NGHIÊN cứu đa DẠNG DI TRUYỀN PHÂN đoạn s7 của các CHỦNG VIRUS gây BỆNH lúa lùn sọc ĐEN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---Lại Phương Liên NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN PHÂN ĐOẠN S7 CỦA CÁC CHỦNG VIRUS GÂY BỆNH LÚA LÙN SỌC ĐEN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2013...

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-Lại Phương Liên

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN PHÂN ĐOẠN S7 CỦA CÁC CHỦNG VIRUS GÂY BỆNH LÚA LÙN SỌC ĐEN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2013

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-Lại Phương Liên

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN PHÂN ĐOẠN S7

CỦA CÁC CHỦNG VIRUS GÂY BỆNH LÚA LÙN SỌC ĐEN

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 60420121

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Phạm Xuân Hội

PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân

Hà Nội – Năm 2013

PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong

suốt quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành luận văn này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới ThS Nguyễn Duy Phương, CN Nguyễn

Hoàng Quang cùng các cán bộ, anh chị em trong Bộ môn Bệnh học Phân tử Thực vật,

Viện Di truyền Nông nghiệp đã nhiệt tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi rất nhiều trong

thời gian thực tập tại Bộ môn

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể các thầy cô giáo trong bộ môn

Di truyền học, khoa Sinh học , trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia HàNội đã tạo điều kiện cho tôi được học tập và nghiên cứu trong một môi trường học

tập khoa học, giúp cho tôi có những kiến thức bổ ích trong suốt 2 năm học

Cuối cùng tôi cũng xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến gia đình và bạn bè,những

người luôn đứng sau giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 10 tháng 12 năm 2013

Học viên thực hiện

Lại Phương Liên

bp Base pair (Cặp bazơ)

cDNA complementary (DNA bổ sung)

ddNTP Dideoxyribonucleoside triphosphate

DNA Axit deoxy ribonucleic

dNTP Deoxynucleotidetriphosphates

dsRNA Double stranded RNA (ARN sợi đôi)

FDV Fiji disease virus (Virus bệnh Fiji)

EDTA Axit Ethylenediaminetetra acetic

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay (xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kếtvới enzyme)

EtBr Ethidium Bromide

IRRI International Rice Research Institute (Viện nghiên cứu lúa quốc tế)

Kb Kilobase

LB Môi trường Luria Bertani

LSĐPN Lùn sọc đen phương Nam

MRCV Mal de Río Cuarto virus (Virus Mal de Rio Cuarto)

MRDV Maize rough dwarf virus (Virus lùn ngô)

NLRV Nilaparvata lugens virus (Virus nilaparvata lugens)

NN&PTNT Nông nghiệp và phát triển nông thôn

OD Optical Density (mật độ quang học)

ORF Open reading frame (Khung đọc mở)

OSDV Oat Sterile-Dwarf Virus (Virus lùn yến mạch)

PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

RBSDV Rice black streaked dwarf virus (Virus lùn sọc đen)

RGSV Rice grassy stunt virus (Virus lúa cỏ)

RNA Axit ribonucleic

RRSV Rice ragged stunt virus (Virus lùn xoắn lá)

phiên mã ngược)

RTSV Rice tungro spherical virus (Virus Tungro hình cầu)

RTBV Rice tungro bacilliform virus (Virus Tungro dạng thẳng)

RDV Rice dwarf virus (Virus bệnh lúa lùn)

RGDV Rice gall dwarf virus (Virus vết u lùn lúa)

SRBSDV Southern rice black-streaked dwarf virus (Virus lùn s ọc đen phương Nam)TAE Tris base – Acetic - EDTA

Bảng 2 Các biểu hiện của bệnh lùn sọc đen trên lúa 35

Bảng 3 Kết quả sàng lọc mẫu bệnh bằng phương pháp Sandwich-ELISA và

RT-PCR một bước

Bảng 4 Trình tự các mồi đặc hiệu được thiết kế phục vụ cho phản ứng

RT-PCR

Bảng 5 So sánh mức đồng nhất trình tự phân đoạn S7 phân lập của các

mẫu Việt Nam và Trung Quốc

40

42

54

Hình 2 Rầy lưng trắng Sogatella furcifera truyền virus SRBSDV 9

Hình 3 Cấu trúc phân tử các Fijivirus 11

Hình 4 Tổ chức bộ gen của các Fijivirus 11

Hình 5 Cấu trúc hình đa diện kiểu icosahedral T=13 12

Hình 6 Ảnh điện di 10 phân đoạn RNA sợi đôi của virus SRBSDV

trên gel polyacrylamide 12,5%

Hình 7 Sự xuất hiện của protein P7-1 trong tế bào vector truyền bệnh

14

16

(rầy Sogatella furcifera) dưới kính hiển vi điện tử

Hình 8 Xét nghiệm virus SRBSDV bằng phương pháp DOT-ELISA 17

Hình 9 Vector nhân dòng pGEM-T và một số vị trí cắt của các 32enzyme cắt giới hạn trên vector pGEM-T

Hình 10 Triệu chứng một số mẫu lúa thu thập tại các tỉnh Việt Nam 37

Hình 11 Một số kết quả kiểm tra ELISA với các mẫu thu thập ở các tỉnh

Việt Nam

Hình 12 Một phần kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR một

bước của các mẫu lúa

Hình 13 Hình ảnh điện di genome của SRBSDV phân lập từ 12 mẫu

lúa

Hình 14 Kết quả điện di phân đoạn S7 phân lập được của SRBSDV

trên gel agarose 1% (chủng Thái Bình-2)

Hình 15 Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu của phân

Hình 17 Sơ đồ minh họa quá trình dòng hóa S7 vào vector pGEM-T 46

Hình 18 Kết quả biến nạp sản phẩm phản ứng gắn vào E.coli chủng 46

Hình 22 Kết quả điện di sản phẩm cắt giới hạn vector tái tổ hợp

pGEM-T/S7 bằng enzyme EcoRI

Hình 23 Một phần kết quả giải trình tự phân đoạn S7 của virus

SRBSDV (mẫu Nghệ An)

Hình 24 Trình tự amino acid suy diễn của 2 khung đọc mở nằm trên

phân đoạn S7 (mẫu Nghệ An)

Hình 25 Một phần kết quả so sánh trình tự nucleotide phân đoạn S7

của các mẫu SRBSDV thu đƣợc tại Việt Nam và trên thế giới

Hình 26 Một phần kết quả so sánh trình tự amino acid phân đoạn S7

của các mẫu SRBSDV thu đƣợc tại Việt Nam và trên thế giới

Hình 27 Hai cây phả hệ dựa trên toàn bộ trình tự S7 (A) và trình tự

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÁC VIRUS HẠI LÚA Ở VIỆT NAM 3

1.1.1 Các virus gây bệnh trên lúa 3

1.1.2 Tình hình nghiên cứu virus hại lúa ở Việt Nam 3

1.2 BỆNH LÙN SỌC ĐEN PHƯƠNG NAM VÀ VIRUS SRBSDV 5

1.2.1 Giới thiệu chung về bệnh lùn sọc đen phương Nam 5

1.2.1.1 Nguồn gốc phát sinh bệnh lùn sọc đen phương Nam 5

1.2.1.2 Diễn biến bệnh lúa lùn sọc đen tại Việt Nam 6

1.2.2 Đặc điểm bệnh học của bệnh lùn sọc đen phương Nam 7

1.2.2.1.Dấu hiệu nhận biết 7

1.2.2.2 Vector truyền bệnh 8

1.2.3 Đặc điểm sinh học của virus SRBSDV 10

1.2.3.1 Phân loại 10

1.2.3.2 Đặc điểm hình thái của SRBSDV 12

1.2.3.3 Đặc điểm di truyền của virus SRBSDV 12

1.2.3.4 Đặc điểm phân đoạn S7 và khả năng tiến hóa của SRBSDV 14

1.2.3.5 Chuẩn đoán virus SRBSDV 16

1.2.4 Tình hình nghiên c ứ u b ệ nh lùn s ọc đen phương Nam và virus SRBSDV ở Việ t Nam 17

1.2.4.1 Các nghiên cứu xác định virus SRBSDV 17

1.2.4.2 Các nghiên cứu về quy trình chẩn đoán virus SRBSDV 19

CHƯƠNG II - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 VẬT LIỆU 21

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 21

2.1.2 Hóa chất 21

2.1.3 Thiết bị 22

2.2.2 Xét nghiệm mẫu 22

2.2.2.1 Phương thức ELISA gắn đặc hiệu - "Sandwich ELISA" 23

2.2.2.2 RT-PCR một bước 25

2.2.2.3 Điện di DNA trên gel agarose 1% 26

2.2.3 Tinh sạch dsRNA của SRBSDV bằng cột CF-11 26

2.2.4 Tổng hợp cDNA từ dsRNA 28

2.2.4.1 Thiết kế cặp mồi 28

2.2.4.2 Tổng hợp cDNA sợi 1 28

2.2.4.3 Tổng hợp cDNA sợi đôi bằng kĩ thuật PCR 29

2.2.4.4 Tinh sạch sản phẩm PCR từ gel agarose bằng bộ kit Fermentas 30

2.2.5 Nhân dòng sản phẩm PCR bằng bộ kit pGEM®-T Easy Cloning 31

2.2.5.1 Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pGEM-T 31

2.2.5.2 Biến nạp DNA vào tế bảo khả biến E.colichủng DH5α 32

2.2.6 Tinh sạch plasmid từ vi khuẩn E.coli bằng bộ kit GenJETTM Plasmid Miniprep 33

2.2.7 Cắt enzyme giới hạn 33

2.2.8 Giải trình tự nucleotide đoạn gen đã nhân dòng 34

2.2.9 Phân tích đa dạng di truyền phân đoạn S7 35

CHƯƠNG III – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 Thu thập và bảo quản mẫu 36

3.2 Kết quả sàng lọc mẫu bệnh bằng phương pháp Sandwich-ELISA và RT-PCR một bước 38

3.2.1 Kết quả xét nghiệm mẫu bệnh sử dụng phương pháp Sandwich- ELISA 38

3.2.2 Sàng lọc mẫu bệnh bằng phương pháp RT-PCR 1 bước 39

3.3 Phân lập hệ gen của các mẫu SRBSDV 39

3.4 Phân lập phân đoạn S7 của SRBSDV thu thập từ mẫu lúa bệnh 41

3.5 Nhân bản phân đoạn S7 bằng phương pháp RT-PCR 43

3.5.1 Thiết kế đoạn mồi đặc hiệu cho phản ứng RT-PCR phục vụ nhân bản phân đoạn S7 43

3.5.2 Nhân bản phân đoạn S7 bằng phương pháp RT-PCR 43

3.7.1 Tạo plasmid tái tổ hợp PGEM-T/S7 biến nạp vào tế bào E.coli chủng DH5α 45

3.7.2 Kiểm tra sự có mặt phân đoạn S7 trong plasmid tái tổ hơ ̣p 47

3.7.2.1 Kiểm tra sự có mặt phân đoạn S7 trong plasmid tái tổ hơ ̣p bằng phản ứng PCR 47

3.7.2.2 Kiểm tra sự có mặt phân đoạn S7 trong plasmid tái tổ hơ ̣p bằng cách xử lí với enzyme cắt giới hạn EcoRI 49

3.8 Giải trình tự phân đoạn S7 của SRBSDV 50

3.9 Phân tích đa dạng di truyền phân đoạn S7 của các mẫu SRBSDV 52

3.9.1 So sánh trình tự phân đoạn S7 của các mẫu SRBSDV Việt Nam với các mẫu SRBSDV trên thế giới 52

3.9.2 Phân tích đặc điểm di truyền 55

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57

Kết luận 57

Kiến nghị 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

PHỤ LỤC 1 62

PHỤ LỤC 2 68

MỞ ĐẦU

Lúa (Oryza sativa L.) là cây lương thực quan trọng nhất ở Việt Nam, đồng thời

cũng là nguồn lương thực chính cho một nửa dân số thế giới Là nước xuất khẩu gạođứng thứ 2 trên thế giới, lúa gạo là nguồn thu ngoại tệ lớn nhất của nền nông nghiệpxuất khẩu Việt Nam và cũng là nguồn thức ăn chính của 90 triệu dân số trong nước

Tuy nhiên, sản xuất lúa gạo của Việt Nam đang phải đối mặt với nhiều tháchthức như (1) điều kiện bất lợi của môi trường do ảnh hưởng của hiện tượng biến đổikhí hậu toàn câu và (2) dịch bệnh do việc canh tác quá phụ thuộc vào thuốc hóa họcdẫn đến mất cân bằng sinh thái Trong điều kiện thích hợp, các tác nhân gây bệnh trênlúa có thể phát triển rất mạnh, làm giảm năng suất tới trên 85%, thậm chí mất trắng.Đây là một trong những nguyên nhân chính làm giảm năng suất, dẫn đến sản lượngnông nghiệp không ổn định và gây tình trạng mất an ninh lương thực

Trong số các tác nhân gây bệnh trên lúa, virus là mầm bệnh nguy hiểm nhất dokhả năng phát tán rất rộng, đồng thời rất khó kiểm soát Ở Việt Nam, virus gây ra một

số bệnh rất nguy hiểm, ảnh hưởng nghiêm trọng tới sản lượng lúa như bệnh vàng lùn,bệnh lùn xoắn lá, bệnh lùn sọc đen Trong các năm từ 2009 đến 2010, dịch bệnh lúalùn sọc đen lần đầu tiên bùng phát và gây hại tại 28 tỉnh miền Bắc và Trung với tổngdiện tích nhiễm bệnh lên tới cả trăm ngàn ha, gây thiệt hại lớn cho sản suất Nôngnghiệp Mặc dù, nguyên nhân gây bệnh bước đầu đã được xác định là virus gây bệnhlúa lùn sọc đen (SRBSDV) và dịch bệnh đến nay đã tạm thời lắng xuống nhưng diễnbiến gây bệnh vẫn tồn tại trong sản suất lúa Đặc biệt, virus SRBSDV là chủng viusmới xuất hiện nên tất cả các nghiên cứu như: (1) nguyên nhân gây bệnh, (2) đặc trưngsinh học, (3) dịch tễ bệnh và (4) phòng chống bệnh cần phải được nghiên cứu Thực tếcác nghiên cứu hiện tại vẫn đang tập trung vào việc hoàn thiện quy trình chẩn đoán, sau

đó áp dụng các biện pháp canh tác như nhổ bỏ cây bệnh, diệt trung gian truyền bệnh,trồng giống lúa kháng rầy, luân canh ; chưa có các nghiên cứu chuyên sâu về bản chất

hệ gene, mức độ đa dạng di truyền, mức độ đột biến, nguy cơ phát sinh chủng mới Vìnguy cơ phát dịch trở lại của loại virus này vẫn tiềm ẩn

Hệ gen của SRBSDV có chiều dài 29.124 bp, gồm 10 phân đoạn RNA sợi đôi,

có kích thước từ 1 đến 4,5 kb và được đặt tên theo thứ tự từ S1 đến S10 dựa vàokích thước phân đoạn RNA sợi đôi Phân đoạn S7 có chiều dài 2176 bp, chứa hai ORF

có chiều dài 1073 và 930 nucleotide Trong đó, ORF 7-1 chứa gen 7-1 quy định proteinP7-1 liên quan đến tính tương tác đặc hiệu với vector trung gian truyền bệnh là rầy

lưng trắng (Sogatella furcifera), do đó có vai trò quan trọng trong nghiên cứu tính đa

dạng di truyền và sự tiến hóa của virus

Dựa vào thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu đa dạng di truyền phân đoạn S7 của các chủng virus gây bệnh lúa lùn sọc đen” với

CHƯƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÁC VIRUS HẠI LÚA Ở VIỆT NAM

1.1.1 Các virus gây bệnh trên lúa

Virus là một trong những tác nhân gây bệnh nguy hiểm nhất và là nguyên nhân

chính làm sản lượng nông nghiệp không ổn định, gây ra tình trạng mất an ninh lương

thực Đặc biệt trong bối cảnh thay đổi khí hậu toàn cầu, cân bằng sinh thái bị phá vỡ doviệc canh tác quá phụ thuộc vào thuốc hóa học đã làm cho diễn biến phát sinh dịch và

mức độ gây hại của các bệnh virus càng trở nên nguy hiểm và phức tạp hơn lúc nào

hết Trong sản xuất nông nghiệp tổng cộng có 16 loại virus gây hại cho lúa (phụ lục 1)

và khoảng hơn 1000 loài virus gây hại cho thực vật và các loại cây nông nghiệp như

cây ngô, đậu tương…Trong số các virus hại lúa ngoài Rice hoja blanca virus (một

Ternuivirus, phân bố tại Nam Mỹ), Rice giallume virus (một Luteovirus, phân bố tại

châu Âu), Rice stripe necrosis virus (một Furovirus, phân bố tại châu Phi) thì 13 virus

còn lại đều phát hiện thấy tại các nước trồng lúa châu Á Tuy nhiên có 5 bệnh virus gâyhại nghiệm trọng và phổ biến nhất là: bệnh vàng lùn (bệnh lúa cỏ), bệnh lúa lùn xoắn

lá, bệnh Tungro, bệnh lúa sần lùn, bệnh vàng lá tạm thời.[17,24,26,23,34]

1.1.2 Tình hình nghiên cứu virus hại lúa ở Việt Nam

Việt Nam hiện có 12/16 loại vius gây hại trên lúa, các bệnh do vius gây ra thànhcác đợt dịch thường nối tiếp nhau ở các vùng trồng lúa khác nhau trên cả nước Tuy

nhiên, cho đến nay mới ghi nhận 5 loại bệnh virus gây thành dịch, bao gồm bệnh vàng lá diđộng, bệnh tungro, bệnh lúa cỏ, bệnh lúa lùn xoắn, bệnh lùn sọc đen phương Nam [15] Hiệnnay, virus gây bệnh vàng lụi lúa (Rice yellow stunt virus – RYSV) đang gây hại tại Bắc giang

và đang có nguy cơ thành dịch [14]

Các nghiên cứu về virus ở Việt Nam hiện mới tập trung ở khâu phát hiện sau đó

áp dụng các biện pháp canh tác như nhổ bỏ cây bệnh, diệt môi giới truyền bệnh, trồng

giống kháng rầy, luân canh… Một số cơ quan nghiên cứu như Viện Bảo vệ Thực vật vàTrường đại học Nông nghiệp Hà Nội đã hoàn thiện quy trình chẩn đoán dựa trên kháng

huyết thanh, RT-PCR và đã sản xuất đƣợc kháng huyết thanh cho virus vàng lùn và lùnxoăn lá, đã thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR phát hiện RGSV, RRSV,RBSDV, RSV, RTSV, SRBSDV [8, 13] Các nghiên cứu về quan hệ giữa virus vànglùn và lùn xoăn lá với rầy nâu, các loại rầy (rầy nâu, rầy nâu nhỏ và rầy lƣng trắng) vàbiện pháp phòng trừ môi giới truyền bệnh và bệnh virus hại lúa cũng đã đƣợc nghiêncứu khá đầy đủ và bài bản tại Viện Bảo vệ thực vật [7] Các nghiên cứu về virus hại lúatại Viện Di truyền Nông Nghiệp và Viện Công nghệ Sinh học lại tập trung vào cácnghiên cứu phân tử nhƣ giải trình tự gen, tạo giống chống chịu virus bằng Công nghệgen Hiện Viện Di truyền Nông Nghiệp đã đăng ký 14 trình tự gen của virus vàng lùn

và lùn xoăn lá lúa ở ngân hàng gen NCBI, đã xác định đƣợc các gen quan trọng và cácđoạn trình tự bảo thủ của các gen virus (không trùng lặp với trình tự gen của cây chủ),

đã thiết kế các vector RNAi mang gen có khả năng làm bất hoạt virus và đã nhận đƣợcmột số cây chuyển gen [5, 11] Gần đây, trong một hợp tác nghiên cứu với Trung tâmnghiên cứu Nông nghiệp quốc gia Nhật Bản, Viện Di truyền Nông Nghiệp đã sản suấtđƣợc 7 bộ kit chẩn đoán 7 virus lúa dựa trên kháng huyết thanh bao gồm: RGSV,RRSV, RBSDV, RSV, RTSV, RTBV, RDV và RGDV với số lƣợng đủ cho nghiêncứu, hợp tác và chẩn đoán [5]

Các tiến bộ trong nghiên cứu virus hại lúa ở Việt Nam trong thời gian qua làđáng ghi nhận nhƣng vẫn chƣa thể đáp ứng đƣợc với diễn biến phức tạp của dịch virushiện nay Vì vậy, chiến lƣợc nghiên cứu bệnh virus hại lúa trong giai đoạn hiện nay cầnphải có sự kết hợp hài hòa giữa nghiên cứu đối ứng và nghiên cứu dài hạn Nghiên cứuđối ứng tập trung vào khâu chỉ đạo sản suất và phát hiện nhanh tác nhân gây bệnh từ đóxây dựng các biện pháp phòng trừ hiệu quả, trong khi nghiên cứu dài hạn tập trung vàokhâu xác định bản chất hệ gen, mức độ đa dạng di truyền, tính độc và mức độ đột biến

để xác định danh tính tác nhân gây bệnh, hoàn thiện các quy trình chẩn đoán chính xác,nguy cơ phát sinh chủng mới và tiến tới các biện pháp phòng trừ hiệu quả tác nhân gâybệnh dựa trên công nghệ gen

1.2 BỆNH LÙN SỌC ĐEN PHƯƠNG NAM VÀ VIRUS SRBSDV

1.2.1 Giớ i thi ệ u chung v ề b ệ nh lùn s ọc đen phương Nam

1.2.1.1 Nguồn gốc phát sinh bệnh lùn sọc đen phương Nam.

Từ năm 2001, một bệnh lúa lùn mới đã xuất hiện trên lúa (Oryza sativa) tại

một số vùng thuộc tỉnh Quảng Đông và Hải Nam, phía Nam Trung Quốc Cây lúanhiễm bệnh thấp lùn, lá xanh đậm, ở mặt sau lá và các đốt thân xuất hiện các nốt sầnnhỏ Ban đầu, virus gây bệnh chỉ được coi như là một biến chủng của virus lùn sọc đen.Mãi tới gần đây, dựa vào các kết quả nghiên cứu về môi giới truyền bệnh, cấu trúc vàbản chất hệ gen virus, các nhà khoa học Trung Quốc đã kết luận nguyên nhân gây bệnh

là do 1 chủng virus mới với tên gọi virus lúa lùn sọc đen phương Nam Nhóm virusmới có môi giới truyền bệnh riêng biệt là rầy lưng trắng – một đặc điểm quan trọng và

khá đặc trưng cho các thành viên trong nhóm Fijivirus Hình dạng, kích thước và cấu

trúc đặc trưng của các tiểu thể virus dưới kính hiển vi điện tử có những đặc điểm rấtđặc trưng Toàn bộ trình tự gen của 2 biến chủng (Quảng Đông và Hải Nam) đã đượcxác định Các tính chất đặc trưng ở mức phân tử cho thấy trình tự gen cũng như trình tựaxit amin của 2 biến chủng này có độ tương đồng cao hơn hẳn so với sự sai khác giữa

các biến chủng của các thành viên khác trong nhóm Fijivirus và nằm trong khoảng sai

khác khi so sánh giữa các chủng với nhau Mặt khác, những khác biệt này lại gần gũi

hơn với Rice black streaked dwarf virus (RBSDV), Maize rough dwarf virus (MRDV)

và Mal de Rio Cuarto virus (MRCV) – các thành viên trong phân nhóm Fijivirus-2 của nhóm Fijivirus, so với các thành viên thuộc các phân nhóm khác Do đó, có thể nói

chính xác hơn rằng SRBSDV là 1 thành viên mới thuộc nhân nhóm 2 – cùng với

RBSDV, MRCV, MRDV, trong nhóm Fijivius, họ Reoviridae Việc đặt tên là lùn sọc

đen phương Nam là do nhóm virus này có sự tương đồng về triệu chứng bệnh trên câynhiễm, song virus lùn sọc đen tập trung chủ yếu ở phía Bắc Bán cầu trong khi virusSRBSDV mới chỉ ghi nhận ở các tỉnh phía Nam Trung Quốc [25,24,18] Ngoài lúa vàngô, virus SRBSDV cũng được xác định có thể nhiêm tư ̣ nhiên trên 3 loài cỏ dại là cỏ

̣ ̣

lồng vưc̣ (Echinochloa crusgalli), cỏ đuôi voi (Pennisetum flaccidum) và Juncellus

serotinus có mặt trong hoặc xung quanh ruộng lúa nhiễm bệnh [7,42,22].

1.2.1.2 Diễn biến bệnh lúa lùn sọc đen tại Việt Nam

Vào cuối tháng 8/2009, tại Nghệ An , mô ̣t bê ̣nh la ̣ (bê ̣nh lùn lu ̣i ) đã xuất hiê ̣ntrên diê ̣n rô ̣ng trên lú a mùa với tổng diê ̣n tích nhiêm bê ̣nh lên tới 5.506 ha, trong đógần 3.510 ha bị mất trắng Cây bê ̣nh bi ̣lùn ma ̣nh , lá xanh đậm , nhiều lá bi ̣xoắn vă ̣n ,sau biến vàng, trỗ không thoát Triê ̣u chứng cây bê ̣nh khá giống với bê ̣nh lùn xoắn látại miền Nam Tất cả các giống gieo trồng ta ̣i Nghê ̣ An (TH3-3, Nhị ưu 838, Bio404,Bắc thơm số 7, Khang dân 18 và Hương thơm ) đều bị nhiễm bệnh [9] Cho tới giữatháng 9, mô ̣t số đia phương ta ̣i miền Bắc như Nam Đinh , Thái Bì nh cũng thông báodịch bệnh tương tự [2]

Báo cáo tại cuộc họp do bô ̣ Nông Nghi ệp và Phát Triển Nông Thôn

(NN&PTNT) chủ trì ngày 23/9 cho biết từ ngày 16-19/9, Cục Bảo Vệ Thực Vật

(BVTV) đã kiểm tra và lấy mẫu tại một số tỉnh ở miền Bắc Cục đã phát hiện 5 tỉnh códiện tích lúa nhiễm bệnh gồm Ngh ệ An, Thanh Hóa, Nam Định, Thái Bình và Ninh

Bình với trên 13 nghìn ha lúa nhiễm bệnh, trong đó hơn 8 nghìn ha bị bệnh rất nặng, cókhả năng mất trắng [3]

Để làm rõ nguyên nhân gây bê ̣nh t ại Nghệ An, đặc biệt khi bệnh đang đượcliên tu ̣c báo cáo xuất hiê ̣n ta ̣i nhiều tin̉ h miền Bắc , ngày 4/9/2009, Bộ NN &PTNT đãtổ chức hô ̣i thảo khẩn cấp về nguyên nhân gây bê ̣nh ta ̣i Nghê ̣ An do đích thân Bô ̣trưởng Cao Đức Phát chủ trì với sư ̣ tham gia của các chuyên gia đầu ngành cả nước vàTiến sĩ Rogelio , chuyên gia về bê ̣nh virus lúa của Viê ̣n nghiên c ứu lúa quốc tế (IRRI).Dưạ chủ yếu vào triê ̣u chứng quan sát bê ̣nh trên thưc̣ điạ và ý kiến chuyên gia , hô ̣i nghi ̣kết luâ ̣n bê ̣nh lúa lùn lu ̣i ta ̣i Nghê ̣ An là do 2 virus gây bê ̣nh vàng lùn / lùn xoắn lágiống như ở miền Nam với vector truyền bê ̣nh là rầy nâu Các kết quảxét nghi ệmELISA trên các mâũ rầy nâu thu thâ ̣p đươ ̣c thử nghiê ̣m ta ̣i IRRI và Trung tâm BVTVphía Nam , Bô ̣ NN &PTNT và Cục BVTV v ẫn kết luâ ̣n nguyên nhân gây bê ̣nh lúa lùnlụi ở miền Bắc là do 2 virus vàng lùn và lùn xoắn lá và do rầy nâu lan truyền [4]

Trong tháng 9, 10 năm 2009, các hoạt động nghiên cứu nhằm xác đin h tác nhângây bê ̣nh đã đươ ̣c thưc̣ hiê ̣n tić h cưc̣ ta ̣i các cơ quan như Viê ̣n BVTV , Cục BVTV ,Trường ĐHNN Hà Nô ̣i và Viê ̣n Nghiên c ứu lúa quốc tế (IRRI) Kết quả nghiên cứu đãxác định tác nhân gây bê ̣nh lùn l ụi lúa tại Nghệ An và các tỉnh phía bắc trong vụ mùa

2009 là do SRBSDV [9] Ngay sau khi tác nhân gây bệnh được xác định, Bộ

NN&PTNT đã thành lập ban chỉ đạo phòng chống dịch lùn sọc đen do thứ trưởng Bùi

Bá Bổng làm trưởng ban chỉ đạo

Trong vụ mùa 2010, cũng theo thông báo của Cục BVTV, tính đến tháng 10,bệnh lùn sọc đen cũng vẫn phát sinh gây hại tại 28 tỉnh/thành tổng diện tích bị nhiễmtính từ đầu vụ là 24.000 ha, trong đó diện tích phải nhổ tỉa là 9.000 ha và phải tiêu hủy

là 1.700 ha Các tỉnh có xuất hiện bệnh lùn sọc đen bao gồm:

+ Bắc Bộ (19 tỉnh): Bắc Kạn, Lào Cai, Yên Bái, Lai Châu, Lạng Sơn, Sơn La,Bắc Giang, Hải Dương, Điện Biên, Thái Bình, Ninh Bình, Bắc Ninh; Hải Phòng, HòaBình, Nam Định, Quảng Ninh, Hưng Yên, Cao Bằng và Hà Nam

+ Bắc Trung Bộ (6 tỉnh): Nghệ An, Thừa Thiên Huế, Quảng Bình, Quảng Trị,

Hà Tĩnh và Thanh Hóa

+ Duyên Hải Nam Trung Bộ (3 tỉnh): Quảng Nam, Quảng Ngãi và Đà Nẵng.Đến năm 2013, bệnh lùn sọc đen đã tạm thời lắng xuống, chỉ còn rải rác ở mộtvài tỉnh thành Tuy nhiên, bệnh vẫn chưa được phòng trị hoàn toàn, có nhiều khả năngtái bùng phát thành dịch

1.2.2 Đặc điể m b ệ nh h ọc của b ệ nh lùn s ọc đen phương Nam

1.2.2.1.Dấu hiệu nhận biết

Biểu hiện bệnh của cây lúa nhiễm virus SRBSDV rất giống với biểu hiện củabệnh lùn sọc đen do virus RBSDV gây ra Triệu chứng chung của lúa nhiễm bệnh baogồm: cây lúa tương đối thấp lùn, lá xanh đậm, lá bị xoăn ở đầu lá hoặc toàn bộ lá, ráchmép lá và đặc biệt có những u sáp màu trắng đến đen chạy dọc các đường gân ở mặtsau lá, bẹ lá hoặc các đốt thân Các u sáp này được hình thành do sự phát triển vượt trội

cả về số lượng và kích thước của mô mạch dẫn nhựa Khi cây còn non gân chính trên

bẹ lá cũng bị sưng phồng Từ giai đoạn làm đòng và khi có lóng, cây bị bệnh thườngnảy chồi trên đốt thân và mọc nhiều rễ bất định Trên bẹ và lóng thân xuất hiện nhiều usáp và sọc đen (rất dễ nhận thấy u sáp khi dùng tay vuốt nhẹ thân) Cây lúa bị bệnhnặng không trổ bông được hoặc trổ bông không thoát, hạt thường bị đen [11] (Hình 1)

Hình 1: Cây lúa bị nhiễm bệnh lùn sọc đen phương Nam[11]

1.2.2.2 Vector truyền bệnh

Vector chính truyền bệnh lùn sọc đen phương nam là rầy lưng trắng (Sogatella

furcifera) Cả rầy non và rầy trưởng thành đều có khả năng truyền bệnh Rầy lưng

trắng sau khi đã chích hút nhựa cây bị bệnh mang virus có thể truyền virus gây bệnhđến khi chết Một nghiên cứu về phương thức lan truyền bệnh lùn sọc đen phương nam

ở lúa đã được tiến hành nhằm đánh giá khả năng lan truyền virus SRBSDV qua vector

đã được thực hiện trên 3 loài rầy là rầy lưng trắ ng (Sogatella furcifera), rầy nâu

(Nilaparavata lugenes) và rầy nâu nhỏ (Laodelphax striatellus) Kết quả cho thấy cả

rầy lưng trắng và rầy nâu nhỏ đều có khả năng truyền SRBSDV từ lúa sang lúa vớihiê ̣u quả truyền rất cao (100 % cây nhiêm bê ̣nh với chỉ 3 – 4 rầy/cây) Tuy nhiên, chỉ

có rầy lưng trắng (Hình 2) mới có khả năng truyền SRBSDV từ lúa sang ngô Nghiêncứu này cũng cho thấy rầy nâu không thể truyền đươ ̣c SRBSDV [36,38,39].

Rầy cánh dài Rầy cánh ngắn

Hình 2: Rầy lưng trắng Sogatella furcifera truyền virus SRBSDV[11]

Rầy lưng trắng gây hại cùng với rầy nâu nhỏ, nhưng trong cùng một lứa thì rầylưng trắng phát sinh rộ sớm hơn Rầy lưng trắng thường có mật độ cao, gây hại nặngvào giai đoạn lúa làm đòng Cũng như rầy nâu, rầy lưng trắng thích hợp với điều kiệnkhí hậu ấm nóng, ẩm độ cao, mưa nắng xen kẽ Ở vùng Đồng bằng sông Hồng, mộtnăm có 6-7 lứa rầy, quan trọng nhất là lứa rầy vào tháng 4 (vụ xuân) và cuối tháng 8đầu tháng 9 (vụ mùa) Vụ xuân thường gây hại nặng hơn vụ mùa Rầy lưng trắng hạinặng trên các giống lúa nhiễm rầy, lúa lai; nếu thâm canh cao, bón nhiều đạm, ruộnglúa cấy dày, rậm rạp là điều kiện cho rầy lưng trắng phát sinh, phát triển Rầy lưngtrắng phân bố rộng rãi trên khắp các vùng trồng lúa của Việt Nam và trên thế giới, cókhả năng du nhập và di chuyển rất cao [7]

Một nghiên cứu về đặc tính lây truyền SRBSDV của rầy lưng trắng Sogatella

furcifera đã được các nhà khoa học Trung Quốc thực hiện nhằm xác định các giai đoạn

phát triển của bệnh cũng như tìm phương pháp kiểm soát bệnh hiệu quả nhất Bằngphương pháp RT-PCR, các nhà khoa học đã xác định được sự có mặt của virus

SRBSDV trong tất cả các giai đoạn phát triển khác nhau của S furcifera, bao gồm cả giai đoạn ấu trùng, rầy cánh dài và rầy cánh ngắn S furcifera khi đã nhiễm virus

SRBSDV sẽ có khả năng truyền virus cho cây lúa trong suốt vòng đời còn lại Tuy

nhiên, virus SRBSDV không truyền qua giai đoạn trứng Mỗi cá thể rầy S furcifera

mang virus SRBSDV trung bình có thể lây nhiễm cho 48-50 cây lúa, tối đa là 87-90cây lúa Thời gian tối thiểu và tối đa để rầy nâu lưng trắng truyền virus cho cây lúa non

tương ứng là 5-7 phút và 10-12 phút, tùy theo từng giai đoạn phát triển của rầy Kếtquả nghiên cứu cũng chứng tỏ giai đoạn lúa non là giai đoạn dễ bị nhiễm virus

1.2.3 Đặc điểm sinh học của virus SRBSDV

1.2.3.1 Phân loại

Dựa trên các phân tích phân tử, virus SRBSDV được xếp là một thành viên

mới của phân nhóm Fijivirus-2, thuộc ho ̣ Reoviridae.

Họ Reoviridae: Các virus thuộc họ Reoviridae (được gọi chung là các Reovirus)

được đặc trưng bởi có bộ gene RNA sơ ̣i kép (dsRNA), phân đoạn bao gồm 10 đến 12phân tử RNA sợi kép mạch thẳng Tất cả các phân tử RNA đều được lắp ráp trong cùng

một phân tử virus hình cầu Họ Reoviridae là một họ đa dạng về ký chủ Trong số 12

chi của họ, có tới 8 chi hại người và động vật, một chi hại nấm và 3 chi gây hại thực

vật là (1) Phytoreovirus (ví dụ virus lúa lùn RDV (Rice dwarf virus)), (2) Oryzavirus (ví dụ virus lúa lùn xoắn lá RRSV (Rice ragged stunt virus), (3) Fijivirus (ví dụ virus lúa lùn sọc đen RBSDV (Rice black streaked dwarf virus))[30].

Chi Fijivirus: Các virus thuộc chi Fijivirus được đặc trưng bởi có phân tử virus

hình khối đa diện đối xứng 20 mặt (icosahedral) và nhìn dưới kính hiển vi điện tử códạng hình cầu, kích thước 65-70 nm Phân tử virus có cấu trúc phức tạp, gồm 2 lớp vỏ(với lớp vỏ ngoài có số tam giác T = 13 còn lớp vỏ trong có T = 2) Trên bề mặt phân

tử, ở mỗi lớp vỏ đều có 12 gai vỏ (Hình 3)

Tất cả các Fijivirus đã biết đều có b ộ gen phân đoạn gồm 10 phân tử RNA sợi

kép, mạch thẳng Các phân tử RNA này có kích thước dao đô ̣ng từ 1,4 kb đến 4,5 kb vàđươ ̣c đă ̣t tên lần lươ ̣t từ S 1 đến S 10 theo tốc đô ̣ di chuyển khi đi ện di PAGE(Polyacrylamide) Các phân tử RNA genome đều mã hóa cho 1 gen, ngoại trừ phânđoạn 7 và 9 mã hóa 2 gen (Hình 4) [30].

Hình 3.Cấu trúc phân tử các Fijivirus [30]

Đối với các Fijivirus, phần lớn chức năng của các gen chưa được nghiên cứu

ngoại trừ gen VP10 (trên phân đoạn S10) mã hóa protein tạo gai vỏ của virus và VP1(trên phân đoạn S1) mã hóa cho protein tái bản của virus là RdRp (RNA dependentRNA polymerase) [30]

Hình 4.Tổ chức bộ gen của các Fijivirus [30]

Chi Fijivirus là 1 trong 3 chi gây hại thực vật thuộc họ Reoviridae Hiện nay, chi

Fijivirus được ghi nhận gồm 9 loài trong đó Fiji disease virus (FDV) là loài điển hình.

Ngoài ra, căn cứ vào mức đồng nhất của bộ gen, các Fijivirrus lại được chia thành 5

1.2.3.2 Đặc điểm hình thái của SRBSDV

Virus SRBSDV có hình thái điển hình của chi Fijivirus là dạng hình cầu đa diện đốixứng icosahedral [38] Đường kính lớp vỏ ngoài là ~ 70 nm, trên bề mặt vỏ ngoài có 12gai ngắn gắn trên 12 đỉnh của hình đa diện icosahedra kiểu T=13 Hình đa diện

icosahedra T=13 cấu tạo từ 60 mặt tam giác, mỗi mặt tam giác là 13 phân tử protein,tạo thành 12 pentamer tương đương với 120 capsomer lục giác (Hình 5) [15]

Hình 5:Cấu trúc hình đa diện kiểu icosahedral T=13 [ 41]

1.2.3.3 Đặc điểm di truyền của virus SRBSDV

Theo một nghiên cứu về SRBSDV gây bệnh ở tỉnh Quảng Đông, Trung Quốc, virus

SRBSDV là một thành viên mới của phân nhóm Fijivirus-2, thuộc ho ̣ Reoviridae Hệ

gen có chiều dài 29124 bp, gồm 10 phân đoạn RNA sợi đôi, có kích thước từ 1,8 đến4,5 kb và được đặt tên theo thứ tự từ S1 đến S10 dựa vào kích thước phân đoạn RNAsợi đôi (Hình 6) Phân đoạn S1 có chiều dài 4500 bp, mã hóa một polypeptide (chứacác vùng chức năng của enzym RNA polymerase) có trọng lượng phân tử 169 kDa.Phân doạn S2 có chiều dài 3815 bp, chứa một ORF mã hóa một protein vỏ virus cótrọng lượng phân tử 141 kDa (chưa xác định rõ chức năng) Phân đoạn S3 có chiều dài

3618 bp, chứa một ORF mã hóa một protein có trọng lượng phân tử 141 kDa (chưa xácđịnh rõ chức năng) và có điểm đẳng điện Pi là 5,96 Phân đoạn S4 có chiều dài 3618

bp, chứa một ORF mã hóa một protein có vùng trình tự từ acid amin 608 – 786 tươngđồng 22 – 25% với các thành viên khác của reovirus Phân đoạn S5 có chiều dài 3167

bp, chứa một ORF chính và một ORF mã hóa một protein (chưa xác định rõ chứcnăng) trọng lượng phân tử 24 kDa chồng lên ORF chính Phân đoạn S6 có chiều dài

2651 bp, mã hóa một protein có trọng lượng phân tử 90 kDa và có điểm đẳng điện4,89 Đây là phân đoạn có sự khác biệt lớn nhất về trình tự nucleotide so với các thành

viên trong phân nhóm Fijivirus-2 (70,6% tương đồng so với RBSDV và 62,4% tương

đồng so với MRCV) Phân đoạn S7 có chiều dài 2176 bp, chứa hai ORF có chiều dài

1073 và 930 nucleotide mã hóa hai protein có trọng lượng phân tử tương ứng là 40,5kDa và 36,4 kDa Phân đoạn S8 có chiều dài 1928 bp, chứa một ORF có chiều dài

1776 nucleotide mã hóa protein có trọng lượng phân tử tương ứng là 67.9 kDa Phânđoạn S9 có chiều dài 1899 bp, chứa hai ORF có chiều dài 1044 và 630 bp, mã hóa haiprotein có trọng lượng phân tử tương ứng là 39,9 kDa và 24,2 kDa Phân đoạn S10 cóchiều dài 1797 bp, chứa một ORF có chiều dài 1674 nucleotide mã hóa protein hiǹ hthành lớp vỏ ngoài của phân tử virus có tr ọng lượng phân tử tương ứng là 62,6 kDa và36,4 kDa [37,22] Trong một nghiên cứu khác, hệ gen virus SRBSDV gây bệnh trênlúa ở tỉnh Hải Nam Trung Quốc đã được phân lập và giải trình tự Kết quả là trình tựnucleotide của hai phân đoạn S9 và S10 có độ tương đồng 98-99% so với chủng QuảngĐông [22] Nếu so sánh toàn bộ hệ gen thì hai chủng virus SRBSDV ở Quảng Đông vàHải Nam có độ tương đồng >97% Nếu so sánh với các thành viên của phân nhóm

Fijivirus-2, hai chủng virus này chỉ có độ tương đồng ở mức độ amino acid là 77-78%

so với RBSDV, 65% so với MRCV và 44% so với Fiji disease virus (FDV) [23] Như

vậy sau 25 năm kể từ khi dịch virus lùn sọc đen bùng phát lần cuối cùng tại TrungQuốc vào năm 1975, trình tự nucleotid của hệ gen virus lùn sọc đen đã thay đổi hơn20%

Hình 6: Ảnh điện di 10 phân đoạn RNA sợi đôi của virus SRBSDV trên gel

polyacrylamide 12,5%[37].

1.2.3.4 Đặc điểm phân đoạn S7 và khả năng tiến hóa của SRBSDV

SRBSDV là một thành viên mới của phân nhóm Fijivirus-2, thuộc ho ̣ Reoviridae.

Hệ gen có chiều dài 29124 bp, gồm 10 phân đoạn RNA sợi đôi, có kích thước từ 1,8đến 4,5 kb và được đặt tên theo thứ tự từ S1 đến S10 dựa vào kích thước phân đoạnRNA sợi đôi [17] Phân đoạn S7 có chiều dài 2176 bp, chứa hai ORF không chồng gốilên nhau: ORF 7-1 có chiều dài 1073 và ORF 7-2 có chiều dài 930 nucleotide lần lượt

mã hóa hai protein có trọng lượng phân tử tương ứng là 40,5 kDa và 36,4 kDa [33].Phân đoạn S7 có phần không dịch mã ở đầu 5„ dài 40bp, phần không dịch mã ởđầu 3„ dài 81bp và vùng intron dài 51bp, trình tự bảo thủ ở hai đầu S7 là 5‟-

AAGTTTTT và CAGCTGATGTC-3„ Ngoài ra, SRBSDV tồn tại đặc điểm đặc trưng

cho chi Fijivirus, sát những vùng bảo thủ này tồn tại những đoạn lặp lại liền kề, ở phân

đoạn S7 chúng tồn tại ở những trình tự 5′-TTTCGACCT……AGGTCGA AA-3′[36,38,39]

Một nghiên cứu về các chủng SRBSDV được phát hiện trên các mẫu bệnh ởSơn Đông, Quảng Đông và Hải Nam, Trung Quốc cho thấy có sự tương đồng lớn giữahai ORF của phân đoạn S7 ở SRBSDV với phân đoạn tương ứng của FDV, OSDV,NLRV, MRCV, MRDV và RBSDV Đặc biệt, ORF 7-1 của phân đoạn S7 ở SRBSDV

có mức độ tương đồng trung bình với các virus trên lớn hơn hẳn so với bất kì phânđoạn nào còn lại, lớn nhất là 81% amino acid tương đồng với RBSDV [34,36,37] Điềunày cho thấy có sự liên hệ giữa phân đoạn S7, đặc biệt là ORF 7-1 với khả năng tiếnhóa của SRBSDV [33]

Trong hai gen của phân đoạn S7, một nghiên cứu gần đây cho thấy, gen 7-1 mãhóa cho protein P7-1 chịu trách nhiệm tạo thành các cấu trúc ống (tubular) cho phép

virus di chuyển qua tế bào biểu mô ruột của vector truyền bệnh (rầy Sogatella

furcifera) [25,28] Các protein P7-1 được tìm thấy dày đặc trong các cấu trúc ống ở bề

mặt tế bào Sogatella furcifera mang virus và gen 7-1 cũng có chức năng giúp các

protein này tự lắp ráp tạo thành các cấu trúc ống (tubular) [34] (Hình 7) Điều này chothấy gen 7-1 mã hóa cho protein P7-1 liên quan đến tính tương tác đặc hiệu với vector

trung gian truyền bệnh là rầy lưng trắng (Sogatella furcifera), do đó có vai trò quan

trọng trong sự tiến hóa của virus

Hiện nay, chức năng của gen 7-2 ở SRBSDV chưa được công bố Tuy nhiên, một

nghiên cứu về RBSDV, họ hàng gần với SRBSDV, trên vật chủ là cây ngô (Zea mays)

cho th ấ y gen 7- 2 quy định protein P7-2 có khả năng tương tác với một tiểu đơn vị lõicủa SCF ubiquitin ligase trong phức hợp SCF [32], có chức năng quan trọng trong chutrình tế bào và chịu trách nhiệm chỉ định tiêu hủy nhiều loại protein [31] Chức năngnày ở SRBSDV cần được nghiên cứu xa hơn để làm rõ vai trò của gen trong sự tiếnhóa của virus

Hình 7: Sự xuất hiện của protein P7-1 trong tế bào vector truyền bệnh

(rầy Sogatella furcifera) dưới kính hiển vi điện tử [34]

1.2.3.4 Chuẩn đoán virus SRBSDV.

Việc phát hiện bệnh lùn sọc đen phương Nam khi gieo trồng lúa không quá khókhăn do cây lúa bệnh có biểu hiện khá rõ Tuy nhiên, việc phân biệt bệnh do virusSRBSDV và bệnh do RBSDV rất khó thực hiện bằng cách quan sát hình thái bênngoài, do cả 2 bệnh đều có chung những đặc điểm về triệu chứng bệnh Cho đến nay,công tác chẩn đoán bê ̣nh virus trên lúa nhiǹ chung v ẫn khá phức ta ̣p Hiê ̣n nay , kỹ

thuâ ̣t chẩn đoán bê ̣nh virus phổ biến nhất vâñ là phương pháp ELISA và phản ứ ngtrùng hợp chuỗi (RT-PCR và PCR).

Theo công bố mới nhất năm 2012, Zhenchao Wang và cộng sự đã phát triển mộtphương pháp phát hiện nhanh virus SRBSDV trong mẫu lúa nhiễm bệnh, sử sụng kĩthuật DOT-ELISA Phương pháp của Z.Wang sử dụng loại kháng thể đa dòng đặc hiệucho protein vỏ của viurs SRBSDV (mã hóa bởi phân đoạn S10) để phát hiện sự có mặtcủa SRBSDV trong mẫu lúa bệnh Kết quả xét nghiệm trên 100 mẫu lúa bằng phươngpháp này cho kết quả tương đồng với kết quả xét nghiệm bằng phương pháp RT-PCR(Hình 8) Phương pháp DOT-ELISA này khắc phục được những nhược điểm của

phương pháp xét nghiệm truyền thống bằng RT-PCR, đồng thời vẫn có độ chính xáccao, cho phép phát hiện sớm virus SRBSDV [11]

Hình 8: Xét nghiệm virus SRBSDV bằng phương pháp DOT-ELISA[11]

1.2.4 Tình hình nghiên c ứ u b ệ nh lùn s ọc đen phương Nam và virus SRBSDV ở Việ t Nam

1.2.4.1 Các nghiên cứu xác định virus SRBSDV

Ngày 27/9/2009, Trung tâm Bệnh cây nhiệt đới (ĐH Nông Nghiệp Hà Nội) đãnhâ ̣n đươ ̣c yêu cầu của Trung tâm Kiểm dịch sau nhập khẩu 2 (thuô ̣c Cu ̣c BVTV ) yêucầu thử các m ẫu lúa thu thâ ̣p ta ̣i Nghê ̣ An (60 mâũ ) Các thử nghiệm ELISA với kháng

Tuy nhiên khi chuẩn bi ̣mâũ bê ̣nh cho kiểm tra ELISA , nhóm nghiên cứu đãquan sát thấy 2 đă ̣c điểm không bình thường (ngoài các đặc điểm giống như cây bi ̣

bê ̣nh lùn xoắn lá lá bi ̣nhiêm bởi virus Rice ragged stunt virus (RRSV) ở miền Nam

như cây lùn, lá xanh đậm, ngọn lá xoắn vặn):

(1) Cây bê ̣nh không biểu hiê ̣n triê ̣u chứng táp và biến vàng ta ̣i mô ̣t bên của mép lá

ở các lá bi ̣xoắn vă ̣n Đây là mô ̣t triê ̣u chứng luôn đươ ̣c quan sát thấy trên cây bi ̣bê ̣nhlùn xoắn lá bị nhiễm bởi virus RRSV

(2) Có nhiều nốt phồng nhỏ màu trắng tới nâu chạy dọc gân của thân cây lúa sau khibóc lớp bẹ bên ngoài Các nốt phồng này đặc biệt nhiều ở phần lóng sát gốc

Các mẫu được thu thập tiếp theo tại Nam Định , Thanh Hóa , Sơn La cũng đều cótriê ̣u chứng tương tư ̣ mâũ Nghê ̣ An

Dưạ trên 2 triê ̣u chứng trên , đă ̣c biê ̣t là triê ̣u chứng thứ 2, tác nhân gây bệnh đãđươ ̣c dư ̣ đoán là do mô ̣t reovirus (họ Reoviridae) gây ra Các triệu chứng này khá

giống với 2 reovirus là Rice black streaked dwarf virus (RBSDV) và Southern rice

black streaked dwarf virus (SRBSDV) = Rice black streaked dwarf virus 2 (RBSDV2).

Để kiểm tra liê ̣u mâu lúa bê ̣nh miền Bắc có bi ̣nhiêm RBSDV và SRBSDV hay không ,

mô ̣t că ̣p mồi cho phép phát hi ện đồng thời cả 2 virus này đã đươ ̣c thiết kế dưạ trênvùng bảo thủ gene S10 của tất cả các chủng sẵn có của 2 virus trên Ngân hàng gen

Kết quả kiểm tra RT -PCR cho thấy các mâũ bê ̣nh thu thâ ̣p ta ̣i Nghê ̣ An và mô ̣t sốđia phương miền Bắc như Thanh Hóa , Nam Đinh , Sơn La đều cho phản ứng RT -PCRdương đối với mồi đă ̣c hiê ̣u RBSDV và SRBSDV nhưng không phản ứng với mồi đă ̣chiê ̣u virus lùn xoắn lá (RRSV)

Bốn sản phẩm RT -PCR đa ̣i diê ̣n cho Nghê ̣ An , Nam Đinh , Thanh Hóa và Sơn

La đã đươ ̣c giải triǹ h tư ̣ trưc̣ tiếp Kết quả phân tić h triǹ h tư ̣ và ph ả hệ cho thấy cả 4mâũ này đều là virus lùn s ọc đen phương Nam (SRBSDV) Ngoài ra, nghiên cứu hiển

vi điện tử cũng phát hiện thấy phân tử virus và thể vùi của virus trong mô cây lúa bịbệnh.Dưạ trên kết quả nghiên cứu này, Trung tâm đã bước đầu kết luâ ̣n bê ̣nh lúa lùn lu ̣itại miền Bắc là do virus lùn sọc đen phương Nam (SRBSDV) gây ra [18,25,19,17].

Trong cùng thời gian, các nghiên cứu tương tự cũng được tích cực thực hiện tạiViện Bảo Vệ thực vật (BVTV) Nhóm nghiên cứu Viện Bảo Vệ thực vật cũng hợp tácchặt chẽ với chuyên gia Trung Quốc và Pháp để xác định tác nhân gây bệnh dựa trênRT-PCR, giải trình tự sản phẩm PCR và hiển vi điện tử

Căn cứ vào đặc điểm triệu chứng bệnh trên cây, đặc điểm hình thái, kích thướctiểu thể virus trên kính hiển vi điện tử và kết quả lây bệnh nhân tạo nhằm khẳng địnhnguyên tắc Koch, cũng như giải trình tự sản phẩm PCR trên phân đoạn S10 và S3 của

hệ gene virus, nhóm nghiên cứu Viện BVTV cũng xác định tác nhân gây bệnh là viruslùn sọc đen phương Nam (SRBSDV)[10]

Ngoài ra, các nghiên cứu lan truyền thực hiện tại Viện Bảo vệ Thực vật cũngxác định được môi giới truyền bệnh là rầy lưng trắng giống như nghiên cứu của các tácgiả Trung Quốc

Dựa vào các nghiên cứu trên, Bộ NN & PTNT thống nhất gọi lại tên bệnh tạiViệt Nam là bệnh lùn sọc đen (LSĐ) và virus gây bệnh là virus lùn sọc đen phươngNam (SRBSDV)

1.2.4.2 Các nghiên cứu xây dựng quy trình chẩn đoán virus SRBSDV

Năm 2010, Viện Bảo vệ Thực vật đã nghiên cứu phát triển quy trình chẩn đoánSRBSDV bằng phương pháp PCR/RT-PCR Quy trình bao gồm các bước: Giải trình tựsản phẩm PCR vùng gen bảo thủ có chiều dài 600 bp và phân tích trình tự gen sử dụngchức năng BLAST trong ngân hàng gen để xác định độ tương đồng với tất cả các trình

tự nucleic acid hiện có trong ngân hàng gen Sau đó, gia phả trình tự gene thu đượcđược phân tích bằng phần mềm MEGA-4.1 với trình tự gen tương ứng của các virus có

độ tương đồng cao nhất cũng như các virus có cùng nhóm hoặc cùng phân nhóm và cácvirus thuộc nhóm hay phân nhóm khác cùng họ[6]

Từ năm 2012 đến nay, Bộ môn Bệnh học Phân tử thực vật - Viện Di truyềnNông nghiệp và Trung tâm bệnh cây nhiệt đới - Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã phânlập và giải trình tự toàn bộ phân đoạn S7, S9 và S10 của 13 chủng SRBSDV đại diệncho các vùng sinh thái trồng lúa từ miền Trung trở ra Trên cơ sở phân tích trình tự hệgene phân đoạn S10 của các chủng vius đã thiến kế cặp mồi đặc hiệu cho chủng

SRBSDV ở Việt nam và phát triển quy trình chẩn đoán dựa trên kỹ thuật RT-PCR.Nghiên cứu đã tối ưu hóa được phương pháp tách chiết RNA tổng số, thiết kế được cặpmồi đặc hiệu dùng trong chẩn đoán SRBSDV, tối ưu được loại mẫu và vị trí xét

nghiệm, tối ưu loại phản ứng RT-PCR dùng trong xét nghiệm SRBSDV và thời gianRT-PCR tương ứng [5,12] Ngoài ra, nhóm nghiên cứu cũng đã nghiên cứu cơ sở khoahọc của việc chẩn đoán SRBSDV bằng kỹ thuật kháng nghuyên kháng thể và đã (1) tạomẫu nhiễm bệnh, tinh sạch phân tử virus từ mẫu nhiễm bệnh và tạo thành công khángthể đa dòng SRBSDV và (2) tinh sạch và biểu hiện thành công protein vỏ P10, 2

polypeptide P1 và P2 trên protein P10 phục vụ cho việc tạo kháng thể đặc hiệu [5]

CHƯƠNG II - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Mẫu lúa

Tổng số 51 mẫu lúa bệnh có những đặc điểm nhiễm bệnh điển hình của bệnh lúalùn sọc đen như cây lúa lùn, lá vặn xoắn, gốc thân có nốt, vết sần mầu trắng đến đen đại diện cho các vùng sinh thái trồng lúa khác nhau của Việt Nam như: (1) đồng bằngBắc bộ, (2) Hà Nội và các tỉnh vùng ven, (3) Trung du và miền núi phía Bắc, (4) cáctỉnh Bắc Trung bộ và (5) các tỉnh Duyên hải Miền Trung được thu thậpphục vun chonghiên cứu

2.1.2 Hóa chất

Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu gồm có:

- Các cặp oligo nucleotide sử dụng làm mồi trong phản ứng PCR nhân bản trình

tự S7 của SRBSDV do Bộ môn Bệnh học phân tử thực vật, Viện Di truyền Nông

nghiệp (Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam) thiết kế dựa trên trình tự S7 đã đượccông bố trên Ngân hàng gen Thế giới (mã số EU 784841)

- Các cặp oligo nucleotide sử dụng làm mồi trong phản ứng RT-PCR một bướcnhằm xét nghiệm sự có mặt của SRBSDV được thiết kế theo nghiên cứu của Zhou và

1 bước; pJet1.2 cloning kit và first strand cDNA kit của Fermentas

- Các enzyme dùng trong nghiên cứu gồm: Dream Taq DNA polymerase, T4DNA ligase (Thermo Scientific)…

Tên mồi Trình tự mồi

Bảng 1:Trình tự các cặp oligo nucleotide sử dụng trong nghiên cứu.

- Các hóa chất và d ụng cụ tiêu hao khác dùng trong nghiên cứu: bột celluloseCF11, SDS , Phenol, ống PCR 0,2 ml, đầu tip 2, 20, 200 và 1000 µl, chày cối sứ đạttiêu chuẩn cho Sinh học Phân tử

2.1.3 Thiết bị

Các thiết bị dùng trong nghiên cứu gồm: Máy PCR 9700 của hãng AppliedBiosystem, hệ thống điện di DNA của hãng Biorad, máy ly tâm Universal 30RF củahãng Hettich, Biofuge 28RS của hãng Heraus, máy chụp ảnh huỳnh quang Firereadercủa hãng UVItec, máy giải trình tự ABI 3100,

2.2 PHƯƠNG PHÁP

2.2.1 Thu mẫu

Những mẫu có triệu chứng nhiễm bệnh đặc trưng (như cây lùn, lá xanh đậm,xoắn đầu lá, rách mép lá và đặc biệt có những u sáp màu trắng đến đen chạy dọc cácđường gân ở mặt sau lá, bẹ lá hoặc các đốt thân) được thu thập trên đồng ruộng tại cáctỉnh thành miền Bắc và miền Trung

trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắnvới một enzyme Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphate)

vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu Sự xuất hiện màuchứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông quacường độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện

Phương pháp này được thiết kế cho việc phát hiện và định lượng vật chất nhưpeptides, protein, antibodies, hormone,… Đôi khi nó còn được gọi bởi một tên gọi

khác là EIA (Enzyme ImmunoAssay) Kĩ thuật này khá nhạy và đơn giản, cho phép taxác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml) Sovới kĩ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA- Radio Immuno Assay) thì kĩ thuật này rẻ tiền và

an toàn hơn mà vẫn đảm bảo độ chính xác như nhau ELISA được dùng để xác định

nhiều tác nhân gây bệnh như virus, vi khuẩn, nấm, kí sinh

Kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng là: kháng nguyên, khángthể và chất tạo màu; thực hiện qua hai bước:

- Phản ứng miễn dịch học: Là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể

- Phản ứng hóa học: Thông qua hoạt tính xúc tác của enzyme làm giải phóng

oxy nguyên tử [O] từ H2O2 để oxy hóa cơ chất chỉ thị màu, do đó làm thay đổi màu củahỗn hợp trong dung dịch thí nghiệm

Tiến hành:

- Mẫu khi lấy về trữ ở -20oC, chọn những lá vừa không non cũng không già,

phiến lá lớn, cân 0,5g cho vào cối, thêm 2,5ml dịch trích mẫu Nghiền thật nát vụn chỉthấy dạng dung dịch Sau đó đổ vào eppendoff gần đầy và ghi ký hiệu thật cẩn thận

- Mẫu sau đó được đem ly tâm tốc độ 5000vòng/phút trong 3 phút ở nhiệt

độ 4oC, dùng Micropipette P1000 hút phần dịch nỗi sang một eppendoff 1.5ml mới vàcũng ghi nhãn cẩn thận (loại bỏ cặn lắng) và giữ ở 4oC

Sử dụng bộ kit ELISA (IgG & conjugate) để phát hiện virus RRSV, RGSV, RBTV,RBSDV do TS Omura, Trung tâm Khoa học Nông nghiệp Nhật Bản chuyển giao, quy trìnhELISA được tiến hành như sau:

- Đĩa và sơ đồ bố trí được chuẩn bị Mỗi đĩa được bố trí 2 đối chứng âm và 2 đốichứng dương Pha loãng kháng thể 1/250 trong dung dịch đệm (coating buffer) Trênmỗi đĩa sử dụng 60 giếng, mỗi giếng hút vào 100µl, chạy trên 5 đĩa, như vậy tổng cộng

là 30ml, do đó phải pha dung dịch đệm là khoảng 35ml: pha loãng 140µl kháng thểvào trong 35ml dung dịch đệm kháng thể, trộn thật kỹ trước khi dùng Hút 100µl

dung dịch vừa pha vào mỗi giếng, dùng băng keo dán kín lại và đặt vào tủ ủ ở 37oCtrong 2 giờ

- Hỗn hợp được rửa với dung dịch đệm PBS – T bằng máy rửa, rửa 3 lần mỗilần 3 phút Sau đó, mỗi đối chứng âm và dương được hoà tan với 1ml nước cất, hút100µl mỗi loại đối chứng vào các giếng đối chứng, tiếp theo hút 100µl mẫu vào cácgiếng đã được bố trí Đem ủ ở 4oC qua đêm

- Hỗn hợp được rửa lại với PBS – T 3 lần mỗi lần 3 phút Sau đó, pha kháng thể

có gắn enzyme vào dung dịch đệm (tương tự như pha kháng thể ở bước 2) Hút 100µldung dịch kháng thể có gắn enzyme đã được pha vào mỗi giếng , dán băng keo lại, sau

đó đem ủ ở 37oC trong 2 giờ

- Hỗn hợp được rửa lại với PBS – T 3 lần, mỗi lần 3 phút Sau đó, hoà tan pNPPtrong dung dịch đệm Subtrate để đạt nồng độ cuối là 1mg/ml của pNPP, chờ 5 phút

để pNPP tan hoàn toàn trong dung dịch đệm Hút 100µl hỗn hợp cho vào mỗi giếng,dán băng keo lại Ủ hỗn hợp ở 37oC trong 30 phút

- Kết quả được đọc bằng máy đọc OD sau 30 phút, 1 giờ, 2 giờ

+ Những giếng xuất hiện màu vàng: giếng chứa mẫu dương tính vớikháng nguyên

+ Những giếng không màu: giếng chứa mẫu âm tính với kháng nguyên.Các mẫu cho kết quả âm tính với kháng nguyên của RRSV, RGSV, RBTV,RBSDV sẽ được phân loại riêng để tiếp tục phục vụ cho thí nghiệm tiếp theo

2.2.2.2 RT-PCR một bước

Nguyên tắc

cDNA được tổng hợp từ RNA dưới sự xúc tác của enzyme phiên mã ngược(reverse transcriptase) Enzyme này tổng hợp sợi đơn DNA bổ sung dựa vào sợi khuônmRNA Sợi kép RNA/DNA sẽ tách nhau ra dưới tác động của nhiệt độ cao, giải phóngsợi đơn cDNA Tiếp sau đó, enzyme Taq polymerase tổng hợp sợi đơn cDNA thứ hai

để có được sợi đôi cDNA hoàn chỉnh

Tiến hành:

Các cặp oligo thiết kế đặc hiệu cho phân đoạn S7 được sử dụng để tiến hànhtổng hợp cDNA sợi đôi từ RNA hệ gen virus SRBSDV phân lập từ mẫu lúa nhiễmbệnh lùn sọc đen Quy trình phản ứng tổng hợp cDNA như sau:

Reverse transcriptase (200u/µl) : 0.5 µl

Taq DNA polymerase (5u/ µl) : 0.2 µl

RiboLockTM RNase Inhibitor (20u/µl) : 0.3 µl

ddH2O : 8.7 µl

Tổng thể tích : 15µl

Phản ứng RT-PCR một bước được thực hiện với chu trình nhiệt như sau:

Phản ứng kết thúc sau khi ủ ở 72ºC trong vòng 7 phút và giữ sản phẩm ở 4ºCcho đến phân tích Sản phẩm PCR được phân tích bằng phương pháp điện di trên gelagarose 1% và nhuộm DNA bằng Ethidium bromide.

2.2.2.3 Điện di DNA trên gel agarose 1%

Nguyên tắc:

Điện di là một quá trình chuyển động của các phân tử tích điện trong dung dịchdưới tác dụng của điện trường DNA là phân tử tích điện âm nên trong môi trườngtrung tính hoặc kiềm, dưới tác dụng của điện trường, chúng sẽ di chuyển theo chiều từcực âm sang cực dương Các phân tử DNA sẽ chuyển động với vận tốc khác nhau phụthuộc vào điện tích, hình dạng, kích thước của chúng Do vậy phương pháp điện diđược sử dụng để phân tách các đoạn DNA có kích thước, hình dạng khác nhau

Các mẫu điện di lên băng dương tính với SRBSDV được giữ lại để tiếp tục tiếnhành các thí nghiệm tiếp theo

2.2.3 Tinh sạch dsRNA của SRBSDV bằng cột CF-11

Nguyên lý:

Các phân tử RNA sợi đôi (dsRNA) có đặc tính bám vào cột CF-11 trong điềukiện môi trường đệm STE có chứa 16.5% EtOH và mất khả năng bám cột trong môi

trường đệm STE không chứa EtOH Vì vậy hệ gen virus được tách ra khỏi hệ gen vàRNA của lúa bằng phương pháp chạy qua cột CF-11.

Tiến hành:

Quy trình phân lập hệ gen của SRBSDV được thực hiện theo những bước sau:

- Nghiền nhỏ khoảng 1g mẫu lúa, chuyển mẫu đã được nghiền sang ống falcolsạch, bổ sung 10-20ml STE 2X vào mẫu để làm đệm cho phản ứng Tiếp tục bổ sungvào hỗn hợp 2ml SDS 10% và lắc đều Sau đó, bổ sung vào hỗn hợp 10ml phenol đãbão hòa, lắc nhẹ trong khoảng 45 phút

- Ly tâm hỗn hợp trong 10 phút ở tốc độ 12000v/p, chuyển dịch nổi sang ốngmới, thêm vào H2O đến thể tích 20ml Sau đó, bổ sung 4ml EtOH tuyệt đối vào dungdịch, tạo điều kiện để phân tử dsRNA bám vào cột (~16.5%EtOH)

- Cân 2g bột CF-11 vào cốc đong, bổ sung 10ml dung dịch STE 1X chứa 16.5%EtOH Sau đó, đưa hỗn hợp lên cột và tiếp tục bão hòa cột bằng 10x10ml STE1X chứa16.5% EtOH Quá trình gắn cột xảy ra khi hỗn hợp mẫu (đã chuẩn bị) chảy từ từ quacột đã được bão hòa

- Sau khi gắn cột, rửa cột bằng cách cho chảy từ từ qua cột 10x10ml STE 1Xchứa 16.5% EtOH

- Cột sau khi rửa, đẩy cột bằng cách cho chảy từ từ 10ml STE 1X không chứaEtOH qua cột, làm mất khả năng bám cột của các phân tử dsRNA, thu dịch đẩy vàoống Falcol sạch Sau đó, tách hoàn toàn dsRNA bằng cách thêm 0,6V Isopropanol vàodịch đẩy cột, lắc đều hỗn hợp, ủ ở -20oC ít nhất 4h

- Ly tâm dịch trong 10 phút ở tốc độ 12000v/p, loại bỏ dịch nổi, thu cặn Rửacặn 2 lần bằng EtOh 70% để làm tan các muối Sau đó, cặn được phơi trong không khíđến khi khô và tiếp tục được hòa tan bằng 50µl H2O (cất 2 lần) Sản phẩm thu đượcđược giữ ở -20°C để phục vụ cho thí nghiệm tiếp theo

2.2.4 Tổng hợp cDNA từ dsRNA

2.2.4.1 Thiết kế cặp mồi

Các phân đoạn S7 của các chủng SRBSDV trên thế giới có trên GeneBank đượctổng hợp, so sánh và phân tích mức độ tương đồng bằng phần mềm MEGA5 Vùng bảothủ của các phân đoạn này sẽ được lựa chọn và sử dụng để thiết kế các cặp mồi đặchiệu cho phép nhân bản phân đoạn S7 Các cặp mồi có sẵn trình tự sẽ được chúng tôiđặt sinh tổng hợp tại công ty Sigma

2.2.4.2 Tổng hợp cDNA sợi 1

Nguyên tắc:

cDNA được tổng hợp từ RNA dưới sự xúc tác của enzyme phiên mã ngược(reverse transcriptase) Enzyme này tổng hợp sợi đơn DNA bổ sung dựa vào sợi khuônmRNA Sợi kép RNA/DNA được xử lý với kiềm hoặc ribonuclease (phân hủy sợikhuôn RNA) để tạo thành sợi đơn cDNA Tiếp sau đó, DNA polymerase I tổng hợp sợiđơn cDNA thứ hai để có được sợi đôi cDNA hoàn chỉnh

Tiến hành:

Các cặp oligo thiết kế đặc hiệu cho phân đoạn S7 được sử dụng để tiến hànhtổng hợp cDNA sợi 1 từ RNA hệ gen virus SRBSDV phân lập từ mẫu lúa nhiễm bệnhlùn sọc đen Quy trình phản ứng tổng hợp cDNA như sau: