Xây dựng phương pháp phát hiện một số chủng human papilloma virus nguy cơ cao gây ung thư cổ tử cung ở việt nam bằng kỹ thuật realtime PCR

1.2.5.2Các phương pháp phát hiện HPV ở mức độ phân tử Do HPV không phát triển trong điều kiện nuôi cấy ở phòng thí nghiệm mà chỉ có thể thực hiện nghiên cứu invivo trên người hay động v

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Thanh Tâm

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN MỘT SỐ CHỦNG HUMAN PAPILLOMAVIRUS NGUY CƠ CAO GÂY UNG THƯ CỔ TỬ CUNG Ở VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT

REALTIME PCR

LUẬN VĂNTHẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2016

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Thanh Tâm

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN MỘT SỐ CHỦNG HUMAN PAPILLOMAVIRUS NGUY CƠ CAO GÂY UNG THƯ CỔ TỬ CUNG Ở VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT

REALTIME PCR

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

LUẬN VĂNTHẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN VÂN TRANG

TS LÊ HỒNG ĐIỆP

Hà Nội – 2016

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Vân Trang, người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn này

Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn TS Lê Hồng Điệp cùng các thầy giáo,

cô giáo trong khoa Sinh học, đặc biệt là các thầy giáo, cô giáo trong bộ môn Sinh lý Thực vật và Hóa sinh học đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, giảng dạy

và dìu dắt tôi trong thời gian thực hiện luận văn cũng như trong suốt thời gian học tập tại trường

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các anh chị, các bạn làm việc tại Phòng Miễn dịch Vắc xin –Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã tận tình giúp

đỡ và chỉ bảo tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn tại phòng

Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã luôn khích lệđộng viên tôi trong suốt thời gian qua

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Học viên

Nguyễn Thanh Tâm

BẢNG KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN/ ARN (Deoxi)ribonucleic acid Vật chất di truyền

HPV Human Papillomavirus Papillomavirus gây bệnh trên người

LRC Long Control Region Vùng kiểm soát dài của gen

PCR Polymerase Chain Reaction

ORF Open Reading Frame Khung đọc mở của gen

URR Upstream Regulatory Region Vùng điều hòa của gen

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG………

DANH MỤC CÁC HÌNH………

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về Human Papillomavirus 3

1.1.1 Đặc điểm hình thái của HPV 3

1.1.2 Đặc điểm sinh học phân tử 3

1.1.3 Phân loại HPV 8

1.2 HPV và ung thư cổ tử cung 12

1.2.1 Tình hình nhiễm HPV tại Việt Nam và trên thế giới 12

1.2.2 Đường lây truyền của HPV 14

1.2.3 Các bệnh lý thường gặp do HPV, cách phòng nhiễm và điều trị 14

1.2.4 Chu kỳ nhân lên và cơ chế gây bệnh của HPV 15

1.2.5 Các phương pháp phát hiện HPV 18

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 26

2.1 Vật liệu 26

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 26

2.1.2 Sinh phẩm và vật tư tiêu hao 26

2.1.3 Máy móc và thiết bị 27

2.2 Phương pháp nghiên cứu 27

2.2.1 Xây dựng kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV 16, 18 và 33/52 27

2.2.2 Tạo chứng dương và xác định giới hạn phát hiện của kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV 16, 18 và 33/52 29

2.2.3 Thẩm định phương pháp phát hiện chủng HPV16, 18, và 33/52 32

2.3 Nội dung thực hiện 34

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

3.1 Xây dựng kỹ thuật Realtime PCR phát hiện các chủng HPV 16, 18 và 33/52 35

3.1.1 Kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer và probe 35

3.1.2 Kỹ thuật realtime PCR đa cặp primer và probe 40

3.2 Tạo chứng dương và xác định giới hạn phát hiện của kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV 16, 18 và 33/52 42

3.2.1 Khuếch đại trình tự đích 42

3.2.2 Nhân dòng gen tạo chứng dương 43

3.2.3 Xác định giới hạn phát hiện của kỹ thuật Realtime PCR 48

3.3 Thẩm định phương pháp phát hiện các chủng HPV16, 18 và 33/52 50

3.3.1 Xác định độ chính xác của kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV16, 18 và 33/52 51

3.3.2 Xác định độ chụm (hệ số tái lâp và hệ số lặp lại) của kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV16, 18 và 33/52 52

3.3.2.1 Xác định hệ số lặp lại của phương pháp 52

3.3.2.2 Xác định hệ số tái lập của phương pháp 56

3.3.3 Xác định độ đặc hiệucủa kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV16, 18 và 33/52 60

3.3.4 Xác định độ nhạycủa kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV16, 18 và 33/52 61

KẾT LUẬN 67

KIẾN NGHỊ 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO 68

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các type HPV và các bệnh có liên quan 11

Bảng 1.2 Tỷ lệ nhiễm HPV trên một số tỉnh thành phố tại Việt Nam 13

Bảng 1.3 Các cặp mồi dùng cho PCR phát hiện HPV……… 22

Bảng 2.1 Thành phần kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer và probe 29

Bảng 2.2 Thành phần kỹ thuật realtime PCR đa cặp primer và probe……….29

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng khuếch đại trình tự đích 30

Bảng 2.4 Chu kì nhiệt của phản ứng khuếch đại trình tự đích 30

Bảng 3.1 Kết quả kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer và probe phát hiện HPV16….34 Bảng 3.2 Kết quả kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer và probe phát hiện HPV18….36 Bảng 3.3 Kết quả kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer và probe phát hiện HPV33/52.37 Bảng 3.4 Kết quả kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer và probe IC……… 38

Bảng 3.5 Kết quả kỹ thuật realtime PCR 4 cặp primer và probe phát hiện HPV16, HPV18 và HPV33/52……… 39

Bảng 3.6 Kết quả phản ứng Realtime PCR đa cặp primer và probe với chứng dương….47 Bảng 3.7.Kết quả thí nghiệm xác định độ chính xác của phương pháp………50

Bảng 3.8.Kết quả thí nghiệm xác định hệ số lặp lại của phương pháp……… 52

Bảng 3.9 Giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của thí nghiệm đánh giá hệ số lặp lại…….53

Bảng 3.10.Kết quả thí nghiệm xác định hệ số tái lập của phương pháp………55

Bảng 3.11 Giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của thí nghiệm đánh giá hệ số tái lập….57 Bảng 3.12 Kết quả thí nghiệm xác định độ đặc hiệu của phương pháp………58

Bảng 3.13.Kết quả thí nghiệm xác định độ nhạy của phươngpháp……… 61

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hạt vi rút của HPV ……… 3

Hình 1.2 Cấu trúc bộgen của Papillomavirus và HPV 16 ……….4

Hình 1.3 Cây phả hệ của 118 genotype của Papilomavirus dựa trên trình tự gen vùng L1 ORF 9

Hình 1.4 Tỷ lệ nhiễm HPV ở nữ giới trên thế giới 12

Hình 1.5 Chu kỳ nhân lên của HPV ……….16

Hình 1.6 Phương pháp lai phân tử phát hiện HPV 21

Hình 3.1 Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của phản ứng Realtime PCR đơn cặp primer và probe phát hiện HPV16 ……….35

Hình 3.2 Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer và probe phát hiện HPV18 ………36

Hình 3.3 Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer và probe phát hiện HPV33/52 ……… 37

Hình 3.4 Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer và probe IC ………39

Hình 3.5 Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của kỹ thuật realtime PCR 4 cặp primer và probe phát hiện HPV16, 18 và 33/52 ………40

Hình 3.6 Ảnh điện di sản phẩm khuếch đại trình tự HPV16E6-E7, HPV18L1 …………41

Hình 3.7 Ảnh điện di sản phẩm khuếch đại trình tự HPV52L1 ……… 42

Hình 3.8 Kiểm tra kết quả nhân dòng trình tư HPV16E6-E7 43

Hình 3.9 Kết quả tinh sạch Plasmid mang đoạn chèn HPV16E6-E7 44

Hình 3.10 Kiểm tra kết quả nhân dòng trình tự HPV18L1 44

Hình 3.11 Kết quả tinh sạch Plasmid mang đoạn chèn HPV18L1 45

Hình 3.12 Kiểm tra kết quả nhân dòng trình tự HPV52L1 46

Hình 3.13 Kết quả tinh sạch Plasmid mang đoạn chèn HPV52L1 46

Hình 3.14 Kết quả kỹ thuật realtime đa cặp primer và probe với chúng dương ……… 48

Hình 3.15 Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của thí nghiệm xác định độ chính xác ……….51

Hình 3.16 Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của thí nghiệm xác định hệ số lặp lại ……….52

Hình 3.17 Biến động giá trị Ct của thí nghiệm đánh giá hệ số lặp lại ……… 53

Hình 3.18.Đường tín hiệu huỳnh quang của thí nghiệm xác định hệ số tái lập của kỹ thuật viên 1 ……… 56

Hình 3.19.Đường tín hiệu huỳnh quang của thí nghiệm xác định hệ số tái lập của kỹ thuật viên 2 ……… 56

Hình 3.20.Đường tín hiệu huỳnh quang của thí nghiệm xác định hệ số tái lập của kỹ thuật viên 3 ……… 56

Hình 3.21 Biến động giá trị Ct của thí nghiệm đánh giá hệ số tái lập ……… 57

Hình 3.22.Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của thí nghiệm đánh giá độ đặc hiệu ……….59

Hình 3.23 Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của thí nghiệm đánh giá độ nhạy … 62

Hàng năm trên thế giới ước tính có khoảng 529.000 ca mắc mới UTCTC, tử vong khoảng 275.000 trường hợp, trong đó 85% tổng số các trường hợp bệnh gặp ở những nước đang phát triển[21] Mỗi năm, Châu Á có thêm khoảng 312.000 bệnh nhân UTCTC, chiếm 59% trường hợp mắc mới trên toàn thế giới – đặc biệt ở khu vực Nam Á và Đông Nam Á, nơi có tỷ lệ nhiễm HPV cao nhất trong châu lục[21, 34].Cùng với sự lây nhiễm HPV trong cộng đồng, UTCTC thực sự trở thành gánh nặng bệnh tật toàn cầu, gây ảnh hưởng nặng nề đến sức khỏe và tâm lý của nữ giới

Tại Việt Nam, theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới năm 2012, UTCTC hiện đang là loại ung thư chiếm tỷ lệ cao ở nữ giới, xếp thứ 2 trong số các loại ung thư mà nữ giới độ tuổi 15-44 hay mắc phải, với hơn 5000 ca nhiễm mới (tỷ lệ: 8.1/100.000 phụ nữ) và tử vong hơn 2000 trường hợp mỗi năm[40] Điều đặc biệt quan tâm là phần lớn các trường hợp UTCTC thường được phát hiện ở giai đoạn muộn, trong khi quá trình diễn biến từ nhiễm virus đến ung thư thường trải qua thời gian dài Quá trình tiến triển từ mức dộ loạn sản nhẹ, loạn sản vừa, loạn sản nặng đến ung thư tại chỗ (giai đoạn tổn thương có thể phục hồi) đến giai đoạn ung thư xâm nhập có thể kéo dài từ 10 – 25 năm[22].Đây chính là cơ hội cho việc phát hiện nhiễm HPV, sàng lọc người có nguy cơ mắc ung thư cổ tử cung nhằm giúp quá trình điều trị hiệu quả các tổn thương tiền ung thư và ung thư giai đoạn sớm.Hiện nay ở Việt Nam, xét nghiệm tế bào mô bệnh học (Pap smear) đã được đưa vào thành thường quy trong chương trình sàng lọc UTCTC, các xét nghiệm HPV cũng

đã phổ biến tuy nhiên chi phí còn cao đối với các kit chẩn đoán đã thương mại hóavà yêu cầu đảm bảo chất lượng xét nghiệm với các xét nghiệm trong nước[8]

Với tầm quan trọng và ý nghĩa của việc xác định genotype HPV, cũng như

xuất phát từ thực tiễn nêu trên, đề tài “Xây dựng phương pháp phát hiện một số chủng Human Papillomavirus có nguy cơ cao gây ung thư cổ tử cung ở Việt Nam bằng kỹ thuật Realtime PCR” được thực hiện với mục tiêu sau:

1 Xây dựng phương pháp phát hiện chủng HPV 16, 18 và 33/52 bằng

kỹ thuật multiplex Realtime PCR

2 Thẩm định phương pháp phát hiện các chủng HPV 16, 18, 33/52 bằng

kỹ thuật multiplex realtime PCR trên mẫu dịch quét cổ tử cung

Đề tài nàyđược chúng tôi thực hiện tại phòng Miễn dịch Vắc xin,ViệnVệ sinh Dịch tễ Trung ương

CHƯƠNG1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về Human Papillomavirus

Papillomaviruslàcác thành viên trong họ Papillomaviridae, được tìm thấy

trong rất nhiều loài động vật có vú trong đó có con người Các loài vật chủ khác nhau sẽ nhiễm các loại Papillomavirus đặc thù cho loài đó.CácPapillomavirusgây bệnh cho người gọi là Human papillomavirus(HPV)

1.1.1Đặc điểm hình thái của HPV

HPV là nhóm virus có kích thước nhỏ, không vỏ.Hạt virus có đường kính 55nm, vỏ gồm 72 đơn vị capsomer.Mỗi đơn vị capsid gồm một pentamer của protein cấu trúc L1 kết hợp với một protein L2 (protein này là thành phần kháng nguyên được sử dụng trong phản ứng miễn dịch đặc hiệu)

52-Hình 1.1.Hạt vi rút của HPV[14]

Cả hai protein cấu trúc đều do virus tự mã hóa: Protein capsid chính (L1) có kích thước khoảng 55 kDa và chiếm khoảng 80% tổng số protein của virus Protein capsid phụ (L2) có kích thước khoảng 70 kDa[14]

1.1.2Đặc điểm sinh học phân tử

1.1.2.1 Cấu trúc hệ gen

HPV là virus có vật liệu di truyền là ADN, mạch đôi không hoàn chỉnh, tồn tại dạng siêu xoắn hình vòng (circular ds-ADN).ADN của virus liên kết với histone tạo thành cấu trúc phức hợp giống Chromatin (Chromatin-like conplex) nằm trong lớp vỏ capsid protein

Hình 1.2.Cấu trúc bộgen của Papillomavirus và HPV 16[14]

Cấu trúc hệ gen của nhóm Pappillomavirus nói chung tương tự nhau ở các loài vật chủ, tất cả các khung đọc mở ORF (Open Reading Frame) của virus đều trên một chuỗi ADN, điều này có nghĩa là quá trình phiên mã chỉ xảy ra trên một mạch duy nhất Hệ gen của HPV có 8 khung đọc mở ORF, có thể chia thành 3 vùng chức năng[26]:

1 Vùng mã hóa sớm (Early region) gồm 6 gen mã hóa, ký hiệu là E1, E2, E4, E5, E6, E7 và các khung đọc mở ORF tương ứng Sản phẩm của vùng gen này là các protein chức năng giúp cho quá trình nhân lên ADN của virus, gây hiện tượng tăng sinh tế bào và gây biến đổi tế bào, hình thành tế bào bất tử

2 Vùng mã hóa muộn (Late region) gồm 2 gen mã hóa protein cấu trúc lớp

vỏ capsid L1 và L2

3 Vùng kiểm soát dài LRC (Long Control Region) hay còn gọi là vùng điều hòa URR (Upstream Regulatory Region) chứa ADN không mã hóa, có chức năng điều hòa quá trình sao chép ADN và quá trình phiên mã Đây

là vùng biến động nhất, chiếm khoảng 10% chiều dài của bộ gen, tương đương 800 đến 1000bp tùy từng genotype khác nhau Trình tự vùng này gồm:

- Trình tự tăng cường là nơi gắn của các yếu tố phiên mã như AP-1, NF1, TEF1, TEF2, YY1

- Promoter bao gồm cấu trúc TATA và vùng khởi đầu phiên mã tổng hợp RNA (P97 ở HPV16 và P105 ở HPV18)

- Điểm khởi đầu sao chép ORI và một số chuỗi gen câm (Silencing gene)

1.2.2.2Chức năng và sản phẩm của các gen HPV

 Chức năng gen E1

HPV là virus sử dụng hoàn toàn các thành phần tế bào chủ để sao chép ADN Gen E1 là một trong hai vùng gen bảo tồn nhất của HPV (cùng với L1) mã hóa protein chức năng có vai trò cần thiết cho quá trình sao chép ADN và plasmid Protein E1 gắn vào vị trí khởi đầu của quá trình tái bản (ORI), thực hiện quá trình tháo xoắn ADN (Helicase) và giúp chuổi gen của virus duỗi ra trong quá trình sao chép Hoạt động tháo xoắn ADN của E1 không cần ATP

Khi xâm nhập vào trong tế bào, E1 và E2 đóng vai trò quan trọng trong điều chỉnh quá trình sao chép của virus Protein E2 còn có khả năng gắn với chuỗi ADN đặc hiệu (ở vị trí E2-E2BSs) và protein E1 Tuy nhiên cả hai chức năng của protein E2 đều do gen E1 điều chỉnh

 Chức năng gen E2

Ngoài chức năng trong sao chép ADN của virus, protein mã hoá bởi gen E2 còn đóng vai trò chủ đạo trong quá trình phiên mã cũng như trong quá trình điều hòa giải mã và duy trì ADN virus ở ngoài NST Chức năng điều hòa giải mã của E2 được thực hiện do sự gắn kết với E2BSs trong chuỗi gen của virus có ái lực với E2

và những vị trí liên quan này xác định hiệu quả của E2 trong quá trình giải mã

Trong hệ gen của nhóm HPV nguy cơ cao (HR-HPV), gen E2 mã hoá cho protein có khả năng ức chế quá trình sao chéo bằng các yếu tố thúc đẩy biểu hiện các gen ở vùng mã hóa sớm của virus, do đó khi nhóm HR-HPV cài gen vào trong NST vật chủ sẽ làm tăng khả năng biểu hiện của gen gây ung thư E6, E7

 Chức năng của protein E1^E4 (quá trình splicing giữa gen E1 và E4)

Giống như các protein khác của HPV, protein điều hòa E1^E4 là sản phẩm được tạo ra từ mRNA kết nối chuỗi mã hóa 5 axit amin đầu tiên của E1 và ORF của E4 khi mở vòngdịch chuyển gen E1 và E4 Protein này có chức năng giúp cho quá trình trưởng thành và phóng thích vi rút ra khỏi tế bào mà không làm tan tế bào chủ

ProteinE1^E4 chứa 3 dạng chính tác động vào chu kỳ sống của vi rút gồm: (1) Dạng gen chứa nhiều leucine ở đầu tận cùng N liên quan đến keratin và cần thiết cho nhân lên của ADN; (2) Vùng chứa nhiều proline ở đoạn trung tâm, chứa vị trí threonine cần thiết cho khoảng nghỉ của chu kỳ tế bào tại giai đoạn G2/M và giải

mã của phức hợp cyclinB/cdk1 ở bào tương; (3) Đầu tận cùng C chứa domain đơn dạng kiểu niêm mạc và điều hòa khả năng gen E1^E4 tạo ra sự polimerize, gắn với DEAD-box RNA helicase và tạo ra sự phá vỡ hệ thống sợi keratin[23]

 Chức năng của protein mã hoá bởi gen E5

Gen E5 mã hóa cho sản phẩm là protein E5, một protein chuỗi đôi kỵ nước, kích thước nhỏ nằm ở phần màng Golgi và lưới nội chất của tế bào, cần thiết cho quá trình xâm nhập và tồn tại của virus trong tế bào chủ Protein E5 là yếu tố tác động ngay trong giai đoạn đầu của quá trình xâm nhiễm vào trong tế bào, tạo ra phức hợp với các thụ thể của yếu tố kích thích tăng trưởng và biệt hóa tế bào đồng thời giúp cho virus lẩn trốn đáp ứng miễn dịch của tế bào chủ

Mặt khác, protein E5 còn có vai trò trong việc ngặn chặn sự chết theo chu trình (apotosis) của tế bào khi có sự sai hỏng do chính virus gây ra Khả năng của E5 gây nên sự biến đổi của tế bào do gen E5 có khả năng hoạt hóa receptor của yếu

tố phát triển và ức chế ATPase không bào

 Chức năng gen E6

Gen E6 mã hóa cho protein E6, gồm khoảng 150 acid amin hình thành cấu trúc Cys-X-X-Cys gắn với Zn điều hòa, mã hóa cho khung đọc mở ORF đầu tiên trong chuỗi gen HPV và là một trong những protein gây ung thư chính của HPV

Ba chức năng chính của protein E6 cũng là ba chức năng rất nguy hiểm đối với tế bào vật chủ[12]:

(1) Protein E6 của nhóm Hr-HPV liên kết hoặc không liên kết với protein E7 gây kích thích tế bào chủ phân chia mạnh mẽ và sự phân chia này là liên tục, gây

ra bất tử tế bào Protein E6 có khả năng gây tăng sản bằng cách ức chế chu kỳ nghỉ của vòng tế bào do sự phá hủy ADN và gây thúc đẩy bệnh lý của tế bào Khả năng gây ung thư của E6 được điều hòa bởi hoạt động tương tác protein với protein Một

số tương tác protein được mã hóa trên chuỗi E6 gồm: p53, protein liên quan đến E6 (E6AP), protein gắn với E6 (E6BP), c-myc, p300/CBP, paxillin, protein PDZ, yếu

tố điều hòa interferon 3 và đồng phân của Bcl-2 (Bak)

(2) Tương tác với p53 thông qua sự liên kết giữa E6 và E6AP bằng liên kết ligand, tạo ra thoái triển của p53 (yếu tố giải mã và ức chế ung thư, có vai trò điều hòa chính hoạt động ức chế tổng hợp ADN thông qua chu kỳ nghỉ của tế bào)

Bình thường, khi có tín hiệu phá hủy tế bào hoặc có sự sai hỏng trong quá trình nhân lên của ADN, gen ức chế ung thư p53 được hoạt hóa,dẫn đến dừng chu

kỳ tế bào và gây chết tế bào theo chương trình (apotosis) thông qua hoạt động giải

mã của gen

Hơn nữa, E6 còn có khả năng gắn kết với protein PDZ dẫn đến sự thoái triển của protein PDZ, một protein được bảo tồn trong quá trình tiến hóa, cần thiết cho sự phát triển, kết dính, tăng sinh, biệt hóa và duy trì chu kỳ sống của tế bào

(3) Liên kết với gen Rastrong quá trình bất tử tế bào và kích thích sự phát

triển của NIH3T3, đồng thời hoạt hóa promoter E2 của Adenovirus

 Chức năng của gen E7[12, 29]

Protein E7 được mã hóa từ gen E7 gồm 98 acid amin, tuy kích thước nhỏ hơn protein E6 nhưng lại giữ vai trò không kém phần quan trọng trong cơ chế gây ung thư ở tế bào chủ

Hoạt động chức năng của E7 trong cơ chế gây ung thư do (1) protein E7 có vùng bảo tồn đầu tận cùng N và có domain gắn Kẽm ở đầu C giúp liênkết chặt chẽ hơn với E6, hỗ trợ nhau trong cơ chế gây bất tử hóa tế bào; (2)E7 chứa mô típ gắn protein pocket (LXCXE) giúp E7 gắn kết với các gen ứcchế khối u (như pRb) hoặc gắn với hai protein pocket khác là p107 và p130 làmgiải phóng một số lượng lớn yếu tố phiên mã E2F tự do, kích thích quá trìnhphiên mã, kéo dài tuổi thọ tế bào

Protein E7 của HPV nhóm “nguy cơ cao” cũng như của nhóm “nguy cơ thấp” đều có khả năng gắn kết với protein pocket Tuy nhiên, sự ưu tiên gắnkết của protein E7 với protein pocket khác nhau giữa hai nhóm HPV Ái lựcliên kết này ở những type “nguy cơ cao” cao gấp 10 lần so với ở những type “nguy cơ thấp”

Thông thường, pRb bị thủy phân sớm ở chu kỳ của tế bào Ở giai đoạn phosphorin hóa, pRb ngắn với yếu tố sao chép E2F/DP (phức hợp hoạt hóa sao chép điều khiển sự bộc lộ các gen ở giai đoạn S) gây ức chế quá trình hoạt hóa phức hợp sao chép Sang giai đoạn G1 muộn, pRb được phosphorine hóa bởi phức hợp cyclin/cdk, giải phóng phức hợp E2E/DP do đó các gen thúc đẩy giai đoạn S được hoạt hóa và giải mã

Trong trường hợp nhiễm HPV, sự bộc lộ gen E7 không cần quá trình phosphorine hóa pRb để hoạt hóa phức hợp sao chép E2F/DP Sự kết hợp của E7 với pRb đã được khử phosphorin dẫn đến giải phóng phức hợp E2F/DP từ pRb và hoạt hóa tiếp theo của phức hợp E2F Do đó, sự bất hoạt E7 của pRb tạo điều kiện cho HPV có khả năng vượt quả sự ức chế pRb trong chu kỳ tế bào

 Chức năng của gen L1 và L2

L1 và L2 là hai vùng gen cấu trúc còn gọi là vùng gen mã hóa muộn cho protein vỏ capsid chính và phụ.Hình ảnh virus trên kính hiển vi điện tử cho thấy vỏ capsid của HPV chứa 72 capsomere có cấu trúc vòng bảy cạnh trên hàng rào dạng lưới icosahedral T=7 với kích thước đường kính khoảng 55nm Gen L1 là vùng bảo tồn nhất của vi rút và được dùng để phát hiện cũng như trong phân loại Papillomavirus

Thành phần của vỏ capsid vi rút gồm protein capsid chính L1 và capsid phụ L2 Chỉ cần biểu hiện gen L1,đểhình thành các hạt giả vi rút hoặc phân tử giống vi rút (Virus-like particles, VLPs), các thành phần này khó phân biệt với vi rút thực sự

và đóng vai trò quyết định trong sản xuất kháng nguyên và vắc xin Nếu L2 bộc lộ cùng với L1, nó cũng góp phần tạo ra VLPs, nhưng L2 không cần thiết cho việc hình thành vỏ capsid.L1 và L2 được tổng hợp và gắn trên bề mặt của tế bào sừng (nơi giải phóng các vi rút mới được hình thành)

Mặc dù protein L2 không đặc biệt cần thiết cho việc hình thành vỏ capsid nhưng có vai trò quan trọng trong chu kỳ sống và trong quá trình xâm nhập của vi rút do L2 có khả năng tạo sự gắn kết giữa receptor bề mặt tế bào với actin và với protein ức chế khối u PML (promyelocytic leukemia protein), cần thiết cho giai đoạn đầu của quá trình xâm nhiễm

1.1.3 Phân loại HPV

1.1.3.1 Phân loại theo sự tương đồng trình tự nucleotide gen E6, E7, L1

Theo Hội phân loại virus học quốc tế (Iternational Committee on the

Taxonomy of Viruses), họ Papillomaviridae gồm 15 loại khác nhau (ký hiệu:

Alpha-, Beta-, Gamma-, Delta-, Epsilon-, Zeta-, Theta-, Iota-, Kappa-, Lambda-, Mu-, Nu-, Xi-, Omikron-, Pi-papillomavirus)[9, 18, 31]

HPV là nhóm papillomavirus gây bệnh trên người và là một trong những virus có nhiều genotype nhất Trong hơn 100 genotype được biết đến xác định được khoảng 40 genotype có khả năng gây bệnh và lây truyền qua đường sinh dục[14] Mỗi type gồm có các phân type (Subtype) khác nhau và dưới phân type được chia thành các biến thể (variant) còn gọi là chủng virus[32]

Việc xác định type HPV không dựa vào huyết thanh như các loại virus khác (virus viêm gan, HIV ) mà dựa trên mức độ giống nhau của thành phần nucleotide

và mức độ tương đồng giữa các thành phần acid amin trên chuỗi gen E6, E7 và L1

do đó, các type của HPV thường được gọi là các genotype[18]

Khi một type HPV có ít nhất 10% trình tự vùng gen E6, E7, L1 khác với các

genotype đã biết trước đó thì được xác định là một genotype mới Một subtype

trong genotype được xác định là phân nhóm mới khi bộ gen của chúng khác 2-10%

so với phân nhóm khác trong cùng một genotype đã biết Nếu các subtype có vùng

mã hóa khác nhau1-2% hoặc khác 5% ở vùng không mã hóa thì được gọi là các

biến thể[18]

Hình1.3 Cây phả hệ của 118 genotype của Papilomavirus dựa trên trình tự gen

vùng L1 ORF[18]

Hầu hết HPV gây bệnh trên người và động vật đều thuộc nhóm

Alpha-papillomavirus (thích ứng niêm mạc) hoặc thuộc nhóm Gamma-Alpha-papillomavirus

(thích ứng ở biểu mô sừng)[21]

Mỗi genotype của HPV có một sự thích nghi cao với một loại biểu mô nhất định và khả năng gây bệnh của các genotype khác nhau là không giống nhau trên tế bào đích, điều này còn phụ thuộc vào cách tác động khác nhau của từng vùng gen virus đối với protein bao phủ tế bào chủ ở những vị trí khác nhau trên cơ thể[14] Chính vì vậy, HPV còn có thể phân loại theo khả năng gây bệnh và vị trí gây bệnh

1.1.3.2 Phân loại theomức độ tác động của HPV trên tế bào chủ (khả năng gây ung thƣ)

Dựa vào khả năng gây ung thu, HPV được chia làm 3 nhóm[14, 30]:

+ Nhóm genotype HPV ”nguy cơ thấp” (Low-risk type): những genotype thuộc nhóm này chỉ gây mụn cóc hoặc khối u lành tính ADN của chúng ở dạng vòng nằm ngoài nhiễm sắc thể(NST) chủ Các genotype HPV trong nhóm ”nguy cơ thấp” thường gặp là: HPV6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81, 89 và CP6108

+ Nhóm genotype HPV ”nguy cơ cao” (High-risk type): gồm những genotype có khả năng tích hợp ADN vào hệ gen người, làm rối loạn quá trình nhân lên của tế bào chủ gây ra hiện tượng tăng sinh và bất tử hóa tế bào hính thành các khối u lành tính Những genotype có khả năng gây ung thư thường gặp gồm HPV

16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, 82 và HPV 26, 53, 66 Theo các nghiên cứu trên toàn thế giới, HPV là nguyên nhân gây ra 100% của các ca ung thư cổ tử cung Trong đó HPV16, HPV18 là nguyên nhân dẫn đến 70% các ca ung thư cổ tử cung, 41-67% các tổn thương tế bào biểu bìmức cao (HSIL) và 16-32% các tổng thương mức thấp (LSIL) của ung thư cổ tử cung, tiếp theo là nhóm HPV31, 33, 35, 45, 52, 58 gây 20% các ca ung thư cổ tử cung[41]

+ Nhóm genotype HPV “chưa xác định nguy cơ” (Unknown-risk type): gồm

đa số các genotype HPV chưa xác định được khả năng gây ung thư như HPV 2a, 3,

7, 10, 13, 27, 28, 29, 30, 32, 34, 55, 57, 62, 67, 69, 71, 74, 77, 83, 84, 85, 86, 87, 90,

91

1.1.3.3 Phân loại theo vị trí gây bệnh của HPV (khả năng kích ứng của HPV trên

tế bào đích)

Theo vị trí gây bệnh, HPV được chia thành 3 nhóm[14]

+ Nhóm HPV thích ứng biểu mô sừng: những genotype HPV ở nhóm này có khả năng xâm nhiễm trên da, hình thành các dạng hạt cơm thông thường (HPV 2, 4,

26, 27, 29, 57), hạt cơm phẳng (HPV 1, 2, 4), hạt cơm Butcher (HPV7) Tổn thương thường xuất hiện ở vùng da mặt, cổ và tay chân Đặc biệt, một số genotype HPV ở

nhóm này còn cả khả năng gây loạn sản biểu bì dạng hạt cơm (HPV 2, 3, 5, 8, 9, 10,

12, 14, 15, 17, 19, 20, 25, 36, 37, 46, 47, 50), một dạng bệnh lý nghiêm trọng có khả năng dẫn đến ung thư da và thường xuất hiện trên bệnh nhân suy giảm miễn dịch

+ Nhóm thích ứng tế bào niêm mạc, không phải là niêm mặc đường sinh dục: gồm HPV có khả năng gây bệnh ở niêm mạc miệng, hầu họng (HPV 6, 11, 13, 32), gây đa bướu gai hô hấp tái diễn Một số HPV là nguyên nhân gây bệnh lý lành tính (khối u sùi) hoặc gây bệnh lý ác tính (ung thư) vùng hậu môn, ung thư phổi (HPV 6,

11, 16, 18, 33, 52)

+ Nhóm gây kích ứng tế bào niêm mạc đường sinh dục: nhóm HPV này gây

ra các bệnh lý tại đường sinh dục như sùi mào gà (HPV 6, 11, 42, 43, 44, 54), ung thư cổ tử cung, ung thư dương vật, ung thư âm hộ, ung thư âm đạo (HPV 16, 18, 31,

nang biểu bì, ung thư thanh quản) 6, 11, 16, 30, 33, 36, 37, 38, 41, 48, 60, 72, 73

Tạo hột cơm loạn sản biểu bì 2, 3, 10, 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23,

24, 25, 36, 37, 38, 47, 50

Siêu loạn sản biểu bì trung tâm của Heck 13, 32

Tân loạn sản nội bì tử cung

56, 58

bệnh

1.2 HPV và ung thƣ cổ tử cung

1.2.1 Tình hìnhnhiễm HPV tại Việt Nam và trên thế giới

HPV là một trong những nguyên nhân phổ biến nhất gây ra các bệnh lây truyền qua đường tình dục đối với cả nam giới và nữ giới trên khắp thế giới Theo kết quả báo cáo của tổ chức nghiên cứu ung thư quốc tế (IARC), trên toàn thế giới

có khoảng 6,6% phụ nữ độ tuổi từ 15 đến 74 nhiếm HPV và khoảng 80% phụ nữ nhiễm HPV ít nhất một lần trong suốt đời sống tình dục của họ[16].Vào năm 1976, Harold zur Hausen, một nhà virus học người Đức đã chỉ ra mối liên quan giữa nhiễm HPV và ung thư cổ tử cung Kể từ đó, đã có rất nhiều nghiên cứu dịch tễ học, nghiên cứu in vitro chứng minh mối liên quan giữa nhiễm HPV và ung thư cổ tử cung[19] Ung thư cổ tử cung chiếm trên 25% trong tổng số các ca ung thư trên phụ

nữ ở các quốc gia phát triển, là nguyên nhân đứng sau ung thư vú gây tử vong cho phụ nữ trên thế giới[20] Ước tính vào năm 2002 trong 1 triệu ca mắc bệnh ung thư nói chung có khoảng 500.000 trường hiện hợp đang mắc ung thư cổ tử cung và 275.000 người đã tử vong vì căn bệnh này chiếm 1/10 số phụ nữ bị tử vong do tất

cả các dạng ung thư[13]

Hình 1.4 Tỷ lệ nhiễm HPV ở nữ giới trên thế giới[41]

Theo lứa tuổi, nhóm tuổi dưới 25, tỷ lệ nhiễm HPV ở châu Âu chiếm tỷ lệ cao nhất (50%), tiếp đó đến Trung Á (38%), Châu Úc và Châu Á (21%) Ở nhóm tuổi từ 35 đến 50, tỷ lệ nhiễm HPV có sự thay đổi ở các khu vực, đặc biệt ở khu vực châu Phi và châu Âu Châu Âu có tỷ lệ nhiễm HPV giảm rõ rệt theo độ tuổi tăng dần của phụ nữ (15%) nhưng ngược lại, Châu Phi lại có tỷ lệ nhiễm HPV tăng cao hơn so với phụ nữ trẻ tuổi dưới 25 (20%)[16]

Theo giới, HPV nhiễm phổ biến nhất trong các phụ nữ trẻ ở độ tuổi hoạt động giới tính (khoảng từ 18-30 tuổi) Có chiều hướng giảm rõ rệt ở sau 30 tuổi Tuy nhiên ung thư cổ tử cung lại phổ biến ở phụ nữ trên 35 tuổi hơn các phụ nữ dưới 35 tuổi qua đó đề xuất rằng sự nhiễm HPV xảy ra ở các lứa tuổi trẻ và phát triển chậm chạp qua thời gian dài thành ung thư cổ tử cung[15] Nam giới cũng là nguồn mang HPV có hoặc không biểu hiện thànhcác triệu chứng nhưmụn cóc sinh dục, ung thư dương vật, ung thư hậu môn v.v Tỷ lệ nhiễm HPV chung ở nam trên toàn thế giới trung bình khoảng 7,9%, dao động từ 3,5 – 45% tùy theo độ tuổi và các quốc gia khác nhau, trong đó tỷ lệ các type HR-HPV từ 2,3% đến 34,8% và HPV 16 là type thường gặp nhất Tỷ lệ nhiễm type LR-HPV từ 2,3% đến 23,9% Tình trạng đa nhiễm các type HPV ở nam cũng chiếm tỷ lệ tương đối cao (3,4-22,6%) Như vậy, tỷ lệ nhiễm chung ở nam (7,9%) thấp hơn so với ở nữ (17,9%)

Tại Việt Nam, tỷ lệ nhiễm HPV trong cộng đồng dân cư nữ thay đổi theo vùng địa lý, nghiên cứu (năm 2015) trên 6 tỉnh thành từ năm 2000 đến năm 2006 cho thấy tỷ lệ nhiễm virus HPV chung là 7,9%, cao nhất ở Cần Thơ (14,0%) và thấp nhất ở Hà Nội (5,3%), tỷ lệ nhiễm của từng vùng được trình bày trong Bảng

độ tuổi 18-45 tại Hà Nội và Hồ Chí Minh, ước tính tỷ lệ nhiễm HPV chủng nguy cơ cao (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68) là 8,2% Tỷ lệ phụ nữ

khoảng 9.7% phụ nữ Hà Nội và 6.8% phụ nữ ở thành phố Hồ Chí Minh[27, 37].Tốc độ mắc ung thư cổ tử cung xâm lấn (invasive cervical carcinoma-ICC) ở thành phố Hồ Chí Minh – phía nam Việt Nam cao hơn gấp 4 lần tỷ lệ mắc ở Hà Nội – phía bắc Việt Nam[1-2]

Bảng 1.2.Tỷ lệ nhiễm HPV trên một số tỉnh thành phố tại Việt Nam[36]

1.2.2 Đường lây truyền của HPV

HPV có thể được lây truyền trực tiếp qua da, niêm mạc hay các vết thương

hở từ người bệnh sang người lành trong đó lây truyền qua đường tình dục chiếm đa

số Hoạt động tình dục đồng giới hoặc khác giới qua đường sinh dục, miệng và hậu môn đều là nguyên nhân lây truyền trực tiếp HPV.Nguy cơ lây nhiễm HPV tăng theo số lượng bạn tình của mỗi cá thể

HPV còn có thể được lây truyền qua tiếp xúc với da, từ da sang niêm mạc hoặc từ niêm mạc sang niêm mạc dưới dạng dịch tiết của mụn cơm, qua nước bọt hoặc qua các vật dụng như khăn mặt, quần áo mang HPV của người bệnh

Ngoài ra HPV cũng lây truyền từ mẹ sang con trong quá trình chu sinh, dịch tiết nhiễm HPV từ đường sinh dục của mẹ lây truyền trực tiếp và niêm mạc mắt, miệng và đường hô hấp trẻ sơ sinh và là nguyên nhân của các bệnh lý dai dẳng tại đường hô hấp do HPV[1]

1.2.3.2 Cách phòng nhiễm HPV

Vắc xin phòng HPV: Do không nuôi cấy được, vắc xin HPV được sản xuất bằng quá trình tái tổ hợp tạo các hạt giả virus (virus-like-particles, VLPs) cấu trúc giống HPV gồm các kháng nguyên L1, L2 ở lớp vỏ capsid nhưng không mang vật chất di truyền bên trong Hiện nay có hai loại vắc xin được sử dụng phổ biến trên thế giới là Gardasil® (đặc hiệu với type 6, 11, 16, 18; sử dụng cho nữ 9-26 tuổi và cho nam 11-26 tuổi chưa từng quan hệ tình dục) và Cervarix® (đặc hiệu HPV type

16, 18; sử dụng cho nữ từ 10 đến 45 tuổi) Cả 2 loại vắc xin này đã được FDA công nhận và được sử dụng rộng rãi trên thế giới để phòng nhiễm HPV Tháng 12/2014

tổ chức FDA của Mỹ đã công bố thêm một loại vắc xin mới là Gadasil® 9, sử dụng cho nữ giới 9-26 tuổi và nam giới 9-15 tuổi; ngoài khả năng phòng nhiễm các genotype HPV 6, 11, 16, 18 như Gadasil® thông thường thì Gadasil® 9 còn phòng ngừa thêm các genotype HPV nguy cơ caokhác như 31, 33, 45, 52 và 58[42]

Thực hiện hành vi tình dục an toàn: Việc sử dụng bao cao su cũng là biện pháp giúp hạn chế các bệnh lây truyền qua đường tình dục và góp phần phòng lây

nhiễm HPV tuy nhiên bao cao su không phòng tránh lây nhiễm HPV qua tiếp xúc

da hoặc qua đường miệng

1.2.3.3 Điều trị

Đa số HPV xâm nhiễm vào tế bào chủ chỉ tồn tại trong thời gian ngắn, khoảng 90% HPV bị đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào và đáp ứng miễn dịch (IgA) trong 12 đến 36 tháng đầu sau nhiễm

Những tổn thương tại chỗ ở biểu mô trên da và niêm mạc được điều trị lạnh, phương pháp lazer hoặc bằng phương pháp cắt vòng bằng điện.Ở những bệnh nhân ung thư do HPV, phẫu thuật là phương pháp được sử dụng chủ yếu Xạ trị và hóa trị được sử dụng để ngăn chặn lây lan sau phẫu thuật hoặc trong trường hợp bệnh nhân không thể phẫu thuật được

1.2.4Chu kỳ nhân lênvà cơ chế gây bệnh của HPV

1.2.4.1 Chu kỳ nhân lêncủa HPV

Chu kỳ nhân lêncủa HPV liên quan chặt chẽ với tế bào biểu mô vật chủ,được chia làm 4 giai đoạn[11]:

(1) Giai đoạn xâm nhập: Vị trí đầu tiên HPV xâm nhập vào là lớptế bào đáy

ở những vị trí dễ tổn thương Ở giai đoạn này, số lượng vi rút thấp và tồn tại ở dạng episomal tách rời với gen của tếbào vật chủ

(2) Giai đoạn tiềm tàng: ADN HPV có thể tồn tại rất lâu với số lượng ítvà

không sao chép, không tạo các hạt virus Các gen E1, E2 rất cần thiết chosự nhân lên của vi rút ở giai đoạn này

(3) Giai đoạn nhân bản mạnh: Cùng với quá trình nhân lên và biệt hóatừ

lớp tế bào đáy lên các tế bào ở lớp trên, các tế bào sừng bị nhiễm HPV mớihình thành cũng di chuyển lên các lớp trên, các gen muộn HPV được bộc lộvà khởi động giai đoạn tăng sinh của vi rút, ADN HPV được nhân lên trong tếbào chủ Chu kỳ nhân lên của vi rút không kèm theo hiện tượng chết hoặcphân hủy tế bào do vậy không gây hiện tượng viêm và sản xuất các cytokinetiền viêm Các gen E5, E6, E7 tác động hỗ trợ cho hoạt động nhân lên của virút đồng thời tăng hoạt động tổng hợp ADN của tế bào chủ và ngăn hiệntượng appotosis

(4) Giai đoạn giải phóng: Ở lớp tế bào sừng ngoài cùng, gen L1 và L2có vai

trò hình thành vỏ capsid cho ADN của vi rút Các hạt vi rút mới đượchình thành giải phóng ra bề mặt tế bào sừng.Quá trình biểu hiện gen và quá trình phát triển nhân lên của vi rút xảyra trong nhân tế bào chủ, liên quan chặt chẽ với quá trình tăng sinh của tế bàochủ ở lớp tế bào đáy mà không có giai đoạn HPV di chuyển

trong máu Tuynhiên, HPV ADN vẫn có thể được tìm thấy trong các tế bào bạch cầu đơnnhân máu ngoại vi, trong các tế bào di căn của bệnh nhân ung thư doHPV, các trường hợp đồng nhiễm HIV Điều này được giải thích do trong quátrình biểu hiện gen và trong quá trình nhân nhân bản mạnh của vi rút đã xảyra hiện tượng đứt gãy đoạn gen E2 và gen E6

Có nhiều cơ chế giải thích sự lẩn trốn của HPV khỏi đáp ứng miễn dịchcủa vật chủ, gây nhiễm dai dẳng HPV dẫn đến sự biến đổi tế bào Gen E6 vàE7 của HPV nhóm “nguy cơ cao” làm cơ thể suy giảm khả năng sản xuấtinterferon, cytokine, ức chế đáp ứng miễn dịch tự nhiên tiêu diệt vi rút và điềuhòa miễn dịch Gen E6 có khả năng gắn vào yếu tố 3 điều hòa interferon(IRF-3) gây ức chế chức năng hoạt hóa của yếu tố này Đồng thời, gen E7phản ứng với IRF-1 gây ức chế sự sao chép đối với yếu tố thúc đẩy IFN-1.Mặc dù, HPV có khả năng lẩn trốn khỏi cơ chế đáp ứng bảo vệ của cơthể vật chủ nhưng hầu hết các trường hợp nhiễm HPV diễn ra ngắn và tổnthương có thể tự hết trong vòng 1 năm hoặc dưới tác động của đáp ứng của hệmiễn dịch cơ thể Khoảng 91% HPV bị loại bỏ tự nhiên trong năm đầu saunhiễm và 70% xảy ra trong năm thứ hai Tuy nhiên, một tỷ lệ nhỏ HPV có thểtồn tại dai dẳng ở lớp tế bào đáy và là nguyên nhân dẫn đến sự biến đổi tế bào

Hình 1.5 Chu kỳ nhân lên của HPV[21]

1.2.4.2 Cơ chế gây bệnh của HPV

HPV lây truyền chủ yếu qua đường tình dục, có khả năng gây biến đổi tế bào

và dẫn đến ung thư qua các bước sau[6, 10]:

(1) Xâm nhập chuỗi gen của HPV vào tế bào chủ: Bộ gen của HPV xâm nhập vào chuỗi gen của vật chủ ở dạng episome (ADN dạng vòng ở ngoài NST vật chủ) đối với nhóm LR-HPV hoặc tích hợp ADN vào NST vật chủ đối với nhóm HR-HPV

Ở dạng episome, vùng gen mã hóa E2 không bị biến đổi Nồng độ protein E2 tăng lên cùng với sự tăng cường sao chép ADN HPV gây hiện tượng tăng sinh tế bào đồng thời ức chế giải mã vùng gen mã hóa sớm và ức chế hoạt động của gen E6, E7 Khi E6, E7 bị ức chế sẽ hoạt hóa con đường p53 và yếu tố ức chế hình thành khối u pRb giúp tế bào sửa chữa hoặc chết theo chương trình phụ thuộc vào mức độ của sự tác động phá hủy Do đó, có hiện tương tăng sinh một số lượng lớn

tế bào nhưng vẫn dưới sự kiểm soát của p53 và pRb

Khi chuỗi gen HPV xâm nhập và NST của vật chủ sẽ làm hỏng và phá vỡ ORF của gen E2 làm cho protein E2 không được tổng hợp và giải phóng gen E6, E7 khởi trạng thái ức chế Chính việc mất kiểm soát các gen E6, E7 đã gây ra những tổn thương nghiêm trọng cho tế bào chủ Hai oncogen E6, E7 sẽ tổng hợp ồ ạt các protein tương ứng có khả năng gắn và làm giảm chức năng của các protein điều hòa chu kỳ của tế bào p53 (protein ức chế khối u) và pRb; bất hoạt các cyclin của tế bào (cell cyclins) và các kinase phụ thuộc cyclin (cyclin dependent kinases) đây là điều kiện quan trọng gây biến đổi gen tế bào chủ[23]

(2) Gây bất tử hóa tế bào: Protein E6, E7 của các genotype nhóm

HR-HPV có khả năng kết hợp với ras Protein ras là phân tử truyền thông tin nội tế bào, khi ras được hoạt hóa làm tế bào phát triển, biệt hóa và duy trì sự sống Gen mã hóa protein ras được coi là gen gây ung thư phát hiện đầu tiên Cơ chế của protein E6

gây bất tử tế bào được chứng minh bằng khả năng liên kết với p53,làm cho p53 bị phân giải nhanh chóng theo con đường phân giải ubiquitin nội bào (cellular ubiquitin lygase) Do đó protein p53 không tham gia được vào quá trìnhdừng tế bào

ở pha G1-S, không kích hoạt được quá trình chết theo chu trình (apoptosis) và sửa chữa ADN không được diễn ra Điều này đồng nghĩa với sự nhân lên một cách không kiểm soát của các tế bào bị nhiễm HPV[23] Bên cạnh đó, protein E7 của HPV tham gia vào cơ chế gây bất tử tế bào bằng cách liên kết với pRb khiến protein

này ít được phosphoril hóa, qua đó phá vỡ sự kết hợp của pRb với yếu tố sao chép E2F-1 (transcription factor), giải phóng E2F-1, kích hoạt phiên mã các gen cần cho quá trình chuyển từ pha G1 sang pha S,dẫn đến sự mất kiểm soát của tế bào ở giai

đoạn chuyển pha G1-S, thúc đẩy sự phân chia không ngừng nghỉ của tế bào

(3) Gây bất ổn định gen tế bào chủ: Bất thường quá trình phân bào có thể gây ra bởi protein E6, E7 của các genotype nhóm HR-HPV mà không gặp ở nhóm LR-HPV, gây mất alen ở một số gen nhất đinh có liên quan đến sự xuất hiện và tiến triển của ung thư E6 gây bất ổn định gen do khả năng ức chế chức năng p53 dẫn đến rối loạn quá trình sửa chữa ADN bình thường, do đó các sai hỏng của gen sẽ không được sửa chữa E7 gây bất ổn định gen thông qua sự bất hoạt của pRb và khả năng tác động tới quá trình tổng hợp trung thể dẫn đến hậu quả là sự phân chia

ADN không bình thường trong quá trình phân chia tế bào[26]

(4) Biến đổi đáp ứng với phá hủy ADN: Gen E6 và E7 gây mất khả năng đáp ứng của cơ thể với sự phá hủy ADN Khi có sự phá hủy ADN cơ thể đáp ứng bởi quá trình hoạt hóa p53 tạo protein điều hòa giai đoạn nghỉ giữa hai chu trình nhân lên của tế bào Chính vì thế E6, E7 có khả nẳng ức chế giai đoạn nghỉ giữa các lần phân bào thông qua sự ức chế p53 E6 chỉ kết hợp và bất hoạt p53, nhưng E7 không chỉ gây rối loạn chức năng của pRb-yếu tố điều hòa chu trình tế bào, mà còn bất hoạt p21 chất ức chế kinase phụ thuộc cycline, yếu tố cần thiết xuất hiện do p53

Các xét nghiệm sàng lọc tổn thương và phát hiện bất thường tế bào mô bệnh học có thể áp dụng như sinh thiết cổ tử cung, xét nghiệm Pap smear (xét nghiệm tế bào học theo phương pháp Papnicolaous)

Theo phân loại mới của Hệ thống Bethesda, trên mẫu phết tế bào cổ tử

cung, những biến đổi tế bào được chia ra các loại sau đây:

- ASC (Atypical Squamous Cells): Tế bào gai không điển hình, với 2 nhóm: + ASC–US (Atypical Squamous Cells of Undetermined Significance): Tế bào gai không bình thường, không điển hình, nhưng không thể biết tại sao, đôi khi do HPV Trong tình huống này, có thể làm xét nghiệm HPV để xác định

+ ASC–H (Atypical Squamous Cells cannot exclude a High-grade squamous intraepithelial abnormality): Tế bào gai không bình thường, không điển hình, nhưng không thể biết tại sao, có thể liên quan với tổn thương tiền ung thư

- AGC (Atypical Glandular Cells): Tế bào tuyến cổ trong không bình thường, không điển hình, nhưng không thể biết tại sao

- AIS (endocervical Adenocarcinoma In Situ): Có tế bào tiền ung thư tuyến tại chỗ

- LSIL (Low-grade Squamous Intraepithelial Lesion): Tổn thương trong biểu

mô độ thấp, tổn thương nhẹ, thường gặp, nhất là ở phụ nữ trẻ, thường được coi là tổn thương do HPV, đa số tự khỏi sau vài tháng đến vài năm

- HSIL (High-grade Squamous Intraepithelial Lesion): Tổn thương trong biểu mô độ cao Tổn thương này có tế bào kích thước và hình dạng khác nhiều so với tế bào bình thường, là tổn thương nặng, có thể diễn tiến thành ung thư nếu không được điều trị đúng và kịp thời.

1.2.5.2Các phương pháp phát hiện HPV ở mức độ phân tử

Do HPV không phát triển trong điều kiện nuôi cấy ở phòng thí nghiệm mà

chỉ có thể thực hiện nghiên cứu invivo trên người hay động vật bị nhiễm, các kháng

nguyên capsid của virus xuất hiện không ổn định và kháng thể kháng protein capsid HPV vẫn tồn tại nhiều năm sau khi đã loại bỏ hoàn toàn HPV nên các xét nghiệm miễn dich học rất ít được sử dụng trong xét nghiệm HPV[7] Trạng thái sống tiềm

ẩn của HPV khi xâm nhập vào cổ tử cung thường kéo dài từ 1-8 tháng, không phát triển, không gây tổn thương, có hoặc không có các triệu chứng nhẹ, không đặc hiệu

Do đó các kỹ thuật xét nghiệm tế bào học, giải phẫu bệnh, soi cổ tử cung đều khó có thể phát hiện chính xác sự có mặt của HPV Chỉ những xét nghiệm sinh học phân tử

có độ nhạy cao như PCR, lai phân tử mới có khả năng phát hiện được HPV[3].Các phương pháp phân tử phát hiện HPV có thể chia thành hai nhóm chính: phương pháp dựa vào khuếch đại tín hiệu để phát hiện mục tiêu và phương pháp phát hiện dựa vàoviệc trực tiếp khuếch đại mục tiêu[43]

1.2.5.2.1 Khuếch đại tín hiệu

Phương pháp lai là một trong những phương pháp khuếch đại tín hiệu được

sử dụng phổ biến để phát hiện HPV trong bệnh phẩm, dựa trên sự phát quang bằng phản ứng hóa học của phức hợp gồm kháng thể bị bắt giữ dung dịch lai và tín hiệu được khuếch đại Các phương pháp lai sử dụng trong phát hiện HPV bao gồm[14]:

 Xét nghiệm lai bắt giữ thế hệ 2 (Hybrid Capture 2 HPV Test - Qiagen)

Kỹ thuật lai bắt giữ là kỹ thuật lai được ứng dụng phổ biến nhất để phát hiện HPV Kit Hybrid Capture 2 HPV Test (HC2) ứng dụng kỹ thuật lai bắt giữ để phát hiện HPV do tập đoàn Diegene công bố và được US FDA công nhận vào năm 1999

là kỹ thuật được sử dụng nhiều hơn trong lâm sàng

Nguyên tắc kỹ thuật dựa trên hiện tượng lai HPV ADN với probeARN đặc hiệu Xétnghiệm này mẫu ADN được giải phóng nhờ môi trường kiềm có độ ly giải cao chuẩn bị cho việc lai với hỗn hợp probe là các đoạn ARN đặc hiệu với trình tự của 13 chủng HPV nguy cơ cao (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 và 68)

5 chủng HPV nguy cơ thấp (6, 11, 42, 43 và 44), probeARN có thể được đánh dấu phóng xạ hoặc không đánh dấu phóng xạ Thể lai giữa ARN – ADN chỉ được tạo ra khi có mặt của HPV ADN.Một kháng thể đơn dòng đặc hiệu cố định các thể lai ARN-ADN vào đĩa.Phức hợp lai ADN-ARN được phát hiện bởi kháng thể đặc hiệu

đã gắn alkaline phosphatase trên máy miễn dịch huỳnh quang Mỗi phức hợp lai sẽ phát một tín hiệu huỳnh quang (relative light unit - RLU), số lượng tín hiệu huỳnh quang tương ứng lượng ADN đích trong mẫu bệnh phẩm (Hình 1.6)[14, 43]

Xét nghiệm bán định lượng này được sử dụng trong lâm sàng để cảnh báo nguy cơ ung thư cổ tử cung Xét nghiệm nàycó độ nhạy cao với khả năng phát hiện ADN HPV16 ở nồng độ 1pg/μl, tương ứng với 105 copy, rất dễ thực hiện và dễ dàng đối chiếu giữa các phòng thí nghiệm Tuy nhiên xét nghiệm này không cho xác định chủng một cách đặc hiệu, do đó không phải là phương án tối ưu cho các nghiên cứu dịch tễ học đánh giá hiệu quả của vắc xin đặc hiệu cho các chủng HPV[43]

Hình 1.6 Phương pháp lai phân tử phát hiện HPV[14]

 Phương pháp lai Southern-blot

Nguyên tắc lai Southern-blot dựa trên khả năng tiếp nhận ADN của màng lai nitrocellulose Sự ra đời của phương pháp điện di trên gel đã cho phép phân tách các đoạn ADN được cắt bởi enzym cắt giới hạn dựa trên kích thước của chúng và phương pháp chuyển ADN từ gel sang màng lai nitrocellulose là cơ sở cho sự ra đời của phương pháp lai do E.M Southern mô tả năm 1975

Lai Southern-blot là phương pháp được ứng dụng sớm nhất trong phát hiện HPV Đây là phương pháp có độ nhạy rất cao, cho phép phát hiện đoạn ADN đích

sử dụng các mẫu dò được đánh dấu bằng phóng xạ (hệ thống phát hiện bằng enzym) Các điều kiện cho quá trình lai có thể được kiểm soát tại các thời điểm khác nhau trong hoặc sau quá trình lai bằng cách thay đổi nhiệt độ và nồng độ muối

Có nhiều phương pháp đánh dấu mẫu dò oligonucleotid khác nhau được sử dụng nhưng đa số mẫu dò thường đánh dấu ở đầu 5’ bằng 32P hoặc bằng các chất không phải là phóng xạ như chất nhuộm huỳnh quang đã được gắn với horseradish peroxydase, với alkaline phosphatase, với digoxygenin Sau đó, phức hợp mẫu dò

đã đánh dấu sẽ được phát hiện bởi các kháng thể đặc hiệu[5]

Lai Southern-blot có thể sử dụng ADN tách từ bệnh phẩm đã bảo quản hoặc bệnh phẩm tươi Sự xuất hiện của sản phẩm lai được đánh giá như tiêu chuẩn chẩn đoán sự có mặt của HPV trong bệnh phẩm vì kích thước của kích thước của đoạn lai được đánh giá bằng nội kiểm dương đặc hiệu cho mỗi phản ứng Tuy nhiên, độ đặc hiệu của phương pháp này không cao và cần thực hiện bắt buộc tại các phòng xét nghiệm chuyên sâu

1.2.5.2.2 Khuếch đại mục tiêu

Phương pháp khuếch đại mục tiêu được sử dụng phổ biến nhất là PCR Nhiều thí nghiệm PCR đặc hiệu chủng đã được phát triển để phát hiện sự có mặt của từng chủng HPV nhưng các nghiên cứu dịch tễ nói chung thường đòi hỏi phải

lý giải được sự có mặt của nhiều chủng HPVchủ chốttìm thấy trong đường sinh dục Vấn đề này được giải quyết bằng cách khuếch đại một phần bộ gen HPVđươc bảo tồn bền vững như gen L1, xét nghiệm được gọi là PCR phát hiện HPV dựa trên đoạn gen L1 Xét nghiệm PCR phát hiện tất cả các chủng HPV được đưa ralần đầu tiên bởi Manos và cộng sự Xét nghiệm này dùng cặp mồi MY09/11 khuếch đại đoạn sản phẩm dài 450 bp để phát hiện sự có mặt của HPVvà sau đó xác định chủng được thực hiển bằng các kỹ thuật khác như RFLP, giải trình tự ADNvà RBH với các đầu dò oligonucleotide đặc hiệu các chủng Các cặp mồi bổ sung nhắm tới cùng một vùng mã hóa trong L1 được sử dụng khá rộng rãi, bao gồm GP5+/GP6+, SPF10khuếch đại đoạn sản phẩm tương ứng dài khoảng 160 bp, 65 bp Do kích thước sản phẩm nhỏ nên các đoạn mồi GP5+/6+ vàSPF được sử dụng nhiều hơn với các mẫu bảo quản trong parafin để tăng độ nhạy của xét nghiệm với các acid nucleic đứt gãy Do kích thước rất nhỏ sản phẩm khuếch đại mà phương pháp Elisa lai ADN trên đĩa được thực hiện nhiều cho mồi SPF Việc phát hiện ra sản phẩm khuếch đại chứng tỏ sự hiện diện của HPV, với thể lai đặc hiệu có thể xác định được từng chủng HPV Việc định typetừ các sản phẩm khuếch đại đểphát hiện tất cả các chủng HPV được thực hiện phổ biến nhất bằng RBH, trong đó sản phẩm khuếch đại lai với đầu dò đặc hiệu chủng gắn trên màng và sau đó phát hiện bằng phương pháp so màu hoặc quang hóa.Các phương phápkhuếch đại mục tiêu để phát hiện và định chủng HPV sử dụng được phát triển và sử dụng ngày càng nhiều và phong phú hơn Các phòng thí nghiệm cần phải thẩm định lại độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm mà họ sử dụng, cho dù đó là xét nghiệm tự xây dựng hay là xét nghiệm mua trên thị trường, nhằm đảm bảo rằng các xét nghiệm này sẽ nâng cao được khả năng chẩn đoán phát hiện HPV[43]

Bảng 1.3.Các cặp mồi dùng cho PCR phát hiện HPV[43]

Tên mồi Gen đích Chiều dài sản phẩm

Một số kit thương mại phát hiện HPV ADN dựa trên nguyên lý phản ứng PCR:

+ Kỹ thuật Reverse line blot (Roche Molecular systems - Alameda, CA) là

kỹ thuật đầu tiên ứng dụng phương pháp PCR trong phát hiện HPV ADN và HPV genotype, dựa trên nguyên lý của PCR sử dụng primer PGMY09/11 khuếch đại vùng gen L1 HPV Sản phẩm PCR được lai với các mẫu dò gồm các mẩu olionucleotid đặc hiệu đa type HPV gắn trên màng Phức hợp gắn được phát hiện bằng mắt thường Kỹ thuật này có thể phát hiện được 27 HPV genotype khác nhau trong đó có 11 type LR-HPV Hiện nay, trên thương mại đã công bố Linear Array HPV Genotyping Test (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) có thể phát hiện 37 HPV genotype bao gồm 14 type LR-HPV Đây là loại kit được sử dụng phổ biến nhất trong các phòng thí nghiệm ở Châu Âu, đã được FDA chấp thuận nhưngchưa được phê chuẩn Ngoài ra, trên thương mại còn có kit INNO-LiPA HPV Genotyping Extra (Innogenetics, Ghent, Begium) với nguyên lý lai Reverse line blot phát hiện 24 HPV genotype khác nhau, L1 ADN HPV được khuếch đại bằng primer SPF 10 và được lai với các probeđặc hiệu trên màng Phương pháp này chỉ tập trung xác định sự có mặt của HPV qua gene L1, trong trường hợp virus đã xâm nhập vào trong tế bào và có sự cắt bỏ 1 số gen không cần thiết thì xác định bằng phương pháp này sẽ là không chính xác

+ Amplicor HPV test (Roche Molecular Systems) là kỹ thuật có thể phát hiện

13 type HPV "nguy cơ cao" Nguyên lý kỹ thuật dựa trên phản ứngPCR khuếch đại sản phẩm lai sau khi ADN đích đã lai kháng thể đặc hiệu gắn huỳnh quang Nhược điểm của kit là chỉ phát hiện được nhóm genotype HPV mà không phát hiện từng HPV genotype đặc hiệu So sánh Amplicor với Hybrid Capture II Assay (cùng phát hiện được 13 type HPV "nguy cơ cao") cho thấy độ tương đồng là 83,3%[7]

+ Multiplex HPV Genotyping Kit (Multimetrix, Heidelberg, Gemany) là kỹ thuật gắn huỳnh quang sản phẩm PCR và mẫu dò đặc hiệu Primer kit gồm 24 mẫu

dò tương ứng 24 genotype HPV, 1 mẫu dò β-globin và 1 mẫu dò chứng Sau khi sản phẩm PCR được lai với các mẫu dò sẽ được gắn R-phycoerythrin đã đánh dấu streptavidin và được đọc trên máy phân tích Luminex Đây là Kit có độ nhạy cao và

có thể ứng dụng cho các nghiên cứu dịch tễ học, tuy nhiên hiện nay Kit thường chỉ

sử dụng cho mục đích nghiên cứu vì giá thành cao

1.2.5.2.3 Phương pháp Realtime PCR

Các phương pháp PCR thông thường chỉ đánh giá định tính mà không đánh giá định lượng vi rút Real-time PCR là phương pháp khuếch đại đích có độ nhạy cao, thường được sử dụng trong định tính và định lượng ADN HPV

Realtime PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại ADN đích hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng, do đặc điểm này nên với realtime PCR người làm thí nghiệm không cần làm tiếp các thí nghiệm để xác định có sản phẩm khuếch đại đích hay không Phản ứng realtime PCR cho phép phát hiện các bản sao được tạo ra trong từng chu kỳ nhiệt bằng cách sử dụng probe (đoạn dò)có khả năng phát huỳnh quang dưới tác động của nguồn sáng kích thích.Kết quả sản phẩm khuếch đại hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt dựa trên sự tỷ lệ thuận giữa tín hiệu huỳnh quang phát ra và số lượng bản sao ADN được tổng hợp.Do đó đây là phương pháp khuếch đại đồng thời cả mục tiêu và tín hiệu để phát hiện tác nhân đích

Nguyên lý của kỹ thuật realtime PCR sử dụng Taqman probe: Trong phản ứng Realtime PCR ngoài các thành phần giống phản ứng PCR cơ bản còn cần probe (probe) có thể phát huỳnh quang khi xuất hiện sản phẩm khuếch đại đặc hiệu Probe

là những đoạn oligonucleotide sợi đơn có trình tự bắt cặp bổ sung với một đoạn trình tự trên ADN đích, đầu 5’ có gắn huỳnh quang (reporter) còn đầu 3’ gắn chất hấp phụ huỳnh qang tương ứng (quencher) để hấp phụ ánh sáng huỳnh quang phát

ra từ reporter Khi chưa có sự xuất hiện của sản phẩm khuếch đại, probe vẫn còn nguyên vẹn, huỳnh quang phát ra từ reporter ở đầu 5’ sẽ bị quencher ở đầu 3’ ở probe hấp phụ do vậy huỳnh quang sẽ không được phát ra dưới tác động của nguồn sáng kích thích Khi bắt đầu xuất hiện sản phẩm khuếch đại, probe bắt cặp vào sợi khuôncủa sản phẩm sẽ cản trở hoạt động Enzyme Taq polymerase kéo dài primer tổng hợp mạch bổ sung, do đó probe sẽ bị enzyme này thủy phân bởi hoạt tính 5’-3’ exonuclease giải phóng ra đầu reporter của probe, reporter rời xa quencher sẽ phát được huỳnh quang khi nhận nguồn sáng kích thích Sản phẩm khuếch đại càng nhiều thì số lượng reporter tự do càng lớn, dưới tác động của nguồn sáng kích thích

mà cường độ huỳnh quang reporter đủ mạnh thì máy sẽ ghi nhận tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng[4] Multiplex realtime PCR nguyên lý cũng tương tự như kỹ thuật realtime PCR nhưng sử dụng nhiều probe trong cùng một phản ứng giúp tiết kiệm sinh phẩm, thời gian và phát hiện được nhiều tác nhân trong cùng một phản ứng

Đường chuẩn của phản ứng được xây dựng dựa trên số lượng bản sao ADN đích trong một gam mẫu chuẩn và xác định giá trị chu kỳ ngưỡng cho từng mẫu tương ứng Chu kỳ ngưỡng (Ct-threshold cycle) là chu kỳ nhiệt mà ở tại thời điểm

đó sản phẩm PCR cho tín hiệu huỳnh quang tăng vọt vượt qua cường độ huỳnh quang nền Nếu số lượng ADN đích càng lớn thì Ct càng nhỏ và nếu số lượng ADN đích ít thì cần nhiều chu kỳ nhiệt hơn Phản ứng real-time PCR lý tưởng khi tín hiệu huỳnh quang tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ nhiệt

Phương pháp real-time PCR có thể thực hiện nhanh, giá thành không đắt, định lượng được sản phẩm ADN và ARN Phương pháp này có thể phát hiện được 10.000 chuỗi gen sao chép/phản ứng (khoảng 100 tế bào bị nhiễm)[4]

Trên thị trường có các loại Kit khác nhau dựa trên nguyên lý của realtime PCR như Roche LightCycler 2, GenoID realtime HPV Kit hoạt động trên hệ thống Applied Biosystems 7900 HT Những kit này thường được sử dụng trong chẩn đoán

invitro tại Châu Âu, tuy nhiên vẫn chưa được FDA công nhận

Cobas® kit 4800 Roche định tính HPV trong các mẫu bệnh phậm dựa trên nguyên lý là Realtime PCR, được FDA công nhận, đã được thương mại hóa, sử dụng rộng rãi để phát hiện các gennotype HR-HPV 16, 18, nhóm HPV31, 33, 35,

39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68

Từ những ưu điểm giá thành hợp lý, nhanh và chính xác nêu trên, chúng tôi quyết định chọn Realtime PCR là phương pháp dùng trong nghiên cứu

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu là mẫu ADN HPV từ dịch phết âm đạo của nữ giới ở độ tuổi

18 đến 45 ở Hà Nội và thành phố Hồ Chí Minh trong năm 2014 Các chủng HPV có nguy cơ cao (hrHPV) được phát hiện bởi bộ sinh phẩm Cobas 4800 (Roche, Đức) Đồng thời các mẫu kể trên được xác định chủng tại Viện Ung Thư- CHLB Đức và giải trình tự được một số gen E6, E7, L1 Bộ mẫu này được sử dụng như mẫu chuẩn của nghiên cứu

Ở mục tiêu 1, chúng tôi sử dụng số lượng mẫu n <5 cho mỗi chủng HPV đang nghiên cứu để xây dựng phương pháp Các trình tự genome HPV tìm thấy ở

ngân hàng gen NCBI (từ khóa: human papillomavirus complete genome) được tải

về, tạo cơ sở cho việc thiết kế primer và probe

Ở mục tiêu 2, chúng tôi sử dụng số lượng mẫu lớn hơn, đa dạng về genotype (n= 2-20) để đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của phương pháp

2.1.2 Sinh phẩm và vật tư tiêu hao

Sinh phẩm sử dụng trong nghiên cứu sử dụng trong nghiên cứu, bao gồm:

- Sinh phẩm cho phản ứng Realtime PCR: các cặp primer và probe đặc hiệu với một số đoạn gen đặc trưng cho các chủng HPV nguy cơ cao(IDT, Mỹ); Quantifast Multiplex PCR Kit (QiaGen, CHLB Đức)

- Sinh phẩm cho tạo dòng và sản xuất chứng dương:

+ Sinh phẩm cho phản ứng PCR khuếch đại các gene 16E6-E7, 18L1, 52L1: các cặp primer tương ứng, H2O, DreamTaq buffer 10X, Enxyme DreamTaq, MgCl2, dNTPs và sinh phẩm cho điện di gồm agarose, Redsafe, TAE 1X

+ Sinh phẩm cho nhân dòng: Kit tinh sạch ADN qua gel của Promega, môi trường nuôi cấy LB lỏng, môi trường nuôi cấy LB đặc, vector P-entry D.Topo, tế

bào khả biến E Coli TOP10, Kanamycine

Các vật tư tiêu hao sử dụng trong nghiên cứu gồm: eppendoft 0.2ml, 0.5ml, 1.5ml (Bio Sorenson, Mỹ) , falcol, tip, đĩa nuôi cấy v.v

2.1.3 Máy móc và thiết bị

Thiết bị của phòng thí nghiệm Miễn dịch Vắc Xin, Khoa Miễn Dịch và Sinh học phân tử, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương được sử dụng trong từng mục tiêu nghiên cứu như sau:

- Tủ ấm nuôi cấy vi khuẩn (NUAIRE, ), máy lắc, bể ổn nhiệt

- Máy đo OD Nanodrop Ngoài ra còn các thiết bị khác: tủ hood an toàn sinh học để trộn phản ứng PCR và tra mẫu, cân phân tích, máy vortex, máy minispin, máy li tâm, lò vi sóng, tủ lạnh -20ºC, tủ lạnh 4ºC v.v…

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1Xây dựng kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV 16, 18,33/52

2.2.1.1 Thiết kế primer và probe cho phản ứng Realtime PCR

Trình tự primer được tham khảo từ các bài báo trên cơ sở dữ liệu Pubmed (NCBI) Các phần mềm tin sinh được sử dụng:

+ Primer 5: Kiểm tra các đặc điểm của primer và probe: chiều dài, %GC, cấu trúc hairpin, sự bắt cặp không đặc hiệu giữa hai primer hoặc giữa primer và trình tự đích; chiều dài sản phẩm, tính đặc hiệu của primer và probe với trình tự đích trên ADN HPV

+ Mega 5: Kiểm tra tính đặc hiệu của primer và probe với nhiều trình tự genome khác nhau của chủng HPV đang cần phát hiện và các chủng HPV còn lại Các trình tự này được thảm khảo từ cơ sở dữ liệu Nucleotide (NCBI) Kiểm tra tính đặc hiệu của primer và probe với các trình tự E6, E7 và L1 của các chủng HPV16,

18 và 52 mà nhóm nghiên cứu đã phân tích được để xác định tính đặc hiệu của primer và probe với các chủng HPV đang lưu hành ở Việt Nam

Từ dữ liệu tham khảo trong các bài báo[28, 33-34], trình tự genome của các chủng HPV trên cơ sở dữ liệu, trình tự các đoạn gen mà nhóm nghiên cứu phân tích đượcvà các phần mềm tin sinh kiểm tra,chúng tôi thiết kế được primer và probe cho

kỹ thuật realtime PCR phát hiện chủng HPV16, 18, 33/52 như sau: primer và probe

nhận biết HPV16 cho kết quả dương tính trên kênh HEXvà phát hiện đoạn trình tự đặc hiệu ở vùng HPV16 E6-E7 [34]; primer và probe nhận biết HPV18 cho kết quả dương tính trên kênh Cy5 và phát hiện đoạn trình tự đặc hiệu ở gen HPV18 L1 [33]; primer và probe nhận biết HPV33/52 cho kết quả dương tính trên kênh FAM và phát hiện đoạn trình tự đặc hiệu ở gen HPV33/52 L1 [28]; primer và probe chứng nội kiểm (IC) cho kết quả dương tính trên kênh Cy5.5 và phát hiện đoạn trình tự đặc hiệu trên gen HMBS (Hydroxymethylbilane synthase) – là một gen quản gia nằm trên nhiễm sắc thể số 11 trong hệ genome người, mã hóa cho enzyme Hydroxymethylbilane synthase, enzyme này tham gia vào quá trình sinh tổng hơp protein Hem, thành phần có trong máu, tủy xương và gan Cả 4 trình tự mồi sử dụng trong kỹ thuật realtime PCR đều khuếch đại sản phẩm có kích thước không quá 200bp

2.2.1.2 Xác định tính đặc hiệu của primer và probe trong phản ứng Realtime PCR

Xác định tính đặc hiệu của primer và probe bao gồm hai bước sau:

(1)Thực hiện phản ứng realtime đơn cặp primer và probe: từng cặp primer và probe riêng lẻ

(2) Thực hiện phản ứng realtime đa cặp primer và probe: trộn 4 cặp primer

và probe

Phản ứng Realtime PCR thực hiện trên máy Rotogen Q (Qiagen, CHLB Đức) với các thành phần phản ứng như sau: primer xuôi, primer ngược, probe tương ứng với từng cặp primer, QuantiFast Multiplex 2X Mastermix (Qiagen, CHLB Đức)

Sau khi thực hiện phản ứng realtimeđơn cặp primer và probe với các điều kiện khác nhau: nồng độ primer và probe, thay đổi một số loại enzyme khác nhau, chúng tôi đưa ra thành phần và nồng độ tương ứng của phản ứng Realtime PCR đơn cặp primer và probe ởbảng 2.1, thành phần và nồng độ tương ứng của phản ứng Realtime PCR đa cặp primer và probe ở Bảng 2.2

Chu trình nhiệt của phản ứng như sau: 95oC trong 10 phút; 45 chu kì (95oC trong 15 giây, 60oC trong 60 giây) Huỳnh quang phát ra ở giai đoạn nhiệt 60oC trong 60 giây được ghi nhận ở một trong các kênh HEX (HPV16)/Cy5 (HPV18)/ FAM (HPV33/52) tương ứng với từng tác nhân cần nhận biết của kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer và probe đối với kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer; ghi nhận ở cả 4 kênh HEX (HPV16)/Cy5 (HPV18)/ FAM (HPV33/52)/ Cy5.5 (IC) với

kỹ thuật realtime PCR đa cặp primer và probe

Bảng 2.1 Thành phần kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer và probe

là trình tự đích Giới hạn phát hiện của kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV16, 18 và 33/52 được xác định bằng số bản copi tối thiểucủa chứng dươngtrong một phản ứng mà kỹ thuật realtime PCR vẫn phát hiện được

2.2.2.1 Khuếch đại trình tự

gen đích của phản ứngRealtimePCR

Trình tự gen đích gồm HPV16E6-E7, HPV18 L1 và HPV52 L1 Do cặp primervà probe phát hiện HPV33/52 phát hiện đoạn trình tự đặc hiệu giống nhau trên cả 2 chủng HPV33 và 52 nên sử dụng trình tự HPV52L1 để tạo chứng dương cho tác nhân HPV33/52

 Thiết kế primer khuếch đại các trình tự đích

Trình tự primer dùng để khuếch đại gen E6-E7 của chủng HPV 16 được tham khảo từbài báo[24] trên cơ sở dữ liệu Pubmed (NCBI) Trình tự gen L1 của các chủng HPV18, HPV52 ngoài việc sử dụng cho nghiên cứu chính này còn được

sử dụng cho những nghiên cứu chuyên sâu hơn, nên nhóm nghiên cứu tham khảo các trình tự gen L1 của các chủng HPV18, 52 trên cơ sở dữ liệu Nucleotide (NCBI)

và tự thiết kế cặp primer khuếch đại gen L1 của các chủng HPV18 và HPV52 Sử dụng các phần mềm tin sinh Mega5, Primer5 đánh giá lại cặp primer được lựa chọn

Thiết kế được 3 cặp primer để khuếch đại trình tự đích của phản ứng Realtime PCR HPV16 E6-E7, HPV18 L1 và HPV52 L1cho các đoạn sản phẩm có kích thước tương ứnglà 876bp, 1720bp và 1606bp

 Phản ứng PCR khuếch đại các trình tự đích

Phản ứng PCR được sử dụng để khuếch đại các trình tự gen E6-E7 của HPV16 và L1của HPV18, 52 Tiến hành tối ưu hóa các điều kiện phản ứng cho từng cặp primer: nồng độ primer, dNTP, MgCl2, nồng độ và loại enzyme (Dream Taq, green 2X Master mix, Fedili Taq), nhiệt độ gắn primer Các thành phần, nồng độ tương ứng và chu kì nhiệt của phản ứng PCR đươ ̣c trình bày ở Bảng 2.3 và Bảng 2.4.Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1.5%

94ºC – 30s 42ºC – 30s 72ºC – 2p

94ºC – 30s 50ºC – 30s 72ºC – 2p 72ºC– 10p

4ºC – ∞

2.2.2.2 Sản xuất chứng dươngvà xác định giới hạn phát hiện củakỹ thuật realtime PCR

 Nhân dòng trình tự đích tạo chứng dương

Sản phẩm PCR HPV16E6-E7, HPV18L1, HPV52L1 sau khi tinh sạch và giải trình tự sẽ được chọn lọc tiến hành chèn gen vào trong vector Pentr D.Topo (với HPV18L1 và HPV52L1) và vector pGEM T easy (với HPV16E6-E7), biến nạp vào

tế bào khả biến E Coli TOP10, sau đó nuôi cấy trên môi trường LB đặc có bổ sung

Kanamycine 50mg/l, rồi tiến hành chọn khuẩn lạc sau 18 tiếng

Kiểm tra kết quả nhân dòng gen bằng phản ứng PCR các khuẩn lạc nuôi cấy với cặp primer của vector pGEM-T hoặc cặp primer khuếch đại đoạn chèn (trình tự đích) Đồng thời cấy vạch các khuẩn lạc được chọn để PCR sang đĩa nuôi cấy khác

Nuôi khuẩn lạc mang đoạn chèn của HPV trong falcol 15ml chứa môi trường

LB lỏng có bổ sung Kanamycine 50mg/ml trong 16-18h Sau đó tinh sạch plasmidtừ dịch nuôi cấy bằng kit tinh sạch Plasmid của Promega Plasmid sau tinh sạch được điện di kiểm tra và kiểm tra lại bằng phản ứng PCR với cặp primer vector

Plasmid mang đoạn chèn HPV16E6-E7, HPV18L1 và HPV52L1 sau tinh sạch được sử dụng để tạochứng dương của phản ứng Realtime PCR

 Xác định giới hạn phát hiện của kỹ thuật realtime PCR

Plasmid mang đoạn chèn HPV16E6-E7, HPV18L1 và HPV52L1sau khi tinh sạch được tiến hành đo OD để xác định nồng độ, từ đó tính được số bản copy của plasmid theo công thức sau [44]:

A = (X*6.0221*1023) / (N*660*109) Trong đó A: số bản copy của plasmid trong 1 đơn vị thể tích

X: khối lượng của plasmid trong đơn vị thể tích cần tính

N: chiều dài của plasmid mang đoạn chèn Tiến hành pha loãng plasmid để tạo chứng dương là hỗn hợp 3 plasmid với dải nồng độ từ 1010 copy/ul đến 100 copy/ul Xác định giới hạn phát hiện của phản ứng multiplex Realtime PCR ở các nồng độ chứng dương sau 105, 103,102, 101,100copy/ul Từ đó xác định được số bản copy tối thiểu của chứng dương trong mỗi phản ứng mà kỹ thuậtmultiplex realtime PCR phát hiện được

Tối ưu hóa kỹ thuật realtime PCR phát hiện đa tác nhân trên chứng dương vừa sản xuất và dùng kỹ thuật realtime PCR đã được tối ưu hóa để đánh giá các chỉ tiêu của việc thẩm định phương pháp Realtime PCR

2.2.3 Thẩm định phương pháp phát hiện các chủng HPV16, 18 và 33/52

Thẩm định phương pháp là việc khẳng định bằng kiểm tra và cung cấp bằng chứng khách quan để chứng minh các yêu cầu cụ thể đối với mỗi mục đích sử dụng đặc thù đã được đáp ứng đầy đủ (ISO/IEC 17025: 2005).Thẩm định kỹ thuật Realtime PCR được xây dụng bên trên là xác định khả năng phát hiện của kỹ thuật realtime PCR đối với tác nhân HPV16, 18 và 33/52 thông qua việc đánh giá các chỉ tiêu sau: độ chính xác, độ chụm, độ đặc hiệu, độ nhạy[35]

Độ chính xác: Độ chính xác thể hiện mức độ thống nhất của kết quả phân

tích với giá trị thực của chúng Sự chênh lệch giữa giá trị phân tích và giá trị thực càng nhỏ thìđộ chính xác càng cao Thực hiện phản ứng Realtime trên 6 mẫu dương tính (với một trong bốn chủng HPV 16, 18, 33, 52) và 3 mẫu âm tính (với các chủng HPV 16, 18, 33 và 52) thuộc bộ mẫu chuẩn của nghiên cứu

Độ chụm: Mức độ thống nhất của các kết quả xét nghiệm riêng lẻ trong một

lần thực hiện thí nghiệm và giữa các lần thực hiện khác nhau, được xác định thông qua hệ số lặp lại và hệ số tái lập

- Hệ số lặp lại (độ chụm trong 1 lần thử nghiệm): thực hiệnphản ứng Realtime trên 2 mẫu dương tính, mỗi mẫu được lặp lại 3 lần trong 1 lần thử nghiệm

- Hệ số tái lập (độ chụm giữa các lần thử nghiệm): thực hiện phản ứng Realtime trên 3 mẫu dương tính, tiến hành 3 lần thử nghiệmriêng biệt bởi 3 kỹ thuật viên khác nhauvới mỗi mẫu

Độ đặc hiệu: Tỷ lệ kết quả thật sự âm tính trong tổng số kết quả âm tính của

thử nghiệm Xác định bằng tỷ lệkết quả âm tính khi thực hiện phương pháp mớivới20 mẫu âm tínhcủa bộ mẫu chuẩn,

Độ nhạy:Tỷ lệ kết quả thật sự dương tính trong tổng số kết quả dương tính

của thử nghiệm Xác định bằng tỷ lệ kết quả dương tínhkhi thực hiện phương pháp

mới với20 mẫu dương tính của bộ mẫu chuẩn