QUÁ TRÌNH THỰC tập tại VIỆN DI TRUYỀN NÔNG NGHIÊP VIỆT NAM

CTAB là một chất tẩy cation, hòa tan màng tế bào làm cho DNA dễ hòa tan hơn, biến tính protein vâ hình thành phức hợp với những polysaccharide, protein, polyphenol,… CTAB Là một loại ion

QUÁ TRÌNH THỰC TẬP TẠI VIỆN DI TRUYỀN NÔNG NGHIÊP VIỆT NAM

Người hướng dẫn: Anh Trần Duy Cường

Địa điểm: Từ Liêm, Hà Nội

Thời gian: Ngày 8/6/2015 - 12/6/2015

A: Tách chiết DNA từ genome mô thực vật

I Hóa chất và dụng cụ

a) Hóa chất

- Nước cất lạnh

- Nito lỏng

- Dung dịch chiết suất

- 10%(wt/vol) N-Lauryl sarkosyl

II: Các quá trình cơ bản của quá trình tách chiết DNA

Có rất nhiều phương pháp tách chiết , tinh sạch DNA khác nhau và cũng thành công trên nhiều đối tượng thực vật Tuy nhiên các phương pháp đều trải qua 3 qiai đoạn cơ bản:

a) Giai đoạn 1: Phá vỡ màng tế bào bằng phương pháp vật lí hay hóa học

Tuỳ từng loại tế bào, có cấu tạo thành và màng tế bào khác nhau mà chọn phương pháp thích hợp Đối với tế bào thực vật ta thường nghiền tế bào trong nito lỏng để phá vỡ tách tế bào.Nito lỏng có 2 tác dụng chính là làm cho vách xenllulose bị cứng gion, dễ bị vỡ khi nghiền và nito giữ cho mẫu ở trạng thái lạnh, trạng thái mà các enryme phá hủy axit nucleic không hoạt cho tới khi chúng bị ức chế bằng hóa chất Một số quá trình sử dụng vật liệu khô

dễ phá vỡ màng hơn, mặt khác sử dụng vật liệu đông khô không cần giữ mẫu

ở trạng thái lạnh, vì trong môi trường khô tuyệt đối cũng làm ức chế các enzyme phá hủy axit nucleic

CTAB (Cetryl Ammonium Bromide):Là loại hóa chất dung trong chiết suất axit nucleic có hiệu quả cao và đang được sử dụng rộng rãi hiện nay CTAB là một chất tẩy cation, hòa tan màng tế bào làm cho DNA dễ hòa tan hơn, biến tính protein vâ hình thành phức hợp với những polysaccharide, protein, polyphenol,… CTAB Là một loại ion dương có hoạt tính bề mặt, có khả năng liên kết thuận nghịch với DNA và polysaccharide, cụ thể ở nồng độ muối cao(trên 1,4 M Nacl có trong đệm chiết) thì CTAB kết hợp với DNA và polysaccharide nhưng phức hợp CTAB-DNA tồn tại ở trạng thái hòa tan, trong khi đó phức CTAB-Polysaccharide lại kết tủa- phức hợp này sau đó tách khỏi dung dịch tách chiết bằng hỗn hợp chloroform-isoamyl alcohol Nacl được thêm vào dể điều khiển nồng độ muối trong dung dịch Và như vậy, mercaptoethanol và PVP thường được thêm vào dung dịch ly trích để bảo vệ DNA.Đẻ tăng hiệu quả hoạt động của CTAB, mẫu được sử lý với nhiệt khoảng từ 550C-650C Ở nhiệt độ như vậy , nó còn có tác dụng làm rách thêm màng tế bào và màng nhân để giải phóng tối đa lượng axit nucleic ra dung dịch và làm biến tính một số protein, đặc biệt là enzyme phân hủy axit nucleic.

SDS(Sodium đoecyl sulfate): là một loại chất tẩy , có nhiệm vụ loại

bỏ những phân tủ lipit của màng, do đó sẽ làm đứt gãy màng tế bào và màng nhân thành từng mảng nhỏ cho phép DNA phóng thích ra bên ngoài

EDTA(Ethylenediamine tetra acetate): Trong phòng thí nghiệm, EDTA được sử dụng rộng rãi giữ các ion kim loại làm dừng hoat động của các enzyme để ngăn chặn thiệt hại cho DNA EDTA được thêm vào một số dung dịch đệm Khi màng tế bào bị phá vỡ, một loạt các chất được giải phóng ra dung dịch, trong số chúng có các loại enzyme thủy phân axit nucleic thành những vụn nhỏ, bởi vậy ức chế sự hoạt động của enzyme này bằng EDTA Các ion hóa trị 2 như: Mg2+ và Ca2+…rất cần thiết cho sự hoạt động của enzyme thủy phân axit nucleic Nếu trong dung dịch có EDTA, chất này sẽ lien kết với các ion hóa trị nói trên, liên kết này dẫn tới sự ức chế hoạt động của eyme thủy phân axit nucleic, do vậy mà axit nucleic sẽ không bị thủy phân.

Tris: Axit nuceic còn bị ảnh hưởng rất lớn bởi axit và kiềm của dung dịch trong tách chiết, axit có thể làm cho axit nucleic bị gãy, chẳng hạn axit HCL làm cho DNA bị đứt ở những vị trí purin, trong khi đó nếu ở nồng độ kiềm cao thì DNA sẽ

bị tách thành sợi đơn DNA ổn định khi tính axit của dung dịch ở Ph 8,0 Do trong mẫu có nhiều axit hữu cơ trong không bào và giữa các khe hở tế bào, vì thế các axit

đó làm thay đổi pH dung dịch gây tổn hại đến phân tử DNA Để loại trừ ảnh hưởng của axit và kiềm người ta sử dụng Tris để điều chỉnh ph của dung dịch; trong trường hợp như vậy ph của dung dịch sẽ ổn định khó bị thay đổi khi bị nhiễm axit hoặc kiềm

Proteinase K: Là enzyme phân giải protein, giúp loại bỏ những protein gắn kết với DNA và phá hủy enzyme của tế bào đảm bảo DNA tách ra được nguyên vẹn

b) Giai đoạn 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu.

Mẫu được sử ly bằng dung dịch phenol hoặc phenol / chloroform(1:1) sau đó bằng chloroform hoặc chloroform/ isoamyl alcolhol (24:1) Phenol và chloroform

là những chất hữu cơ có tác dụng biến tính protein và làm protein tan được trong pha hữu cơ nhưng không hòa tan ( DNA, RNA) nằm trong pha nước N goài ra chloroform còn có tác dụng loại bỏ các phân tử lipit cho nên cải thiện sự phân tách giữa pha nước và pha hữu cơ Isoamyl acohol thêm vào có tác dụng loại bỏ bọt và ngăn cản sự tạo bọt trong dung dịch khi trộn và ổn định 2 pha nước và phenol hoặc chloroform sau ly tâm

Nguyên lý của việc sử dụng phenol trong chiết suất DNA như sau; tuy ở nhiệt

độ thường phenol ở dạng tinh thẻ rắn ( tan chảy ở 80Oc) nhưng khi lẫn với khoảng 20% nước thì phenol ở dạng nhũ tương gồm các phân tử phenol ở giữa với các phân tử nước vây quanh Khi pha hỗn hợp này vào dung dịch tế bào, các phân tử phenol có tính kỵ nước nên có khuynh hướng lien kết vào vùng kỵ thủy của protein

ở bên trong cấu trúc của các phân tử này, kết cục làm protein trương phồng lên và

lộ xuất nhóm bên kỵ nước( của gốc axit) ra ngoài Các nhóm kỵ nước này của protein khi đó kết hợp với nhau tạo thành búi kết tủa gồm nhiều phân tử protein, trong khi đó DNA vẫn tiếp tục là chất tan trong nước và có thể hút sang ống chứa khác

Thao tác loại bỏ protein, lipit và các chất tan khác tan trong dung dịch DNA

là chiết suất bằng phenol rồi bằng phenol-chloroform sau đó bằng chloroform hoặc chloroform- isoamyl alcohol(24:1) Sử dụng cả 2 loại dung môi hữu cơ thường có hiệu quả cao hơn nhưng cũng có có thể chỉ dung một loại Tuy nhiên, nhiều khi cần phải loại bỏ hoàn toàn phenol khỏi dung dịch, khi đó cần phải lặp lại việc chiết suất bằng chloroform Phenol có ưu điểm có thể tan trong nước (ở mức độ nhất định) nên không cần khuấy trộn nhiều lân cũng có thể làm biến tinhsprotein tan trong nước, trong khi đó sử dụng chloroform hay chloroform-isoamyl alcohol thì phải trộn đảo kỹ vì các chất này không tan trong nước Pha thêm chloroform vào phenol làm tính kỵ nước của phenol tăng và làm tăng hiệu quả biến tính protein Sau khi ly tâm, pha nước chứa DNA nằm ở phía trên, protein sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nước và pha hữu cơ

c) Giai đoạn 3:Tủa và thu nhân DNA

Mục đích của việc tủa DNA là nhằm thu nhận DNA dưới dạng cô đặc, một mặt nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme, mặt khác có thể hòa tan chúng lại trong dung dịch theo nồng độ mong muốn

Sau k hi đã loại bỏ protein ta hút dung dịch nổi( pha nước chứa DNA) cho vào ống eppendorf mới, cho muối của cation hóa trị 1( thường dùng sodium acetate) và ethanol ( hoặc isopropanol) tuyệt đối lạnh để thực hiện việc tủa DNA Việc thêm muối làm DNA trở nên giảm tính tan Khi thêm muối vào , những ion mang điến tích dương của muối sẽ tương tác với điện tích aamcuar DNA gắn kết với nhau thay vì đẩy nhau.Ethanol tuyệt đối lạnh sẽ giúp loại bỏ các phần tử nước

và trong dung môi ethanol DNA khó tan hơn so vơi trong nước Đồng thời nhiệt

độ lạnh tạo thuận lợi cho việc tủa DNA.Như vâỵ trong môi trường có nồng độ ion cao (nồng độ muối cao) và nồng độ ethanol cao(2,5 thể tích ethanol/1 thể tích mẫu)

sẽ kết tủa mẫu

Sau khi tủa, DNA được thu nhận bằng cách ly tâm Để thực hiện việc tinh sạch DNA người ta dung ethanol 70% để rửa DNA Công đoạn này nhằn mục đích loại bỏ muối còn lien kết với DNA, lượng ethanol dư trong DNA được loại bỏ bằng cách phơi mẫu ở nhiệt độ phòng(15-30’) hay để trong tủ ấm 55o(5-10’) Sở

dĩ phải loại ethanol vì nó có thể ức phản ứng PCR Sau đó,DNA được hòa tan trong nước hoặc TE(đây là dung dịch gồm có Trí HCL và EDTA) để bảo quản

III: Các bước tiến hành.

- Gồm 20 bước:

- Chuẩn bị mô thực vật:

1 Lấy mẫu từ 10-20 g mô cây tươi( thường là bộ phận lá non).- lá lúa

2 Rửa mô bằng nước lạnh vô trùng rồi thấm khô

3 Cho mẫu vào cối, đổ dung dịch nito lỏng rồi nghiền kĩ thành bột( giữ mô ở trạng thái băng lạnh) Cắt lá thành các mẩu nhỏ rồi cho vào cối,lấy nito lỏng trong bình giữ lạnh đổ vào cối ,dùng chày nghiền từ từ ,khi nào hết lạnh thì bổ sung nito cứ làm như vậy cho tơi khi nào mẫu thành bột mịn

-Phá vỡ và phân giải tế bào:

4 Đưa bột nghiền vào ống ly tâm dung tích 250ml ngay lập tức, đổ dung dịch chiết suất đổ vào với lượng cứ 5-10ml dung dịch chiết xuất đổ vào 1

g mẫu cây tươi rồi khuấy trộn đều

5 Thêm lượng xấp xỉ dung dịch 10%( wt/ vol) Sarkosyl để có được nồng độ cuối cùng 1% vào mẫu

6 Ử ở nhiệt độ 550C trong 1-2 giờ

7 Ly tâm mẫu trong 10 phút với tốc độ 5500g ( v/p) ở nhiệt độ 400C để kết tủa toàn bộ lắng cạn bã, hút lấy phần dung dịch DNA phía trên ống nghiệm , chuyển sang ống nghiệm khác rồi ly tâm tiếp sang ống nghiệm khác rồi ly tâm tiếp nếu cần thiết để loại bỏ hết cạn bã không tan

- Kết tủa DNA:

8 Thêm vào 0.6 V Isopropanal vào dung dịch DNA, trộn nhẹ , DNA kết tủa lúc này có thể nhìn thấy nếu chưa nhìn thấy thì đặt vào tủ 2000C trong

11 Ử mẫu trong đá 30 phút, ly tâm 10 phút với tốc độ 8000 vòng / phút

ở nhiệt độ 400 C , rồi thu lấy phần dung dịch phía trên Sau li tâm có thể có 1 lớp tồn dư sakosy l trên bề mặt dung dịch, có thể bỏ đi bằng cách lọc dung dịch phía trên qua 2 lớp vải thưa

12 Thêm 0,5 ml dung dịch 10 mg/ml Ethydium Bromide vào rồi ủ trong đá 30 phút Chú ý Ethydium bromide là tác nhân gây đột biến, cần đeo găng tay khi tiếp xúc

13 Ly tâm với tốc độ 8000 vòng/phút ỏ nhiệt độ 40 C trong 10 phút Bước này có tác dụng làm kết tủa RNA, protein và cacbon hidrat

14 Chuyển dung dịch phía trên sang 2 ống nghiệm dung tích 5ml có thể ly tâm và bịt miệng được Nhớ rằng 2 ống nghiệm được đổ đầy, với lượng bằng nhau rồi bịt kín miệng lại

15 Ly tâm trong 4 tiếng với tốc độ 80000 vòng/ phút ở 200C hoặc ly tâm qua đêm ví tốc độ 60000 vòng/phút ở nhiệt độ 200C.

16 Thu nhận băng DNA, có thể sủ dụng kim tiêm xilanh lớn 15 G, tạo

1 lỗ ở náp ống nghiệm, sau đó đưa kim tiêm xilanh vào qua thành ống nghiệm trực tiếp ngay sau đưới vạch băng Nếu chỉ có 1 vệt băng xuất hiện thì có thể nhìn thấy qua đèn UV

17 Loại bỏ Ethydium Bromide bằng cách chiết tách lặp lại mẫu DNA thu được với Isopropanol

18 Thêm 2 thể tích nước và 6 thể tích Ethanol vào dung dịch chứa DNA, chộn đều rồi ủ 1 giờ ở nhiệt độ -200C Ly tâm 10 phút với tốc độ 8000 vòng/phút ở nhiệt độ 40 C

19 Hòa tan kết tủa DNA trong dung dịch TE và kết tủa lại bằng cách

đổ 1/10 thể tích dung dịch 3M Sodium Acetate và 2 phần thể tích Ethanol Nếu chưa nhìn thấy kết tủa thì ủ lại tại nhiệt độ -200C đến khi có kết tủa thu được

20 Làm khô DNA hòa tan trong TE

B Kỹ thuật PCR

PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction, được

dịch ở một vài sách là Phản ứng chuỗi trùng hợp cũng có sách gọi là "phản

ứng khuếch đại gen" PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E coli hay nấm men PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng, chẩn đoán những bệnh nhiễm trùng,

tách dòng gene, và xác định huyết thống

1)Lịch sử: Phương pháp căn bản chạy PCR được Kary Mullis phát minh, ông đã đoạt

giải Nobel về Hóa học vào tháng 10 năm 1993 cho thành tựu này, chỉ sau 7 năm khi ông đưa

ra ý tưởng Ý kiến của Mullis là phát triển một quy trình mà DNA có thể nhân lên nhiều lần một cách nhân tạo qua nhiều chu kỳ sao chép bởi enzyme DNA polymerase.

DNA polymerase có tự nhiên trong sinh vật sống, nơi mà nó thực hiện chức năng nhân DNA khi tế bào phân chia Nó làm việc bằng cách nối với sợi DNA và tạo sợi bổ sung Theo quy trình PCR gốc của Mullis, enzyme phản ứng nhân bản DNA được thực hiện trong ống nghiệm (in vitro) Sợi DNA đôi bị tách thành 2 sợi đơn khi đun nóng ở 96 °C Tuy nhiên, ở nhiệt độ này DNA polymerase bị phá hủy vì vậy cần bổ sung enzyme sau mỗi giai đoạn nung nóng của mỗi chu kỳ Quy trình PCR gốc của Mullis không có hiệu quả cao vì nó mất nhiều thời gian, cần một lượng lớn DNA polymerase, và phải liên tục lưu ý suốt trong quá trình PCR.

Sau đó, quy trình gốc này được phát triển bằng cách dùng DNA-Polymerase lấy từ vi khuẩn thermophilic (ưa nhiệt) sống trong mạch nước phun ở nhiệt độ trên 110 °C DNA polymerase

từ sinh vật này là thermostable (ổn định ở nhiệt độ cao) và khi dùng trong PCR nó không bị phá vỡ khi hỗn hợp được nung nóng để tách sợi DNA Từ đó, không cần phải thêm DNA- polymerase vào mỗi chu kỳ, quá trình sao chép DNA có thể đơn giản và tự động hơn.

Một trong những DNA-polymerase chịu nhiệt đầu tiên được phân lập được từ Thermus

aquaticus và được gọi là Taq Taq polymerase được dùng rộng rãi trong thực nghiệm PCR

(5/2004) Nhược điểm của Taq là thỉnh thoảng nó nhầm lẫn trong quá trình sao chép DNA, dẫn đến đột biến (sai) trong chuỗi DNA, vì nó thiếu tính sửa sai exonuclease 3’-5’ Các polymerase như Pwo hay Pfu, được phân lập từ Archaea có cơ chế sửa sai (cơ chế kiểm tra lỗi sai) và có thể làm giảm một cách đáng kể số đột biến xảy ra trong chuỗi DNA được sao chép Ngày nay, sự kết hợp giữa Taq và Pfu có thể cung cấp cả độ tin cậy cao lẫn sự nhân bản chính xác của DNA.

2, Vấn đề bản quyền của kỹ thuật PCR

enzyme Taq polymerase cũng được bao phủ bởi các bằng sáng chế Đã có nhiều vụ kiện cao cấp liên quan đến kỹ thuật , bao gồm nổi tiếng nhất là một vụ kiện của DuPont Các công ty dược phẩm Hoffmann - La Roche mua được quyền bằng sáng chế vào năm 1992 và hiện đang nắm giữ chúng Kỹ thuật PCR đã được cấp bằng sáng chế Cetus Corporation, nơi Mullis làm việc khi ông phát minh kỹ thuật Các

a)Nguyên lý của kỹ thuật PCR

Từ một đoạn ADN chọn lọc , nó sẽ được nhân lên gấp hàng triệu lần hoặc hơn nữa trong một thời gian ngắn Trong thời gian này, sự sao chép ADN được tạo ra trong môi

trường in vitro như trong quá trình phân bào.

Để tạo được quá trình này, trước tiên chuỗi ADN kép được làm nóng đến mức bị tách thành hai nhánh đơn Làm nguội các nhánh đơn này rồi nhờ xúc tác của enzym ADN polymerase và các tiền chất deoxynucleotid tương ứng để nhánh ADN bổ sung được tổng hợp Trong ống nghiệm, quá trình này không thể tự xảy ra được mà phải có các đoạn ADN mồi (primers) sẽ tổng hợp với những vị trí bổ sung trên hai chuỗi đơn Các đoạn mồi khởi động đặc thù thường được tổng hợp nhân tạo Từ vị trí gắn của mồi khởi động, nhánh bổ sung sẽ được tổng hợp Mồi khởi động mang tính đặc thù riêng cho mỗi ADN có trình tự nhất định Với mỗi loại mồi khởi động thì chỉ ADN đặc hiệu với nó được sao chép.

Sau khi các chuỗi bổ sung đã được tổng hợp xong, hai chuỗi kép được tạo thành qua quá trình này sẽ lại được dùng nhiệt để tách ra và quá trình tổng hợp lại được lặp lại như trên để sản sinh ra 4 chuỗi ADN và cứ như thế tiếp diễn.

Bằng cách sử dụng một loại ADN polymerase bền với nhiệt

(Taq polymerase), có thể trộn lẫn bệnh phẩm với các tiền chất deoxynucleotid,

mồi thử cho hai chuỗi và polymerase, sau đó hỗn hợp này được đưa vào chu trình xử lý bằng nhiệt độ thích hợp với sự tách chuỗi, tiếp cận của mồi và tổng hợp các chuỗi bổ sung Trong vòng 60 phút, sự khuếch đại có thể lên đến 1 triệu lần ADN khuếch đại sẽ dễ dàng được phát hiện bằng các phương pháp khác nhau, thông thường nhất, bằng điện di trên gel agarose và nhuộm bằng ethidium bromide

ADN polymerase chịu nhiệt đầu tiên được sử dụng có nguồn gốc từ vi

hết Taq polymerase đều được trích từ E coli tái tổ hợp.

b) Các yếu tố cần thiết trong phản ứng PCR.

Các thành phần chính của PCR gồm : ADN khuôn, dNTP, mồi ( primer), enzyme polymerase( Taq), MgCl2 và đệm PCR; phản ứng được thực hiện trong máy chu

kỳ nhiệt, hay còn gọi là máy PCR

+ ADN khuôn

ADN khuôn ( ADN template) hay còn gọi là ADN mục tiêu được sử dụng làm khuôn để các mồi PCR gắn vào vị trí bổ sung với nó, sau đó với sự tham gia của các thành phần cần thiết , phản ứng tổng hợp sẽ diễn ra tạo nên một đoạn ADN mới giống hệt đoạn ADN nằm giữa hai vị trí gắn mồi

Từ chu kỳ thứ hai trở đi, ngoài ADN khuôn ban đầu, những đoạn ADN vừa được tổng hợp cũng được sử dụng làm khuôn cho những chu kỳ tổng hợp tiếp theo Lượng ADN khuôn rất nhỏ khoảng từ 10ng cho đến 100ng Do lượng ADN cần thiết nhỏ như vậy, nên khi chuẩn bị ADN khuôn phải hết sức chú ý tránh bị lẫn ADN từ các nguồn khác và cần phải có ADN có độ nguyên vẹn cao

+ Mồi PCR

Mồi là một đoạn oligonucleotit ngắn, có chiều dài khoảng từ 6 đến 70 nucleotit, những mồi ngẫu nhiên ( mồi RAPD) có chiều dài khoảng 10 nucleotit và đa số các mồi PCR có chiều dài khoảng 20 đến 30 nucleotit

Thiết kế mồi: Khi thiết kế mồi, người ta thường quan tâm sao cho không có sự bổ sung giữa

các bazơ nitơ trong cùng một mồi và giữa các mồi Vì phản ứng tổng hợp được bắt đầu từ đuôi 3’ của mồi; do vậy để nâng cao hiệu quả gắn mồi và tính đặc hiệu của phản ứng, người

ta thường quan tâm đến việc thiết kế sao cho đuôi 3’ của chúng là các bazơ G hoặc C để tạo

ra sự bắt cặp chắc chắn hơn và đặc hiệu hơn so với cặp A và T.

Nhiệt độ gắn mồi : Trong PCR phải tìm được nhiệt độ thích hợp nhất cho mồi gắn vào ADN

khuôn Để xác định nhiệt độ gắn mồi tương đối ban đầu, người ta đã dựa trên những công thức toán khác nhau.

Đối với mồi có chiều dài ≤ 20 bazơ thì nhiệt độ gắn mồi được tính theo công thức sau: Tm

( o C) = {2 x (A + T) + 4 x (G + C)}

Đối với những mồi có chiều dài từ 20 đến 35 bazơ thì nhiệt độ gắn mồi được tính theo công

thức : Tm ( oC) = 22 + 1,46 x {[2 x (C +G) + ( A + T)]}

Đối với những mồi có chiều dài từ 35 đến 70 bazơ thì nhiệt độ gắn mồi được tính theo công

thức:Tm ( o C) = 81,5 + 16.6 log10C + + 0,41 (% của G + C) – 600/L Trong đó C+ là nồng độ của cation hóa trị một ( Na + ), tính theo nồng độ của phân tử; L là chiều dài mồi.

Trong thực tế nhiệt độ gắn mồi có thể dao động từ 3 o C đến 15 o C so với nhiệt độ tính toán được từ các công thức Nhiệt độ gắn mồi tối ưu được rút ra qua thí nghiệm cụ thể.

Nồng độ mồi: Nồng độ cụ thể phụ thuộc vào từng thí nghiệm và mục đích nghiên

cứu Nếu nồng độ mồi quá thấp sẽ không đủ cho phản ứng và nồng độ mồi quá cao có thể dẫn tới sai lệch kết quả.

Thời gian gắn mồi: Thời gian gắn mồi vào khuôn thường dao động trong khoảng 30-60

giây Nếu thời gian gắn mồi lâu sẽ gây sai lệch kết quả phản ứng do sự gắn mồi không đặc hiệu, hơn nữa kéo dài thời gian phản ứng là suy giảm sự hoạt động của enzyme Taq.

+ Enzyme tổng hợp ADN

Là một thành phần quan trọng của phản ứng PCR Trong điều kiện thích hợp cùng với các thành phần cần thiết khác, enzym hoạt động tổng hợp nên ADN mới Nồng độ sử dụng enzym phụ thuộc vào mỗi loại enzym và thuộc tính của nó Nếu quá nhiều enzym có thể sẽ làm tăng nồng độ glycerol trong dung dịch phản ứng, dẫn tới quá trình tổng hợp không đồng đều giữa các vị trí và tạo ra hình ảnh điện di không rõ nét Ngược lại, nếu quá ít sẽ thiếu enzym và kết quả nhận được là sản phẩm tổng hợp không đầy đủ

+ Dung dịch đệm PCR

Dung dịch đệm chung nhất của PCR bao gồm các thành phần KCl, MgCl2 và Tris Muối KCl góp phần làm tăng hiệu quả của phản ứng, thông thường những mồi cho sản phẩm PCR với kích thước lớn hơn thì hoạt động tốt hơn trong môi trường có nồng độ muối thấp hơn và ngược lại những cặp mồi cho sản phẩm PCR ngắn hơn sẽ hoạt động tốt hơn trong môi trường có nồng độ muối cao hơn MgCl2 là nhân tố cần thiết để enzym Taq hoạt động, nếu nồng độ MgCl2 thấp, sẽ ức chế sự hoạt động của enzym Taq, tuy nhiên nếu nồng độ quá cao sẽ cho kết quả PCR không đặc hiệu Tris có vai trò giữ cho pH dung dịch ổn định, sự thay đổi nồng độ của Tris không ảnh hưởng nhiều đến kết quả phản ứng PCR

c, Quy trình

Quy trình PCR gồm 20 đến 30 chu kỳ Mỗi chu kỳ gồm 3 bước (Hình 2)

(1)Nhiệt độ tăng lên 94-96 °C để tách hai sợi DNA ra Bước này gọi là biến tính,

nó phá vỡ cầu nối hydrogen nối 2 sợi DNA Trước chu kỳ 1, DNA thường được biến tính đến thời gian mở chuỗi để đảm bảo mẫu DNA và mồi được phân tách hoàn toàn và chỉ còn dạng sợi đơn Thời gian: 1-2 phút

(2)Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ thấp xuống để mồi có thể gắn vào sợi DNA đơn Bước này gọi là gắn mồi Nhiệt độ giai đoạn này phụ thuộc vào đoạn mồi và thường thấp hơn nhiệt độ biến tính 50 °C (45-60 °C) Sử dụng sai nhiệt độ trong giai đoạn này dẫn đến việc đoạn mồi không gắn hoàn toàn vào DNA mẫu, hay gắn một cách tùy tiện Thời gian: 1-2 phút

(3) Cuối cùng, DNA polymerase gắn tiếp vào sợi trống Nó bắt đầu bám vào và hoạt động dọc theo sợi DNA Bước này gọi là kéo dài Nhiệt độ kéo dài phụ thuộc DNA-polymerase Thời gian của bước này phụ thuộc vào cả DNA-polymerase và chiều dài mảnh DNA cần khuếch đại Như một quy tắc …, 1000bp/ 1 phút

Figure 2: Hình 2: Chu trình PCR dưới dạng sơ đồ (1) Nóng chảy ở 96°C (2)Gắn mồi ở

68°C (3)Kéo dài ở 72°C (P=Polymerase) (4)Chu trình đầu tiên hoàn thành Hai sợi DNA kết quả thành DNA mẫu cho chu trình kế tiếp, mặc dù gấp đôi lượng DNA bản sao cho mỗi chu kỳ.

Ví dụ

Thời gian và nhiệt độ trong ví dụ này được lấy từ chương trình PCR mà đã thành công trên phân đoạn

250bp của đầu C của insulin-like growth factor (IGF).

100 µl hỗn hợp phản ứng (sử dụng ống eppendorf 200 μl) được đưa vào máy PCR.l) được đưa vào máy PCR.

Quy trình PCR bao gồm các bước sau:

3 Các bước tiến hành

Bước 1: Pha loãng DNA: Dùng Pipec 10 hút 6µl và 30µl nước sau đó lắc nhẹ.Bước 2 : Pha loãng mồi gốc nồng độ 100pmol /ml: 10ml gốc + 90 µl nước.Bước 3: Lấy DNA pha loãng mỗi loại vào từng ống PCR

D Kỹ thuật RAPD

RAPD là viết tắt của cụm từ tiếng Anh: Randomly Amplified Polymorphic ADN (Đa hình ADN được nhân bản ngẫu nhiên) Nó là kỹ thuật được xây dựng dựa trên nguyên lý PCR, với những mồi được thiết kế ngẫu nhiên có chiều dài khoảng 10 nucleotide Trong phản ứng, các mồi RAPD gắn ngẫu nhiên vào ADN khuôn ở bất

kỳ vị trí nào mà có trình tự bổ sung với nó

Phản ứng sau đó xảy ra với sự tham gia của enzym Taq, dNTP và các thành phần khác Kỹ thuật này chỉ sử dụng một lượng nhỏ ADN khuôn (khoảng 25ng) Sản phẩm PCR được điện di trong gel agarose và phát hiện bằng cách nhuộm với dung dịch ethidium bromide, kích thước sản phẩm có chiều dài từ 200bp đến 2000 bp

Về cơ bản, chỉ thỉ RAPD là một chỉ thị trội, nghĩa là chỉ thị này không phân biệt được giữa những cá thể đồng hợp tử và dị hợp tử trong quần thể F2 RAPD là một

kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện, không mất nhiều thời gian, ít tốn kém Kỹ thuật này rất phù hợp cho phân tích đa dạng di truyền và lập bản đồ gen sử dụng quần thể RIL (Recombinant Inbred Line) Hạn chế lớn nhất của kỹ thuật RAPD đó là nó rất nhậy cảm với nhiều yếu tố như: các thành phần tham gia phản ứng và đặc biệt

là nhiệt độ gắn mồi, vì yếu tố gắn mồi mà có thể có hai kết quả khác nhau với cùng một thí nghiệm sử dụng hai máy PCR khác nhau Để hạn chế nhược điểm này, cần phải tuân thủ nghiêm ngặt các điều kiện thí nghiệm và phải tiến hành đồng bộ giữa các lần thí nghiệm

E Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat hay Microsatelite)

Khi nghiên cứu genom của một số sinh vật người ta đã phát hiện ra những đoạn ADN có chiều dài khác nhau phân bố một cách ngẫu nhiên mà trình tự của nó bao gồm các nhóm nucleotide giống nhau nhắc lại nhiều lần; các nhóm này thưòng có

số lượng từ 2 đến 6 nucleotit, lặp lại từ vài đến hàng trăm lần

Những đoạn ADN lặp lại như vậy được gọi là Microsatelite hay còn có các tên khác như: SSLPs (simple sequence length polymorphisms), SSRs (simple sequence repeats)

Các đoạn ADN nhắc lại này có trình tự hai đầu rất đặc trưng cho mỗi đoạn; bởi vậy mà trình tự đặc trưng ở hai đầu của đoạn nhắc lại này đã được sử dụng để thiết kế mồi cho PCR Do có sự khác nhau về chiều dài giữa các đoạn nhắc lại, bởi vậy mà kỹ thuật nhận dạng ADN Microsatelite rất phù hợp trong nghiên cứu

đa hình; lập bản đồ và phân lập gen Cũng giống như kỹ thuật RAPD, kỹ thuật SSR đơn giản, thuận tiện, không tốn kém; mặt khác Microsatelites là chỉ thị đồng trội nên nó được sử dụng để phát hiện cá thể dị hợp tử và lập bản đồ gen sử dụng quần thể F2