do chịu nhiềutác động của con người Tuy vậy, cũng giống như khu hệ sinh thái nước tự nhiênkhác, hệ sinh thái đầm nuôi tôm, cá được cấu thành bởi nước, khoáng chất, các hợ pchất hữu cơ hòa tan và hệ thủy sinh vật Vi sinh vật là một thành phần quan trọngcủa hệ thủy vi sinh vật ở đây bởi chúng không những đóng vai trò chủ đ ạo trong cácchu trình chuyển hóa các nguyên tố cơ bản cấu tạo nên hợ p chất hữu cơ mà tácđộng trực tiếp hoặc gián tiếp lên nguồn lợi thủy sản của người nuôi trồng [13], [35]

Vi sinh vật hữu ích trong nước nuôi tôm bao gồm các nhóm có khả năng phân giải

và tái vô cơ hóa các hợ p chất hữu cơ, chuyển hóa các hợ p chất vô cơ, đồng thời bảnthân chúng cũng không gây h ại với tôm (không sinh ra s ản phẩm độc hại, khônggây bệnh) Hoạt động sống c ủa chúng sẽ giúp ích cho việc cải thiện chất lượng môitrường nước, ổn định pH, tạo điều kiện môi trường không thuận lợi đối với các visinh vật gây hại, cạnh tranh và ức chế sự phát triển của nhóm vi sinh vật gây bệnh ởtôm cá, qua đó giúp tôm, cá tăng trưở ng nhanh, khoe mạnh và môi trường sinh tháitrong đầm được cân bằng [28].

Trong môi trường nước nuôi tôm, cá luôn tồn tại các hợ p chất hữu cơ từnhiề u nguồn khác nhau như: lư ợng thức ăn dư thừa, phân tôm cá, chất tiết ra từ mọiquá trình trao đổi chất c ủa thủy sinh vật, xác động vật, thực vật phù du… [4 ] Do đó,nếu nồng độ c ủa chúng trong nước quá cao sẽ gây ô nhiễm nguồn nước và dẫn tớicác hội chứng sốc ở tôm, cá Hoạt động tích cực của các vi sinh vật phân giải cáchợ p chất hữu cơ sẽ giúp gi ải phóng những tồn t ại hữu cơ gây ô nhiễm nguồn nước,đồng thời bổ sung trực tiếp hoặc gián tiếp vào nguồn dinh dưỡng cần thiết cho độngvật nuôi trồng [43] Cơ chế các hoạt động phân gi ải chất hữu cơ ở vi sinh vật hữuích chính là cơ chế của các quá trình trao đổi chất và trao đổi năng lượng trong cơthể chúng Nấm, động vật nguyên sinh và đa số vi khuẩn là vi sinh vật dị dưỡ ng nênchúng cần chất hữu cơ từ bên ngoài môi trường để làm thức ăn Chúng sử dụngnhững chất này để thu nhận các tiền chất cho việc xây dựng nên tế bào của mình vàthu nhận năng lượ ng cho các quá trình sống Khi đó vật chất hữu cơ được vi sinhvật biến đổi thành các chất nghèo năng lượ ng và cuối cùng trong những điều kiệnphù hợ p thì chuyển hóa ngược l ại thành những chất vô cơ ban đ ầu Trong môitrường nước nuôi tôm, cá các loại chất hữu cơ thườ ng chiếm tỷ lệ lớn là: protein,cacbonhidrat, kitin,… Sự phân hủy protein trước hết là nhờ nhiều loại vi khuẩn như

Pseudomonas, Clostridium, Bacillus và họ vi khuẩn Enterobacteriaceae [34] Đại

diện cho nhóm vi sinh vật hữu ích chuyển hóa các hợ p chất cacbonhidrat bao gồm

các chi Bacillus, Lactobacillus, Streptococus, Cellulomonas, Aerobacter … Các

nghiên cứu cụ thể hơn còn cho thấy bên c ạnh khả năng phân giải chất hữu cơ, nhóm

vi khuẩn này còn có khả năng c ạnh tranh sinh học, ức chế sự phát triển c ủa các vi

khuẩn gây bệnh ở tôm là Vibrio và Aeromonas [35], [39], [61].

Môi trường nước nuôi tôm, cá vốn là một môi trường giàu dinh dưỡ ng, thức

ăn giàu đạm luôn được con người cung cấp dư thừa, ngoài ra còn từ phân tôm, cá vàxác động vật thủy sinh Mặt khác, một số hợ p chất nitơ vô cơ như NH3 là một khí

độc với tôm và NO3- là tác nhân gây ung thư đối với nhiều động vật Do đó, vai tròphân gi ải hợp chất nitơ hữu cơ của nhóm vi khuẩn amôn hóa, nhóm vi khuẩn nitrathóa và nhóm vi khuẩn phản nitrat hóa đặc biệt được quan tâm Tuy nhiên, chỉ mộtsố ít vi sinh vật (vi khuẩn sống t ự do trong đất và nước, vi khuẩn số ng cộng sinh vớithực vật, vi khuẩn quang hợp,…) có khả năng cố định nitơ phân tử thành dạng nitơhợ p chất mà các vi sinh vật khác có thể sử dụng được Dạng amôniac (NH3) vànitrat (NO3-) được t ảo và nhiều vi sinh vật hấp thụ tạo nên nguồn nitơ hữu cơ, sauđó có thể chúng lại trở thành nguồ n thức ăn cho động vật thủy sinh.

- Nhóm vi khuẩn amôn hóa: Nhóm này phân gi ải protein và các hợ p chất

hữu cơ chứa nitơ tạo thành amôniac, ho ạt động của nhóm vi khuẩn amôn hóa giúploại bo các hợ p chất hữu cơ gây ô nhiếm nguồn nước nuôi tôm, cá góp phần t ạo nênmột môi trường trong s ạch cho tôm cá phát triển

- Nhóm vi khuẩn nitrat hóa: vi khuẩn amôn hóa là vi khuẩn hữu ích, song

sản phẩm mà chúng sinh ra là NH3, nếu trong nước nồng độ NH4+ quá cao vượtmức cho phép sẽ gây hại cho động vật nuôi trồng [1] Nhóm vi khuẩn nitrat hóa đó

là các chi Nitrosomonas, Nitrococus, Nitrobacter, Nitrospira,… được xếp vào

nhóm vi khuẩn hữu ích trong môi trường nước nuôi tôm cá vì chúng có khả năngchuyển hóa NH4+ thành NO3- (dạng không độc với môi trường và các sinh vật kháctrong đầm) Mặt khác, NO3- do hoạt động c ủa chúng sinh ra lại có thể được đồnghóa trong tổng hợp protein c ủa nhiều sinh vật và tảo Như vậy, nhóm vi khuẩn nitrathóa không chỉ làm gi ảm độ độc của nước mà còn góp phần làm mới nguồn nước,mang lại các chất dễ hấp thụ cho động vật thủy sinh [51], [55]

Pseudomonas, Bacillus, Paracoccus … là các vi khuẩn có khả năng khử NO

3-thành N2 khí quyể n, giúp khép kín vòng tuần hoàn nitơ trong thủy vực, đồng thờihạn chế một tác nhân gây hại cho động vật nuôi trồng Trong nước nuôi tôm cácũng như t ại các nhà máy xử lý nước thải, số lượng và hoạt động sinh lý c ủa nhóm

vi khuẩn nitrat hóa và vi khuẩn phản nitrat hóa được xem như các thông số giới hạntốc độ quá trình chuyể n hóa sinh học của nitơ trong nước [26]

Vi sinh vật dị dưỡng sinh trưởng và thu nhận năng lượ ng bằng nhiều phảnứng xúc tác enzym Các enzym có tính đặc hiệu cơ chất c ũng như có hiệu quả xúctác chuyển hóa cao Một số enzym cũng tham gia vào chuỗi các phản ứng sinh hóađể hiệp đồng chuyển hóa một số cơ chất khó phân hủy Có 2 loại enzym là enzymnội bào vào enzym ngo ại bào Enzym ngoại bào phân hủy các cơ chất cao phân tử

̃ ̣

thành các phân tử nho hơn để có thể di chuyển vào tế bào qua màng sinh chất

Enzym nội bào xúc tác các phản ứng oxy hóa cơ chất thu năng lượ ng và sinh tổng

hợ p trong tế bào Trong quá trình phân hủy cơ chất hữu cơ, vai trò hàng đầu thuộcvề các vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợ p các enzym thủy phân ngoại bào

1.5.2 Biện pháp sử dụng các chế phẩm sinh học (probiotic) và vai trò của nó

trong việc cải tạo nước đầm nuôi t rồng thủy sản

 Định nghĩa vê Probiotic

Theo định nghĩa của tổ chức y tế thế giới WHO, probiotic là “những vi sinh vật còn sống khi đưa vào cơ th ể một lượng đầy đủ sẽ có lợi cho sức khỏe của cơ

thể” [48] Probiotic có nguồn gốc từ tiếng Hy La ̣p , ghép từ chữ pro l à vì và biotic là

sư ̣ sống , nên tiếng Viê ̣t thường go ̣i là trơ ̣ sinh Thuâ ̣t ngữ probiotic đươ ̣c dùng để

mô tả những chất sinh ra từ vi sinh vâ ̣t có tác du ̣ng tăng trưởng vi sinh vâ ̣t hoă ̣c sinh

vâ ̣t khác Năm 1959, Rl Fuller đinh nghi ̃ a rõ hơn Probiotics hay vi sinh vâ ̣t

probiotic là những vi sinh vâ ̣t sống , bổ sung vào thức ăn có tác du ̣ng cân bằng hê ̣vikhuẩn đường ruô ̣t và có tác du ̣ng hữu ích cho đô ̣ng vâ ̣t chủ [54] Gần đây , đinhnghĩa này được mở rộng hơ n Probiotic là chế phẩm bao gồm vi sinh vâ ̣t sống có tácdụng hữu ích cho động vật và người sử dụng Tác dụng hữu ích bao gồm tác dụnglàm cân bằng hệ vi sinh đường ruột hay sinh chất đối kháng làm giảm số lượng cá

thể hay tăng lươ ̣ng kháng thể kich thich hê ̣thống miên dich hoă ̣c là cung cấp enzymtrong quá triǹ h trao đổi chất của vi khuẩn Probiotic là giảm các vi sinh vâ ̣t có ha ̣i(các vi sinh vật cạnh tranh th ức ăn và tiết các chất đô ̣c ản h hưởng xấu tới hoa ̣t đô ̣ngsống của vâ ̣t chủ ), làm tăng các vi sinh v ật có lợi (đó là các sinh vâ ̣t ca ̣nh tranh th ức

ăn và vi trí bám vào các mô với vi sinh vâ ̣t có ha ̣i , chún g tiết ra các chất diê ̣t khuẩnvà vitamin K cho cơ thể )

Ngày nay, khái niệm probiotic còn được mở rộng sang lĩnh vực môi trườ ng.Đưa probiotic vào môi trường nước để tạo sự cân bằng giữa các vi sinh vật trong

môi trường Ở nước ta, việc sử dụng các chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy

sản và sản xuất giống chỉ mới ứng dụng nhiều từ năm 2000 trở lại đây, qua thực tế

sử dụng đã cho thấy kết quả tốt Hiện nay ở Việt Nam, hầu hết các cơ sở nuôi tôm

cá đều sử dụng chế phẩm vi sinh vật probiotic Với mục tiêu tăng nhanh sản lượ ng,người ta thả tôm, cá với mật độ quá dày trong khi không có biệ n pháp xử lý môi

trường thích hợ p, dẫn đến hiện tượ ng thối đầm, làm giảm oxy hòa tan khiến tôm, cángạt thở Hàm lượ ng các NH3, NH4+, NO2-, NO3-, H2S… tăng cao sẽ khi ến tôm cá

giảm sự chống đỡ với môi trường bất lợi và tác nhân gây bệ nh, nếu vượt quá

ngưỡ ng sẽ chết

 Probiotic trong nuôi trồng thuỷ s ản

Probiotic là chế phẩm của công nghê ̣sinh ho ̣c ứng du ̣ng vi sinh vâ ̣t trong

các vấn đề thực tiễn Trong nuôi trồng thủy sản , probiotic hiê ̣n đang đươ ̣ c coi là mô ̣tliê ̣u pháp an toàn và hiê ̣u quả nhằm thay thế cho các loa ̣i thuốc kháng sinh và hóa

chất đã đươ ̣c sử du ̣ng trước đây [26]

Probiotic có thành phần là mô ̣t chủng đơn hoă ̣c mô ̣t h ỗn hơ ̣p các chủng visinh vâ ̣t hữu ích Nhóm vi sinh vật hữu ích ấy tham gia tích cực vào các quá trình

phân hủy sinh ho ̣c bùn và chất thải hữu cơ , chúng có khả năng cạnh tranh ức chế

các vi sinh vật gây bệnh cho động vật hủy sinh , chúng rất an toàn với môi trườ ng vàcũng không gây độc hại đối với người và vật nuôi Đối với các hình thức nuôi trồngkhác nhau , viê ̣c sử du ̣ng chế phẩm sinh ho ̣c đươ ̣c nhiǹ nhâ ̣n như biê ̣n phấp tić h cưc ̣nhất bởi vì chế phẩm sinh ho ̣c có tác du ̣ng giảm đô ̣c tố trong đầm , chủ yếu là NH 3

và H 2S, giảm mùi hôi , cải thiện màu nước , ổn định pH và cân bằng hệ sinh thái

trong đầm Chế phẩm sinh ho ̣c cũng có tác du ̣ng phòng bê ̣nh , giảm thiểu hiện tượnggây bê ̣nh cho tôm Ngoài ra , việc áp dụng chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủysản còn giúp đối tượng nuôi hấp thụ thức ăn dễ hơn , giảm hệ số tiêu thụ thức ăn ,

tăng năng suất thu hoa ̣ch từ 20 – 30% [60] Bên ca ̣nh đó , viê ̣c sử du ̣ng chế phẩm

sinh ho ̣c tron g nuôi trồng thủy sản sẽ ha ̣n chế viê ̣c sử du ̣ng hóa chất và chất khángsinh, yếu tốt gây ra hâ ̣u quả của viê ̣c nuôi trồng thủy sản kém bền vững Thưc ̣ tế

cho thấy , những cơ sở sử du ̣ng chế phẩm sinh ho ̣c đã đa ̣t năng suất thủy sản khácao, giảm thiểu nguy cơ mắc bệnh

Sử du ̣ng chế phẩm probiotic cho kết quả ưu viê ̣t hơn hẳn sử du ̣ng hóa chấtcũng như thuốc kháng sinh vì hóa chất chỉ làm sạch nước tạm thời và chúng giết

chết hàng loa ̣t tảo tro ng đầm Hơn nữa , thay vì cần phải làm sa ̣ch chất hữu cơ và

lắng că ̣n bùn thì hóa chất la ̣i góp phần hiǹ h thành nên lớp bùn dày hơn ở đáy đầm ,tạo điều kiện cho các vi sinh vật gây hại phát triển Bên ca ̣nh đó , nhiều loài tôm, cávà động vật thủy sinh khác cũng có thể bị giết chết b ởi hóa chất Hâ ̣u quả của viê ̣cdùng thuốc kháng sinh cũng không kém phần nghiêm trọng Chất kháng sinh cũnggiết chết nhiều loa ̣i vi khuẩn , kể cả vi khuẩn gây ha ̣ i lâñ vi khuẩn có ích , do đó làmgiảm tốc độ các quá trình các quá trình chuyển hóa sinh học trong nước , đồng thời ,giảm khả năng tạo miễn dịch tự nhiên của chúng Hơn nữa , sử du ̣ng thuốc kháng

̣ ̣

sinh lâu dài sẽ dâñ đến xuất hiê ̣n các chủng vi khuẩn gây bê ̣nh kháng thuốc Hiê ̣ntươ ̣ng kháng thuốc cũng có thể xuất hiê ̣n ở người thông qua chuỗi thức ăn khi conngười sử du ̣ng các sản phẩm thủy sản nuôi trồng Vì thế , hiê ̣n nay các loa ̣i thuốckháng sinh đều bi cấm sử du ̣ng trong nuôi trồng thủy sản Mă ̣t khác , tôm cá lànhững sinh vâ ̣t rất nha ̣y cảm với bê ̣nh tâ ̣t , dễ bi tổn thương và bi tấn công bởi nhiềutác động, đôi khi viê ̣c sử du ̣ng chất kháng sinh liên tu ̣c đã là m mất đi sản lươ ̣ng tômcá khổng lồ , ví dụ vở nhiều nơi trên thế giới đã từng bị mất đến 80% sản lượng thủysản Như vâ ̣y , rõ ràng cần phải có một sự kiểm soát khác thay thế thuốc kháng sinh ,hóa chất và probiotic đã t hể hiê ̣n đươ ̣c vai trò ấy

Hiện nay các loài vi sinh vật: Bacillus, Lactobacillus, nhóm vi khuẩn quang

dưỡng, hóa dưỡng… được sử dụng chủ yếu để sản xuất các chế phẩm sinh học

Những nghiên cứu cho thấy rằng các loài vi khuẩn này đều không độc hại, dễ nuôicấy, dễ tồn tại trong môi trường nước và đất nghèo dinh dưỡ ng Chúng có khả năngphân huỷ thức ăn thừa, chất thải hữu cơ và làm sạch môi trườ ng nhờ enzym do

chúng tổng hợp được Ngoài ra chúng còn có khả năng sinh các chất kháng khuẩnnhư bacteriocin, một chất có hoạt tính kháng sinh được dùng nhiều trong chăn nuôi,bảo quản thực phẩm để nâng cao hiệu suất tăng trưở ng, hiệu suất sử dụng thức ăncủa vật nuôi, làm giảm sự phát triển của những vi sinh vật có hại Chính nhờ nhữngđặc điểm này mà chúng được dùng để sản xuất các chế phẩm nhằm c ải thiện môitrường nước, nâng cao hiệu suất kinh tế, hạn chế dịch bệ nh cho tôm cá

 Mục đích của vi ệc sử dụng chế phẩm probiotic

Trong nuôi trồng thủy sản s ử dụng chế phẩm probiotic nhằm các mục đích:

- Giảm độc tố trong ao ở mức thấp nhất, giảm mùi hôi thối của nước

- Cải thiện màu nước, ổn định pH, cân bằng hệ sinh thái trong ao

- Phân hủy các chất hữu cơ, phòng tảo nở hoa, hấp thu nguồ n tảo chết trong

ao, giảm độ nhớt c ủa nước

- Cạnh tranh thức ăn làm giảm lượ ng vi khuẩn có hại, phòng bệ nh

- Tăng sự hòa tan oxy

- Kích thích hệ miễn dịch trong tôm để kháng bệnh, gi ảm sốc khi môi trườ ngthay đổi đột ngột

- Giúp tôm cá hấp thu thức ăn tốt, gi ảm hệ số tiêu tố n thức ăn

- Hạn chế được sử dụng thuốc kháng sinh và hóa chất

- Giảm số lần thay nước trong quá trình nuôi.

 Một số nhóm vi khuẩn thường được sử dụng trong sản xuất

probiotic cho tôm cá

 Nhóm Bacillus

Vi khuẩn thuộc chi Bacillus phân bố r ất rộng trong tự nhiên, trong rất nhiều

môi trường (đất, nước, không khí, thực phẩm…) và gồm nhiều nhóm sinh lí sinhthái khác nhau (ưa ấm, ưa nhiệt, ưa l ạnh…), với gần kho ảng gần 500 loài và dướiloài Do sự đa dạng sinh thái và đa dạng loài như vậy các ho ạt chất sinh học củachúng cũng vô cùng phong phú: các enzym ngo ại bào, các chất kháng khuẩn vàkháng nấm, các chất kích thích sinh trưở ng thực vật, các chất ho ạt động bề

mặt…[32]

Bacillus là những vi khuẩn Gram dương, hình que, có bào tử, sinh trưở ng

trong điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc, thuộc nhóm vi khuẩn dị dưỡ ng

hoại sinh Về dinh dưỡng và sinh trưởng nhìn chung Bacillus là những vi khuẩn hóa

tự dưỡng hữu cơ tùy tiện có khả năng s ử dụng nhiều các hợ p chất hữu cơ đơn giảnnhư là các đường, axit amin, các axit hữu cơ Trong một số trường hợ p chúng lênmen cacbonhydrat thông qua chuỗi các phản ứng phức tạp tạo ra glycerol và

butanediol Một số ít loài như Bacillus megaterium lại không cần đến các yếu tố

sinh trưở ng hữu cơ, một số khác sinh trưởng lại c ần có vitamin B ho ặc các axit

amin Phần lớn Bacillus là các vi khuẩn ưa ấm với nhiệt độ sinh trưởng tối ưu từ

30 - 45oC một số loài có thể sinh trưởng ở nhiệt độ 65oC Một số loài ưa lạnh có thểsinh trưở ng và hình thành nội bào tử ở 0oC pH sinh trư ởng r ất khác nhau từ 2 -11

Đa số Bacillus sinh trưởng tốt ở pH = 7, một số phù hợ p với pH = 9 như Bacillus alcalophillus, hay có loài phù hợ p với pH = 2 - 6 như Bacillus acidocaldrius [32].

Tr ừ Bacillus anthracis gây bệnh than cho ngư ời, tất c ả các Bacillus khác được coi là không độc hại cho người Bacillus làm sạch môi trường nước nhờ khả

năng sinh enzym phân hủy chất hữu cơ nguồn gốc từ thức ăn thừa, chất thải từ tômcá: proteaza phân hủy protein, amylaza phân hủy tinh bột, xenlulaza phân hủyxenlulozơ, kitinaza phân giải kitin Ngoài chức năng phân giải các hợ p chất hữu cơlàm s ạch môi trường thì chúng còn có tác d ụng kiểm soát sự phát triển quá mức visinh vật gây bệnh do cơ chế cạnh tranh nguồn dinh dưỡ ng, gi ữ cho môi trường luôn

ở trạng thái cân bằng sinh học Đặc điểm quan trọng nhất của chi Bacillus là có khả

năng t ạo nội bào tử, nhất là trong những điều kiện bất lợi như c ạn kiệt nguồ n dinh

dưỡng hay điều kiện bất lợi về nhiệt độ cao, tia bức xạ hóa chất… Bào t ử Bacillus

có thể tồn tại rất lâu thậm chí trong nhiều năm, khi gặp điều kiện thuận lợi có thểnảy mầm, phát triển thành tế bào dinh dưỡ ng Trong quá trình hình thành bào tử,

Bacillus thườ ng s ản sinh ra các hợ p chất có hoạt tính sinh học, ứng dụng trong

nhiều lĩnh vực Một trong những đặc tính đó là sinh enzym phân hủy hữu cơ nhưproteaza, amylaza, xenlulaza Proteaza là enzym xúc tác sự thủy phân liên kết peptit(CO-NH) trong phân t ử protein và các chất tương tự Sản phẩm thủy phân là cácaxit amin, sản phẩm trung gian là các peptit có mạch dài ngắn khác nhau Enzymamylaza có tác dụng thủy phân tinh bột Quá trình trải qua giai đoạn dextrin hóa,khi đó chỉ một số liên kết trong phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lượngdextrin và giai đoạn đường hóa Trong giai đoạn này các dextrin vừa được tạo thành

bị phân hủy tiếp thành các phân t ử thấp hơn như maltozơ, isomaltozơ, glucozơ.Enzym xenlulaza xúc tác sự thủy phân xenlulozơ thành s ản phẩm trung gian

xenlubiozơ và sản phẩm cuối cùng là glucozơ Các sản phẩm cuối cùng của sự phânhủy chất hữu cơ nhờ hệ enzym proteaza, amylaza, xenlulaza là các axit amin vàglucozơ Đó là nguồn dinh dưỡ ng cho nhiều loại vi sinh vật có ích, giúp cho chúngphát triển mạnh và làm c ải thiện chất lượng nước [32]

 Nhóm vi khuẩn lactic

Một trong những nhóm vi khuẩn điển hình có ích đối với môi trường đầmnuôi tôm cá là nhóm vi khuẩn lactic Các vi khuẩn lactic được xế p chung vào họ

Lactobacteriacae Chúng không đồng nhất về mặt hình thái, các giống khác nhau có

hình dạng và kích thước khác nhau Nhưng nhìn chung chúng được chia thành hailoại hình cầu và hình que Ngoài ra hình d ạng và kích thước tế bào vi khuẩn lacticcòn phụ thuộc vào môi trường, điều kiện nuôi cấy, sự có mặt c ủa oxy và tuổi tế bào

Streptococcus có tế bào hình c ầu ho ặc hình ovan, đườ ng kính khoảng

0,5 -1,0 µm, sắp xếp riêng biệt, cặp đôi ho ặc thành chuỗi dài Tuy nhiên, một sốchủng thuộc loài này có thể có dạng hơi giống trực khuẩn vì có kích thước chiều dài

lớn hơn chiều rộng, chẳng hạn như Streptococus lactic [9].

Leuconostoc có hình dạng hơi dài ho ặc hình ovan, đường kính từ 0,5 - 0,8µm

và chiều dài khoảng 1,6µm Đôi khi chúng có dạng hơi tròn, chiề u dài khoảng

1 - 3µm, sắp xếp thành chuỗi và không tạo thành đám [9 ]

Lactobacillus có hình que Đây là loại vi khuẩn phổ biế n nhất Hình dạng của chúng thay đổi từ hình c ầu cho đến hình que dài Chẳng hạn L plantatum có

dạng hình que kích thư ớc từ 0,7-1,1µm đến 3-8µm, s ắp xếp thành chuỗi ho ặc đứng

riêng lẻ, trong khi L casei có dạng hình que ngắn hoặc hình que dài, tế bào hình

que mảnh, đôi khi hơi cong, sắp xếp thành cặp hay chuỗi [9]

Về hình thái, vi khuẩn lactic có hình dạnh không đồng nhất Nhưng về mặtsinh lý chúng lại có những điểm tương đối đồng nhất Chúng đều là những vi khuẩnGram (+), không có khả năng t ạo bào tử, không di động, sinh axit lactic trong quátrình phát triển, catalase, oxydase và khử nitrat âm tính, không chứa các xitocrom,

hô hấp kỵ khí hoặc vi hiếu khí [10]

Mỗi loài vi khuẩn khác nhau có nhu cầu về dinh dưỡng c ũng khác nhau.Chúng không những cần cung cấp đủ các chất dinh dưỡng: cacbon, nitơ, muối

khoáng… mà còn cần các chất kích thích sinh trưở ng

Nhóm vi khuẩn lactic có khả năng kiểm soát vi sinh vật gây bệnh trong môitrường nhờ sinh chất đối kháng như axit lactic, bacteriocin Ngoài vai trò ki ểm soát

vi sinh vật gây bệnh trong môi trường thì chúng cũng có tác dụng làm gi ảm mùi hôicủa đầm nuôi Quan trọng hơn cả, sử dụng nhóm vi khuẩn này còn có tác dụng hạnchế việc sử dụng kháng sinh, đảm bảo tiêu chuẩn vệ sinh thực phẩm cho sản phẩmthủy s ản Khi sử dụng nhóm vi khuẩn lactic để bổ sung vào thức ăn tôm cá, ngoàimục đích làm cân bằng khu hệ vi sinh vật đường ruột, ngăn cản sự xâm nhập của visinh vật có hại, tăng khả năng phòng ngừa một số bệnh đườ ng ruột thì chúng còn cótác dụng t ăng khả năng tiêu hóa và hấp thụ thức ăn, giúp cho tôm cá nuôi phát triểnkhoe mạnh, t ăng trưởng nhanh [5]

 Nhóm vi khuẩn nitrat hóa tự dƣỡng

Tr ước đây, theo phân loại truyền thống đã xế p các chủng vi khuẩn nitrat hóa

chung vào cùng một nhóm thuộc họ Nitrobacteriaceae sau đó, dựa vào khả năng

oxy hóa các cơ chất vô cơ của vi khuẩn nitrat hóa mà người ta đã chia chúng thành

2 nhóm, đó là nhóm vi khuẩn oxy hóa amôni và nhóm vi khuẩn oxy hóa nitrit [53]

 Vi khuẩn oxy hóa amôni hay còn gọi là vi khuẩn nitroso là nhóm vi

khuẩn Gram âm, hóa t ự dưỡ ng và hiế u khí bắt buộc Vi khuẩn này lấy nănglượng từ quá trình oxy hóa amôni thành nitrit Quá trình oxy hóa amôni xảy

ra theo phương trình sau:

Vi khuẩn oxy hóa amôni tự dưỡ ng lấy năng lượ ng và l ực khử t ừ quá trìnhoxy hóa amôni để sinh trưở ng Nguồ n cacbon chính mà các tế bào vi khuẩn s ử dụnglà CO2 trong khí quyển thông qua chu trình Calvin-Benson Các tế bào vi khuẩnsinh trưở ng rất chậm, thời gian nhân đôi tế bào của vi khuẩn ít nhất là 7 - 8 giờ ,thậm chí cũng có thể kéo dài thêm vài ngày [42].

Trong hệ thống phân loại hiện nay, người ta chia nhóm vi khuẩn amôni hóathành 3 chi, dựa vào sự khác biệt về hình dạng tế bào, kiểu hình và tổ chức nội bào

Đó là các chi Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosospira Tế bào vi khuẩn thuộc chi Nitrosomonas có hình que thẳng, chi này là phổ biến nhất trong nhóm vi khuẩn

amôni hóa, có vùng phân bố rộng, chúng sống trong đất, nước ngọt, bùn, nước lợ,

biển Chi Nitrosococcus tế bào có hình cầu đặc trưng, tế bào có roi nên có khả năng

di chuyển Tế bào vi khuẩn thuộc chi Nitrosospira có hình xoắn ốc[62].

 Nhóm vi khuẩn oxy hóa nitrit tự dưỡng được biết đến như là vi khuẩn tựdưỡng hóa năng (chemoautotroph), Gram âm và hiếu khí Giống như vikhuẩn oxy hóa amôni, vi khuẩn oxy hóa nitrit sử dụng nguồn cacbon là CO2

thông qua chu trình Calvin-Benson [41] Quá trình oxy hóa nitrit xảy ra nhưsau:

Tốc độ sinh trưở ng của vi khuẩn oxy hóa nitrit phụ thuộc vào nồng độ cơchất, nhiệt độ, pH, ánh sáng và nồng độ oxy hòa tan Các chủng vi khuẩn nitrit hóa

tự dưỡng sinh trưở ng tốt ở nồng độ nitrit từ 2 - 30 mM, nồng độ nitrit quá cao cóthể gây ức chế sinh trưởng của tế bào Vi khuẩn oxy hóa nitrit có thể sinh trưởngbình thường trong môi trườ ng tự nhiên ở dải pH = 6 - 8 Điều kiện tối ưu cho sinhtrưởng là pH = 7 - 8 Nhiệt độ lý tưởng cho sinh trư ởng c ủa chúng là 25 - 30oCtrong môi trườ ng không khí [62]

Tốc độ của giai đoạn (1) xảy ra nhanh gấp 3 lần so với giai đoạn (2) Bằngthực nghiệm người ta đã chứng minh r ằng lượng oxy tiêu hao để oxy hóa 1mg nitơcủa muối amôni ở giai đoạn tạo nitrit là 343 mg O2, còn ở giai đoạn tạo nitrat là 4,5

mg O2 Sự có mặt của nitrat trong nước thải phản ánh mức độ khoáng hóa hoànthành các chất bẩn hữu cơ Năng lượ ng sinh ra từ phản ứng nitrat hóa được vi khuẩnsử dụng trong quá trình tổng hợ p tế bào [5]

Ngày nay, vi khuẩn oxy hóa nitrit được phân loại thành 4 chi: Nitrobacter, Nitrococcus, Nitrospina và Nitrospira Tế bào vi khuẩn thuộc chi Nitrobacter có

hình que ngắn, màng trong tế bào chứa mũ phân cực Tế bào vi khuẩn thuộc chi

Nitrococcus có hình tròn, màng trong tế bào hình ống Tế bào vi khuẩn thuộc chi Nitrospina có hình que, màng trong tế bào dạng túi Tế bào vi khuẩn thuộc chi

Nitrospira có hình xo ắn và không xuất hiện màng trong tế bào [62].

Các vi khuẩn oxy hóa nitrit có khả năng thích nghi cao với các điều kiện môitrường khác nhau và chúng thườ ng tồn tại cùng với vi khuẩn oxy hóa amôni do các

vi khuẩn này đã cung cấp nitrit cho chúng trong môi trường hiếu khí [41]

Trong các chế phẩm dùng cho ao, đầm nuôi tôm cá hiện nay người ta thườ ng

bổ sung nhóm vi khuẩn nitrat hóa tự dưỡ ng cụ thể là chi Nitrosomonas và chi

Nitrobacter Vi khuẩn thuộc hai chi này đóng vai trò quan trọng trong việc gi ảm các

độc tố trong môi trường nước, chuyển hóa các chất độc như amôni và hợ p chất nitơ,

do đó sẽ làm gi ảm mùi hôi trong nước, giúp tôm cá nuôi phát triển tốt [7]

1.5.3 Ưu điểm và nhươ ̣c điểm của biêṇ phấp sưư du ̣ng vi sinh vâ ̣t trong xưư lý nước nuôi trồng thủy sản

- Ưu điểm: các loài vi sinh vật được dùng ngày càng nhiều trong xử lý môitrường nước nuôi trồng thủy sản và đem lại nhiều lợi ích cho con người và môitrường sống mà các phương pháp khác không có đươ ̣c như : an toàn đối với ngườivà động vật , đă ̣c hiê ̣u đối với vâ ̣t chủ , thích hợp với các phương pháp phòng trừkhác , thời gian bán hủy ngắn nên không tồn đọng lâu để gây ô nhiễm môi trườngsống, có khả năng tự nhân lên (tư ̣ sinh sản ), có khả năng ức chế các vi sinh vật đãkháng thuốc hóa học

- Nhươ ̣c điểm : thời gian phát huy tác du ̣ng châ ̣m , tác động không triê ̣t để ,hiê ̣u quả phương pháp chiụ ảnh hưởng lớn vào điều kiê ̣n ngoa ̣i cảnh , kết quả thuđươ ̣c thường không ổn đinh

Để ha ̣n chế các nhươ ̣c điểm này , chúng ta cần phải tuyển chọn các chủng visinh vâ ̣t có tiń h đối kh áng tốt nhất , nghiên cứu sử du ̣ng kết hơ ̣p nhiều chủng

Chương 2 – ĐỐI TƯ ỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng

2.1.1 Chủng giông

- Các chủng VSV dùng trong nghiên cứu được tuyển chọ n từ các chủng vikhuẩn phân lập t ừ các mẫu đ ất, nước tại địa bàn Hà Nội

- Các chủng Vi sinh vật kiểm định l ấy từ bảo tàng giống chuẩn VSV, Việ n

VSV và Công Nghệ Sinh học- ĐH Quốc gia Hà Nội, bao gồm các chủng E coli

aureus ATCC 25923; Vibrio parahaemolyticus; Shigella flexneri ATCC 29903D; Fusarium oxysporum.

- Buồng cấy vô trùng (Pháp )

- Máy lắc Inforsagch – 4103 (Pháp)

- Tủ sấy , tủ ấm ( Trung Quốc )

- Cân phân tích (Nhâ ̣t )

- Nồi khử trùng Tomy SS 325 (Nhâ ̣t )

- Máy đo DO meter Hanna HI 8043 (Hàn Quốc )

- Máy đo pH Hanna 8733 (Hàn Quốc )

- Tủ cấy ( Trung Quốc )

- Tủ ổn nhiệt (Nhâ ̣t )

- Tủ lạnh (Nhâ ̣t )

- Kính hiển vi quang học OLYMPUS (Nhật Bản)

- Máy li tâm

2.1.3 Môi trường

2.1.3.1 Môi trường phân lâp ̣ và nuôi cấy vi sinh vât

- Môi trường tha ̣ch thường cải t iến (g/l):

1 lít

K2HPO4

CH3COONa.2H2OMgSO4

MnSO4.4H2 OCaCO3

Thạch

2g5g0,58g0,28g5g14-15g

- Môi trường ISP 4 (g/l) pH = 7

14 - 15 g

Dịch vi lượng : 0,1g FeSO4.7H2O + 0,1g MnCl + 0,1g ZnSO4

Môi trường giữ giống thêm 5g peptone

- Môi trường nuôi Nitrosomonas:

- Môi trường 1:

Bắp cải 300gNước mắm 15mlNước cất 1 lít

- Môi trường 2:

Cà chua 300gNước mắm 15mlNước cất 1 lít

- Môi trường 3:

Giá đỗ 300gNước mắm 15mlNước cất 1 lít

- Môi trường 4:

Khoai tây 300gNước mắm 15mlNước cất 1 lít

trùng, đem khử trùng ở 121 C trong 30 phút , để nguội môi trường trong 24h giữ ở

K2HPO4 1gMgSO4 0,2gCaCl2.2H2O 20mgFeSO4.7H2O 50mgMnCl2.4H2O 2,0mg

Na2MoO4.2H2O 1mgNước cất 1 lít

pH 8,5

- Môi trường nuôi Nitrobacter:

K2HPO4 1gMgSO4 0,2gCaCl2 2H2O 20mgFeSO4.7H2O 50mgMnCl2.4H2O 2,0 mg

Na2MoO4.2H2O 1mgNước cất 1 lít

2.1.3.2 Môi trường lên men di ̣ch thể (g/l):

Đun sôi môi trường sau đó đổ 40ml vào biǹ h tam giác 100ml đã đươ ̣c khử

o

4oC

2.2 Phương pháp nghiên cưưu

2.2.1 Phương pháp phân lập vi khuẩ n

- Lấy 1ml mẫu đưa vào ống nghiệm chứa 9ml nước c ất đã được khử trùng đểđược độ pha loãng 10 -1 Vontex đều sau đó lấy 1ml dung dịch ở độ pha loãng 10 -1

cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng ta được độ pha loãng 10 -2 Tiếp tụcnhư vậy đến nồng độ 10-6

- Lấy 50µl dung dịch pha loãng m ẫu ở các nồng độ thích hợp trải đều lên đĩapeptri chứa môi trườ ng nuôi cấy

- Tinh sạch, ria cấy 3 pha các chủng để thu nhận chủng thuần khiết, sau đógiữ giống trong ống nghiệm môi trườ ng thạch nghiêng

2.2.2 Phân loại vi sinh vật

Phân loại theo phương pháp truyền thống

Phương pháp phân loại cổ điển là phương pháp phân loại các chủng vi khuẩndựa vào các đặc điểm về hình thái, đặc điểm sinh lí, sinh hóa Dựa vào đó, người taphân loại chúng vào các chi

Phân lọai theo phương pháp sinh học phân tử

 Phương pháp tách ADN vi khuẩn

- Lấy 2 vòng que cấy vi khuẩn hoà vào 200 µl TE trong ố ng Eppendoff

- Thêm lyzozym vào, trộn đều, sau đó ủ ở 37oC trong 30 phút

- Thêm 100 µl SDS 10%, ủ ở 37oC trong 30 phút

- Thêm 300 µl PCI (phenol: chloroform: isoamyl alcohol) vào, tr ộn đềutrong đá lạnh, sau đó ly tâm với vận tốc 15.000 vòng/phút, sau ly tâm, l ấy dịch trên

- (Bước này được lặp l ại 2 lần)

- Dùng etanol lạnh với thể tích gấp 2 l ần thể tích mẫu để tủa ADN

- Rửa tủa bằng etanol 70%

- Làm khô ADN bằng máy làm khô chân không

- Thêm 30-50 µl nước, bảo quản để dùng dần

 Điện di trên gel agaroza

Thành phần Thể tích (%)

photphodieste của các sợi axit nucleic Điều đó có nghĩa là các phân tử sẽ chạy vềcực dương khi đặt trong điện trường Kỹ thuật này được tiến hành trên một đệm gelcó tác dụng phân tách các axit nucleic theo kích thước

- Tiến hành: Đun tan 1% agaroza trong dung dịch đệm TAE 1x đổ vàokhuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập trong 300ml dungdịch 1X TAE Trộn đều 2 µl dung dịch loading buffer 6x với 5µl mẫu, nho vàogiếng Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế 100V, cường độ dòngđiện 80mA trong 30 phút, bo ra ngâm trong dung dịch EtBr (nồng độ 0,5 µl/ml) 20phút vớt ra Quan sát vạch ADN trên máy soi gel

Mồi cho phản ứng PCR

Mồi xuôi: 5'- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3' t ương ứng với vị trínucleotit 27 đến 47

Mồi ngược: 5'- AAAGGAGGTGATCCAGCC -3' tương ứng với vị trínucleotit 1525 đến 1507

- Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR

Bước tiến hành Nhiệt độ ( C)o Thời gian

-Kiểm tra các sản phẩm của PCR bằng điện di: Tiến hành tương tự như đối

với điện di genome

 Phản ứng khuếch đại ADN cho giải trình tự

Terminator Ready Reaction Mix 8 µl Mồi 1 µl

Mẫu 1µl Nước c ất đủ đến 20µl

Sử dụng bộ kít Cycle sequencing với hỗn hợp phản ứng như sau :

- Chu trình nhiệt

 Xác định hàm lượng axit nucleic

Do trong thực tế thường phải sử dụng những lượng axit nucleic rất nho (thườnglà micro-, nano- hoặc picogram) khi tiến hành các thí nghiệm tách dòng Không thể xácđịnh số lượng này một cách trực tiếp mà nồng độ của dung dịch axit nucleic được xácđịnh bằng cách đo độ hấp thụ tại bước sóng 260 nm (A260) trong máy đo quang phổ kế.Một đơn vị (1,0) giá trị hấp thụ bước sóng 260 nm tương đương với nồng độ 50 µg/mlcủa ADN sợi kép, hoặc tương đương với nồng độ 40 µg/ml của ADN hoặc ARN mạch

đơn Tỉ số A260/A280 là chỉ số cho thấy độ nhiễm các chất như phenol hoặc protein Tỷ số

A260/A280 là 1,8 đối với mẫu ADN sạch

 Đọc trình tự ADN

Trình tự của rADN 16S của các chủng vi khuẩn được đọc trực tiếp trên

máy đọc trình tự tự động ABI 3100 Avant Sau đó kết quả trình tự được so sánh vớicác trật tự của các loài đã có trong ngân hàng gen quốc tế để xác định đến tên loài

2.2.3 Phương pháp bảo quản giông

Vi khuẩn được nuôi trong ống thạch nghiêng thạch thường, nuôi ở nhiệt độphòng Sau kho ảng 10 - 14 ngày khi vi khuẩn đã mọc tốt cất vào tủ mát ở nhiệt độ4-6oC Sau 1 - 2 tháng c ấy truyền l ại một lần

Nhằm bảo quản được giống lâu hơn, để giống trong ố ng cát, trong paraffinlong vô trùng giữ l ạnh sâu trong glycerin ho ặc đông khô, bảo quản được từ 6 thángđến 2 năm

2.2.4 Phương pháp xác định hoạt tính enzym và hoạt tính kháng khuẩn

Xác định hoạt tính enzym

Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào (proteaza, kitinaza, xenlulaza,

amylaza) trong dịch nuôi cấy bằng phương pháp khuyếch tán trên thạch chứa 1% cơchất tương ứng (cazein, kitin, CMC, tinh bột tan)

Môi trường gồm cơ chất và thạch được khử trùng ở 1atm trong 30 phút, sauđó được đổ vào các đĩa peptri đã được vô trùng, với độ dày thạch khoảng 3mm, đợinguội, dùng khoan nút chai để đục các lỗ thạch trên môi trườ ng Nho 200µl dịch

nuôi c ấy vi sinh vật vào các lỗ thạch, rồi để vào tủ lạnh 4 - 5 giờ cho enzym

khuyếch tán vào thạch, sau đó chuyể n vào tủ ấm 30 - 32oC Sau 24 giờ đem ra hiệnvòng phân giải bằng cách nhuộm màu các đĩa bằng dung dịch Lugol (với cơ chất làCMC, kitin, tinh bột) và bằng axit triclo axetic với cơ chất là cazein

Hoạt tính enzym được xác định qua kích thước vòng phân gi ải theo công

( T) 10o tương đương với 9mg axit lactic.

Dùng khoan nút chai đ ục các lỗ trên môi trườ ng thạch đã c ấy VSV kiểm địnhtrong đĩa peptri Dịch nuôi vi khuẩn 2 ngày ở nhiệt độ thích hợp được ly tâm với tốcđộ 6000 vòng/phút, ở 4oC trong 15 phút sau đó được nho với lượ ng 0,1 ml vào mỗilỗ thạch Đọc kết quả sau 3 ngày ho ạt tính kháng sinh xác định dựa vào kích thướcvòng vô khuẩn (D - d, mm) Trong đó, D là kích thước vòng vô khuẩn, d là kíchthước thoi thạch

* Phương pháp đặt thoi thạch

Vi sinh vật đ ược nuôi trong môi trường ở nhiệt độ thích hợp trong các đĩapetri Dùng khoan nút chai khoan các thoi thạch đặt vào môi trường đã cấy VSVkiểm định Để trong tủ lạnh từ 4 - 8 giờ cho chất kháng sinh khuếch tán vào môitrường, rồi đặt vào tủ ấm (30 oC) Đọc kết quả sau một ngày đối với vi sinh vật kiểmđịnh là vi khuẩn

Hoạt tính enzym/hoạt tính kháng sinh (HTE/HTKS) xác định theo công thức:

HTE/HTKS = D – d (mm)

D: Đường kính vòng phân giải/vòng vô khuẩn + đường kính thoi thạch

2.2.5 Xác định sinh khôi bằng phương pháp đo mật độ quang học

Số lượng tế bào VSV trong dịch nuôi có thể xác định gián tiếp bằng cách đomật độ quang học OD Dịch nuôi được pha loãng 5 lần, đo OD ở bước sóng 660nm

2.2.6 Phương pháp định lượng axit lactic

Nuôi vi khuẩn trong môi trường long Lấy 10ml dịch mẫu vào ống nghiệmchứa 20ml nước cất, thêm 3 giọt chỉ thị phenolphtalein 1% Chuẩn độ bằng dungdịch NaOH 0,1% cho đến khi xuất hiệ n màu hồng không đổi trong 1 phút

Lấy số ml NaOH tiêu tốn khi chuẩn độ nhân với 10 ta được số độ Therner

o

2.2.7 Phương pháp nghiên cứu khả năng chuyển hóa các hợp chất chứa nitơ của tế bào

Định lượng NO 2- theo phương pháp Griss [49]

Hàm lượ ng NO2- được xác định dựa trên phản ứng t ạo màu hồng của NO

2-với thuốc thử Griss

Thuố c th ử:

+ Griss 1: Hòa tan 0,5g axit sunfaninic vào 150ml axit acetic 5N

Nồng độ NO2- (mg/l) 0 0,1 0,5 1 2 3 5 Độ hấp thụ màu 0 0,0058 0,346 0,395 0,098 0,171 0,247

+ Griss 2: Hòa tan 0,5g α- Naphtylamin vào 50ml nước cất, bổ xung 150 axitacetic 5N Bảo quản trong tủ lạnh

Ti ế n hành: Thêm 0,05ml Griss 1 và 0,05ml Griss 2 vào 5ml dung dịch mẫunghiên c ứu, sau 10 phút phản ứng kết thúc đo độ hấp thụ ở bước sóng A520 mm

Cường độ mầu t ỷ lệ thuận với nồng độ nitrit Lượng nitrit có trong mẫu nghiên cứuđược dựa vào đồ thị chuẩn sử dụng dung dịch N-NO2- 5mg/l

Lập đườ ng chuẩ n: Lấy 6 ống nghiệm cho l ần l ượt dung dịch nitrit chuẩn

nồng độ từ 0,1 đến 5 mg/l và một mẫu trắng Làm tuần tự các thao tác đã trình bày ởtrên Sau đó mang đi đo m ật độ quang học, vẽ đườ ng chuẩn và xác định phương

trình hồi quy của đườ ng chuẩn trên Kết quả thu được trình bày ở bảng và biểu diễntrên đồ thị

Đường chuẩn 0.3

Định lượng NO 3- theo phương pháp Brucine [49]

Phương pháp dựa trên nguyên t ắc giữa phản ứng của nitrat và hợ p chất

brucine t ạo thành phức hợ p màu nâu vàng có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước

sóng 410 mm

Hóa chất: Dung dịch nitrat chứa 100mg N/l; Natri asenit: Hòa tan 0,5g

NaAsO2 trong 100 ml nước cất; thuốc thử brucine: hòa tan 1g brucine-sulfate và

0,1g axit sulfanilic trong 70ml nước cất nóng, thêm 3ml axit HCl , làm l ạnh và bổ

sung nước cất đến thể tích cuối cùng là 100ml; dung dịch axit sunfuric: bổ sung cẩn