Phân tích biến đổi của gen CXCL12 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng

DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1 Hình ảnh đại trực tràng và polyp đại tràng nội soi Hình 2 Các giai đoạn phát triển của ung thư đại trực tràng Hình 3 Hình ảnh điện di ADN tổng số tách từ máu Hìn

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-


  -

PHẠM THỊ BÍCH

PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI CỦA GEN CXCL12

Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2012

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Phạm Thị Bích

PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI CỦA GEN CXCL12

Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS Trịnh Hồng Thái

Hà Nội – 2012

LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Trịnh Hồng Thái, người

thầy đã rất quan tâm, tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập và

thực hiện luận văn này

Trong quá trình học tập, làm việc và thực hiện luận văn, tôi đã nhận được sự

giúp đỡ của các anh chị và các bạn sinh viên làm việc tại Phòng Proteomics và Sinh

học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein,

trường Đại học Khoa học tự nhiên Tôi xin chân thành cảm ơn

Để thực hiện tốt luận văn này, tôi đã nhận được sự quan tâm, giúp đỡ của cán

bộ nhân viên thuộc khoa Trữ máu của Viện huyết học và Truyền máu Trung Ương;

khoa Tế bào và Giải phẫu bệnh thuộc Bệnh viện K- Tam Hiệp, Hà Nội Tôi xin

chân thành cảm ơn

Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã khích lệ, động viên và

luôn bên tôi trong suốt thời gian qua

Hà Nội, tháng 03 năm 2012

Phạm Thị Bích

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 TÌM HIỂU VỀ UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG 3

1.1.1 Khái quát về ung thư 3

1.1.2 Ung thư đại trực tràng là gì 4

1.1.3 Các tác nhân gây ung thư đại trực tràng 4

1.1.4 Các hệ thống phân giai đoạn ung thư đại trực tràng 6

1.2 CHỈ THỊ SINH HỌC TRONG UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG 8

1.2.1 Chỉ thị sinh học là gì 8

1.2.2 Một số biến đổi về gen liên quan đến ung thư đại trực tràng 9

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI GEN LIÊN QUAN ĐẾN BỆNH UNG THƯ………12

1.4.CHEMOKINE CXCL12 VÀ VAI TRÒ TRONG UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG ……… 16

1.4.1 Chemokine 16

1.4.2 Chemokine CXCL12 và thụ thể của nó CXCR4 19

1.5 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ĐA HÌNH VÀ METHYL HÓA GEN CXCL12 Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG 21

Chương 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 23

2.1 NGUYÊN LIỆU 23

2.1.2 Hóa chất 23

2.1.3 Thiết bị 24

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.2.1 Tách chiết ADN tổng số từ mô 24

2.2.2 Tách chiết ADN tổng số từ máu 25

2.2.3 Khuếch đại gen CXCL12 bằng phương pháp PCR 27

2.2.4 Phân tích RFLP 28

2.2.5 Khuếch đại vùng promoter của gen CXCL12 bằng kỹ thuật MSP 29

2.2.6 Điện di kiểm tra sản phẩm 32

2.2.7 Kỹ thuật nhuộm bạc 33

2.2.8 Dự đoán vùng promoter và xác định phân bố đảo CpG xung quanh vị trí khởi đầu phiên mã của gen CXCL12 34

2.2.9 Phân tích số liệu bằng phương pháp thống kê 34

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

3.1 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH PCR - RFLP 35

3.1.1 Tách chiết ADN tổng số từ mẫu máu 35

3.1.2 Kết quả khuếch đại đoạn gen CXCL12 bằng PCR 36

3.1.3 Kết quả phân tích RFLP 37

3.1.4 Phân tích số liệu bằng phương pháp thống kê 41

3.2 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH TÌNH TRẠNG METHYL HÓA GEN CXCL12 47

3.2.1 Kết quả tách chiết ADN từ mẫu mô 47

3.2.2 Kết quả xác định phân bố đảo CpG xung quanh vị trí khởi đầu phiên mã của gen CXCL12 48

3.2.3 Khuyếch đại đoạn trình tự nằm trong đảo CpG thuộc vùng promoter của gen CXCL12 bằng kỹ thuật MSP 52

3.2.4 Phân tích tích tình trạng methyl hóa vùng promoter của gen CXCL12

ở bênh ung thư đại trực tràng 53

KẾT LUẬN 62

KIẾN NGHỊ 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO 64

PHỤ LỤC 1 i

PHỤ LỤC 2 ii

PHỤ LỤC 3 iv

PHỤ LỤC 4 ix

PHỤ LỤC 5 x

BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Acid Deoxyribo Nucleic

AJCC American Joint Committee on Cancer

CEA Carcinoembryonic antigen (kháng nguyên ung thư)

CIN Chromosomal instability (sự bất ổn định nhiễm sắc thể) CPG-CIMP CpG island methylator phenotype

CRC Colorectal cancer (ung thư đại trực tràng)

CXCL12 CXC ligand 12 (phối tử dạng CXC 12)

CXCR4 CXC receptor 4 (thụ thể dạng CXC 4)

DHPLC Denaturing high performance liquid chromatography

FAP Familial adenomatous polyposis (hội chứng polyp u tuyến

theo dòng họ) FOBT Fecal occult blood test (xét nghiệm máu trong phân) IUAC International Union Against Cancer

HNPCC Hereditary nonpolyposis colon cancer (ung thư ruột kết

không polyp di truyền) LOI Loss of imprinting (sự mất dấu ấn)

MAPK Mitogen activated protein kinase

MSI Microsatellite instability (sự bất ổn định vi vệ tinh)

MSP Methyl specific polymerase chain reaction (phản ứng

chuỗi trùng hợp đặc hiệu methyl)

NCBI National Center for Biotechnology Information

PI3KCA Phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit

PCR- RFLP Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length

Polymorphism SNP Single nucleotide polymorphism (Đa hình nucleotide đơn) SSCP Single strand conformation polymorphism

TEMED Tetramethylethylenediamine

TGF β Transforming growth factor β (yếu tố tăng trưởng chuyển

hóa β) TNF Tumor necrosis factor (Yếu tố gây hoại tử khối u)

TNM Tumor- lymph node- metastases (khối u-hạch-di căn)

UTĐTT Ung thư đại trực tràng

Bảng 11 Tần xuất alen của gen CXCL12 của mẫu bệnh theo giới tính

Bảng 12 Tần xuất alen của gen CXCL12 của mẫu bệnh theo độ tuổi

Bảng 13 Tỷ lệ methyl hóa và không methyl hóa vùng promoter của gen CXCL12

trên mô u và mô lân cận u

Bảng 14 Thống kê tỷ lệ methyl hóa trong vùng promoter của gen CXCL12 theo

các đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân ung thư đại trực tràng

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 Hình ảnh đại trực tràng và polyp đại tràng nội soi

Hình 2 Các giai đoạn phát triển của ung thư đại trực tràng

Hình 3 Hình ảnh điện di ADN tổng số tách từ máu

Hình 4 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của gen CXCL12

Hình 5 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt ADN bằng enzyme MspI với 3 băng

Hình 8 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt ADN bằng enzyme MspI với 1 băng 302bp

Hình 9 Hình ảnh điện di ADN tổng số tách từ mô

Hình 10 Kết quả khảo sát đảo CpG sử dụng phần mềm MethPrimer

Hình 11 Kết quả khảo sát đảo CpG sử dụng phần mềm cpgplot

Hình 12 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của gen CXCL12

Hình 13 Tỷ lệ methyl và unmethyl khảo sát trên 2 loại mô u và lân cận u

Hình 14 Hình ảnh điện di sản phẩm MSP của gen CXCL12 của bệnh nhân ung thư

đại trực tràng

MỞ ĐẦU

Ung thư trực tràng là bệnh lý hay gặp trong ung thư đường tiêu hóa, đứng hàng thứ hai sau ung thư dạ dày và chiếm 1,4 % trong tổng số ung thư Bệnh tiến triển tương đối chậm, di căn muộn, nếu phát hiện sớm, điều trị kịp thời và triệt để thì tỷ lệ sống trên 5 năm đạt 60-80% [26] Tuy nhiên bệnh thường được phát hiện ở giai đoạn muộn khi đã di căn hay biến chứng, do đó hiệu quả điều trị rất hạn chế

Hàng năm, trên thế giới có khoảng 650.000 người được chẩn đoán mắc bệnh ung thư đại trực tràng và có khoảng 150.000 người chết vì căn bệnh này, đây là loại ung thư nguy hiểm đứng hàng thứ ba gây tử vong trên thế giới và đứng hàng thứ hai gây ra tử vong tại Mỹ Tại Việt Nam, bệnh này chiếm khoảng 15% trong số các loại ung thư và đang gia tăng một cách rõ rệt Gần đây, do sự thay đổi trong thói quen ăn uống giàu chất đạm, ít chất xơ, lạm dụng thức ăn nhanh khiến ung thư đại trực tràng ngày càng phổ biến Tuổi mắc căn bệnh chết người này ngày càng trẻ hóa, nhiều trường hợp mới 18 - 20 tuổi, thậm chí có trẻ mới 12 đã mắc ung thư đại trực tràng [30]

Trên thế giới ung thư đại trực tràng luôn được các nhà sinh y học quan tâm,

có nhiều nghiên cứu genomics, transcriptomics, proteomics đã được tiến hành Mục tiêu của những nghiên cứu này nhằm tìm ra những chỉ thị sinh học cho việc chẩn đoán bệnh sớm hơn để điều trị kịp thời Tuy nhiên, đến nay, mới chỉ có carcinoembryonic antigen (CEA) là chỉ thị sinh học thường dùng cho chẩn đoán bệnh cho các bệnh nhân trong giai đoạn III, IV, nhưng chi phí cho xét nghiệm còn rất tốn kém[38].Vì vậy, việc tìm ra những chỉ thị mới dễ nhận biết và có thể phát hiện chính xác giai đoạn ung thư là cần thiết Genomics và proteomics là những lĩnh vực nghiên cứu cho phép xác định các chỉ thị đặc trưng cho bệnh, phục vụ cho công tác chẩn đoán, điều trị và tìm nguyên nhân bệnh

Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Phân tích biến đổi của gen

CXCL12 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng”, nhằm mục tiêu:

1 Nghiên cứu đa hình gen CXCL12 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng:

- Xác định được tính đa hình của gen CXCL12 ở bệnh nhân ung thư đại trực

tràng, so sánh với các mẫu đối chứng

- Đánh giá mức độ liên quan giữa tính đa hình của gen CXCL12 với các đặc

điểm lâm sàng của bệnh ung thư đại trực tràng ở Việt Nam

2 Phân tích tình trạng methyl hóa promoter của gen CXCL12 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng:

- Xác định được sự phân bố của đảo CpG và mật độ nucleotide CpG trong

các đảo CpG thuộc vùng promoter của gen CXCL12

- Xác định được tình trạng methyl hóa của 1 đảo CpG thuộc vùng promoter

của gen CXCL12

- Đánh giá mối liên quan giữa tình trạng methyl hóa gen CXCL12 với các đặc

điểm bệnh học lâm sàng của ung thư đại trực tràng ở người Việt Nam

Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Chương 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TÌM HIỂU VỀ UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

1.1.1 Khái quát về ung thư

Ung thư (u ác tính) là một loại bệnh của các tế bào, biểu hiện là sự phát triển không bình thường của các tế bào, tăng sinh nhanh chóng về số lượng một cách không kiểm soát được và tế bào không tuân theo các cơ chế kiểm soát và phát triển của cơ thể [33] Trong một số trường hợp, chúng di căn (lan tràn tới các cơ quan ở xa) (bảng 1)

Bảng 1 Phân biệt hai khái niệm u lành tính và ung thư theo đặc điểm sinh bệnh học

- Rất ít tái phát và ít ảnh hưởng tới cơ thể

- Tế bào ít biệt hóa

- Phân bào nhanh, không tuân theo sự kiểm soát của chu trình tế bào

- Xâm lấn xung quanh

- Không có vỏ bọc

- Thường hoại tử

- Ảnh hưởng lớn tới cơ thể

Ung thư không phải là một bệnh Bệnh này là một nhóm của hơn 100 bệnh khác nhau

Ung thư có thể có nguồn gốc từ bất cứ tế bào nào của cơ thể và có rất nhiều loại khác nhau trong mỗi vùng của cơ thể Hầu hết các bệnh ung thư được đặt tên theo loại tế bào hoặc cơ quan nơi chúng phát sinh Nếu một khối ung thư lan rộng ra (di căn), thì khối u mới mang tên giống với tên của khối u nguồn gốc đầu tiên [33]

1.1.2 Ung thư đại trực tràng là gì

Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là căn bệnh phổ biến, đứng hàng đầu trong ung thư đường tiêu hóa tại các nước Âu Mỹ Tại Việt Nam và các nước châu Á, UTĐTT đứng thứ hai trong ung thư đường tiêu hóa sau ung thư dạ dày Ở nước ta, mỗi năm có khoảng hơn 7.300 người mới mắc và hơn 4.100 người tử vong do ung thư đại trực tràng [34] Ung thư đại trực tràng là ung thư biểu mô phổ biến hiện nay, bao gồm ung thư đại tràng và ung thư trực tràng Đại tràng là phần ruột lớn hình chữ N gồm đoạn lên, đoạn ngang và đoạn xuống Trực tràng là phần ruột thẳng nối giữa đại tràng và hậu môn Ung thư thường xảy ra ở đoạn nối giữa đại tràng và trực tràng (hình 1) Ung thư đại tràng và ung thư trực tràng thường có liên hệ với nhau

và khó có thể xác định ung thư nào xảy ra trước, ung thư nào xảy ra sau, vì thế chúng được gọi chung là ung thư đại trực tràng [35]

Hình 1 Hình ảnh đại trực tràng và polyp đại tràng nội soi [35]

1.1.3 Các tác nhân gây ung thư đại trực tràng

Các loại ung thư khác nhau có tác nhân gây bệnh khác nhau Trong ung thư đại trực tràng thì có rất nhiều tác nhân và các nghiên cứu cho thấy các tác nhân sau đây có thể gây nguy cơ bị bệnh ung thư đại trực tràng:

• Polyp đại trực tràng là bệnh khá thường gặp, đây là những khối u lồi vào

trong lòng đại trực tràng, chúng được hình thành do sự tăng sinh quá mức của niêm mạc đại trực tràng Triệu chứng của bệnh thường nghèo nàn và không đặc hiệu Việc phát hiện sớm và điều trị kịp thời, đặc biệt nếu xác định rõ và loại bỏ những polyp bằng thủ thuật cắt polyp qua nội soi sẽ làm giảm thiểu đáng kể nguy cơ polyp trở thành ung thư

• Tác nhân lối sống: Những người có thói quen hút thuốc, hoặc có chế độ

ăn uống giàu chất mỡ và ít trái cây, rau quả sẽ có nguy cơ mắc bệnh ung thư đại trực tràng cao hơn vì nó có thể gây nên những biến đổi trong tế bào biểu mô trực tràng, gây viêm loét đại tràng và từ đó có thể dẫn tới ung thư đại trực tràng

• Bệnh Crohn hoặc chứng lở ruột già: Người bị chứng bệnh gây viêm đại

tràng (như chứng lở ruột già hoặc bệnh Crohn) trong nhiều năm sẽ có nguy cơ mắc bệnh cao

• Bệnh sử ung thư cá nhân: Người từng bị ung thư đại trực tràng có thể sẽ

lại bị ung thư đại trực tràng lần thứ hai Đồng thời, phụ nữ có tiền sử ung thư buồng trứng, dạ con, hoặc ung thư vú, sẽ có nguy cơ mắc bệnh ung thư đại trực tràng cao hơn

• Bệnh sử ung thư trong gia đình: Trong khi phần lớn các trường hợp ung

thư đại trực tràng là các khối u rời rạc thì có rất ít các trường hợp xảy ra do đột biến gen di truyền Phổ biến nhất là hội chứng polyp u tuyến theo dòng họ (familial adenomatous polyposis - FAP) và hội chứng ung thư ruột kết không polyp di truyền (hereditary nonpolyposis colon cancer - HNPCC) Dạng ung thư này thường biểu hiện từ rất sớm (trung bình dưới 45 tuổi) [20]

Khối u FAP chủ yếu nằm ở vùng ngoại biên (bên trái) trong khi HNPCC chủ yếu nằm ở vùng đầu gần (bên phải) của đại tràng Khi có thành viên trong gia đình được chẩn đoán là mắc ung thư đại trực tràng thì nguy cơ các thành viên khác mắc căn bệnh này cao gấp nhiều lần so với bình thường, phụ thuộc nhiều vào số thành

viên mắc bệnh và độ tuổi mắc bệnh Thực tế, các nghiên cứu cho thấy phải có tới 20 đến 25% các bệnh nhân ung thư đại trực tràng có tiền sử gia đình mắc căn bệnh này

1.1.4 Các hệ thống phân loại giai đoạn ung thư đại trực tràng [39]

Phân loại Duke cho ung thư trực tràng

Năm 1932, Cuthbert E Dukes, một bác sĩ giải phẫu bệnh ở bệnh viện St.Mark, đã đưa ra một hệ thống phân loại giai đoạn cho ung thư trực tràng

Phân loại được chia làm 3 giai đoạn:

- Dukes A: khối u giới hạn ở thành trực tràng

- Dukes B: những khối u đã vượt thành trực tràng đến những cơ quan cạnh trực tràng

- Dukes C: những khối u đã di căn đến hạch lympho vùng

Phân loại TNM (Tumor, Node, Metastasis)

Phân loại này được đưa ra vào năm 1954 bởi AJCC (American Joint Committee on Cancer) và IUAC (International Union Against Cancer) dựa trên những dữ kiện lâm sàng và bệnh học Phân loại TNM thường dùng để dự báo tỉ lệ sống sót 5 năm của bệnh nhân ung thư trực tràng

Phân loại TNM cho ung thư đại trực tràng

U nguyên phát (T):

Tx – không xác định được u

T0 – không có bằng chứng của khối u

Tis – u tại chỗ (niêm mạc)

T1 – u xâm lấn lớp dưới niêm mạc

Mx – không xác định được di căn xa

M0 – không di căn xa

M1 – di căn xa

Nói chung, ung thư đại trực tràng được chia làm các giai đoạn (hình 2):

• Giai đoạn 0: Trong giai đoạn 0, các tế bào bất thường được tìm thấy trong các lớp trong cùng của đại trực tràng Những tế bào bất thường có thể trở thành ung thư và lây lan vào các mô bình thường gần đó Giai đoạn 0 cũng được gọi là ung thư biểu mô tại chỗ

Hình 2 Các giai đoạn phát triển của ung thư đại trực tràng [28]

• Giai đoạn I: Ung thư đã bắt đầu lây lan, nhưng vẫn còn trong lớp lót bên trong

• Giai đoạn II: Ung thư đã lan đến các cơ quan khác ở gần đại trực tràng hoặc trực tràng nhưng chưa lây lan đến các hạch bạch huyết

• Giai đoạn III: Ung thư đã lan đến hạch bạch huyết nhưng chưa lan đến những phần xa của cơ thể

• Giai đoạn IV: Ung thư đã lan đến các phần xa của cơ thể thông qua hệ thống bạch huyết, được gọi là di căn Các cơ quan mà ung thư đại trực tràng thường di căn đến là phổi và gan

Tỉ lệ sống sót sau 5 năm của ung thư đại trực tràng: Giai đoạn I: 72% Giai đoạn II: 54% Giai đoạn III: 39% Giai đoạn IV: 7%.[39]

1.2 CHỈ THỊ SINH HỌC TRONG UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

1.2.1 Chỉ thị sinh học là gì

Chỉ thị sinh học (biomarker) là những phân tử chất được sử dụng như một chỉ báo của một trạng thái sinh học Đó là một đặc tính khách quan được đặc trưng bởi các thông số như các chỉ số hóa sinh, miễn dịch… Do đó, nó được dùng để đánh giá những quá trình sinh học bình thường, quá trình gây bệnh hoặc các phản ứng dược của quá trình điều trị [18]

Trong ung thư, chỉ thị sinh học đóng một vai trò quan trọng, nó là công cụ hữu hiệu, chỉ thị sinh học mới có độ nhạy và tính đặc hiệu cao sẽ giúp cho việc kiểm soát ung thư tốt hơn, tạo điều kiện thuận lợi cho việc xác định nhanh chóng các đáp ứng của khối u đối với liệu pháp điều trị mới Ví dụ như đột biến dòng phôi

gen APC là một chỉ thị để chẩn đoán nguy cơ mắc polyp và sự phát triển tiếp theo

của ung thư biểu mô trực tràng, biểu hiện của β-catenin trong tế bào chất và nhân là một chỉ thị để tiên lượng ung thư biểu mô thực quản Tuy nhiên, rất ít các chỉ thị phân tử hiện nay được ứng dụng thực tiễn trong lâm sàng vì sự hạn chế về độ nhạy

và tính đặc hiệu, do đó, cần phải phát triển nhiều hơn nữa các chỉ thị đáng tin cậy có liên quan tới phần lớn các khối u để có thể sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán và điều trị ung thư

1.2.2 Một số biến đổi về gen liên quan đến ung thư đại trực tràng

Hiện nay, có rất nhiều nghiên cứu tập trung vào việc tìm ra các chỉ thị phân

tử trong chẩn đoán ung thư Trong đó, nhiều nghiên cứu tập trung vào việc xem xét mức biến đổi của ADN, các đột biến, đa hình của gen, Các nghiên cứu đã cho thấy trong ung thư đại trực tràng, một số biến đổi về gen đóng vai trò quan trọng trong sự phát sinh ung thư

Đột biến gen APC (Adenomatous polyposis coli) APC là gen ức chế khối u

có vai trò điều hòa sự tăng sinh và bám dính tế bào Sự biến đổi của gen này đóng vai trò quan trọng, đánh dấu sự hình thành và phát triển của ung thư

Đột biến gen APC là dạng đột biến phổ biến nhất trong ung thư đại trực tràng được tìm thấy ở 60 - 80% ung thư đại trực tràng Đột biến chủ yếu xảy ra trong khu vực exon 15 Các cá thể sinh ra với một alen đột biến của gen này sẽ phát sinh hàng trăm, thậm chí hàng nghìn polyp u tuyến ở đại tràng trong lứa tuổi 13 đến 20 Hội chứng này gọi là hội chứng FAP Protein APC khu trú trong bào tương, ở đây chúng tương tác với nhiều protein nội bào khác, trong đó có β-catenin - một protein có thể

đi vào nhân tế bào, hoạt hoá việc phiên mã các gen Chức năng quan trọng của protein APC là duy trì mức độ thấp của β-catenin trong bào tương nhờ sự hình thành phức hệ APC/β-catenin, phức này kích thích sự phân hủy của β-catenin Sự

bất hoạt gen APC gây hậu quả mất protein APC, dẫn đến làm tăng β-catenin của tế

bào, chất này sẽ xâm nhập vào nhân tế bào và điều hòa tăng sinh tế bào Hậu quả là các khối u hình thành trong lớp biểu mô ruột và có thể tiến triển thành ung thư Vì vậy, APC là yếu tố điều hòa âm tính của việc truyền tín hiệu β-catenin

Ngoài ra, những đột biến làm mất chức năng của APC cũng dẫn đến sự bất

ổn định nhiễm sắc thể do APC liên kết với các vi ống làm chúng bị sai lệch [21]

TP53 là một gen ức chế khối u cực kì quan trọng với một số chức năng chủ yếu như khởi động quá trình apoptosis, sửa chữa ADN bị lỗi và điều khiển chu trình

tế bào Đột biến gen này dẫn đến sự biểu hiện bất thường của protein p53 Do đó, khi p53 mất chức năng thì các tế bào sẽ tiếp tục phân chia mang theo các sai hỏng

ADN, tích lũy qua mỗi chu trình tế bào và đến một lúc nào đó tế bào không kiểm soát được hoạt động phân bào nữa và chuyển sang trạng thái ung thư

Một số gen gây ung thư như RAS và BRAF cũng đóng vai trò quan trọng trong việc phát triển căn bệnh ung thư trong đó có: Đột biến RAS xảy ra ở 37% các trường hợp mắc ung thư đại trực tràng và 13% đối với BRAF Các đột biến RAS mà phần lớn là ở KRAS đã làm hoạt hóa GTPase, vốn có vai trò dẫn tín hiệu trực tiếp

đến RAF Các đột biến BRAF ảnh hưởng tới enzyme MAPK (mitogen activated protein kinase) vốn có vai trò điều hòa một số hoạt động của tế bào (như phân bào, tăng sinh, biệt hóa tế bào, chết theo chu trình) và sau đó điều khiển các lớp tín hiệu dẫn tới con đường tín hiệu này bị hạn chế từ đó ảnh hưởng tới hoạt động của tế bào

Các đột biến BRAF có thể phát hiện được ngay cả ở các polyp nhỏ và so với các đột biến RAS thì chúng phổ biến hơn ở các polyp tăng sản, các u tuyến dạng khía và các

ung thư đại trực tràng phần đầu gần, và đặc biệt là ở các trường hợp ung thư có kiểu hình methyl hóa đảo CpG - CIMP (CpG island methylator phenotype) [16] Năm

2003, Shield và cộng sự khi nghiên cứu về gen KRAS (gen gây ung thư) cho thấy

đột biến này có vai trò chuyển ung thư đa u tuyến từ giai đoạn trung gian

Sự methyl hóa ADN

Như đã biết, những biến đổi di truyền bao gồm các đột biến trong gen gây ung thư, các gen gây ức chế khối u gây ung thư, tuy nhiên chỉ khoảng 10% bệnh nhân thuộc kiểu genotype kiểu cổ điển này Ngoài ra, sự phát sinh ung thư còn có thể do cơ chế biến đổi ngoại di truyền gây ra

Di truyền ngoại sinh (Epigenetics) là sự biến đổi trong biểu hiện gen mà sự biến đổi này không phải do những biến đổi trình tự base trên ADN, bao gồm sự methyl hóa ADN, biến đổi histone,…Trong đó, di truyền ngoại sinh được nghiên cứu nhiều nhất là sự methyl hóa ADN

Methyl hóa là sự gắn nhóm methyl vào vị trí C thứ 5 ở cytosine của vòng pyrymidine nhờ enzyme methyl transferase Có 3 dạng methyl hóa ADN khác nhau được biết đến liên quan tới ung thư, đó là: sự giảm methyl hóa (hypomethylation),

tăng cường methyl hóa (hypermethylation) và sự mất đi dấu ấn gen (loss of imprinting – LOI)

Bình thường có 3-6% cytosine bị methyl hóa trong tế bào bình thường ở người Cặp nucleotide CpG là vị trí trong vùng giàu CpG, còn được gọi là đảo CpG

LOI là hiện tượng có sự mất biểu hiện hay hoạt hóa biểu hiện của các alen

bố mẹ trong các khối u Sự giảm methyl hóa ADN xảy ra ở giai đoạn tiến triển của bệnh, liên quan tới sự tăng cường phiên mã của gen (như các gen gây ung thư) Trong khi đó thì sự tăng cường methyl hóa ADN lại xảy ra tại các vị trí điều hòa đặc hiệu ở các vùng promoter, dẫn tới sự ngăn cản phiên mã từ đó gây bất hoạt gen (như ở các gen ức chế khối u) Chính sự tăng cường methyl hóa ADN này đã trở thành một lĩnh vực được quan tâm lớn trong nghiên cứu ung thư hiện nay [12] Ngoài ra, sự methyl hóa ADN còn đóng vai trò trung tâm trong sự đánh dấu của gen, sự phát triển của phôi, sự im lăng NST X và sự điều khiển chu trình tế bào

Đã có những bằng chứng chứng tỏ rằng sự methyl hóa bất thường là một hiện tượng phổ biến trong ung thư và đó có thể là sự thay đổi sớm nhất trong sự phát sinh ung thư

Năm 2010, Kim và cs thuộc trường đại học y John Hopkins, Hoa Kỳ qua việc tổng hợp từ hơn 40 bài báo khác nhau đã đưa ra một bản tổng hợp về tình trạng methyl hóa của 59 gen khác nhau trên mô đại trực tràng, 19 gen được phân tích từ mẫu huyết tương, huyết thanh hoặc mẫu phân Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ

methyl hóa là: 76,2% ở CXCL12, 32% ở E-Cadherin, 100% như ở Cyclin

A1,…Nhìn chung, các nghiên cứu đều cho thấy có sự tăng cường methyl hóa cao ở các gen của bệnh nhân ung thư đại trực tràng, trong khi đó tỷ lệ này rất thấp và gần như là 0% ở người bình thường, điều đó cho thấy tình trạng tăng cường methyl hóa ADN có thể là yếu tố quan trọng góp phần vào sự phát sinh ung thư đại trực tràng [12] Sự methyl hóa ADN có thể được phát hiện trong các ADN bắt nguồn từ mẫu

mô, mẫu phân hoặc dịch cơ thể

Vì vậy, nếu các phương pháp nghiên cứu sự methyl hóa ADN khi được tối

ưu hóa về độ nhạy và độ đặc hiệu của nó sẽ giúp xác định chính xác những khác biệt trong tình trạng methyl hóa ADN giữa bệnh nhân ung thư và người bình thường, cho thấy rằng đây có thể là một công cụ hữu hiệu cho việc phát hiện sớm bệnh và là một chỉ thị tầm soát mới cho ung thư đại trực tràng

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI GEN LIÊN QUAN ĐẾN BỆNH UNG THƯ

PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphism)

Đây là kĩ thuật truyền thống, được sử dụng để lập bản đồ gen, xác định đột biến điểm Kĩ thuật này được áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu ung thư ở cấp độ đột biến gen

Nguyên lí cơ bản của phương pháp này là dựa vào tính chất của enzyme giới hạn, có thể nhận biết một trình tự ADN đặc hiệu để cắt đoạn ADN thành các mảnh nhỏ có chiều dài khác nhau Các mảnh giới hạn này sau đó được phân tách theo chiều dài của chúng bằng phương pháp điện di trên gel agarose/polyacrylamide và được chuyển qua màng bằng phương pháp lai Southern blot Trên màng có những đầu dò ADN để xác định những đoạn ADN giới hạn có thể bắt cặp bổ sung với đầu

dò RFLP xảy ra khi chiều dài của các đoạn giới hạn khác nhau ở những mẫu khác nhau Mỗi đoạn giới hạn đó được gọi là một alen và có thể dùng để phân tích di truyền Phân tích RFLP thường được hỗ trợ bằng kĩ thuật PCR để khuếch đại đoạn gen cần phân tích Chính vì thế, kĩ thuật này thường được gọi là PCR-RFLP Tùy theo mục đích và dựa vào đặc điểm của gen cần nghiên cứu, người ta có thể thực hiện phương pháp PCR-RFLP theo các cách khác nhau, có thể đơn giản hóa hoặc tiến hành cùng một số phương pháp khác

SSCP (Single strand conformation polymorphism)

Một phương pháp đơn giản khác được sử dụng trong nghiên cứu đột biến điểm là phân tích đa hình cấu hình sợi đơn (SSCP) của phân tử ADN Cấu trúc

không gian 3 chiều của phân tử ADN sợi đơn được xác định bởi trình tự và môi trường chứa chúng Do đó, trong trường hợp điều kiện môi trường không thay đổi, cấu trúc của chúng chỉ phụ thuộc vào trình tự nucleotide và bất cứ thay đổi nào trong đó cũng làm thay đổi cấu hình sợi đơn Khi điện di trên gel polyacrylamide không biến tính, các cấu hình khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau và phân tách ra Những yếu tố khác ảnh hưởng đến cấu hình sợi đơn như nhiệt độ, pH, đệm chạy có thể được sử dụng để tăng khả năng phân tách Nhìn chung, nhiệt độ và pH thấp giúp duy trì cấu hình và dễ dàng phân biệt được các phân tử ADN có trình tự khác nhau

DHPLC (denaturing high performance liquid chromatography)

Đây là phương pháp phân tích ADN dị sợi kép Thay vì sử dụng gel và phân tách ADN bằng điện di, ADN được phân tách bằng sắc ký HPLC Các mạch ADN được phân tách ở nhiệt độ cao, sau khi hạ nhiệt độ xuống, chúng liên kết với nhau

và hình thành ADN dị sợi kép chứa các cặp ghép đôi không chính xác Các phân tử

dị sợi kép này có thời gian di chuyển khác biệt so với sợi kép bình thường DHPLC

là một kĩ thuật mạnh, đơn giản và mẫu được đưa vào tự động Với những tiến bộ gần đây trong việc phát triển phần mềm dự đoán đường cong biến tính, phương pháp này có độ nhạy cao và khả năng tái sử dụng tốt

Real Time PCR

Trong sinh học phân tử, đây là kĩ thuật PCR mà kết quả khuếch đại ADN được hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng Kĩ thuật này cho phép phát hiện và định lượng tuyệt đối số lượng bản sao của một hay nhiều trình tự cụ thể của một mẫu ADN Hai phương pháp để định lượng là nhuộm huỳnh quang không đặc hiệu với trình tự ADN kép và lai sản phẩm với một đầu dò ADN đặc hiệu có gắn huỳnh quang Qua mỗi chu kì của phản ứng, lượng sản phẩm tăng lên dẫn đến sự gia tăng tỉ lệ phát huỳnh quang Qua đó có thể dựa vào số đo huỳnh quang để định lượng chính xác lượng sản phẩm Đây được coi là hướng tiếp cận mới so với PCR chuẩn, được sử dụng nhiều trong cả khoa học cơ bản và trong chẩn đoán

Giải trình tự

Phần lớn các phương pháp nói trên được sử dụng để sàng lọc bước đầu đột biến điểm/SNPs Để khẳng định chính xác đột biến hay biển đổi người ta phải giải trình tự trực tiếp Nguyên tắc của hầu hết các phương pháp giải trình tự hiện nay đều dựa trên phương pháp được Sanger và cộng sự công bố năm 1977, được gọi là phương pháp dideoxyribonuleotide (gọi tắt là phương pháp dideoxy) [3]

Theo phương pháp này, một trình tự Sanger giới hạn được bắt đầu tại một vị trí cụ thể trên chuỗi ADN bằng cách sử dụng một oligonucleotide ngắn, có trình tự

bổ sung với trình tự của mẫu tại vị trí đó Các mồi oligonucleotide được kéo dài nhờ tác dụng của enzyme ADN polymerase Trong hỗn hợp phản ứng có sẵn các loại deoxynucleotide A, T, G, C trong đó có một loại là di-deoxynucleotide để ngắt phản ứng kéo dài chuỗi

Các đoạn ngắn ADN mới được tổng hợp sau đó được điện di trên gel polyacrylamide, hình ảnh thu được sẽ được dùng để phân tích trình tự ADN Ngày nay, phương pháp giải trình tự tự động được áp dụng rộng rãi ở các phòng thí nghiệm trên thế giới nhưng cơ bản vẫn áp dụng nguyên lý như trên Với sự phát triển của các enzyme ADN polymerase và các hợp chất hóa học, phương pháp này cho phép sàng lọc SNPs hiệu quả rất cao khi so sánh với các kỹ thuật đã miêu tả trên Cho đến nay, nó đã được cải tiến thành giải trình tự tự động và sử dụng chất huỳnh quang, cho phép xác định chính xác các điểm đột biến trên cả một hệ gen với

độ nhạy rất cao Ưu điểm lớn nhất của giải trình tự là cung cấp đầy đủ thông tin về điểm đột biến như: loại đột biến, vị trí, hậu quả Tuy nhiên nó có hạn chế là đòi hỏi sản phẩm khuếch đại ADN phải có độ tinh sạch rất cao và các hóa chất, thiết bị đắt

tiền

Kỹ thuật phân tích ADN microarray

Đây là một trong những kỹ thuật được ứng dụng hiệu quả trong nghiên cứu genomics tìm các chỉ thị về gen Phân tích ADN microarray có thể đo mức độ biểu hiện ARN của hàng nghìn gen cùng một lúc, sự biểu hiện gen có thể được sử dụng

để phân biệt các dạng khối u cũng như có ý nghĩa trong chẩn đoán bệnh Điều này

đã được chứng minh với ung thư vú và trong ung thư bạch cầu ác tính Các mảnh ADN trên các tấm kính mỏng được lai với các mẫu cADN, chúng có thể được nhuộm huỳnh quang đỏ và xanh Phụ thuộc vào mối tương tác của mẫu phân tích, mỗi điểm trên kính có thể phát ra tín hiệu màu đỏ hoặc xanh Các gen có thể được tập hợp lại thành nhóm và có thể so sánh giữa các mẫu

Một số phương pháp trong nghiên cứu sự methyl hóa ADN

Sự methyl hóa ADN trong vùng promoter của các gen khác nhau có thể đóng vai trò làm chỉ thị sinh học trong việc phát hiện sớm ung thư từ ADN có trong mẫu phân và mẫu máu của bệnh nhân ung thư đại trực tràng, giúp cho việc theo dõi và điều trị bệnh hiệu quả hơn Các nghiên cứu tình trạng methyl hóa ADN chủ yếu sử dụng kỹ thuật PCR làm cơ sở do độ nhạy và khả năng ứng dụng cao của kỹ thuật này Sau đây là một số phương pháp phổ biến dùng để khảo sát tình trạng methyl hóa ADN:

MSP (Methyl Specific PCR)

Hiện nay, kỹ thuật MSP được sử dụng phổ biến nhất do tính đơn giản, nhạy

và chi phí hợp lý của nó, chủ yếu để phát hiện sự tăng cường methyl hóa tại một vùng promoter quan tâm của một số gen có chức năng quan trọng, liên quan tới sự bất hoạt gen đó trong các bệnh ung thư ở người [9] Đây là kỹ thuật nhanh chóng phát hiện được sự methyl hóa của bất kỳ vị trí CpG nào trong một đảo CpG Đầu tiên, ADN được biến đổi với sodium bisulfite để chuyển hóa tất cả các cytosine không bị methyl hóa thành uracil, sau đó, ADN này được khuếch đại lên qua phản ứng PCR bằng cặp mồi thiết kế đặc hiệu cho đoạn trình tự bị methyl hóa và không

bị methyl hóa Kỹ thuật MSP đòi hỏi lượng ADN rất ít, phát hiện nhạy tới 0,1% các alen bị methyl hóa trên locus đảo CpG quan tâm và cũng có thể thực hiện được với ADN tách chiết từ các mẫu đúc paraffin Kỹ thuật MSP hạn chế được các kết quả dương tính giả từ các nghiên cứu trước đó dựa trên PCR và sự phân cắt của enzyme giới hạn để phân biệt giữa ADN bị methyl hóa và không bị methyl hóa

MethyLight

Đây là kỹ thuật định lượng, phát triển dựa trên kỹ thuật MSP Kỹ thuật này cho phép phân biệt được các vị trí methyl hóa và không methyl hóa trên cùng một mẫu Để phát hiện ra các vị trí methyl, đầu dò đánh dấu FAM được sử dụng trong khi đầu dò đánh dấu VIC phát hiện ra các vị trí không methyl Kỹ thuật này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, chỉ cần một lượng ADN rất nhỏ là có thể phát hiện ra các alen bị methyl hóa trong sự có mặt của 10.000 các alen không bị methyl hóa khác, tuy nhiên chi phí cho phương pháp này là khá cao [6]

Pyrosequencing

Phương pháp này được sử dụng để phân tích ADN đã được xử lý với bisulfite mà không cần sử dụng kỹ thuật MSP Sau khi dùng PCR khuếch đại vùng gen quan tâm thì pyrosequencing được sử dụng để xác định trình tự đã biến đổi với bisulfite của các vị trí CpG đặc hiệu trong vùng Tỷ lệ C chuyển thành T tại các vị trí riêng biệt có thể được định lượng dựa trên tỷ lệ kết hợp của C và T trong suốt quá trình kéo dài chuỗi Hạn chế duy nhất của phương pháp này chính là giá thành cao, tuy nhiên giải trình tự luôn là phương pháp chính xác nhất để xác định trình tự ADN, nên kỹ thuật này thường được sử dụng trong việc khẳng định kết quả nghiên cứu cuối cùng từ các phương pháp khác

1.4 CHEMOKINE CXCL12 VÀ VAI TRÒ TRONG UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

1.4.1 Chemokine

Chemokine là những cytokine có bản chất là protein, có kích thước 8-14 kDa, có khả năng di chuyển trực tiếp hoặc hóa hướng động, có khả năng hòa tan

Nó liên kết và hoạt hóa với một họ các thụ thể chemokine

Chemokine được sản xuất trong những giai đoạn sớm nhất của nhiễm trùng Các phân tử này được phát hiện cách đây không lâu Chúng phát huy tác dụng hóa hướng động đến các tế bào có khả năng đáp ứng gần đó Interleukine-8 là

chemokine đầu tiên được nghiên cứu rõ ràng và nó là đại diện tiêu biểu của họ này Tất cảc các chemokine đều có trình tự sắp xếp amino acid giống nhau và các thụ thể của chúng có đến 7 vùng xuyên màng Các tín hiệu của chemokine sau khi gắn với thụ thể sẽ được truyền thông qua protein G

Tổng cộng khoảng 50 chemokine đã được xác định, chia thành 4 họ (CXC, CX3C, CC, và C) [11] Để phân biệt các chemokine trong dưới họ thì người ta thêm

L (có nghĩa là ligand- phối tử) và số thứ tự tương ứng theo từng dòng và đặc điểm của nó (bảng 2)

Thụ thể của chemokin gồm các thụ thể được đặt tên CCR1 đến CCR11 và CXCR1 đến CXCR7, XCR1 và CX3CR1 Hầu hết các thụ thể đều gắn trên bề mặt màng thế bào, tuy nhiên cũng có một số thụ thể tự do, hòa tan lưu hành trong máu [15]

Chemokine và thụ thể của nó đóng vai trò quan trọng trong quá trình viêm, nhiễm, tổn thương mô, dị ứng, các bệnh về tim mạch và các khối u ác tính Một trong những chức năng quan trọng nhất của phức hệ chemokine và thụ thể của nó là điều hòa quá trình di căn Thụ thể chemokine có thể giúp cho việc phát tán tế bào ung thư dễ dàng hơn trong mỗi giai đoạn chính của quá trình di căn, bao gồm việc gắn các tế bào khối u vào nội mô, giúp chúng thoát khỏi mạch máu, di căn xâm lấn, tăng sinh mạch máu, tăng sinh nhanh…Thêm vào đó, chemokine lại đóng vai trò quan trọng trong việc liên hệ giữa các tế bào ung thư và các tế bào bình thường trong vi môi trường khối u (tumor microenvironment-TME), nơi chứa các tế bào nội biểu mô và các nguyên bào sợi Chúng thúc đẩy sự di chuyển, sự hoạt hóa của bạch cầu trung tính và các đại thực bào liên quan tới khối u trong môi trường TME [17]

Bảng 2 Các chemokine thuộc họ CXC [33]

CXC chemokines Tên Gene Tên gọi khác Thụ thể

tế bào nội mô trong phần lớn các cơ quan, có khối lượng phân tử là 7,8kDa [17]

CXCL12 được tiết ra trong các mô bị tổn thương, đã tạo nên vi môi trường giúp cho việc thu hút các tế bào gốc tạo mô tới khu vực bị tổn thương, thực hiện chức năng của mình và kết quả là mô đó được sửa chữa

Chemokine CXCL12 liên kết với 2 thụ thể là CXCR4 và CXCR7

CXCR4

CXCR4 là một thành viên của họ thụ thể chemokine CXC, được mã hóa bởi gen nằm trên NST số 2 CXCR4 là một protein có 7 vùng xuyên màng cùng gắn kết với protein G, có 3 cấu trúc loop thuộc đầu N nằm bên ngoài bề mặt tế bào và 3 cấu trúc loop thuộc đầu C nằm bên trong tế bào chất Một trong số các loop nội bào của thụ thể chemokine đồng gắn kết với protein G và làm trung gian để phối tử gắn kết với thụ thể hình thành phức hệ chuyển tín hiệu [17]

Vai trò của phức hệ CXCL12/CXCR4 trong ung thư

Chemokine và thụ thể của nó đóng vai trò quan trọng trong quá trình viêm nhiễm, lây nhiễm, tổn thương mô, dị ứng, các bệnh về tim mạch và các khối u ác

tính [16]

CXCR4 liên kết với CXCL12 tạo thành phức hệ CXCL12/CXCR4 giúp hoạt hóa các quá trình di chuyển tế bào theo con đường CXCL12/CXCR4 Nếu CXCR4

bị tổn thương có thể gây chết phôi thai do không có khả năng tạo máu, hình thành mạch và vận chuyển tế bào thần kinh

Trong ung thư, phức hệ CXCL12/CXCR4 thường được nghiên cứu để làm chỉ thị sinh học cho các loại ung thư vì nó đóng vai trò quan trọng trong việc di chuyển các tế bào ung thư di căn như trong ung thư vú, ung thư buồng trứng, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư phổi, não, vòm họng, khối u ác tính, ung thư thực quản, ung thư bàng quang, ung thư đại trực tràng, ung thư biểu mô tế bào đáy, u xương ác tính, bệnh bạch cầu và bệnh u xương mãn tính.v.v

Về sinh lý, phức hệ CXCL12/CXCR4 tham gia vào việc di chuyển của một tập hợp con của các tế bào phôi thai, tham gia vào phát triển hệ thống thần kinh trung ương, xương, tủy và tim Các tín hiệu di chuyển được sử dụng trong phôi dường như được nhân đôi trong sự tiến triển khối u và di căn CXCL12 được tiết ra bởi các nguyên bào sợi đệm từ môi trường nội mô của khối u có thể liên kết với CXCR4 trên tế bào khối u và kích thích nhu động tế bào hoặc hoá hướng động tạo

ra một gradient CXCL12, trong đó nồng độ CXCL12 tăng dần ở vị trí quanh khối u Chính vì tập trung nồng độ cao ở quanh khối u, CXCL12 kích thích các tế bào bạch cầu di chuyển đến vùng có khối u, làm nồng độ các loại tế bào này tăng lên

Ngoài ra, phức hệ này còn giúp cho việc phát sinh mạch máu ở các tế bào khối u CXCL12 kích thích sự hình thành cấu trúc dạng mao dẫn với các tế bào nội

mô mạch ở người bằng cách thu hút các tế bào tua PDC (plasmacytoid dendritic cells) vào trong vi môi trường khối u và phát sinh mạch máu cho khối u đó thông qua việc sản sinh ra IL-8 và TNF-α [14]

Thông qua CXCL12, các tế bào nội mô mạch di chuyển, phát triển mở rộng

và sống sót để hình thành một mạng lưới chức năng cần thiết cho sự phát triển mạch máu của khối u trong nhiều dạng ung thư khác nhau

Như đã biết, phức hệ CXCL12/CXCR4 đóng vai trò quan trọng trong việc hàn gắn mô bị tổn thương bằng cách thu hút các tế bào gốc tạo mô về tập trung tại khu vực đó và thực hiện chức năng sửa chữa, trong khi đó đối với các bệnh ung thư thì phức hệ này lại tham gia vào quá trình di căn và phát sinh mạch máu cho khối u

Như vậy, có thể thấy rằng sự rối loạn bất thường của trục tín hiệu trên có thể

là một nguyên nhân góp phần vào quá trình phát triển ung thư

1.5 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ĐA HÌNH VÀ METHYL HÓA GEN CXCL12 Ở

BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

Trên thế giới đã có một số nghiên cứu đa hình gen như:

Nghiên cứu đa hình gen CXCL12-A ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng của

Dimberg và cộng sự (2007) tiến hành trên các mẫu bệnh nhân người Thụy Điển Theo kết quả của nghiên cứu này thì không thấy sự khác biệt đáng kể trong phân bố genotype và tần xuất alen giữa bệnh nhân ung thư đại trực tràng và mẫu đối chứng [8]

Hidalgo-Pascual và cộng sự (2007) đã nghiên cứu đa hình gen CXCL12-A

trên mẫu bệnh nhân người Tây Ban Nha Kết quả cho thấy, không có khác biệt đáng

kể trong phân bố genotype và tần xuất alen của bệnh nhân ung thư đại trực tràng so với đối chứng Tuy nhiên, nghiên cứu này đã chỉ ra có sự khác biệt đáng kể trong phân bố genotype giữa nam và nữ[10]

Nghiên cứu về quá trình methyl hóa thì Wendt và cộng sự [22] đã khảo sát

tình trạng methyl hóa promoter của gen CXCL12 bằng kỹ thuật MSP và giải trình tự

cho kết quả là 62% trong số 21 mẫu ung thư biểu mô đại trực tràng có sự methyl

hóa promoter của CXCL12 Như vậy chính sự tăng cường methyl hóa trên là một cơ chế làm ngừng hoạt động gen CXCL12 ở biểu mô ung thư đại trực tràng

Tại việt Nam, hướng nghiên cứu chỉ thị sinh học trong ung thư đại trực tràng

và đặc biệt là chỉ thị methyl hóa và nghiên cứu về đa hình gen liên quan đến ung thư đại trực tràng vẫn là một hướng nghiên cứu mới Tuy nhiên có những nghiên cứu

gần đây như nghiên cứu của Nguyễn Thị Hồng Vân và cộng sự (2011): Phân tích

exon 16 và 19 gen MLH1 liên quan đến ung thư đại trực tràng không polyp di

truyền (HLPCC) bằng PCR- RFLP [4] Kết quả nghiên cứu bước đầu cho thấy trong

26 bệnh nhân bệnh nhân người Việt Nam bị ung thư dạ dày, đại tràng, đại trực tràng thì vị trí đột biến 528 và 718 tương ứng ở 2 exon 16 và 19 đều có kiểu gen là đồng hợp tử CC Nghiên cứu của Phạm Thu Huyền và Trịnh Hồng Thái (2011): Phân tích

tình trạng methyl hóa promoter của gen CXCL12 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng

[2] Nghiên cứu này chỉ ra rằng tỷ lệ methyl hóa vùng promoter của gen CXCL12 ở

20 bệnh nhân ung thư đại trực tràng là 80% (16/20 bệnh nhân), tỷ lệ không methyl

hóa là 55% (11/20 bệnh nhân) Tình trạng methyl hóa promoter của gen CXCL12

của bệnh nhân ung thư đại trực tràng xảy ra chủ yếu tại vị trí tập trung nhiều tế bào ung thư (76,47% trên mô u), sai khác giữa mô u và lân cận u là có ý nghĩa thống kê với p< 0,05 Tỷ lệ methyl hóa này không phụ thuộc và các đặc điểm lâm sàng bao gồm tuổi, giới tính, dạng ung thư, số lượng, vị trí và kích thước hạch với p> 0,05 [2]

Nhìn chung, các nghiên cứu về đa hình và methyl hóa ở gen CXCL12 đều nhằm mục đích tìm sự biến đổi ở gen CXCL12 và mối liên quan giữa sự biến đổi đó

với bệnh ung thư đại trực tràng

Chương 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 NGUYÊN LIỆU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Gồm mẫu mô và mẫu máu

Mẫu mô là mẫu của người mắc bệnh ung thư đại trực tràng lấy tại vị trí khối

u Mẫu so sánh là mô đại trực tràng lân cận, cách 5-10cm so với vị trí khối u đó Tổng cộng 25 mẫu mô được phân tích

Mẫu mô sử dụng trong nghiên cứu này do Khoa Tế bào và Giải phẫu bệnh, Bệnh viện K Tam Hiệp, Hà Nội cung cấp Mẫu mô được cho vào ống eppendorf, vận chuyển về phòng thí nghiệm trong ni tơ lỏng và bảo quản ở tủ lạnh sâu – 80oC

Máu người bình thường và người mắc bệnh ung thư đại trực tràng đã được chống đông bằng EDTA Mẫu máu người bệnh được lấy từ bệnh viện Hữu Nghị Việt Đức, Hà Nội gồm 42 mẫu (19 nữ và 23 nam) trong đó có:

Mẫu bệnh có độ tuổi từ 19 đến 87 tuổi, tập trung nhiều nhất ở khoảng trên 60 tuổi

Mẫu đối chứng gồm 44 mẫu, được lấy từ những người cho máu tình nguyện tại Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương

2.1.2 Hóa chất

- Cặp mồi CXCL12 dùng cho phân tích đa hình (F, R) (IDT, Mỹ), Agarose

do hãng Invitrogen (Mỹ) cung cấp

- Enzyme: Proteinase K, Fastdigest® MspI của hãng Fermentas (Đức)

- Cặp mồi CXCL12 (U-f, U-r, M-f, M-r) (IDT, Mỹ) dùng cho phân tích methyl

- Sodium bisulfite (Sigma, Mỹ)

- Hydroquinone (Sigma, Mỹ)

- Enzyme HotStarTaq ADN Polymerase (QIAGEN, Đức)

- Enzyme CpG Methyltrasferase (M.SssI) (New England Biolabs, Mỹ)

- Kit tách chiết ADN từ mô: QIAamp ADN Mini Kit (QIAGEN, Đức)

- Kit tinh sạch ADN: QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, Đức)

và các hoá chất khác như:

- dNTPs của Fermentas, Taq polymerase của hãng Biorad (Mỹ) cung cấp

- Phenol, Chloroform, Isopropanol của hãng Sigma Aldrich (Mỹ)

- Hóa chất nhuộm bạc: AgNO3, Na2CO3, HCHO…

- Acid boric, Tris-base, ETDA, ethanol,

- Tất cả các hóa chất được sử dụng đều có độ sạch phân tích

2.1.3 Thiết bị

Bao gồm các thiết bị và máy móc của phòng thí nghiệm Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên như:

- Máy li tâm, li tâm lạnh (Eppendorf, Đức)

- Thiết bị điện di ngang: Mini-Subcell GT (Bio-Rad, Mỹ)

- Thiết bị điện di đứng Mini-protein 3 (Bio-Rad, Mỹ)

- Máy nhân gen PCR (Applied Biosystem, Mỹ)

- Máy Speed vac (Thermo Scientific, Mỹ)

- Ngoài ra còn các thiết bị khác phục vụ cho quá trình nghiên cứu như cân phân tích, cân kỹ thuật, tủ lạnh -20oC, máy vortex …

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Tách chiết ADN tổng số từ mô

- Sử dụng kit tách chiết ADN từ mô QIAamp ADN Mini Kit (QIAGEN, Đức) theo quy trình của nhà sản xuất

- Cắt 25mg mô cho vào trong ống 1,5ml, thêm 180µl đệm ATL

- Thêm 20µl proteinase K, trộn bằng vortex, và ủ ở 56ºC cho đến khi mô được thủy phân hoàn toàn Vortex thường xuyên trong quá trình ủ

- Ly tâm trong thời gian ngắn để loại dịch còn dính trên nắp

- Thêm 200µl đệm AL vào mẫu, trộn bằng vortex trong 15 giây, và ủ ở 70ºC trong 10 phút Ly tâm trong thời gian ngắn để loại dịch còn dính trên nắp

- Thêm 200µl ethanol (96 – 100%) vào mẫu, trộn bằng vortex trong 15 giây Sau khi trộn, ly tâm trong thời gian ngắn để loại dịch còn dính trên nắp

- Cho toàn bộ hỗn hợp vào cột QIAamp Spin Column Đóng nắp, ly tâm ở 6000g (8000 vòng/phút) trong 1 phút Đặt cột vào ống 2ml sạch và loại bỏ ống có chứa dịch

- Thêm 500µl đệm AW1 Đóng nắp, ly tâm ở 6000g (8000 vòng/phút) trong

1 phút Đặt cột vào ống 2ml sạch và loại bỏ ống có chứa dịch

- Thêm 500µl đệm AW2 Đóng nắp, ly tâm ở tốc độ tối đa 20.000g (14.000 vòng/phút) trong 3 phút Có thể lặp lại bước này thêm 1 phút nếu chưa hết dịch trên cột

- Đặt cột vào ống 1,5ml sạch và loại bỏ ống có chứa dịch Thêm 200µl đệm

AE hoặc nước sạch Đặt ở nhiệt độ phòng trong 1 phút và ly tâm 6000g (8000 vòng/phút) trong 1 phút Lặp lại bước trên 1 lần nữa

- Kết quả thu được 400µl ADN

2.2.2 Tách chiết ADN tổng số từ máu

ADN tổng số được tách chiết từ máu theo phương pháp của PitroChomczy

và Nicoleta Sacchi [29] bằng cách dùng phenol: chloroform: isopropanol (25:24:1) bao gồm các bước sau:

- Lấy 250µl máu cho vào ống Eppendorf 1,5 ml

Bổ sung 250µl đệm phân giải (Tris-HCl 10mM, Succroz 0,32M, MgCl25mM, Triton X100 1%), trộn đều và để trong lạnh 10-15 phút

- Ly tâm lạnh ở 4oC với tốc độ 6000 vòng/phút trong 7 phút, bỏ dịch nổi, thu cặn

- Lặp lại bước 2 và 3 lần thứ 2 để loại bỏ hoàn toàn huyết sắc tố

- Thêm 250µl đệm PBS 1x (NaCl 3mM, KCl 0,5mM, Na2HPO4 2mM,

Tris Thêm 500µl dung dịch phenol : chloroform : isopropanol (25:24:1), trộn đều

- Ly tâm lạnh ở 4oC với tốc độ 12000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch trong

ở pha trên cùng

- Thêm 500µl dung dịch chloroform : isopropanol (24:1), trộn đều

- Ly tâm lạnh ở 4oC với tốc độ 12000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch nổi

- Bổ sung 500µl ethanol 100% và NaCH3COO 3M (pH 5,2) vào dịch thu được (tỉ lệ dịch nổi/ NaCH3COO = 10:1) để tủa ADN Giữ ở -20oC trong 3 giờ hoặc qua đêm

- Ly tâm lạnh ở 4oC với tốc độ 12000 vòng/phút trong 15 phút, loại dịch nổi, thu tủa

- Rửa tủa bằng 500µl ethanol 70%, lặp lại bước ly tâm trên

- Làm khô tủa bằng máy Speed vac trong 10 phút hoặc để khô tự nhiên

- Hòa tan tủa trong 30µl đệm TE, bảo quản ở -20oC để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo

- Kiểm tra ADN tổng số bằng điện di trên gel agarose 0,8-1%

2.2.3 Khuếch đại gen CXCL12 bằng phương pháp PCR

Phản ứng PCR với tổng thể tích 25 µl bao gồm các thành phần được trộn theo thứ tự trong bảng 3

Mồi xuôi: 5'- CAGTCAACCTGGGCAAAGCC -3'

Mồi ngược: 5'- AGCTTTGGTCCTGAGAGTCC -3'

Trong phân tích này, enzyme giới hạn được sử dụng để cắt một đoạn ADN

của hai hay nhiều mẫu phân tích thành các đọan có chiều dài khác nhau MspI (HpaII) không cắt các vị trí m4CCGG, m5CCGG, Cm4CGG và hm5 Chm5CGG, nhưng lại cắt tại vị trí Cm5CGG Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng enzyme MspI

để cắt sản phẩm PCR Enzyme MspI là enzyme endonuclease nhận biết ADN tại trình tự: 3' GGC/C 5'

Lọai enzyme được sử dụng là FastDigest® MspI của hãng Fermentas có tác

Bảng 4 Các thành phần của phản ứng cắt sản phẩm PCR bằng enzyme

FastDigest MspI

Trộn đều và ly tâm nhẹ lắng xuống

Ủ dung dịch đã trộn enzyme trong 10 phút ở 37oC để enzyme hoạt động cắt ADN

Sau đó, tiến hành điện di kiểm tra sản phẩm thu được sau khi ủ enzyme trên gel polyacylamide 10%

2.2.5 Khuếch đại vùng promoter của gen CXCL12 bằng kỹ thuật MSP

2.2.5.1 Xử lý bisulfite ADN bằng kit DNA Methylation-Gold TM kit và xử

lý bisulfite ADN theo phương pháp của Herman và cs (1996) [9]

Mục đích của việc xử lý này là nhằm biến đổi toàn bộ cytosine không bị methyl hóa trong trình tự ADN của mẫu thành uracil, còn những cytosine nào bị methyl hóa thì không bị thay đổi

Quy trình xử lý bisulfite ADN theo phương pháp của Herman và cộng

Bổ sung hydroquinone và sodium bisulfite vào dung dịch trên sao cho tổng thể tích cuối cùng là 600µl trong đó nồng độ cuối cùng của hydroquinone là 0,5mM

và sodium bisulfite là 3,1M; pH 5,0) Đảo nhẹ tay

Thêm 50µl dầu khoáng để tránh bay hơi Ủ hỗn hợp ở 55oC trong vòng 16 giờ

Sau khi xử lý thì hỗn hợp trên sẽ được loại muối bằng kit tinh sạch ADN QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, Đức) theo quy trình của nhà sản xuất

ADN tinh sạch sẽ được desulfo hóa trong NaOH 0,3M ở 42oC trong 20 phút, sau đó tủa ADN bằng isopropanol theo tỷ lệ thể tích 1:1 trong 3-4 h ở -20oC và cuối cùng được hòa tan lại bằng 20µl nước sạch

Xử lý bisulfite ADN bằng kit ADN Methylation-Gold TM kit

Cùng với việc xử lý bisulfite ADN theo quy trình trên, chúng tôi còn chuẩn hóa việc xử lý này bằng kit ADN Methylation- Gold TM Quá trình xử lý được thực hiện theo quy trình của nhà sản xuất.[26]

2.2.5.2 Thực hiện phản ứng PCR để khuếch đại gen CXCL12

Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR là kỹ thuật dùng để khuếch đại một đoạn trình tự ADN nhờ sự thay đổi của chu trình nhiệt Mỗi chu kỳ phản ứng gồm ba giai đoạn: giai đoạn biến tính ở nhiệt độ cao, gắn mồi và kéo dài

Cặp mồi được sử dụng trong phản ứng là cặp mồi được thiết kế đặc hiệu cho phản ứng khuếch đại trình tự bị methyl hóa và không bị methyl hóa ADN, được tham khảo từ bài báo của Wendt và cs, (2006) [22] và đã được kiểm tra lại sử dụng phần mềm MethBLAST và MethPrimer

Cặp mồi được thiết kế để nhân đoạn gen thuộc đảo CpG số 4 (theo

MethPrimer) nằm trong vùng promoter của gen CXCL12 với trình tự như sau: