XÁC ĐỊNH KHÁNG NGUYÊN PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH của BỆNH NHÂN UNG THƯ GAN

Hơn nữa, nhiều nghiên cứu đã chứng minhrằng các protein nội bào có liên quan đến quá trình hình thành khối u, kích thích đápứng miễn dịch sinh ra các tự kháng thể [26] và nhiều kháng ngu

LÊ LAN PHƯƠNG

XÁC ĐỊNH KHÁNG NGUYÊN PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH

CỦA BỆNH NHÂN UNG THƯ GAN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2012

Lê Lan Phương

XÁC ĐỊNH KHÁNG NGUYÊN PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH

CỦA BỆNH NHÂN UNG THƯ GAN

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu khoa học

và thực hiện luận văn này

Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn các thầy giáo, cô giáo trong Khoa Sinh học,Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tận tình giảng dạy, dìu dắt tôi trong thời gianhọc tập tại Trường

Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới các anh, chị học viên và các bạnsinh viên làm việc tại Phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí

nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại học Khoa học Tựnhiên đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiệnluận văn tại Phòng

Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâmgiúp đỡ của các cán bộ, nhân viên thuộc Khoa Tế bào - Giải phẫu bệnh, Bệnh việnK2, Tam Hiệp, Hà Nội Tôi xin chân thành cảm ơn

Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã khích lệ, động viên,giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Luận văn được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài mã số KLEPT-09-02

Hà Nội, tháng 6 năm 2012

Học viên

Lê Lan Phương

DANH MỤC CÁC BẢNG d DANH MỤC CÁC HÌNH e

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 - TỔNG QUAN 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ GAN 3

1.1.1 Phân loại ung thư gan nguyên phát 3

1.1.2 Nguyên nhân dẫn tới ung thư gan 4

1.1.3 Các giai đoạn của ung thư gan 6

1.1.4 Các phương pháp chẩn đoán ung thư gan 8

1.2 NGHIÊN CỨU CHỈ THỊ SINH HỌC ĐỐI VỚI UNG THƯ 9

1.2.1 Chỉ thị sinh học đối với ung thư 9

1.2.2 Tiếp cận nghiên cứu chỉ thị sinh học đối với ung thư 10

1.2.3 Các loại chỉ thị sinh học đối với ung thư gan 11

1.3 MIỄN DỊCH CHỐNG UNG THƯ 13

1.3.1 Đáp ứng miễn dịch chống ung thư 13

1.3.2 Kháng nguyên ung thư 13

1.3.3 Chỉ thị ung thư liên quan đến đáp ứng miễn dịch 14

1.4 NGHIÊN CỨU PROTEOMICS MIỄN DỊCH UNG THƯ GAN 15

1.4.1 Khái quát về proteomics và ứng dụng của proteomics 15

1.4.2 Hệ protein gan người 16

1.4.3 Nghiên cứu proteomics miễn dịch ung thư gan 17

Chương 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 24

2.1 NGUYÊN LIỆU 24

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 24

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.2.1 Xử lý mẫu mô gan 25

2.2.2 Định lượng protein theo phương pháp Bradford 27

2.2.3 Điện di hai chiều 27

2.2.4 Western Blot 28

2.2.5 Phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều, kết quả Western Blot 29

2.2.6 Cắt và thủy phân spot trên bản gel điện di hai chiều 30

2.2.7 Phân tích khối phổ và nhận dạng protein 31

Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 33

3.1 TÁCH CHIẾT PROTEIN TỪ MÔ GAN 33

3.2 PHÂN TÍCH HÌNH ẢNH BẢN GEL ĐIỆN DI HAI CHIỀU 34

3.2.1 Phân tách hệ protein mô gan trên bản gel diện di hai chiều 34

3.2.2 Phân tích biểu hiện của protein trên bản gel điện di hai chiều 36

3.3 NHẬN DẠNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP MALDI-TOF MS 41

3.4 THẨM TÁCH MIỄN DỊCH - WESTERN BLOT HAI CHIỀU 44

3.4.1 Xác định tỷ lệ pha loãng kháng thể bậc một thích hợp 44

3.4.2 Kết quả Western Blot hai chiều 46

3.5 ĐẶC ĐIỂM, VAI TRÒ CỦA CÁC PROTEIN BIỂU HIỆN KHÁC BIỆT 47

3.5.1 Protein liên quan đến chu trình tế bào và apoptosis 50

3.5.2 Protein liên quan đến quá trình miễn dịch và bảo vệ cơ thể 52

3.5.3 Protein tham gia cấu trúc tế bào 53

3.5.4 Protein tham gia các quá trình trao đổi chất 54

3.5.5 Protein liên quan đến quá trình phiên mã, dịch mã và cải biến 55

3.5.6 Protein có phản ứng miễn dịch với huyết tương 56

KẾT LUẬN 60

PHỤ LỤC iPhụ lục 1 Danh sách bệnh nhân ung thƣ tế bào gan iPhụ lục 2 Phân tách protein mô gan của 5 bệnh nhân HCC trên bản gel điện dihai chiều iiPhụ lục 3 Kết quả nhận dạng protein bằng cơ sở dữ liệu NCBI sử dụng phầnmềm Mascot viPhụ lục 4 Kết quả phản ứng Western Blot mẫu mô gan của 3 bệnh nhân HCC viii

ABC Ammonium bicarbonate

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay

(Xét nghiệm hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme)

GS Glutamine synthetase

HBV Hepatitis B virus (Virus viêm gan B)

HBsAg Hepatitis B surface Antigen (Kháng nguyên bề mặt virus viêm

gan B)HCC Hepatocellular carcinoma (Ung thư tế bào biểu mô gan)

HCV Hepatitis C virus (Virus viêm gan C)

HLPP Human Liver Proteome Project (Dự án Proteome gan người)

HPT Haptoglobin

HUPO Human Proteome Organisation (Tổ chức Proteome người)

HRP Horse - radish peroxidase

IEF Isoelectric Focusing (Điện di phân vùng đẳng điện)

IPG Immobilized pH gradient (Gradient pH cố định)

LC-MS/MS Liquid Chromatography coupled with tandem Mass Spectrometry

(Sắc ký lỏng kết nối với khối phổ)MALDI-TOF Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight

MFAP3 Microfibrillar-associated protein 3

MHC Mayjor Histocampatibility Complex

(Phức hệ phù hợp tổ chức mô chủ yếu)

MS Mass spectrometry (Khối phổ)

Mw Molecular weight (Khối lƣợng phân tử)

PBS Phosphate Buffer Saline (Đệm muối phosphate)

PCNA Proliferating cell nuclear antigen

PDIA1 Protein disulfide-isomerase

PDIA3 Protein disulfide-isomerase A3

PMF Peptide Mass Fingerprint (Đặc trƣng khối peptide)

PMSF Phenylmethanesulfonyl fluoride

PVDF Polyvinylidene fluoride

p53 Cellular tumor antigen p53

SDS Sodium dodecyl sulfate

SDS-PAGE SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis

(Điện di trên gel polyacrylamide có SDS)SEREX Serological Analysis of Recombinant cDNA Expression Libraries

(Phân tích huyết thanh bằng thƣ viện biểu hiện cDNA tái tổ hợp)SODC Superoxide dismutase [Cu-Zn]

Spot Điểm protein

ST7L Suppressor of tumorigenicity 7 protein-like

TAA Tumour Associated Antigen

(Kháng nguyên liên quan đến ung thư)TAP Transporters of Antigen Peptide

(Phân tử vận chuyển peptide kháng nguyên)TFA Trifluoroacetic acid

TNM Tumor Node Metastasis

(Kích thước khối u - Hạch Lympho - Di căn)TSA Tissue Specific Antigen (Kháng nguyên đặc hiệu mô)TSTA Tumour Specific Transplantation Antigen

(Kháng nguyên ghép đặc hiệu ung thư)

Bảng 2 Các chỉ thị ung thư gan mới được công bố (20 năm gần đây) 12

Bảng 3 Các hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu 24

Bảng 4 Các bước chạy điện di đẳng điện trên thanh strip dài 7cm và 17cm 28

Bảng 5 Tổng số spot trên mỗi bản gel điện di hai chiều 36

Bảng 6 Thống kê các spot biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thư so với mô gan bình thường của từng bệnh nhân trên bản gel 2-DE 17cm, pH 3 - 10 39

Bảng 7 Thống kê các spot biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thư so với mô gan bình thường của từng bệnh nhân trên bản gel 2-DE 7cm, pH 4 - 7 39

Bảng 8 Danh sách các protein biểu hiện khác biệt trên bản gel của mô gan ung thư so với mô gan bình thường được xác định dựa trên cơ sở dữ liệu EMBL 40

Bảng 9 Danh sách các protein được xác định bằng MALDI-TOF MS từ bản gel mô gan ung thư so sánh với mô gan đối chứng của bệnh nhân HCC 42

Bảng 10 Tóm tắt chức năng chính của các protein biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thư so với mô gan đối chứng đã đươc nhận dạng 48

Hình 2 Cơ chế gây ung thư của các tác nhân ung thư gan 5Hình 3 Quy trình chiết protein từ mô gan 26

Hình 4 Phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều sử dụng phần mềm Phoretix 30

Hình 5 Điện di kiểm tra các phân đoạn dịch chiết protein từ mô gan bình thường và

mô gan ung thư trên gel polyacrylamide 10% có SDS 33Hình 6 Phân tách protein mô gan của bệnh nhân 8460 trên bản gel điện di hai chiều 35Hình 7 Hình ảnh 3-D của spot trên bản gel điện di hai chiều 37Hình 8 Minh họa các spot biểu hiện khác biệt giữa bản gel mô ung thư so với bảngel mô bình thường 37Hình 9 Các spot biểu hiện khác biệt giữa bản gel 2-DE mẫu mô gan ung thư so với

mô gan bình thường của bệnh nhân HCC mã 8935 38Hình 10 Phân tích khối phổ các peptide thu được sau khi thủy phân spot proteinC-256-B bằng trypsin 41Hình 11 Phân tách protein chiết từ mô gan bệnh nhân HCC trên gel polyacrylamide

và màng PVDF chuẩn bị cho phản ứng Western Blot 45Hình 12 Kết quả phản ứng Western Blot khi ủ màng với dung dịch kháng thể bậc 1

có độ pha loãng khác nhau 45Hình 13 Kết quả phản ứng Western Blot mẫu mô gan của bệnh nhân 8977 47Hình 14 Tỷ lệ các nhóm protein tham gia vào các quá trình sinh học khác nhau 50Hình 15 Sơ đồ nhận diện kháng nguyên nhờ protein MHC lớp I 58

MỞ ĐẦU

Ung thư gan hiện là một trong các loại ung thư phổ biến nhất trên thế giới vàViệt Nam, đây là bệnh ung thư có tỷ lệ tử vong cao, hơn nữa, tỷ lệ mắc bệnh đang có

xu hướng tăng lên Theo thống kê năm 2008, ước tính trên thế giới có khoảng

748.300 trường hợp mắc ung thư gan và 695.900 ca tử vong do ung thư gan ViệtNam thuộc khu vực Đông Nam Á là nơi có tỷ lệ mắc ung thư gan cao nhất [18] Theothống kê của bệnh viện K, nước ta có tỷ lệ mắc ung thư gan nguyên phát cao donhiễm virus viêm gan B và virus viêm gan C [41] Do đó, việc nghiên cứu về tácnhân gây bệnh, cơ chế và phương pháp chẩn đoán, phát hiện sớm ung thư gan có vaitrò quan trọng đối với việc giảm tỷ lệ mắc và giảm tỷ lệ tử vong ở loại ung thư này

Hiện nay, các phương pháp xét nghiệm lâm sàng như: sinh thiết gan, chụpcắt lớp vi tính, siêu âm chẩn đoán hình ảnh và xác định các chỉ thị sinh học nhưanpha fetoprotein là các “tiêu chuẩn vàng” để chẩn đoán ung thư gan Tuy nhiên,các xét nghiệm này có nhiều hạn chế do chỉ phát hiện được bệnh vào giai đoạnmuộn làm giảm khả năng sống sót của bệnh nhân ung thư gan [38] Nhu cầu đặt ra

là phải tìm kiếm các chỉ thị sinh học mới giúp chẩn đoán, phát hiện ung thư gan ởgiai đoạn sớm

Trong những năm gần đây, các nhà khoa học đang tập trung nghiên cứu tìmkiếm các chỉ thị ung thư gan sử dụng công cụ proteomics Phần lớn các protein cótrong huyết tương đều được tổng hợp từ gan Mô gan của bệnh nhân ung thư gancũng có khả năng tổng hợp nhiều protein liên quan đến khối u Do đó, các tín hiệuprotein trong mô gan có thể dùng làm công cụ để chẩn đoán sự tiến triển của bệnhgan, phát triển chẩn đoán phân tử [29] Hơn nữa, nhiều nghiên cứu đã chứng minhrằng các protein nội bào có liên quan đến quá trình hình thành khối u, kích thích đápứng miễn dịch sinh ra các tự kháng thể [26] và nhiều kháng nguyên ung thư đã đượcxác định trong cơ thể bệnh nhân ung thư [27] Vì thế, các tự kháng thể có thể đượcdùng để chẩn đoán lâm sàng ung thư và dùng trong phân tích proteomics để nhậndạng các kháng nguyên liên quan đến khối u có khả năng liên quan đến sự chuyển

dạng ác tính của tế bào Đây là hướng nghiên cứu mới nhằm tìm kiếm các chỉ thịsinh học ung thư liên quan đến đáp ứng miễn dịch.

Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu:

“Xác định kháng nguyên phản ứng miễn dịch của bệnh nhân ung thư gan”

nhằm mục đích:

- Tìm hiểu sự biểu hiện của các protein ở mô gan ung thư so với mô gan bìnhthường của bệnh nhân ung thư gan thông qua các điểm protein trên bản gel điện dihai chiều

- Nhận dạng được một số protein khác biệt đặc trưng giữa mô gan ung thư sovới mô gan bình thường

- Xác định được protein có phản ứng miễn dịch (kháng nguyên ung thư gan)đặc hiệu với các kháng thể trong huyết tương bệnh nhân ung thư gan

Đề tài được thực hiện tại Phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộcPhòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại họcKhoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Chương 1 - TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ GAN

Ung thư gan là một trong các dạng bệnh lý phổ biến nhất trên thế giới và tỷ

lệ tử vong do ung thư gan xếp hàng thứ ba trên tổng số các trường hợp tử vong doung thư Tại Mỹ, từ năm 2004 đến 2008, tỷ lệ mắc mới ung thư gan mỗi năm tăng3,6% ở nam giới và 3% ở nữ giới, xu hướng này đã tồn tại từ năm 1992 Các nhànghiên cứu dự đoán trong năm 2012 sẽ có khoảng 28.720 trường hợp mắc mới ungthư gan, hơn 80% trong số đó là ung thư tế bào biểu mô gan [8]

Ung thư gan gồm hai dạng là ung thư gan nguyên phát và ung thư gan thứphát (di căn) Ung thư gan nguyên phát là ung thư xuất phát từ các loại tế bào gan(hình 1) Ung thư gan thứ phát là do các tế bào ung thư của các cơ quan, bộ phậnkhác trong cơ thể di chuyển theo dòng máu hoặc mạch bạch huyết tới gan và địnhkhu tại đây, hình thành khối u Ung thư di căn gan không mang các đặc trưng củaung thư xuất phát từ gan, vì vậy, trong phạm vi luận văn này, chúng tôi chỉ đề cậptới ung thư gan nguyên phát với dạng phổ biến nhất là ung thư tế bào biểu mô gan(Hepatocellular Carcinoma - HCC) thường gọi là ung thư gan [49]

Hình 1 Ung thư gan xuất phát từ chính tế bào gan [49]

1.1.1 Phân loại ung thư gan nguyên phát

Dựa vào phân loại mô bệnh học và loại tế bào phát sinh ung thư, ung thư gannguyên phát được phân thành các loại chính như sau [42]:

- Ung thư tế bào biểu mô gan là dạng ung thư biểu mô hay gặp nhất trong ungthư gan Ung thư bắt nguồn từ các tế bào biểu mô, đây là loại tế bào gan chủ yếu, do

đó, HCC chiếm 85 - 95% các trường hợp ung thư gan nguyên phát [32]

- Ung thư tế bào ống mật, đây là dạng ung thư bắt đầu ở các đường mật nhỏtrong gan Dạng ung thư này chỉ chiếm khoảng 5 - 15% [32] Nguy cơ mắc dạngung thư này sẽ tăng cao khi bệnh nhân bị sỏi mật, loét đường tiêu hóa hay nhiễmcác dạng ký sinh trùng trong gan

- Ung thư biểu mô hỗn hợp, đây là dạng ung thư hiếm gặp, tế bào ung thư gồm

cả tế bào biểu mô gan và tế bào ống mật

- U nguyên bào gan là loại u gan ác tính ở trẻ em, hiếm gặp ở người lớn Unguyên bào gan xuất hiện có thể do các gene hoạt động bất thường

- Ung thư tế bào mạch là loại ung thư rất hiếm gặp, nó bắt nguồn từ mạch máutrong gan do gan tiếp xúc với các hóa chất công nghiệp như vinyl chlorid hoặc cáchóa chất gây ung thư

1.1.2 Nguyên nhân dẫn tới ung thư gan

Mặc dù vẫn còn nhiều tranh cãi về cơ chế chính xác dẫn đến ung thư gan,song các nghiên cứu đều chỉ ra rằng tác nhân gây ung thư là đa nhân tố và quá trìnhtiến triển thành ung thư rất phức tạp, phải trải qua nhiều bước [39] Các yếu tố nguy

cơ chính có thể tiến triển thành HCC bao gồm: các tác nhân gây bệnh như nhiễmvirus viêm gan B (Hepatitis B virus - HBV), virus viêm gan C (Hepatitis C virus -HCV) dẫn tới viêm gan mạn tính; xơ gan; các loại hóa chất như: rượu, aflatoxin B1,vinyl chlorid, asen hoặc các rối loạn trao đổi chất như nhiễm sắt ở mô, bệnh thiếuhụt α1 - antitrypsin [38] Tuy rằng, các yếu tố nguy cơ có thể tác động đến tế bàogan theo các con đường khác nhau nhưng cuối cùng đều làm biến đổi di truyền vàdẫn đến hình thành tế bào ung thư (hình 2)

Hình 2 Cơ chế gây ung thư của các tác nhân ung thư gan [13]

Theo số liệu hồi cứu năm 2006 của Wong và cộng sự (cs) cho thấy, nhiễmHBV mạn tính được xem như là yếu tố nguy cơ chính dẫn đến HCC Các bệnh nhân

có phản ứng dương tính với kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B (HBsAg) cónguy cơ phát triển thành HCC cao gấp 70 lần so với người có phản ứng âm tínhHBsAg Nhiễm HBV là một bệnh phổ biến ở các nước Đông Nam Á, Trung Quốc,Đài Loan, Hàn Quốc, Châu Phi, tại những vùng này có tới 85% - 95% bệnh nhânHCC dương tính với HBsAg Nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng việc HBV chènDNA của mình vào hệ gene người bệnh sẽ làm mất tính ổn định của nhiễm sắc thể,

hoạt hóa các gene gây ung thư hoặc gây bất hoạt các gene ức chế khối u như TP53.

Ngoài ra, các sản phẩm protein của HBV có thể gây rối loạn chu trình tế bào, tạođiều kiện cho sự tiến triển của các tác nhân gây ung thư, đồng thời hoạt hóa các yếu

tố phiên mã và promoter của các gene cần thiết cho hoạt động sống của virus [38]

Nhiễm virus viêm gan C mạn tính cũng là một yếu tố nguy cơ dẫn đến ungthư gan Ở các nước phát triển như Nhật Bản, Ý, Pháp và một số nước thuộc Nam

Âu, tỷ lệ bệnh nhân ung thư gan có tiền sử viêm gan C chiếm đa số [14] Các nhà

nghiên cứu đã phát hiện ra rằng protein lõi của HCV có thể tác động tới quá trìnhsinh trưởng tế bào bằng cách kìm hãm hoạt động phiên mã của promoter p53 [38].Đồng nhiễm HCV và HBV làm tăng nguy cơ mắc ung thư gan từ 2 đến 6 lần so vớinhiễm độc lập một loại virus.

Aflatoxin là những chất gây ung thư có độc tính cao được hình thành khi

thực phẩm và nước bị nhiễm nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus Ở

các nước đang phát triển thuộc Châu Phi hay một số nơi ở Châu Á, người dân ăncác thực phẩm nhiễm aflatoxin thì nguy cơ mắc ung thư gan cũng tăng Aflatoxin có

thể trực tiếp làm tổn thương gene TP53 gây bất hoạt protein p53 Đồng nhiễm

aflatoxin B1 (AFB1) và HBVsẽ gây ra biến đổi p53 ở gốc serine 249 HBV làm hoạthóa các cytochrome P450 gây bất hoạt quá trình trao đổi AFB1 tạo ra chất gây độtbiến là AFB1-8,9-epoxide và các hợp chất chứa oxy có khả năng hoạt động hóa họcmạnh làm tế bào mẫn cảm với AFB1 [14]

Ngoài ra, các yếu tố khác như tuổi, giới tính và chủng tộc cũng góp phần làmtăng nguy cơ bị ung thư gan Nam giới có nguy cơ bị ung thư gan cao hơn nữ giới

từ hai đến ba lần Một số nghiên cứu về nội tiết đã chỉ ra rằng, thụ thể hormone giớitính có biểu hiện thay đổi trong khối u HCC [29] Kết quả điều tra dân số Mỹ chothấy những người gốc Châu Á có tỷ lệ ung thư cao nhất, người Mỹ da đen cũng có

tỷ lệ mắc ung thư cao hơn so với người da trắng

Tại Việt Nam, theo số liệu thống kê tại bệnh viện Việt Đức trong năm 2008,

số bệnh nhân nam mắc u gan cao gấp 3 lần so với bệnh nhân nữ; số bệnh nhân bị ugan có phản ứng dương tính với HBsAg chiếm 65,9% tổng số bệnh nhân u gan;bệnh nhân u gan trong độ tuổi từ 20 đến 60 tuổi chiếm 73,88%, bệnh nhân u ganthuộc nhóm tuổi dưới 20 và trên 60 tuổi chỉ chiếm 26,12% [tài liệu chưa công bố]

1.1.3 Các giai đoạn của ung thư gan

Căn cứ theo Tiêu chuẩn phân kỳ lâm sàng Quốc tế bệnh ung thư (năm 1993),

thông qua các chẩn đoán lâm sàng, sử dụng kỹ thuật hình ảnh để xác định kích cỡkhối u nguyên phát và tình trạng bị xâm lấn các mạch máu, các giai đoạn của ung

Phân loại TNM T N Giai đoạn

T 1 - Có 1 khối u không xâm

lấn đến mạch máu xung quanh

T4 - Một hoặc nhiều khối u

xâm lấn trực tiếp tới các cơ

thư gan được mô tả ở bảng 1 [45, 32] Ngoài cách phân giai đoạn theo kích thước u,hạch lympho, di căn (Tumor Node Metastasis - TNM), ung thư gan còn được phânloại thành 4 giai đoạn, gồm: giai đoạn I, II, IIIA/B/C và giai đoạn IV [32]

Bảng 1 Tiêu chuẩn phân kỳ lâm sàng bệnh ung thư gan [32]

1.1.4 Các phương pháp chẩn đoán ung thư gan

Gan được cấu tạo chủ yếu bởi các tế bào biểu mô gan, loại tế bào này có khảnăng tái sinh mạnh nhờ phân bào liên tục, do đó, ung thư gan phát triển rất nhanh,kích thước gan có thể tăng gấp đôi sau 4 tháng Các triệu chứng của HCC thườngbộc lộ khi bệnh đã nghiêm trọng và khối u đã lớn, vì vậy, việc phát hiện HCC vàogiai đoạn muộn gây khó khăn trong việc điều trị, đây chính là lý do dẫn đến tỷ lệ tửvong do HCC rất cao, chiếm khoảng 70% các trường hợp tử vong do ung thư trêntoàn thế giới [14]

Hiện nay, phát hiện HCC chủ yếu dựa vào việc xét nghiệm máu để địnhlượng alpha fetoprotein (AFP) trong huyết thanh AFP là một glycoprotein có khốilượng 70kDa, được tổng hợp ở gan và túi noãn hoàng của thai, sau đó được tiết vàohuyết thanh ở tuần thứ 13 của thai kỳ Sau khi sinh, nồng độ AFP trong huyết thanhgiảm và ở người bình thường khỏe mạnh chỉ còn 3 - 5ng/ml, rất khó để phát hiệnđược ở người trưởng thành AFP có thể được dùng để sàng lọc người có nguy cơ bịung thư gan cao [39] Tuy vậy, AFP trong máu không đặc trưng cho ung thư gan vìnồng độ AFP có thể cũng tăng trong một số trường hợp khác: thai nghén bình

thường, viêm gan ở giai đoạn phục hồi, viêm gan mạn tính, ung thư tế bào mầm nhưung thư tinh hoàn hay mắc một số dạng ung thư khác như ung thư dạ dày, ung thưđường mật [5] Xét nghiệm AFP cũng không nhạy bởi có khoảng 15% - 30% bệnhnhân ung thư gan mà hàm lượng AFP vẫn không tăng [39], nhất là đối với các khối

u gan nhỏ hơn 3cm

Hàm lượng AFP cao có thể nghĩ đến ung thư gan nhưng không thể là yếu tốquyết định chắc chắn Vì thế, để chẩn đoán ung thư gan cần kết hợp xét nghiệm địnhlượng AFP và chẩn đoán hình ảnh bằng siêu âm, chụp cắt lớp vi tính hay chụp cộnghưởng từ để có thể thấy được hình dạng, kích thước và kết cấu của khối u, nhưng đểchẩn đoán chính xác u lành tính hay ác tính thì nhất thiết phải sinh thiết gan Tuynhiên, sinh thiết gan gây nguy cơ chảy máu cao, dò dịch mật, vết bầm máu và nhiễmkhuẩn có thể xảy ra, đồng thời tăng nguy cơ biến u lành tính chuyển dạng thành ác

tính và thúc đẩy di căn [50] Do đó, cần tìm kiếm các chỉ thị sinh học có độ nhạy và

độ đặc hiệu cao hơn để hỗ trợ cho AFP giúp chẩn đoán sớm ung thư gan [26]

1.2 NGHIÊN CỨU CHỈ THỊ SINH HỌC ĐỐI VỚI UNG THƯ

Chỉ thị sinh học là các phân tử được tìm thấy trong máu, các loại dịch của cơthể hoặc trong mô đặc trưng cho một quá trình sinh lý hoặc các giai đoạn bệnh lý.Chỉ thị sinh học có thể được dùng để xem xét đáp ứng của cơ thể đối với một phác

đồ điều trị bệnh hoặc một trạng thái nhất định [46]

1.2.1 Chỉ thị sinh học đối với ung thư

Ngày nay, chỉ thị sinh học là một trong những công cụ quan trọng nhất đểphát hiện sớm ung thư, xác định chính xác sự tiến triển của bệnh, tiên lượng và theodõi điều trị ung thư nhằm kéo dài thời gian sống, giảm tỷ lệ tử vong ở bệnh nhânung thư Các chỉ thị ung thư là những đại phân tử xuất hiện ở một bệnh ung thư, cónồng độ thay đổi theo chiều hướng tăng lên liên quan đến sự phát sinh và tăngtrưởng của những khối u ác tính Chỉ thị ung thư là những chất do các tế bào hoặc

mô ung thư tổng hợp và tiết ra từ khối u bị phá vỡ hoặc được tạo ra từ các phản ứngcủa cơ thể đối với khối u, gồm hai dạng: chỉ thị tế bào và chỉ thị thể dịch Chỉ thịung thư dạng tế bào bao gồm: các kháng nguyên bề mặt các tế bào, các thụ thểhormone và thụ thể yếu tố tăng trưởng, những biến đổi di truyền (biến đổi gene) của

tế bào Chỉ thị ung thư dạng thể dịch bao gồm: các chất được phát hiện ở nhữngnồng độ không bình thường có mặt trong huyết thanh, nước tiểu, các loại dịch của

cơ thể [3]

Dựa vào khả năng đặc hiệu với bệnh, chỉ thị ung thư có thể được phân loại

và đánh giá theo các tiêu chí sau [3]:

- Đặc hiệu cao: chỉ thị ung thư không tìm thấy ở đối tượng khỏe mạnh hoặc ulành tính

- Độ nhạy cao: chỉ thị ung thư dễ phát hiện ở giai đoạn sớm khi chỉ có một tếbào ung thư xuất hiện

- Đặc hiệu cơ quan: chỉ xuất hiện ở cơ quan bị ung thư.

- Xuất hiện tương quan với giai đoạn ung thư và kích thước khối u

- Tương quan với tiên lượng về thời gian sống

1.2.2 Tiếp cận nghiên cứu chỉ thị sinh học đối với ung thư

Hiện nay, có ba cách tiếp cận đang được áp dụng rộng rãi để nghiên cứu cácchỉ thị sinh học phục vụ cho việc chẩn đoán phân tử, phát hiện sớm ung thư [17]

- Sử dụng các kỹ thuật genomics để xác định, nhận dạng các gene lạ có liênquan đến các loại ung thư riêng biệt Tuy nhiên, kết quả của các nghiên cứu này mớichỉ cung cấp thông tin về khả năng mắc bệnh chứ không thể biết được nguy cơ thực

sự của bệnh

- Phương pháp proteomics xác định được hầu hết các protein có triển vọng trởthành các protein chỉ thị ung thư Các kỹ thuật proteomics có thể xác định chính xácđặc điểm bệnh học phân tử của khối u, tiên lượng bệnh, dự đoán được các ảnhhưởng của việc điều trị và giúp phát triển lĩnh vực y học cá nhân Hạn chế của

phương pháp này là một số protein chỉ thị ung thư chỉ được tìm thấy ở trong mô ungthư mà không có mặt trong máu

- Sử dụng các hệ thống dò tìm dựa vào kháng thể để nhận dạng các kháng

nguyên ung thư Song do có hiện tượng phản ứng chéo trong phản ứng miễn dịch,

do đó, kết quả của phương pháp này không đảm bảo tính đặc hiệu

Sự kết hợp các phương pháp trên sẽ làm tăng độ tin cậy cho các chỉ thị phân

tử, tăng tính chính xác khi chẩn đoán bệnh Kỹ thuật proteomics ở đây có vai trò rấtquan trọng, bổ sung cho kỹ thuật genomics và dò tìm kháng thể để nhận dạng khángnguyên khối u Kỹ thuật này đã được áp dụng rộng rãi để nghiên cứu chỉ thị phân tửcủa nhiều dạng ung thư khác nhau [17] Sự phát triển của các kỹ thuật genomics,proteomics giúp chúng ta mở rộng hiểu biết về bản chất sinh học của ung thư; ngàycàng phát hiện và sử dụng được nhiều phân tử chỉ thị với độ nhạy và tính đặc hiệucao trong chẩn đoán lâm sàng

1.2.3 Các loại chỉ thị sinh học đối với ung thư gan

Đối với nghiên cứu ung thư gan, các phương pháp trên đều đã được áp dụng

để tìm ra các chỉ thị phân tử, bao gồm cả DNA và protein, đặc biệt là các kháng thểđặc hiệu Một trong những hướng nghiên cứu quan trọng nhất là phân tích tìm racác chỉ thị phân tử để nhận dạng kiểu hình ác tính của tế bào Các phân tử chỉ thịnày bao gồm: các phân tử tham gia vào quá trình tăng sinh tế bào, gây biến đổi

DNA; gene TP53; các protein khác tham gia điều khiển chu trình tế bào; các gene

gây ung thư và các thụ thể của chúng; các yếu tố liên quan đến sự chết theo chươngtrình của tế bào và sự hoạt động của telomerase Một hướng nghiên cứu khác là tìm

ra các chỉ thị phân tử liên quan đến quá trình xâm lấn và di căn của ung thư, các chỉthị phân tử loại này gồm các phân tử bám dính (Adhesion), các enzyme thủy phânprotein làm giảm chất gian bào, các yếu tố sinh trưởng tham gia vào sự hình thànhmạch giúp khối u phá vỡ vỏ bọc, di căn đến các vị trí khác trong cơ thể [31]

Cho đến nay, ngoài AFP đã được xác định có giá trị, có nhiều chỉ thị sinhhọc khác đã được nghiên cứu để chẩn đoán HCC Trong một nghiên cứu tổng quan

về chỉ thị ung thư gan, tác giả Hoàng Văn Sơn (2011) đã liệt kê một số chỉ thị ungthư gan đang được nghiên cứu (bảng 2) Đa số các chỉ thị mới này vẫn đang đượcnghiên cứu lâm sàng, trong đó, chỉ thị huyết thanh AFP-L3, des-gamma-carboxy-prothrombin (DCP), glypican-3 (GPC-3) có nhiều hứa hẹn [5]

Loại STT Tên chỉ thị sinh học Năm công bố

Bảng 2 Các chỉ thị ung thư gan mới được công bố (20 năm gần đây) [5]

Trong những năm gần đây, các nhà nghiên cứu trên thế giới đã công bốnhiều chỉ thị ung thư nhằm phát hiện sớm, sàng lọc, chẩn đoán chính xác và theodõi điều trị HCC Đa số các chỉ thị mới này hiện vẫn đang được nghiên cứu trên lâmsàng Do đó, hướng nghiên cứu chỉ thị sinh học ung thư gan vẫn đang được triểnkhai và tiếp tục phát triển Hiện nay, các nhà khoa học đang tập trung theo hướngnghiên cứu tìm kiếm các protein kháng nguyên liên quan đến khối u, các proteinnày kích thích sinh ra kháng thể trong huyết thanh, đây cũng là các dạng chỉ thị ungthư tiềm năng

Các tế bào ung thư có thể bị phân hủy bởi các tế bào tham gia đáp ứng miễndịch không đặc hiệu, gồm: đại thực bào, tế bào giết tự nhiên và bạch cầu ưa axít.Đáp ứng miễn dịch loại này không cần có kháng thể hay kháng nguyên đặc hiệu.Trong đáp ứng miễn dịch đặc hiệu chống ung thư, vai trò của đáp ứng miễn dịchdịch thể không rõ bằng đáp ứng miễn dịch tế bào, song các nghiên cứu cũng chứngminh được sự có mặt của các kháng thể đặc hiệu trong ung thư Nhiều nghiên cứuung thư ở động vật thực nghiệm đã chứng minh vai trò của tế bào T độc (Tc) trongphân hủy tế bào khối u khi đáp ứng miễn dịch đặc hiệu tế bào Quá trình này đòi hỏiphải hoạt hóa tế bào TCD8+ bởi các tế bào trình diện kháng nguyên có mang MHClớp I và các cytokin tương ứng (Interleukin-2, Interleukin-4) [7].

1.3.2 Kháng nguyên ung thư

Khi tế bào bình thường chuyển dạng thành tế bào ung thư, quá trình này làmxuất hiện các protein mà tế bào bình thường không có hoặc có rất ít Các proteinnày là các kháng nguyên ung thư và “lạ” đối với cơ thể và trở thành đích của các tếbào đáp ứng miễn dịch tự nhiên và đáp ứng miễn dịch đặc hiệu Dưới đây là một vàiloại kháng nguyên ung thư [7]:

- Kháng nguyên ghép đặc hiệu ung thư (Tumour specific transplantation

antigen - TSTA), kháng nguyên này được phát hiện khi ghép các mảnh ung thư Khi

đó, TSTA sẽ kích thích cơ thể nhận sinh đáp ứng miễn dịch chống ung thư ghép.Đặc điểm TSTA của ung thư do hóa chất hoặc tia xạ là tính đặc hiệu kháng nguyênphụ thuộc vào mô ung thư, chứ không phụ thuộc vào hóa chất gây ung thư Ngược

lại, TSTA của ung thư do virus gây ra có tính đặc hiệu phụ thuộc vào chủng virus,không phụ thuộc vào mô ung thư Tuy nhiên, đáp ứng miễn dịch đặc hiệu chốngTSTA chỉ mới được xác định trong thực nghiệm ghép ung thư.

- Kháng nguyên đặc hiệu mô (Tissue specific antigen - TSA) là kháng nguyên

có trên bề mặt các tế bào bình thường và có đặc tính riêng cho từng loại tổ chức.Ung thư xuất hiện từ mô nào thường biểu hiện kháng nguyên đặc hiệu ở mô đó.TSA không kích thích đáp ứng miễn dịch chống ung thư, song nó có thể sử dụnglàm đích cho miễn dịch điều trị và làm chỉ thị tìm nguồn gốc xuất phát mô ung thư

- Kháng nguyên liên quan đến ung thư (Tumour associated antigen - TAA) làkháng nguyên phát hiện được trong các loại ung thư mà không có hoặc có rất íttrong tế bào mô bình thường Ở người, kháng nguyên này được xác định bằng cáckháng thể đơn dòng [7]

TAA là các peptide hay protein đặc hiệu khối u, chúng có thể biểu hiện tănghoặc giảm bất thường, bị đột biến hay cuộn gấp sai gây ra đáp ứng miễn dịch ungthư Vì vậy, nghiên cứu nhằm tìm ra các chỉ thị ung thư là các TAA giúp chẩn đoánsớm ung thư có vai trò quan trọng Nhiều chỉ thị sinh học là các TAA đã được xácđịnh, như kháng nguyên ung thư phôi thai (Carcino embryonic antigen - CEA) đặctrưng cho ung thư ruột kết, protein AFP đặc trưng cho ung thư gan, CA19-9 choung thư dạ dày - ruột và CA-125 cho ung thư buồng trứng [34]

1.3.3 Chỉ thị ung thư liên quan đến đáp ứng miễn dịch

Hiện nay, các nghiên cứu xác định chỉ thị sinh học ung thư đang được tiếnhành theo hai hướng: hướng thứ nhất là xác định tự kháng thể trong huyết thanh củabệnh nhân ung thư bắt nguồn từ những kháng nguyên ung thư Hướng thứ hai là xácđịnh sớm ung thư dựa vào việc phát hiện ra các kháng nguyên liên quan đến khối u

Khi tế bào bình thường chuyển dạng ác tính thành tế bào ung thư, trong khối

u xuất hiện các protein biểu hiện bất thường, bị đột biến hoặc biến đổi sau dịch mã,đây chính là các kháng nguyên liên quan đến ung thư Nhiều nghiên cứu đã chứngminh các TAA gây ra đáp ứng miễn dịch sinh ra các kháng thể kháng TAA trong

huyết tương và một số TAA đã được xác định trong cơ thể bệnh nhân ung thư [27].Hơn nữa, tế bào ung thư cũng giải phóng nhiều protein vào máu Do đó, hướngnghiên cứu chẩn đoán sớm ung thư dựa vào xét nghiệm máu, huyết tương của bệnhnhân ung thư để xác định TAA đang rất được quan tâm.

Bên cạnh đó, trong quá trình đáp ứng miễn dịch chống ung thư, trong huyếtthanh của bệnh nhân ung thư có xuất hiện các tự kháng thể đặc hiệu chống lại cáckháng nguyên của chính cơ thể Các tự kháng thể này mang nhiều đặc điểm ưu việtkhiến chúng trở thành những chỉ thị phân tử giúp phát hiện ung thư ở giai đoạnsớm: (a) được xác định ở giai đoạn sớm của bệnh do phản ứng miễn dịch giữa các

tự kháng thể và các TAA xảy ra ở giai đoạn đầu của quá trình hình thành khối u,chúng là kết quả của quá trình khuếch đại qua hệ miễn dịch của con người; (b) cókhả năng kháng lại quá trình phân giải protein và tránh được sự chuyển hóa phân tử

Do đó, đời sống của chúng kéo dài khoảng 21 ngày; (c) các tự kháng thể có mặttrong huyết thanh của bệnh nhân, nên có thể được xác định, phân tích bằng các kỹthuật đơn giản nhờ các xét nghiệm máu [28]

1.4 NGHIÊN CỨU PROTEOMICS MIỄN DỊCH UNG THƯ GAN

1.4.1 Khái quát về proteomics và ứng dụng của proteomics

Proteomics là một lĩnh vực khoa học nghiên cứu về proteome - sản phẩm củagenome hay chính là tập hợp các protein được biểu hiện trong tế bào, mô hoặc cơ thể

ở những điều kiện và tại thời điểm xác định [23]

Mục đích của nghiên cứu proteomics là nhận diện được tất cả các proteinđược mã hóa trong hệ gene của sinh vật và xác định: (a) phạm vi và phương thứcbiểu hiện, hoạt động của hệ protein ở các kiểu tế bào và loại mô khác nhau; (b) sựphân bố ở dưới mức tế bào; (c) những cải biến sau dịch mã; (d) mối tương tác vớinhững protein và thành phần khác; (e) mối quan hệ cấu trúc - chức năng Ngoài ra,nghiên cứu proteomics cũng cung cấp những hiểu biết tổng thể về sự biểu hiện củacác protein ở những trạng thái sinh lý, phát triển và bệnh lý khác nhau [2]

Do đó, proteomics bao gồm những nghiên cứu có tính hệ thống nhằm cungcấp những kiến thức tổng quan về cấu trúc, chức năng của protein và vai trò củachúng trong điều hòa hoạt động của các hệ sinh học Các kết quả nghiên cứu

proteomics sẽ bổ trợ cho kết quả giải trình tự gene từ các nghiên cứu genomics vànghiên cứu genomics chức năng Sự phối hợp giữa proteomics và genomics sẽ đóngvai trò chủ đạo trong những nghiên cứu Sinh - Y học, là nền tảng cho sự phát triểntrong chẩn đoán và chữa bệnh trong tương lai

Sử dụng các công cụ proteomics trong nghiên cứu bệnh học, proteomics lâmsàng đã thu được nhiều kết quả theo ba hướng nghiên cứu chính sau [4]:

- Nghiên cứu cơ chế phát sinh bệnh ở mức độ phân tử

- Tìm ra các chỉ thị sinh học mới góp phần sàng lọc, chẩn đoán sớm và theodõi tiến triển của bệnh

- Nghiên cứu các đích tác dụng của thuốc điều trị, qua đó tìm ra các thuốc cótác dụng tối ưu, phát triển hướng nghiên cứu y học cá nhân, tức là sử dụngbiện pháp điều trị thích hợp cho từng người

Tới nay, proteomics lâm sàng đã được phát triển nhanh và hiệu quả nhất trongnghiên cứu về ung thư Các nghiên cứu proteomics đã phát hiện ra nhiều chỉ thị ungthư mới, có giá trị hơn, các chỉ thị mới này hỗ trợ cho các chỉ thị đang được sử dụnglàm tăng độ đặc hiệu và chính xác lên rõ rệt trong chẩn đoán sớm ung thư [4]

1.4.2 Hệ protein gan người

Gan là cơ quan lớn nhất trong cơ thể người, chỉ đứng thứ hai sau não về mức

độ phức tạp Gan có vai trò quan trọng trong quá trình tiêu hóa, trao đổi chất, thanhlọc độc tố và cũng là nơi sản sinh ra nhiều loại protein nhất Các protein được tạo ra

từ tế bào gan thực hiện hàng ngàn phản ứng sinh hóa phức tạp

Tại hội thảo khoa học của Tổ chức Proteome người (Human Proteome

Organisation - HUPO) diễn ra ngày 28-29/04/2002 ở Bethesda (Hoa Kỳ), đã đánhdấu cho sự ra đời của dự án Proteome gan người (Human Liver Proteome Project -

HLPP) Đây là dự án lớn thứ 3 của tổ chức HUPO có mục đích nghiên cứu là: xâydựng bản đồ protein toàn diện của gan người, nhận dạng sự biểu hiện của protein,những cải biến sau dịch mã, thiết lập bản đồ tương tác protein - protein, tiếp cậntheo hướng proteomics để tìm hiểu về trạng thái sinh lý, bệnh lý trong gan từ đógiúp phát triển các chỉ thị chẩn đoán và điều trị các bệnh về gan, thành lập ngânhàng dữ liệu HLPP [47].

Dự án HLPP được triển khai với tiến độ nghiên cứu nhanh và đã thu đượcnhiều kết quả đáng kể Trong 5 năm qua, các nhà khoa học của dự án đã thiết lậpquy trình thao tác chuẩn, tối ưu hóa kỹ thuật phân tích proteomics và khảo sát thànhcông hệ protein mô gan phôi thai và mô gan người trưởng thành Dự án đã thực hiệnđược mục tiêu ban đầu đề ra là xác định được 5000 protein gan, 5500 khung đọc mởcủa các gene biểu hiện ở gan người được lưu giữ trong ngân hàng khung đọc mở.Bên cạnh đó, một hệ thống hơn 1000 tương tác giữa protein - protein ở gan ngườiđược tìm thấy và miêu tả Những thay đổi về proteomics trong mô gan và huyếttương đã được nghiên cứu và so sánh trong quá trình tiến triển của các bệnh về gan,

từ mô gan bình thường tới viêm gan, xơ gan, ung thư gan và ung thư gan di căn Từnhững nghiên cứu đó, 10 chỉ thị sinh học tiềm năng cho các bệnh về gan được tìm

ra và được khẳng định tính hiệu quả của chúng trong chẩn đoán các bệnh về gan.Đặc biệt, dự án đã xây dựng và công bố 3 cơ sở dữ liệu về gan: Liverbase, dbLEP,LiverMap nhằm cung cấp thông tin về đặc điểm protein biểu hiện trong gan, định vịprotein, mô tả tương tác của protein và quá trình hoạt động chức năng của proteintrong gan [47]

1.4.3 Nghiên cứu proteomics miễn dịch ung thư gan

Ung thư có thể coi là bệnh về hệ protein, bởi chính những đột biến di truyềnlàm sai lệch quá trình truyền tín hiệu, làm tế bào sai hỏng không bị loại bỏ, đồngthời khiến tế bào tăng sinh không kiểm soát được Hiện nay, đa số các chỉ thị ungthư đang được sử dụng là kết quả nghiên cứu về protein, vì protein là sản phẩm cuốicùng của gene và tác động trực tiếp đến các quá trình sinh học Hơn nữa, protein là

thành phần phong phú nhất của tế bào Do đó, các nhà khoa học đang tập trung ứngdụng kỹ thuật proteomics trong nghiên cứu tìm kiếm các chỉ thị ung thư là cácprotein nhằm chẩn đoán sớm ung thư.

Proteomics ung thư là ứng dụng kỹ thuật proteomics để xác định sự thay đổiđịnh tính và định lượng của protein được tìm thấy trong mô hoặc các dịch cơ thểcủa người bị ung thư, so sánh với người bình thường khỏe mạnh nhằm giúp choviệc chẩn đoán ung thư, tiên lượng và điều trị có hiệu quả hơn [15]

Proteomics miễn dịch là một khái niệm tương đối mới trong lĩnh vực nghiêncứu proteomics Proteomics miễn dịch nghiên cứu về tập hợp các protein tham giađáp ứng miễn dịch [35] Trong quá trình đáp ứng miễn dịch chống ung thư, tronghuyết thanh của bệnh nhân ung thư có xuất hiện các tự kháng thể đặc hiệu chống lạicác kháng nguyên ung thư của chính cơ thể Đây chính là đối tượng nghiên cứu củaproteomics miễn dịch ung thư

Hiện nay, nhiều nghiên cứu proteomics miễn dịch trên dòng tế bào ung thư,

mô hình động vật, phân tích trực tiếp trên huyết tương và mô gan của bệnh nhânung thư gan đã và đang được tiến hành rộng khắp trên toàn thế giới và đã thu đượcnhiều kết quả khả quan [15]

Để xác định các tự kháng thể có tiềm năng làm chỉ thị phân tử trong chẩnđoán HCC, năm 2006, Takashima và cs đã tiến hành phân tích các tự kháng thểtrong huyết thanh cho thấy có phản ứng miễn dịch với các protein trong mô ung thưlấy từ bệnh nhân HCC Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả đã tiến hành phân táchprotein của 15 cặp mẫu mô ung thư và mô thường bằng kỹ thuật điện di hai chiều,sau đó chuyển lên màng và thực hiện phản ứng miễn dịch với huyết thanh của chínhbệnh nhân đó Bằng cách so sánh từng phần, họ đã xác định được 4 spot có phảnứng miễn dịch có độ nhạy với thuốc nhuộm ở mô ung thư mạnh hơn so với mô bìnhthường Những protein này được nhận dạng bằng sắc ký lỏng kết nối với khối phổ(LC-MS/MS), đó là protein sốc nhiệt 70kDa (HSP70), glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase, peroxiredoxin và manganese superoxide dismutase (Mn-SOD)

Trong huyết thanh bệnh nhân HCC, tần suất của các tự kháng thể kháng lại cácprotein lần lượt là 7/15 (46,7%); 5/15 (33,3%); 5/15 (33,3%) và 6/15 (40%), trongkhi đó, ở mô đối chứng là 2/20 (10%); 7/20 (35%); 0/20 (0%) và 2/20 (10%) Tiếptục phân tích miễn dịch sử dụng các protein thương mại đã tinh sạch được tiến hành

để khẳng định tính đặc hiệu của các tự kháng thể Phân tích thống kê các tự khángthể kháng lại các protein HSP70, peroxiredoxin và Mn-SOD cho thấy những phảnứng miễn dịch có độ đặc hiệu cao trong huyết thanh HCC Ba kháng thể được cho làđặc hiệu đối với bệnh HCC và có thể là các chỉ thị sinh học chẩn đoán bệnh [33]

Trước đây, nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng trong quá trình chuyểndạng từ xơ gan, viêm gan thành ung thư gan, trong cơ thể xuất hiện các TAA kíchthích sinh ra tự kháng thể Các tự kháng thể này có thể xuất hiện trong huyết thanhtrước khi phát hiện biểu hiện chuyển dạng ác tính Để đánh giá sự biểu hiện của các

tự kháng thể trong các trạng thái bệnh lý về gan, năm 2007, Zhang và cs đã tiếnhành sàng lo ̣c huyết thanh của 30 bệnh nhân xơ gan, 30 bệnh nhân viêm gan và 142

bê ̣nh nhân HCC bằng viê ̣c sưư du ̣ng 8 TAA cho ̣n trước là các protein có liên quanđến điều hòa chu trình tế bào, yếu tố phiên mã đang được nghiên cứu rộng rãi, gồm:protein Imp1, p62, Koc, p53, c-myc, cyclin B1, survivin và p 16 Sử dụng kỹ thuậthấp phụ miễn dịch liên kết enzyme (ELISA) để phát hiện các kháng thể kháng 8TAA trong huyết thanh của các đối tượng được nghiên cứu, kết quả dương tínhđược kiểm tra lại bằng Western blot và xét nghiệm kết tủa miễn dịch Kết quả chothấy tỷ lệ xuất hiện phản ứng dương tính của tự kháng thể trong huyết thanh vớitừng TAA biến đổi trong khoảng từ 9,9 - 21,8%, nhưng khi kết hợp thêm lần lượttừng TAA cho tới khi đủ 8 TAA thì thấy tỷ lệ phản ứng dương tính với kháng thểtăng lên đến 59,8% ở bệnh nhân HCC Tỷ lệ này cao hơn hẳn so với tỷ lệ phản ứngdương tính với 8 TAA ở bệnh nhân viêm gan, xơ gan và người bình thường lần lượtlà: 20%, 30% và 12,2% Nghiên cứu này đã chứng minh rằng quá trình chuyển dạng

ác tính thành ung thư có liên quan đến việc tăng phản ứng của tự kháng thể với một

số protein nhất định của tế bào, việc sử dụng mini-array gồm 8 TAA tăng cườngphát hiện tự kháng thể có thể dùng để chẩn đoán HCC [40]

Khi nghiên cứu về quá trình chuyển dạng ác tính của tế bào gan, các nhà khoahọc đã sử dụng tự kháng thể trong huyết thanh trong sàng lọc miễn dịch thư viện biểuhiện cDNA của tế bào ung thư gan HepG2 để xác định kháng nguyên liên quan đếnquá trình này Năm 2007, nhóm nghiên cứu của Chen tại đại học Texas đã tiến hànhnghiên cứu xác định các kháng nguyên liên quan đến khối u như những chỉ thị chochẩn đoán miễn dịch ung thư gan Trong nghiên cứu này, huyết thanh của bệnh nhânHCC được sử dụng để sàng lọc miễn dịch từ thư viện biểu hiện cDNA của tế bàoHepG2 Kết quả sàng lọc thư viện biểu hiện cDNA HepG2 đã chỉ ra 27 gene bao gồm

21 gene đã biết và 6 gene chưa biết Trong 21 gene đã biết thì 11 gene liên quan đếnquá trình chết theo chương trình, biệt hóa và tăng sinh của tế bào cũng như chế biếnkháng nguyên, 10 gene là liên quan đến các ung thư khác và 3 gene liên quan đếnHCC Dựa vào ý nghĩa chức năng và mối liên hệ với ung thư gan, HCC-1 (Suil) vàHCC-13 (RalA) được xác định có thể liên quan đến di truyền ung thư HCC và đượclựa chọn cho những nghiến cứu tiếp theo: phân tích huyết thanh bằng ELISA và

Western blot ở các điều kiện khác nhau Việc xác định biểu hiện protein của cả haikháng nguyên được đánh giá bằng hóa mô miễn dịch Kết quả nghiên cứu này đãchứng minh rằng hai TAA được xác định là Suil và RalA từ thư viện biểu hiện cDNAHepG2 có phản ứng miễn dịch ở HCC cao hơn đáng kể so với viêm gan mạn tính, xơgan cũng như ở người bình thường Điều đó khẳng định rằng hai kháng nguyên này

có thể là những chỉ thị ung thư trong chẩn đoán HCC [10]

Năm 2008, Li và cs đã tiến hành xác định các kháng nguyên khối u và tự khángthể của bệnh nhân HCC sử dụng phương pháp phân tích proteome huyết tương kết hợpvới protein microarray Họ tiến hành phân tách protein tổng số từ hai dòng tế bào ungthư thực nghiệm HepG2 và HepG2.2.15 bằng điện di hai chiều Sau đó, chuyển cácprotein đã được phân tách lên màng Polyvinylidene Fluoride (PVDF) Đầu tiên, protein

từ dòng tế bào HepG2 được ủ với mẫu huyết thanh thu được từ 8 bệnh nhân HCC liênquan đến HBV Huyết thanh bình thường được sử dụng làm đối chứng Protein củadòng tế bào HepG2.2.15 được ủ với mẫu trộn từ mẫu huyết thanh của 10 bệnh nhânHCC liên quan đến HBV và 10 bệnh nhân HCC âm tính với HBV Các nhà nghiên cứu

đã phát hiện 6 spot protein kháng nguyên của dòng tế bào HepG2 có phản ứng vớihuyết thanh của bệnh nhân HCC mà không phản ứng với huyết thanh của người bìnhthường Trong trường hợp HepG2.2.15, họ cũng đã phát hiện được 10 spot proteinkháng nguyên có phản ứng với huyết thanh người bệnh mà không phản ứng với huyếtthanh của người bình thường Kết quả trên đã phản ánh sự khác nhau giữa các tự khángthể của bệnh nhân HCC liên quan đến HBV và bệnh nhân HCC không liên quan đếnHBV Các protein trên được nhận dạng bằng phương pháp phân tích khối phổ MALDI-TOF và phần mềm Mascot Nhóm nghiên cứu đã xác định được 13 kháng nguyên liênquan đến HCC Tính kháng nguyên của các protein này được khẳng định thêm bằngcách sử dụng kỹ thuật Western blotting và phân tích protein microarray Kết quả chỉ rarằng, tần suất của các phản ứng dương tính với DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp), yếu tố kéodài dịch mã 2 (eEF2), yếu tố cảm ứng apoptosis, heterogeneous nuclear A2 (hnRNPA2), protein liên kết với prostatic (PBP), triosephosphate isomerase (TIM) ở mẫu ungthư cao hơn đáng kể so với bình thường và viêm gan ma ̣n tính Phản ứng dương tínhvới DEAD, eEF2, AIF và PBP là thường xuyên xảy ra ở HCC hơn bất kỳ bệnh ung thưkhác Độ nhạy của tất cả kháng nguyên HCC từ 50% đến 85% Vì vậy, các nhà nghiêncứu kết luận rằng việc phát hiện các tự kháng thể kháng lại các kháng nguyên trên cóthể có giá trị trong việc chẩn đoán sớm ung thư gan [22].

Năm 2008, Looi và cs đã dùng phương pháp proteomics để xác định các

TAA liên quan đến HCC Nghiên cứu được tiến hành trên mẫu huyết thanh của 20bệnh nhân HCC, 30 bệnh nhân viêm gan mạn tính, 30 bệnh nhân xơ gan và huyếtthanh của 10 người bình thường khỏe mạnh và dòng tế bào ung thư gan HepG2

Trong số 34 spot protein có phản ứng miễn dịch được cắt ra khỏi bản gel điện di haichiều, thủy phân protein bằng trypsin và phân tích LC-MS/MS, các tác giả đã nhậndạng được 28 protein 17/28 protein không chỉ phản ứng với kháng thể trong huyếtthanh của bệnh nhân HCC mà còn phản ứng với kháng thể trong huyết tương củabệnh nhân tiền ung thư 11/28 protein chỉ phản ứng với kháng thể trong huyết tươngcủa bệnh nhân HCC, nhóm protein này có tiềm năng lớn để trở thành chỉ thị sinh

học của ung thư gan Ngoài ra, để tìm hiểu mối liên quan của các protein đã nhận

dạng với ung thư, tác giả đã tìm kiếm trên Pubmed về cơ sở dữ liệu protein Theokết quả tra cứu, 18/28 protein đã được báo cáo có liên quan đến ung thư: 3 proteinliên quan ung thư vú; 4 protein liên quan HCC (GRP78, HSP70, serotransferrin,Mn-SOD); 11 protein còn lại liên quan đến các loại ung thư khác [26].

Gần đây, việc nhận dạng và mô tả đặc điểm của các TAA và dùng làm “TAAmini-array” để chẩn đoán miễn dịch ung thư là một hướng tiếp cận để phát hiện ungthư đang được quan tâm Theo hướng nghiên cứu này, năm 2010, Zhang và cs đãtiến hành nghiên cứu “Sàng lọc miễn dịch ung thư tế bào biểu mô gan thông qua tựkháng thể và kháng nguyên liên quan đến khối u kết hợp với biểu hiện tăng bấtthường của AFP” Nhóm tác giả đã dùng các tự kháng thể trong huyết thanh củamột bệnh nhân HCC làm mẫu dò để sàng lọc miễn dịch xác định các TAA có liênquan đến quá trình chuyển dạng ác tính của tế bào gan trong thư viện biểu hiệncDNA của dòng tế bào ung thư thực nghiệm HepG2 Theo cách này đã xác định

được 2 gene là SUI1 và RA1A Protein tái tổ hợp của 2 gene này là Sui1 và Ra1A

được biểu hiện, tinh sạch và dùng làm kháng nguyên trong xét nghiệm miễn dịch đểxác định sự có mặt của tự kháng thể trong huyết thanh của 77 bệnh nhân HCC, 30bệnh nhân viêm gan mạn tính, 30 bệnh nhân xơ gan và 82 người bình thường Tỷ lệxuất hiện kháng thể kháng Sui1 và Ra1A trong huyết thanh bệnh nhân HCC lần lượt

là 11,7% (9/77) và 19,5% (15/77), tỷ lệ này cao hơn đáng kể so với tỷ lệ xuất hiệnkháng thể kháng lại 2 protein này trong huyết thanh của bệnh nhân xơ gan (3,3% và3,3%) và không xuất hiện kháng thể kháng 2 protein này ở huyết tương bệnh nhânviêm gan và người bình thường Khi bổ sung 2 protein này vào mini-array gồm 8TAA (Imp1, p62, Koc, p53, c-myc, cyclin B1, survivin và p16 [40]) đã được nghiêncứu trước đó thì thấy tỷ lệ xuất hiện tự kháng thể kháng 10 TAA đạt tới 66,2%.Ngoài ra, khi kết hợp sử dụng 10 TAA trên để chẩn đoán ở những người có AFPbiểu hiện bất thường độ nhạy tăng từ 66,2% lên 88,7% [11]

Hiện nay, nhiều nghiên cứu về proteomics miễn dịch ung thư đã xác địnhđược các kháng nguyên liên quan đến khối u Khi một TAA được xác định, các nhànghiên cứu sẽ dùng nhiều phương pháp khác nhau để mô tả một cách toàn diện về

TAA, mối liên hệ của TAA với quá trình chuyển dạng tế bào ác tính và xác nhận

tương tác của TAA với kháng thể kháng TAA nhằm đánh giá tiềm năng trở thànhchỉ thị để chẩn đoán miễn dịch ung thư Theo hướng này, năm 2011, Liu và cs đãtập trung nghiên cứu về hai TAA mới được tìm ra là p62 và p90 để tìm hiểu vai tròcủa chúng trong chẩn đoán miễn dịch [24]

Tại Việt Nam, những nghiên cứu proteomics mới chỉ được bắt đầu triển khaitại các Phòng thí nghiệm Trọng điểm (PTNTĐ) về công nghệ Gene và Protein đượcthiết lập trong giai đoạn 2001 - 2005 [2] Ở nước ta đã có một số nghiên cứu về ung thưgan sử dụng kỹ thuật proteomics, tuy nhiên, các nghiên cứu mới chỉ bước đầu phân tích

hệ protein mô gan của bệnh nhân ung thư, so sánh với mô gan của người bình thườngnhằm tìm ra các protein biểu hiện khác biệt trên hai loại mô này Năm 2010, nhómnghiên của chúng tôi thuộc Phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc PTNTĐCông nghê ̣ Enzyme và Protein , Trường Đ ại học Khoa học Tự nhiên đã ti ến hànhnghiên cứu phân tích proteomics mô gan bệnh nhân ung thư gan nguyên phát đã xácđịnh được 44 spot protein biểu hiện khác biệt giữa mô gan bệnh nhân ung thư so với

mô gan người bình thường, nhận dạng được 37/44 spot protein tương ứng với 28protein đã được định danh và 8 protein giả thuyết Trong đó, một số protein biểu hiệnkhác biệt đặc trưng giữa mô ung thư so với mô thường như: Annexin V, PCNA (biểuhiện tăng ở mô ung thư), p53, SODC (biểu hiện giảm ở mô ung thư) có tiềm năng trởthành chỉ thị của ung thư tế bào gan [20] Năm 2011, chúng tôi đã tiến hành phân tíchcác protein biểu hiện khác biệt của mô gan ung thư và mô gan lành trên cùng lá gan củabệnh nhân ung thư gan [6], đồng thời cũng tiến hành phân tích biểu hiện khác biệt củaprotein huyết tương của bệnh nhân ung thư gan sử dụng kỹ thuật điện di hai chiều [36]

Tiếp tục thực hiện hướng nghiên cứu proteomics ung thư gan tại Việt Nam,trong đề tài này, chúng tôi đã kết hợp phân tích proteomics mô gan của bệnh nhânung thư gan và thực hiện phản ứng miễn dịch Western blot hai chiều nhằm tìm racác protein có biểu hiện khác biệt, đặc biệt là các protein kháng nguyên phản ứngmiễn dịch với kháng thể trong huyết tương của bệnh nhân ung thư gan, đây là cácprotein có tiềm năng trở thành chỉ thị sinh học giúp chẩn đoán sớm ung thư gan

Tên hóa chất Nhà cung cấp

Ampholytes pH 4 - 7, pH 3 - 10 GE Health Care, MỹECL Advance Western Blotting Detection Kit Product

Peptide chuẩn (Insulin B; Angiotensin II)

Agarose low melting, Glycine, Urea, Tween 20 Sigma, MỹSDS, Acrylamide, Bis - Acrylamide Pharmacia, Thụy Điển

Chương 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 NGUYÊN LIỆU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu là mô gan tại vị trí có khối u của bệnh nhân ung thư tế bàogan nguyên phát và huyết tương của chính bệnh nhân đó Mẫu đối chứng là mô gancách ít nhất 5cm trên cùng lá gan tại vị trí không có khối u Danh sách bệnh nhânung thư gan được tiến hành nghiên cứu ghi tại Phụ lục 1

Mô gan và huyết tương sử dụng trong nghiên cứu này (15 mẫu) do Khoa Tếbào - Giải phẫu bệnh, Bệnh viện K2, Tam Hiệp cung cấp Mẫu mô đựng trong ốngeppendorf được vận chuyển bằng bình chứa nitơ lỏng và bảo quản ở tủ lạnh sâu-80oC, mẫu huyết tương được bảo quản ở tủ lạnh -20oC

2.1.2 Hóa chất

Bảng 3 Các hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu

Tất cả các hóa chất khác được sử dụng trong nghiên cứu đều đạt độ tinh sạchphân tích

2.1.3 Thiết bị

Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu sử dụng các dụng cụ, thiết bị trong PhòngProteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ

Enzyme và Protein, các thiết bị chính bao gồm:

- Máy ly tâm lạnh 5417R (Eppendorft, Đức), máy ly tâm K30 (Sigma, Đức)

- Thiết bị điện di đẳng điện Protean IEF cell (Biorad, Mỹ), Ettan IPGphor3

(GE - Healthcare, Mỹ)

- Thanh IPG strip pH 3 - 10, 17cm; IPG strip pH 4 - 7, 7cm (Biorad, Mỹ)

- Buồng điện di: Protean II xi multi-cell cho phép chạy 6 bản gel 17cm cùng

một lúc, Protean II XL cell chạy 2 bản gel kích thước 17cm và Mini-Protean

3 cell (Biorad, Mỹ) chạy các gel kích thước 7cm.

- Nguồn điện di PowerPacTMHC (Biorad, Mỹ)

- Hệ thống phân tích hình ảnh sử dụng phần mềm chuyên dụng phân tích bản

gel diện di hai chiều Phoretix (Shimadzu, Nhật Bản).

- Hệ thống phân tích khối phổ AXIMA - CRF PLUS (KRATOS ANALYTICAL, Anh).2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Xử lý mẫu mô gan

Mẫu mô gan lành và mô gan ung thư của cùng một bệnh nhân được cắt

nhuyễn trong cối sứ đặt trên đá lạnh, protein mô gan được chiết bằng đệm muối

phosphate (PBS) 0,05M, pH 7,4 và đệm phá tế bào (đệm Lysis) có chứa Urea 7M,Tris 30mM, CHAPS 4% w/v, DTT 65mM, PMSF 10mM Tiến hành ly tâm thu cácphân đoạn dịch chiết và kéo dài thời gian ly tâm lạnh với tốc độ cao để loại bỏ cácthành phần phi protein (lipid, ARN, DNA ) Quy trình chiết protein từ mô gan

được mô tả trong hình 3

Dịch thu được từ các phân đoạn gồm dịch chiết PBS1, PBS2, Lysis1, Lysis2

và Lysis3 sẽ được điện di trên gel polyacrylamide 10% có SDS để kiểm tra thành

phần và độ sạch Các mẫu chƣa đạt độ sạch sẽ đƣợc tủa bằng dung dịch Acetone100% theo tỷ lệ 1 thể tích mẫu và 4 thể tích dung dịch tủa ở -20oC trong 2 giờ.Protein lắng tủa đƣợc hòa lại bằng đệm Lysis Các dịch chiết của cùng một mẫuđƣợc trộn lại để chuẩn bị cho điện di hai chiều.

Hình 3 Quy trình chiết protein từ mô gan

2.2.2 Định lượng protein theo phương pháp Bradford

Để đảm bảo tính đồng nhất về lượng protein giữa các mẫu nghiên cứu, trướckhi chạy điện di hai chiều, chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng protein trongmẫu bệnh và mẫu đối chứng bằng phương pháp Bradford [9]

Phương pháp này định lượng bằng cách so màu và dựa trên sự thay đổi bướcsóng hấp thụ cực đại của phức protein với thuốc nhuộm coomassie brilliant blue.Dung dịch Bradford có tính axít thì độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 465nm, nhưngkhi kết hợp với protein thì độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 595nm Trước tiên,chúng tôi xây dựng đường chuẩn về độ hấp thụ của albumin huyết thanh bò đã biếttrước nồng độ sau đó tiến hành đo mẫu Từ số đọc của mẫu, dựa vào đường chuẩn

để xác định hàm lượng protein trong dịch chiết

2.2.3 Điện di hai chiều

Điện di hai chiều gồm: điện di phân vùng đẳng điện (IEF) để phân táchprotein theo điểm đẳng điện và điện di SDS-PAGE để phân tách protein theo khốilượng và hình dạng phân tử Quá trình này bắt đầu bằng việc làm trương thanh strip

có gradient pH cố định (IPG strip) bằng đệm trương gel có chứa protein, sau 2 giờ,protein sẽ thấm hết vào thanh strip Lượng protein tối đa mà sợi gel IPG strip dài7cm và 17cm có thể thấm tương ứng là 100µg và 400µg

Điện di đẳng điện được thực hiện trên hệ thống Protean IEF cell (Biorad,

Mỹ) hoặc Ettan IPGphor3 (GE - Healthcare, Mỹ) để tập trung các phân tử proteinvào vị trí tương ứng với pI của phân tử đó trên thanh IPG strip Quá trình chạy điện

di đẳng điện diễn ra theo 5 buớc được trình bày ở bảng 4

Kết thúc điện di đẳng điện, các thanh IPG strip được ngâm trong đệm cânbằng I (Tris HCl 50mM pH 8,8; urea 6M, glycerol 30%, SDS 2%, DTT 0,1%) ởnhiệt độ phòng và đệm cân bằng II (Tris HCl 50mM pH 8,8; urea 6M, glycerol30%, SDS 2%, IAA 0,25%), thực hiện trong bóng tối ở nhiệt độ phòng Mỗi bướccân bằng được thực hiện 3 lần, mỗi lần 10 phút

Hiệu điện thế (V) Thời gian (t) V.t (V - giờ) Chế độ tăng

Điện di chiều hai được tiến hành trên gel polyacrylamide 10% có SDS

(SDS-PAGE) để tiếp tục phân tách protein theo khối lượng phân tử

Bảng 4 Các bước chạy điện di đẳng điện trên thanh strip dài 7cm và 17cm

Trong nghiên cứu này, mỗi cặp mẫu bệnh và đối chứng của từng bệnh nhân

được tiến hành điện di hai chiều thành hai cặp bản gel Sau khi kết thúc điện di hai

chiều, một cặp bản gel được cố định protein bằng dung dịch chứa axit phosphoric

1,3%, methanol 20% trong một giờ, sau đó, nhuộm qua đêm bằng Coomassie G250

theo phương pháp nhuộm Colloidal Coomassie Brilliant Blue của Neuhoff (1988).

Phương pháp nhuộm này đạt độ nhạy cao, có thể hiện lên các spot chỉ chứa 30ng

protein [37] Hình ảnh các protein trên bản gel này được chụp lại, lưu giữ, phân tích

đánh giá mức độ biểu hiện và so sánh với cơ sở dữ liệu sẵn có hoặc cắt, thủy phân

spot protein để phân tích khối phổ Cặp bản gel còn lại sẽ được dùng để điện chuyển

sang màng PVDF để thực hiện phản ứng miễn dịch Western Blot

2.2.4 Western Blot

Western Blot hay còn gọi là kỹ thuật thẩm tách miễn dịch, đây là kỹ thuật

đang được sử dụng rộng rãi để phát hiện sự có mặt của các protein cụ thể trong mẫu

nghiên cứu dựa vào tương tác đặc hiệu của kháng nguyên - kháng thể Tiến hành kỹ

thuật Western Blot sử dụng kit ECL Advance TM Western blotting detetion (GE

Healthcare, Mỹ) để xác định kháng nguyên cố định là protein trong dịch chiết mô

gan sử dụng kháng thể bậc một là huyết tương của người bệnh và kháng kháng thể

(kháng thể bậc hai) liên kết với peroxidase cỏ ngựa (HRP), enzyme này xúc tác chophản ứng oxy hóa Luminol gây ra hiện tượng phát quang Sự phát sáng tối đa xuấthiện ở bước sóng 425nm Quá trình thực hiện gồm các bước sau:

Tiến hành điện đi biến tính để phân tách protein trong mô gan trên bản gelpolyacrylamide 10% có SDS

- Điện chuyển qua đêm ở 4oC để chuyển protein trong gel lên bề mặt màng

PVDF

- Nhuộm màng bằng dung dịch Ponceau S để kiểm tra hiệu quả chuyển màng,sau đó, tẩy trắng màng bằng H2O và ủ màng với dung dịch blocking trong 1 giờ

- Ủ màng qua đêm với dung dịch kháng thể bậc 1 (huyết tương của người

bệnh) đã pha loãng Sau đó, rửa sạch màng để loại bỏ kháng thể thừa và cácliên kết không đặc hiệu

- Ủ màng với dung dịch kháng thể bậc hai (kháng kháng thể gắn với HRP)

được pha loãng theo tỷ lệ 1:10.000 trong 1 giờ Rửa bỏ kháng thể thừa

- Ủ màng với dung dịch chứa Luminol và H2O2, để trong bóng tối 5 phút, ghilại hình ảnh phát quang trên màng PVDF

2.2.5 Phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều, kết quả Western Blot

Hình ảnh các bản gel điện di hai chiều và hình ảnh phát quang trên màng

PVDF sau khi thực hiện phản ứng kháng nguyên - kháng thể được số hóa bằng cách

quét vào máy tính có phần mềm chuyên dụng Phoretix (Shimazdu, Nhật Bản) để

phân tích hình ảnh Trước tiên, phần mềm sẽ xác định tất cả các spot protein có trênmỗi bản gel và màng, mỗi spot đều được xác định số thứ tự, vị trí, thể tích (tính theo

độ lớn và độ đậm nhạt của spot) trên bản gel/màng Phần mềm này còn cho phép xácđịnh các spot protein tương ứng trên từng cặp bản gel Dựa vào cường độ khối trungbình của từng spot (nomalized volume - được tính bằng thể tích của spot đó chia chotổng thể tích các spot trên toàn bản gel nhân với 100) có thể chỉ ra điểm khác biệtgiữa bản gel/màng mẫu bệnh so với bản gel/màng mẫu đối chứng (hình 4)