Nghiên cứu chọn lọc giống vi khuẩn khởi động lên men phomat có hương vị đặc trưng

Các sản phẩm giống khởi động đã được thương mại hóa thường là sự kết hợp của một hoặc vài chủng vi khuẩn lactic thuộc các chi Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Leuconostoc.. Nộ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN VĂN LÂM

NGHIÊN CỨU CHỌN LỌC GIỐNG

VI KHUẨN KHỞI ĐỘNG LÊN MEN PHOMAT CÓ HƯƠNG VỊ ĐẶC TRƯNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2015

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN VĂN LÂM

NGHIÊN CỨU CHỌN LỌC GIỐNG

VI KHUẨN KHỞI ĐỘNG LÊN MEN PHOMAT CÓ HƯƠNG VỊ ĐẶC TRƯNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

CHUYÊN NGÀNH SINH HỌC THỰC NGHIỆM

MÃ SỐ: 60.42.01.14

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn La Anh

PGS.TS Nguyễn Quang Huy

Nội – 2015

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự giúp đỡ rất tận tình của cơ quan, thầy cô hướng dẫn, các thầy cô giáo, bạn

bè, đồng nghiệp và gia đình

Tôi xin gửi tình cảm chân thành tới và lòng biết ơn sâu sắc tới:

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

sinh, Viện Công nghiệp Thực phẩm

Hà Nội đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu

Công nghiệp Thực phẩm đã cung cấp vật liệu, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu

mọi điều kiện trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu này

Hà Nội, ngày tháng năm 2015

Tác giả luận văn

Nguyễn Văn Lâm

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC BẢNG BIỂU v

DANH MỤC HÌNH ẢNH vi

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT vii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu chung về phomat 3

1.1.1 Phomat 3

1.1.2 Phân loại phomat 4

1.1.3 Tình hình sản xuất và tiêu thụ phomat trên thế giới và Việt Nam 7

1.2 Công nghệ sản xuất phomat 9

1.2.1 Quy trình sản xuất phomat 9

1.2.2 Vai trò của vi khuẩn lactic trong sản xuất phomat 12

1.2.2.1 Quá trình chuyển hóa lactose 12

1.2.2.2 Quá trình chuyển hóa axit lactic 13

1.2.2.3 Quá trình chuyển hóa citrate 15

1.2.2.4 Quá trình phân giải lipit và chuyển hóa axit béo 17

1.2.2.5 Quá trình phân giải protein 19

1.3 Giống khởi động cho sản xuất phomat 22

1.3.1 Các nhóm vi khuẩn lactic khởi động 22

1.3.1.1 Các chủng vi khuẩn lactic ưa ấm 22

1.3.1.2 Các chủng vi khuẩn lactic ưa nhiệt 23

1.3.1.3 Các chủng khởi động “thủ công” 23

1.3.2 Chức năng cần thiết của giống khởi động công nghiệp 24

1.3.2.1 Sản xuất axit 24

1.3.2.2 Tổng hợp exopolysaccharide (EPS) 25

1.3.2.3 Khả năng tạo hương 25

1.3.3 Kết hợp chủng vi khuẩn ưa ấm và ưa nhiệt trong sản xuất phomat 26

1.3.4 Tình hình nghiên cứu tạo giống khởi động sản xuất phomat ở Việt Nam 26

CHƯƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Nguồn sữa va ̀ chủng vi sinh vâ ̣t nghiên cứu 28

2.2 Hóa chất 28

2.3 Thiết bị 28

2.4 Môi trường 28

2.4.1 Môi trường MRS 28

2.4.2 Môi trường thử citrate 29

2.4.3 Môi trường thử hoạt tính protease ngoại bào 29

2.4.4 Môi trường thử khả năng đông tụ sữa 30

2.5.1 Phương pháp vi sinh 30

2.5.2 Phương pháp bảo quản giống 31

2.5.3 Xác định mật độ tế bào 31

2.5.3.1 Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đo độ đục 31

2.5.3.2 Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp trang cấy 32

2.5.4 Phương pháp kiểm tra khả năng đông tụ sữa 33

2.5.5 Phương pháp xác định kiểu len men 33

2.5.6 Phương pháp kiểm tra phổ nhiệt độ sinh trưởng 33

2.5.7 Phương pháp xác định khả năng phát triển ở phổ pH 33

2.5.8 Phương pháp kiểm tra khả năng sử dụng citrate 33

2.5.9 Phương pháp định lượng EPS 34

2.5.10 Phương pháp xác định hàm lượng đường tổng số phenol - axit sunfuric 34

2.5.11 Phương pháp xác định độ axit 34

2.5.13 Phương pha ́p kiểm tra khả năng sử dụng nguồn cacbon 36

2.5.14 Phương pha ́p kiểm tra hoạt tính enzym 36

2.5.15 Phương pháp cảm quan 36

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39

3.1 Nghiên cư ́ u đă ̣c điểm của giống khởi đô ̣ng cho sản xuất phomat 39

3.1.1 Khả năng đông tụ sữa 40

3.1.2 Đánh giá khả năng tạo EPS và lên men citrate 40

3.1.3 Khả năng tạo hương thơm của các chủng LAB trên phomat tươi 43

3.2 Tuyển chọn chủng giống, định tên và lập hồ sơ chủng giống 44

3.2.1 Định tên chủng 44

3.2.2 Khả năng sử dụng các nguồn đường 46

3.2.3 Phổ hoạt tính enzym 48

3.3 Phối hơ ̣p các chủng giống trong lên men đông tu ̣ sữa làm phomat 51

3.3.1 Ảnh hưởng của mật độ giống tới thời gian đông tụ sữa 51

3.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng đông tụ sữa 54

3.3.3 Phối hơ ̣p các chủng giống trong lên men đông tu ̣ sữa làm phomat 56

3.3.4 Động ho ̣c của hỗn hợp chủng trên môi trường sữa 60

3.3.5 Đặc tính của phomat làm từ hỗn hợp chủng 61

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63

Kết luận 63

Kiến nghị 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO 65

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Phân loại phomat theo độ ẩm và cấu trúc 4

Bảng 1.2 Sản lượng phomat thế giới giai đoạn 2000-2020 8

Bảng 1.3 Mô tả vị và ngưỡng giá trị của vị của một số axit amin của phomat Cheddar (ủ chín 6 tháng) 20

Bảng 2.1 Phiếu đánh giá tiêu chí cảm quan của mẫu phomat 37

Bảng 3.1 Thống kê kiểu hình lên men của các chủng vi khuẩn lactic 39

Bảng 3.2 Danh sách các chủng vi khuẩn lactic làm đông sữa nhanh 40

Bảng 3.3 Hàm lượng EPS được các chủng vi khuẩn lactic tổng hợp 41

Bảng 3.4 Cảm quan hương thơm củ a các mẫu phomat 43

Bảng 3.5 Khả năng sử dụng đường 47

Bảng 3.6 Phổ hoạt tính enzym 49

Bảng 3.7 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng 51

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng 51

Bảng 3.9 Phối hợp tỷ lệ giống VNC1/VNC53 56

Bảng 3.10 Kết quả cảm quan các mẫu phomat tươi sử dụng bộ chủng kết hợp với các tỷ lệ giống khác nhau 57

Bảng 3.11 Kết quả phối hợp các chủng giống trong lên men sữa 58

Bảng 3.12 Đánh giá cảm quan các mẫu kết hợp chủng 59

Bảng 3.13 Đặc tính của sữa lên men bởi hỗn hợp chủng 62

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Các loại phomat 6

Hình 1.2 Thống kê tiêu thụ và giá trị các loại sản phẩm sữa năm 2013 của Việt Nam 8

Hình 1.3 Các bước chính trong sản xuất phomat 11

Hình 1.4 Các con đường lên men hexose (glucose) chính ở vi khuẩn lactic 13

Hình 1.5 Các con đường chuyển hóa lactate trong giai đoạn ủ chín phomat 15

Hình 1.6 Con đường tiềm năng tổng hợp succinate của các chủng Lactobacillus .16

Hình 1.7 Các con đường chuyển hóa citrate của các chủng Cit+ thuộc Lactococcus và Leuconostoc sp 17

Hình 1.8 Các con đường chuyển hóa axit béo tự do 18

Hình 1.9 Khái quát các con đường chuyển hóa protein tạo hương ở các sản phẩm sữa lên men 21

Hình 3.1 Hình ảnh đánh giá khả năng lên men citrate của mô ̣t số chủng vi khuẩn lactic 43

Hình 3.2 Hình ảnh điện di Sản phẩm PCR đoạn gen 16S rADN của 3 chủng LAB 45

Hình 3.1 Ảnh hưởng của mật độ tế bào tới thời gian đông tụ sữa chủng VNC1 52

Hình 3.2 Ảnh hưởng của mật độ tế bào tới thời gian đông tụ sữa chủng VNC53 52

Hình 3.3 Ảnh hưởng của mật độ tế bào tới thời gian đông tụ sữa chủng VNY3 53

Hình 3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự đông tụ sữa bởi chủng VNC1 54

Hình 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự đông tụ sữa bởi chủng VNC53 54

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới thời gian đông tụ của VNY3 55

Hình 3.7 Hình ảnh một số mẫu phomat tươi 57

Hình 3.8 Các mẫu sữa sau khi đông tụ và gia nhiệt 59

Hình 3.9 Sự thay đổi mật độ tế bào của hỗn hợp chủng VNC1, VNC53 60

Hình 3.10 Sự thay đổi mật độ tế bào của hỗn hợp chủng VNC1, VNY3 60

BẢNG CÁC TỪ VIẾT TẮT

1 BSA Bovine serum albumin

2 CFU Colony Forming Unit (đơn vị hình thành khuẩn lạc)

10 FAA Free amino acid (axit amin tự do)

11 FAO Tổ chức Nông – Lương Liên hợp quốc

12 GC-MS Gas chromatography – Mass spectrometry

13 H2 Hydrogen

14 LAB Lactic acid bacteria (vi khuẩn lactic)

15 MRS de Man, Rogosa and Sharpe (Medium for LAB)

16 OD Optical Density (mật độ quang)

17 pNA p-nitroaniline

18 PCR Polymerase Chain Reaction

19 rDNA Ribosomal Deoxyribonucleic Acid

20 TCA cycle Tricarboxylic acid cycle

21 WHO Tổ chức Y tế Thế giới

MỞ ĐẦU

Phomat là một sản phẩm chế biến từ sữa, đã có từ rất lâu đời và được sử dụng rộng rãi khắp thế giới đặc biệt là các nước phương Tây Phomat được khám phá rất tình cờ từ một người du mục Ả Rập về khả năng đông sữa bằng dạ dày cừu

Phomat là một dạng thực phẩm giàu dinh dưỡng, có hàm lượng protein cao với đầy đủ các axit amin không thay thế, vitamin A, B2, B12 và chất khoáng: kẽm, photpho, canxi … vì vậy là thực phẩm lý tưởng khi kết hợp nhiều loại thức ăn khác giúp tăng hương vị, đem lại lợi ích về mặt sức khỏe: bảo vệ răng, chống loãng xương, ngăn ngừa ung thư và được các chuyên gia dinh dưỡng đánh giá cao

Sản lượng phomat trên toàn thế giới liên tục tăng qua các năm Năm 2013, sản lượng phomat đạt khoảng 20 triệu tấn/năm và chủ yếu được sản xuất và tiêu thụ tại các nước phát triển Ở Việt Nam, sản phẩm này mới được biết đến trong thời gian gần đây mà lý do quan trọng nhất cho sự khác biệt này là thói quen ăn uống Khi xã hội ngày càng hiện đại, việc giao lưu với thế giới trở lên dễ dàng, nhu cầu tìm hiểu những thực phẩm bổ dưỡng tăng cao thì phomat đã được chú ý và sử dụng nhiều hơn Tuy nhiên hầu hết phomat được nhập khẩu và mức tiêu thụ còn khiêm tốn Một trong những nguyên nhân là do sản phẩm chưa hợp với thị hiếu của người Việt Nam và giá thành cao Tuy nhiên, cùng với đà tăng trưởng kinh tế thì nhu cầu về các sản phẩm có giá trị dinh dưỡng, tốt cho sức khỏe như phomat đang tăng cao Như vậy có thể thấy nhu cầu về sữa và các sản phẩm từ sữa trong đó có phomat ở Việt Nam là rất lớn

Trong công nghiệp sản xuất các sản phẩm lên men từ sữa nói chung và phomat nói riêng, điều quan trọng là tạo ra sản phẩm có chất lượng cao và ổn định Giống khởi động là một trong các yếu tố quan trọng quyết định chất lượng của phomat Các sản phẩm giống khởi động đã được thương mại hóa thường là sự kết hợp của

một hoặc vài chủng vi khuẩn lactic thuộc các chi Lactobacillus, Lactococcus,

Streptococcus, Leuconostoc Các vi khuẩn này góp phần tạo nên các đặc điểm đặc

trưng về cấu trúc, hương vị và chất lượng của phomat

Hiện nay, Việt Nam đã có nghiên cứu về công nghệ sản xuất chế phẩm giống khởi động cho lên men thực phẩm như nem chua, tôm chua, sữa chua Tuy nhiên, nghiên cứu về giống khởi động ứng dụng cho sản xuất phomat vẫn chưa được tiến hành nhiều Xuất phát từ những vấn đề trên, chúng tôi thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu chọn lọc giống vi khuẩn khởi động cho lên men phomat có hương vị đặc

trưng”

Mục tiêu của đề tài: Tuyển chọn được chủng vi khuẩn lactic làm giống khởi động phục vụ cho sản xuất phomat có hương vị đặc trưng

Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát các đặc điểm của vi khuẩn lactic làm giống khởi động trong sản xuất phomat: khả năng đông tụ sữa, sinh tổng hợp exopolysaccharide, khả năng lên men citrate và sự tạo hương vị phomat phù hợp

- Tuyển chọn chủng giống, định tên và lập hồ sơ chủng giống

- Phối hợp chủng giống để lên men phomat có hương vị đặc trưng: kiểm tra đặc tính của sữa lên men và khả năng tạo hương của phomat tươi làm từ sữa lên men bởi hỗn hợp chủng giống

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về phomat

1.1.1 Phomat

Phomat (phô mai) là tên gọi chung của một nhóm các sản phẩm lên men từ sữa, được sản xuất trên toàn thế giới với đủ các hương vị, màu sắc, độ mềm cứng khác nhau Theo định nghĩa của FAO/WHO, phomat là sản phẩm rắn hoặc bán rắn, ở dạng tươi hoặc đã qua ủ chín, thu được bằng cách làm đông tụ sữa hoặc các nguyên liệu từ sữa: sữa gầy, sữa tách béo, kem, whey cream, nhờ hoạt động của enzym rennet hoặc các tác nhân đông tụ thích hợp khác và làm tách một phần nước khỏi quện sữa đông [55]

Phomat là thực phẩm lâu đời, bắt nguồn từ khu vực nằm giữa hai con sông Tigris và Euphrates, nay là Iraq, cách đây khoảng 8000 năm [28, 51] Phomat được phát hiện lần đầu tiên ở Trung Đông và dạng sơ khai nhất là một dạng sữa bị hỏng Phomat được một du mục Ả Rập khám phá đầu tiên [28, 51] Nghề làm phomat phát triển và được người châu Á đưa sang châu Âu, sau đó từ châu Âu sang châu

Mỹ Trong đế chế La Mã cổ đại, phomat đã trở thành món ăn hết sức phổ biến, được các tu sĩ trong các tu viện ở châu Âu nghiên cứu và cải thiện chất lượng Việc sản xuất và tiêu thụ phomat tăng mạnh ở thị trường mới này Ngành công nghiêp buôn bán phomat được sinh ra và tăng trưởng ở nửa sau của những năm 1800 và kéo dài đến hiện tại [20, 58] Nhờ hương vị đặc biệt và giá trị dinh dưỡng cao, dần dần phomat được sản xuất ở nhiều nơi trên thế giới từ các phòng bếp gia đình cho đến các trang trại, nhà máy quy mô công nghiệp Rất nhiều nguồn sữa được sử dụng để làm phomat như sữa bò, cừu, dê, thậm chí cả sữa ngựa nhưng chủ yếu vẫn

là sữa bò Việc phát hiện ra cách ủ chín phomat cùng với phương pháp tiệt trùng Pastuer đã mang lại hiệu quả cao trong quá trình bảo quản cũng như tạo ra hương vị hấp dẫn cho loại thực phẩm giàu dinh dưỡng này

Phomat cung cấp nhiều chất đạm, có hàm lượng canxi cao và chất dinh dưỡng dồi dào Các protein, chất béo trong phomat đều ở dạng dễ hấp thu, có đầy đủ các axit amin không thay thế, các vitamin và khoáng chất như canxi, photpho, kẽm,…

[10, 29, 58, 59] Trong phomat chứa 20% protein dưới dạng pepton, amino axit, 30% lipit, các muối khoáng và các vitamin (A, B1, B2, C…) Ngoài ra, trong phomat còn có chất kẽm rất tốt cho não, da và hệ miễn dịch Khoảng 30 gram phomat vàng có chứa 7 gram đạm và 20 miligram canxi, bằng với lượng đạm có trong 200 gram sữa [5, 29] Phomat không chỉ mang lại giá trị dinh dưỡng cao mà sản xuất phomat còn góp phần làm đa dạng các sản phẩm từ sữa, tạo đầu ra cho nguồn sữa tươi, từ đó làm tăng doanh thu cho ngành công nghiệp sữa, góp phần phát triển kinh tế xã hội

1.1.2 Phân loại phomat

Hiện nay có hơn 1000 loại phomat được sản xuất trên thế giới Phomat được phân loại theo nhiều cách khác nhau: tên nước sản xuất, loại sữa sử dụng, loài động vật nuôi lấy sữa, hàm lượng chất béo, độ ẩm, cấu trúc, tác nhân đông tụ casein, loại vi sinh vật tham gia vào quá trình ủ chín, quy trình công nghệ làm phomat, độ ẩm trong thành phần chất rắn không phải chất béo Những tiêu chí này được sử dụng độc lập hoặc kết hợp với nhau Việc miêu tả này không thể hiện sự khác nhau về cơ sở lý thuyết tại sao phomat này lại khác phomat khác

Phân loại theo độ ẩm, phomat được chia các loại như sau:

Bảng 1.1 Phân loại phomat theo độ ẩm và cấu trúc [25, 19, 47]

Phomat

mềm 55-80 <40

Mềm, trắng

Phomat tươi, không ủ chín: Cottage, Ricotta, Quarg, Mozzarella Phomat ủ chín bề mặt bằng nấm mốc:

Brie, Camenbert Phomat

Phomat ủ chín có cấu trúc mắt: Emmental Phomat ủ chín không có cấu trúc mắt:

Cheddar, Cheshire

Phân loại phomat dựa vào cấu trúc và công nghệ sản xuất:

- Phomat tươi đông tụ bởi axit, không bổ sung hoặc bổ sung rất ít rennet Axit thường được tạo ra bằng LAB Tuy nhiên có một số loại phomat tươi được axit hóa trực tiếp bởi gluconodelta - lactone Sản phẩm điển hình là Cottage, Quark, Cream

- Phomat mềm ủ chín: LAB được cấy vào để lên men lactic (có kéo dài hơn) trước khâu được đông tụ bởi rennet Sản phẩm điển hình Fetta, Camembert, Brie, Blue

- Phomat bán cứng có qua giai đoạn rửa hạt phomat sau đông tụ: Sản phẩm điển hình Gouda, Edam, Colby

- Phomat cứng nhiệt độ thấp, không qua giai đoạn rửa hạt phomat sau đông tụ Sản phẩm điển hình Cheddar, Pasta Filata

- Phomat cứng nhiệt độ cao, quá trình tách nước hỗ trợ bằng nhiệt độ cao Sản phẩm điển hình Romano, Swiss, Parmersan

Phân loại theo tác nhân đông tụ phomat: được chia thành 2 loại: đông tụ

bằng axit và enzym Đối với các sản phẩm phomat tươi làm từ sữa đông tụ bởi rennet như Morazella hoặc sử dụng axit citric thường có thời gian sản xuất ngắn nhưng không mang hương vị đặc trưng Ngược lại, các phomat tươi sử dụng vi khuẩn lactic để lên men, mặc dù thời gian lên men sữa dài nhưng lại tạo ra các đặc điểm cảm quan về hương thơm và vị cho sản phẩm Vi khuẩn lactic sử dụng thường

là sự kết hợp của các chủng vi khuẩn lactic ưa ấm: Cottage, cream, cheddar hoặc là

sự kết hợp của các chủng ưa ấm và ưa nhiệt như: Manchego, Montasio [17]

Các phomat tươi thường có thời gian bảo quản tương đối ngắn (1- 2 tuần) Để kéo dài thời gian sử dụng, phomat thường được ủ chín hoặc được nấu chảy thành dạng phomat chế biến Khác với phomat truyền thống, nguyên liệu chính là sữa,

phomat chế biến được làm từ các loại phomat khác nhau: phomat cứng hay bán cứng: Emmenthal, Gruyere, Comte, Cheddar, Gouda, Saint Pasin; phomat mềm hay bán mềm: điển hình Roquefort, Blue cheese hoặc loại phomat mềm không qua giai đoạn ủ chín: phomat Blanc Sau khi được lựa chọn, phân loại và bổ sung thêm các nguyên liệu khác, phomat được gia nhiệt tới 85 – 95oC trong vài phút để tạo ra loại phomat chế biến Một đặc điểm đặc trưng của phomat chế biến là hệ vi sinh vật trong sản phẩm đã bị tiêu diệt ở giai đoạn xử lý nhiệt trong quy trình sản xuất Do

đó, phomat chế biến dễ vận chuyển và bảo quản hơn các sản phẩm phomat truyền thống [4]

Hình 1.1 Các loại phomat

(a) Phomat Gouda và cheddar được nhận ra bằng đặc điểm riêng biệt do lớp màng và lớp sáp đỏ phủ trên bề mặt (b) Phomat Roquefort có dạng vụn, vùng có màu tối là do

Penicillium sinh trưởng (c) Phomat Thụy Sỹ, loại phomat cứng có chứa các lỗ do tạo

thành CO2 từ quá trình lên men của vi khuẩn Propionibacterium (d) Phomat Brie (trái) và

phomat Limburger (phải) là loại phomat mềm, khi chín trên bề mặt có sự sinh trưởng của

Penicillium camemberti (Brie) và Brevibacterium linens (Limburger) (e) Phomat dạng

kem (thường được phết vào bánh), là loại phomat không được ủ chín, chúng được bán ngay sau khi tạo thành sản phẩm

Ngoài ra, trên thị trường có loại phomat chế biến: tức là phomat được bổ sung thêm sữa bột, các sản phẩm từ casein, hương, màu, chất bảo quản, chất ổn định, đóng thành bánh, hoặc đóng khuôn ở dạng tấm mỏng, có bọc sẵn màng film để tiện dùng hoặc được sử dụng như đồ ăn sẵn

1.1.3 Tình hình sản xuất và tiêu thụ phomat trên thế giới và Việt Nam

Theo thống kê của FAO, sản lượng phomat trên thế giới năm 2010 đạt khoảng 20,2 triệu tấn, tập trung chủ yếu ở khu vực châu Âu, Bắc - Trung Mỹ, sản xuất hơn 75% sản lượng phomat của toàn thế giới tương ứng là 10,3 và 6,8 triệu tấn Trong giai đoạn từ 2000 - 2010, sản lượng phomat trên toàn thế giới tăng 3,6 triệu tấn, trung bình mỗi năm sản lượng phomat tăng khoảng 2% [60] và có xu hướng tăng trưởng ổn định đến năm 2020 Tình hình tiêu thụ phomat cũng khác nhau rõ rệt giữa các nước và theo khu vực, chủ yếu được tiêu thụ ở các nước phát triển, tập trung nhiều ở khu vực châu Âu và bắc Mỹ, các nước đang phát triển sản lượng tiêu thụ phomat chậm hơn Tuy nhiên, các số liệu thống kê cũng cho thấy lượng phomat tiêu thụ được cho đã tăng

ở hầu hết các nước [61]

Tại Việt Nam, Năm 2009, mức tiêu thụ sữa và các sản phẩm từ sữa bình quân đầu người là 11,2 kg/người/năm thấp hơn nhiều so với mức bình quân của Châu Á (62 kg/người/năm) và của thế giới (96 kg/người/năm) [4] Đến năm 2012 lượng sữa tiêu thụ bình quân đầu người đã tăng hơn nhưng còn thấp đạt 15 lít/ người/năm thấp hơn nhiều với các nước quanh khu vực như: Thái Lan (34 lít/ người/năm), Trung Quốc (25 lít/ người/năm), Anh (112 lít/ người/năm), và dự đoán

sẽ tăng khoảng 28 lít/ người/năm vào năm 2020 Ngành sữa là ngành có tốc độ phát triển nhanh nhất trong lĩnh vực hàng thiết yếu của Việt Nam đạt doanh thu 2,9 tỷ USD vào năm 2013 tăng 16,5% so với năm 2012 và còn tăng trong những năm tới [11] Theo thống kê của Tổng cục hải quan, kim ngạch nhập khẩu sữa và các sản phẩm từ sữa của 11 tháng đầu năm 2009 chỉ đạt 287,14 triệu USD, giảm 28,92%

so với cùng kì năm 2007 nhưng tới năm 2013, con số này đã tăng lên 839,4 triệu USD, tăng 25% so với cùng kỳ năm 2012 (673,8 triệu USD) [62]

Bảng 1.2 Sản lượng phomat thế giới giai đoạn 2000-2020 [61]

Đơn vị: (triệu tấn)

Khu vực 2000 2012 2012/2000 2020 (dự

đoán) 2020/2012 Liên minh châu Âu

(EU) - 28 quốc gia 7,709 9,333 21% 10,606 14% Các quốc gia châu Âu

khác 266 291 9% 338 16% Cộng đồng các quốc

gia độc lập 448 866 93% 1,072 24% Bắc Mỹ 4,227 5,618 22% 6,72 20% Châu Đại Dương 665 700 5% 930 33% Nam Mỹ 1,118 1,625 45% 2,067 27% Châu Á 293 456 55% 1,288 182% Trung đông, châu Phi 744 1,512 103% 2,054 36%

5203 tấn, đạt giá trị 200 tỷ đồng Phomat chủ yếu được tiêu thụ ở các thành phố lớn

và ngày càng trở nên quen thuộc với người tiêu dùng Mặc dù sữa ở Việt Nam cung chưa đáp ứng đủ cầu, nhưng gần đây, các trang trại nuôi bò sữa của nông dân đối mặt với hiện tượng sữa sản xuất ra không kịp bán cho các đại lý công ty, dẫn đến hiện tượng phải đổ sữa tươi đi Các trang trại có nhu cầu chế biến sữa thành các sản phẩm có thời hạn bảo quản dài hơn sữa tươi, nhằm chủ động được nguồn cung của mình ra thị trường Tiềm năng nhu cầu về phomat sẽ tăng trưởng ở Việt Nam, hiện nay một số công ty chế biến sữa quy mô vừa và nhỏ cũng đang chuẩn bị tham gia vào lĩnh vực sản xuất này

1.2 Công nghệ sản xuất phomat

1.2.1 Quy trình sản xuất phomat

Sản xuất phomat thực chất là quá trình loại nước khỏi sữa, trong đó casein và chất béo của sữa được cô đặc từ 6 - 12 lần tùy từng loại phomat, bắt đầu bằng một hoặc kết hợp của hai quá trình: lên men nhờ vi sinh vật và đông tụ protein sữa nhờ enzym rennet Quy trình sản xuất phomat gồm các khâu chính: đông tụ sữa, loại nước khỏi quện sữa (cắt quện sữa, nấu, khuấy, ép), tạo hình (nghiền, đổ khuôn, ép) và muối Tuy nhiên, ở mỗi khâu cách thức thực hiện khác nhau đã tạo ra các sản phẩm đặc trưng riêng Quy trình sản xuất có thể tóm tắt như sau [9, 10, 28]:

- Tiêu chuẩn hóa: Phomat có thể làm từ sữa, sữa đã tách béo hoặc tách một phần chất béo Trước khi đưa vào sản xuất sữa được tiêu chuẩn hóa nhằm đảm bảo nguồn nguyên liệu ổn định để tạo ra sản phẩm phomat có chất lượng đồng nhất

- Thanh trùng: Thanh trùng nhằm tiêu diệt hệ vi sinh vật có mặt trong sữa Tuy nhiên, thanh trùng cũng làm giảm hàm lượng canxi trong sữa do đó làm giảm khả năng đông tụ sữa bằng enzym Để khắc phục nhược điểm này, nhà sản xuất thường

bổ sung thêm muối calcium chloride Chế độ thanh trùng phổ biến 72 - 76oC, trong

15 - 20 giây Một số loại phomat như Parmigiano - Reggiano làm từ sữa tươi chưa qua thanh trùng

- Đông tụ sữa: Quá trình đông tụ cazein có thể thực hiện bằng tác nhân đông tụ

là enzym hoặc giống khởi động Một số loại phomat, quá trình này diễn ra nhờ sự kết

hợp cả hai tác nhân trên Giống khởi động cho mỗi loại phomat thường khác nhau: Giống khởi động trong sản xuất phomat Cheddar là các vi khuẩn lactic ưa ấm, có thể

là một hoặc kết hợp cả hai loài Lactococcus lactis subsp cremoris, Lc lactis subsp

lactis; ở phomat Emmental là các vi khuẩn ưa nhiệt và có thể có các vi khuẩn

propionic; các phomat sử dụng sữa chưa thanh trùng thì hệ vi sinh vật sẵn có trong sữa được xem như là giống khởi động

- Tách nước khỏi quện sữa: Giai đoạn này gồm các bước cắt quện sữa, gia nhiệt nhằm làm đẩy nhanh quá trình tách nước Ở mỗi loại phomat, thời gian và nhiệt độ gia nhiệt quện sữa là khác nhau: Ở phomat Cheddar quện sữa được gia nhiệt tới 37 -

39oC, phomat Parmigiano - Reggiano, Emmental nhiệt độ gia nhiệt lên tới 53 - 55oC

- Tạo hình và muối: Sau khi tách nước, quện sữa có thể được xay nhỏ, bổ sung thêm muối và ép, tạo khuôn hoặc được ép thành khuôn trước, sau đó bổ sung muối bằng cách ngâm trong bể muối từ 1 -2 ngày Kết thúc quá trình này, thu được phomat tươi và sử dụng được

- Ủ chín: Phomat tươi có thời hạn sử dụng ngắn (1 - 2 tuần) Để kéo dài thời gian

sử dụng cũng như tạo cảm quan về hương vị, các loại phomat thường được ủ chín Nhiệt

độ ủ chín thường 4 - 12oC, tùy từng phomat mà thời gian ủ chín có thể từ 1 - 2 tháng (Emmental), 2 - 3 tháng (Gouda) hoặc tới 2 năm (Parmigiano - Reggiano)

Hình 1.3 Các bước chính trong sản xuất phomat [20]

Axít hóa và đông tụ

Tách whey Nghiền, ép

Bổ sung: Giống khởi

động, CaCl2, enzym

renet

Khuấy trộn, ủ

Nhận sữa nguyên liệu, xử lý nhiệt,

tiêu chuẩn hóa

Cắt quyện sữa

Axít làm đông tụ sữa

tươi Sữa nguyên liệu được xử lý sơ cấp

Phân phối, tiêu thụ

Ủ chín Bao gói

1.2.2 Vai trò của vi khuẩn lactic trong sản xuất phomat

Vi khuẩn lactic (lactic acid bacterium - LAB)dùng để chỉ một nhóm lớn các vi khuẩn có lợi, có khả năng chuyển hóa đường hexose thành axit lactic, sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men phân hủ y cacbohydrat [59, 63] Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn Gram dương, không chuyển động và không sinh bào tử, catalase âm tính và cytochrome oxidase, không hóa lỏng gelatin hoặc sinh indol[12] LAB là vi khuẩn kị khí chịu khí, có khả năng lên men đường để tạo axit lactic, khả năng chịu đựng cao với môi trường axit Một số vi khuẩn lactic có hoạt tính protease giúp thủy phân protein của sữa thành peptit và axit amin Đặc biệt một số chủng lactic có khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh [36]

Các LAB quan trọng trong công nghiệp chế biến sữa là:

LAB đã được sử dụng rộng rãi trong các quá trình lên men thực phẩm trên toàn thế giới, không chỉ đóng góp vào sự phát triển các đặc tính mong muốn của sản phẩm mà còn tăng cường tính an toàn của sản phẩm, kéo dài thời gian sử dụng thông qua các quá trình chuyển hóa Trong sản xuất phomat, các vi khuẩn lactic có thể chủ động bổ sung vào sữa hoặc đã có mặt trong sữa tươi LAB tham gia vào nhiều quá trình sinh hóa, tạo lập nên các đặc tính cảm quan như: cấu trúc, hương thơm và vị cho phomat Quá trình sinh hóa cơ bản xảy ra trong sản xuất phomat có: quá trình chuyển hóa lactose, quá trình chuyển hóa axit lactic, quá trình chuyển hóa citrate, quá trình phân giải lipit và chuyển hóa axit béo, quá trình phân giải protein Ngoài ra, chúng còn tham gia vào quá trình chuyển hóa để ta ̣o nên đ ặc điểm cảm quan và các chỉ tiêu hóa lý đặc trưng cho phomat thành phẩm Các quá trình chuyển hóa của vi khuẩn lactic như sau:

1.2.2.1 Quá trình chuyển hóa lactose

Lên men lactose thành L – axit lactic là chức năng cơ bản của chủng giống khởi động trong sản xuất phomat Sự axit hóa này không chỉ tới ảnh hưởng đến cấu

trúc ban đầu của quện sữa mà còn ảnh hưởng tới chất lượng phomat do pH quyết định khả năng hòa tan của casein [41] Ngoài ra, pH còn gián tiếp tác động tới việc tổng hợp chất thơm: tạo ra hệ đệm quy định sự sinh trưởng của vi sinh vật và khả năng hoạt động của các enzym trong quá trình ủ chín

Hình 1.4 Các con đường lên men hexose (glucose) chính ở vi khuẩn lactic [38]

Trong sản xuất, việc vi khuẩn axit lactic vận chuyển lactose vào tế bào thông qua hệ thống phosphotransferase, phosphoenolpyruvate sử dụng một permease dùng triệt để nguồn lactose có trong sữa là điều rất cần thiết để tránh sự phát triển quá mức của hệ vi sinh vật không mong muốn khác cũng như tăng năng suất của quá trình lên men Vì thế người ta thường sử dụng một hoặc kết hợp nhiều hơn một chủng có khả năng sử dụng lactose, có khả năng tương tác với nhau tạo ra tính đặc trưng cho sản phẩm [18]

1.2.2.2 Quá trình chuyển hóa axit lactic

Lactate cũng là một chất tạo hương vị đặc trưng phomat Ở một số phomat

Thụy Sĩ, lactate là nguồn cơ chất chính cho vi khuẩn propionic Propionibacterium sp

sinh trưởng Chúng chuyển hóa lactate thành axit propionic (cũng là hợp chất thơm)

và CO2 – tạo ra cấu trúc lỗ của phomat [42] Ngoài ra, lactate có thể bị oxy hóa theo các con đường khác nhau, tổng hợp nên các hợp chất thơm khác như acetate, ethanol,

formate ở giai đoạn ủ chín Tuy nhiên, mức độ oxy hóa này phụ thuộc vào hệ vi sinh vật và sự có mặt của oxy trong từng loại phomat trong quá trình sản xuất Một số

chủng Lactobacili và Pediococci phân lập từ phomat Cheddar có khả năng oxy hóa

lactate thành acetate và CO2 trong điều kiện hiếu khí ở phòng thí nghiệm và hệ thống oxy hóa này được cho là cũng xảy ra dưới những điều kiện ủ chín của phomat

Cheddar Khi có mặt của oxy, một vài chủng Pediococci có thể oxy hóa lactate thành

formate và acetate Sự có sẵn oxy không chỉ phụ thuộc vào kích thước khối phomat

mà còn do tính thấm oxy của vật liệu bao gói quy định Ở các loại phomat có màng bọc, quá trình oxy hóa lactate xảy ra rất hạn chế do lượng oxy sẵn có thấp [28, 41]

Ở một số loại phomat rắn, quá trình đường phân có thể tạo ra một số sản phẩm

không mong muốn trong giai đoạn ủ chín Dưới điều kiện kị khí, Clostridium

tạo ra khí H2 gây hiện tượng vỡ phomat mà còn liên quan đến sự phát triển của các hợp chất không có hương vị [41] Để tránh hiện tượng này, một số kỹ thuật làm giảm số lượng bào tử trong sữa được sử dụng như: vệ sinh sạch sẽ, ngăn cản sự nảy mầm của bào tử bằng việc bổ sung lysozyme hay bổ sung thêm nitrate (NO3-) hoặc loại bỏ cơ học các bào từ bằng vi lọc [28]

Hình 1.5 Các con đường chuyển hóa lactate trong giai đoạn ủ chín phomat [41]

1) Sự raxemic hóa; 2) Chuyển hóa bởi Propionibacterium freudenreichii ở phomat Thụy Sĩ; 3) Quá trình oxi hóa lactate; 4) Chuyển hóa thành formate, ethanol và acetate; 5) Chuyển hóa kị khí lactate thành butyrate và H 2

1.2.2.3 Quá trình chuyển hóa citrate

Hàm lượng citrate trong sữa tươi khoảng 8 mmol/ lít sữa, nhưng 94% trong số này bị mất trong quá trình sản xuất phomat do hòa tan vào huyết tương sữa [42] Tuy nhiên, một lượng ít citrate còn lại trong curd (10mmol/kg quện sữa) lại đóng vai trò quan trọng trong quá trình thành các hợp chất thơm bay hơi Một số loài có khả năng chuyển hóa citrate (Cit+) như Lactococcus lactis subsp lactis biovar

diacetylactis (trước đây gọi là Streptococcus diacetylactis) và Leuconostoc spp

(như Leuconostoc mesenteriodes subsp cremoris và Ln lactis) [38, 39, 42] Các

loài này có gen mã hóa cho protein vận chuyển citrate ngoại bào vào tế bào chất nằm trên plasmid

Các chủng Cit+

không sử dụng citrate như là nguồn năng lượng nhưng chúng nhanh chóng chuyển hóa citrate khi có mặt của lactose và một số loại đường khác theo các con đường như hình 1.5 Sản phẩm của quá trình chuyển hóa là CO2, diacetyl, acetate, acetoin và có thể có 2, 3 – butanediol CO2 đóng vai trò chính

trong việc tạo nên cấu trúc “mắt” của một số phomat Hà Lan Diacetyl là một hợp chất thơm quan trọng của phomat, nhưng các phản ứng dẫn đến sự tổng hợp diacetyl thì chưa được nghiên cứu sâu Diacetyl có thể được tổng hợp trực tiếp từ acetaldehyde – thiamine pyrophosphate (Acetaldehyde TPP) và acetyl – CoA nhưng enzym diacetyl synthase chưa được nhận dạng một cách rõ ràng ở LAB hoặc có thể được tổng hợp từ quá trình oxy hóa α – acetolactate [39, 48] Diacetyl thường được tổng hợp với một lượng rất nhỏ (<0,11 mmol) trong khi đó lượng acetoin sinh ra cao hơn 10 – 50 lần [28]

Hình 1.6 Con đường tiềm năng tổng hợp succinate của các chủng Lactobacillus

[24]

Các enzym tham gia: 1 – lactate dehydrogenase; 2 – pyruvate casrboxylase; 3 – malate dehydrogenase; 4 – fumarase; 5 – fumarate reductase; 6 – citrate lyase; 7 – aspartate aminotransferase; 8 – aspartase; 9 – aconitase; 10 – isocitrate lyase

Một số loài Lactobacillus có khả năng sử dụng citrate để tổng hợp succinate

(Hình 1.6) Succinate là một axit hữu cơ, có vị cay mặn, là một trong 15 hợp chất cần thiết tạo nên hương vị của phomat Ở phomat Emmental, hàm lượng succinate được

công bố là 0,8 – 1,4 g/kg [24] Ở phomat Cheddar, một số loài Lactobacillus tổng hợp

succinate thông qua chu trình tricacboxilic acid dạng rút gọn (chu trình TCA) [38] Ở phomat Thụy Sĩ, succinate được các vi khuẩn propionic tổng hợp từ quá trình dị hóa axit aspartic Các chủng này không phải đóng vai trò là chủng khởi động

Hình 1.7 Các con đường chuyển hóa citrate của các chủng Cit+ thuộc Lactococcus

và Leuconostoc sp [28, 41]

1.2.2.4 Quá trình phân giải lipit và chuyển hóa axit béo

Chất béo sữa có vai trò quan trọng để tạo nên những hợp chất hương thuần túy của phomat Những nghiên cứu ở phomat Cheddar cho thấy phomat được sản xuất

từ sữa đã thay chất béo bằng nguồn lipit khác đã không tạo ra hương thơm chính xác Trên thực tế, việc phát triển hương vị hài hòa là khó khăn chính khi sản xuất loại phomat ít hoặc tách chất béo [31]

Ở phomat chất béo biến đổi theo hai xu hướng: thủy phân hoặc oxy hóa Quá trình này diễn ra không đồng nhất tùy thuộc vào loại phomat và bề mặt thủy phân kèm theo sự thay đổi liên tục của mùi vị, sự tích tụ các sản phẩm của sự chuyển hóa các chất [13] Quá trình phân giải lipit diễn ra chủ yếu trong giai đoạn ủ chín phomat Lipase tồn tại trong phomat do nhiều nguồn khác nhau Bản thân sữa tươi cũng chứa enzym lipoprotein lipase, tuy nhiên hoạt tính của enzym bị mất ở sữa đã thanh trùng Một số phomat Ý như Provolone, Pecorino trong quá trình sản xuất

người ta bổ sung hỗn hợp lipase, esterase cùng với enzym rennet Hệ enzym lipase/esterase của chủng khởi động ít được quan tâm hơn hệ enzym phân giải

protein Các loài Lactococcus có hoạt tính phân giải lipit yếu nhưng có thể đã giải

phóng một lượng lớn axit béo tự do khi mật độ tế bào ở mức cao sau giai đoạn đông

tụ sữa Các lipase/esterase của Lactococcus thường là enzym nội bào Các loài

Lactobacillus lên men lactic đồng hình bắt buộc như: Lactobacillus helveticus, Lb delbrueckii subsp bulgaricus và Lb delbrueckii subsp lactis cũng tổng hợp

esterase [42] Các loài Lactobacillus lên men lactic dị hình tùy nghi như Lb casei,

Lb paracasei và Lb plantarum chiếm ưu thế trong hệ vi sinh vật không đóng vai trò

là chủng khởi động (Nonstarter lactic acid bacteria – NSLAB) cũng có hoạt tính phân giải lipit yếu

Hình 1.8 Các con đường chuyển hóa axit béo tự do [28]

Quá trình phân giải triglyceride tạo ra các axit béo, glycerol, mono – hoặc diglyceride Chất béo trong sữa của các động vật nhai lại chứa lượng lớn các chuỗi axit béo ngắn và trung bình, khi bị thủy phân chúng đóng góp đáng kể vào việc tạo

hương của nhiều loại phomat Các axit béo tự do có thể phản ứng với ethanol hoặc các nhóm chứa gốc lưu huỳnh tạo ra các ester hoặc thioester (Hình 1.8) Có tới 14 loại ester khác nhau được tìm thấy trong phomat Emmental, và ester cũng được cho

là góp phần vào hương thơm ở phomat Parmigiano – Reggiano Các ester phổ biến nhất trong số 38 ester được tìm thấy trong phomat Parmigiano – Reggiano bao gồm: ethyl butanoate, ethyl hexanoate, ethyl acetate, ethyl octanoate, methyl hexanoate… [38, 42]

1.2.2.5 Quá trình phân giải protein

Phân giải protein là quá trình phức tạp nhất và có thể là quan trọng nhất trong số các sự kiện sinh hóa diễn ra ở giai đoạn ủ chín phomat Quá trình này ảnh hưởng đến

sự hình thành hương vị của phomat theo nhiều hướng khác nhau Một vài chuỗi peptit ngắn, axit amin tạo hương vị và có thể là cả vị không mong muốn (như vị đắng) cho phomat (Bảng 1.3) Sự phân giải casein làm thay đổi cấu trúc phomat (làm mềm) tạo điều kiện để giải phóng các hợp chất có vị trong khi nhai Ngoài ra, quá trình này còn

là nguồn cung cấp cơ chất (axit amin) cho một loạt các quá trình dị hóa diễn ra sau đó như: sự khử amin, khử cacboxyl, chuyển amin, khử lưu huỳnh [28]

Các enzym xúc tác cho quá trình phân giải có thể bắt nguồn từ nhiều nguồn khác nhau: từ tác nhân đông tụ (chymosin, pepsin hay các proteinase có nguồn gốc

từ thực vật hoặc nấm); từ sữa (plasmin, cathepsin D); các chủng khởi động và các chủng tự nhiên có trong sữa; các chủng khởi động thứ cấp gặp ở một số loại phomat

rắn: Propionibacterium freudenreichii ở phomat Thụy Sĩ, P camemberti ở phomat Camembert và Brie, P roqueforti ở phomat Blue [41] Ngoài ra, các peptidase hoặc

proteinase cũng có thể được bổ sung vào quện sữa để đẩy nhanh quá trình chín [31]

Bảng 1.3 Mô tả vị và ngưỡng giá trị của vị của một số axit amin của phomat

Cheddar (ủ chín 6 tháng) [42]

Ở hầu hết các loại phomat, quá trình thủy phân casein ban đầu diễn ra chủ yếu nhờ hoạt động của enzym đông tụ và một mức độ ít hơn của các plasmin, tạo ra các peptit chuỗi dài và trung bình Các oligopeptit này được hấp thụ vào tế bào nhờ kênh vận chuyển oligopeptit, di -/tri – pptit [38, 43] Trong tế bào chất, các peptit bị phân giải nhờ một loạt các enzym nội bào Các peptidase của LAB được chia thành các endopeptidase, aminopeptidase, di -/tri – peptidase [18, 34] Sản phẩm cuối cùng của quá trình phân giải protein là các axit amin tự do (FAA) Nồng độ FAA phụ thuộc vào từng loại phomat và được dùng như là một chỉ số của sự chín [31] Nồng độ của FAA trong phomat ở bất kì giai đoạn của quá trình chín là kết quả của

sự giải phóng các axit amin từ casein và sự chuyển hóa các axit amin thành các sản phẩm khác qua quá trình dị hóa Các axit amin chính ở phomat Cheddar là glutamate, leucine, arginine, lysine, phenylalanine và serine [52] Nồng độ của các axit amin thường là tăng lên trong quá trình chín, ngoại trừ arginine [46]

Mặc dù một số peptit, axit amin có hương vị đặc trưng như vị đắng, ngọt, malt nhưng nhìn chung chúng chỉ tạo nên hương vị cơ bản của phomat Việc tác động nhằm làm tăng quá mức hoạt tính của một vài enzym phân giải protein, cũng như việc thêm các axit amin vào phomat hầu như không ảnh hưởng tích cực đến hương

vị của sản phẩm Sự phân giải protein một cách không cân đối có thể dẫn tới sự dư thừa các peptit có vị đắng và do đó, làm giảm hương vị vốn có của phomat [54]

Hình 1.9 Khái quát các con đường chuyển hóa protein tạo hương ở các sản phẩm

sữa lên men [52]

Trong tế bào, hầu hết axit amin bị chuyển hóa thành α – keto axit nhờ enzym aminotransferase Axit α – Keto là chất trung gian, có thể bị chuyển hóa thành axit hydoroxy, aldehyde hay CoA – ester Các phản ứng này hầu hết diễn ra nhờ enzym, nhưng cũng có thể xảy ra sự chuyển đổi hóa học như sự hình thành benzaldehyde từ axit phenypyruvic [15] Các aldehyde có thể bị khử hydro hoặc hydro hóa để tạo thành các chất tương ứng là alcohol và axit hữu cơ Các hợp chất này là cơ chất cho các enzym esterase và acyltransferase hoạt động, tạo ra các (thio) – ester Một trong những vai trò sinh học của sự phân giải axit amin là tổng hợp nên các tiền chất, chẳng hạn như cần thiết cho sự tổng hợp sterol và các chuỗi axit béo có nhánh

Ngoại bào Nội bào

Axit amin

Axit amin

Con đường chuyển hóa axit amin quan trọng khác, được bắt đầu bởi enzym lyase như: cystathionine β – lyase có khả năng xúc tác chuyển hóa methionine thành methanethiol [21, 41]; threonine aldolase, thuộc lớp enzym lyase khác, có thể chuyển hóa trực tiếp threonine thành acetaldehyde [37]

1.3 Giống khởi động cho sản xuất phomat

1.3.1 Các nhóm vi khuẩn lactic khởi động

Giống khởi động cho sản xuất sản phẩm từ sữa là vi sinh vật được chủ động

bổ sung vào nguyên liệu để tạo ra sản phẩm cuối cùng với các đặc điểm mong muốn, thông qua sự phát triển và quá trình lên men của chúng [47]

Trong công nghệ lên men các sản phẩm từ sữa, nhiệm vụ chính của giống khởi động vi sinh vật là : (1)- bảo quản sản phẩm về mặt sinh học, kéo dài thời hạn sử dụng so với nguyên liệu không lên men; (2)- tạo các đặc điểm cảm quan đặc trưng như vị, hương; (3)- tạo cấu trúc đặc trưng cho sản phẩm về độ nhớt, độ cứng, độ thoáng cũng như màu sắc; (4)- tạo lập các đặc điểm về dinh dưỡng đặc trưng Giống khởi động trong sản xuất phomat có thể được chia thành các nhóm sau:

1.3.1.1 Các chủng vi khuẩn lactic ưa ấm

Trong công nghiệp sản xuất phomat, các chủng lactic ưa ấm thường được sử dụng nhiều hơn cả Người ta ước tính rằng hai phần ba quá trình lên men sữa là sử dụng các chủng ưa ấm Đây dường như là một đặc tính ưu thế của các loài

Lactococcus [19] Nhóm LAB ưa ấm có nhiệt độ sinh trưởng tối ưu ở 30°C, bao

gồm các loài thuộc hai chi Lactococcus và Leuconostoc Lactococcus lactis ssp

lactis, Lactococcus lactis ssp cremoris đóng vai trò chính là sinh axit, các

loài Lactococcus lactis ssp lactis biovar diacetylactis, Leuconostoc lactis,

Leuconostoc remoris tạo hương thơm cho phomat [16]

Các giống khởi động ưa ấm có thể được phân loại thành 4 nhóm sau, dựa trên khả tổng hợp các chất tạo hương cho sản phẩm:

- Loại O: Gồm những chủng khởi động không tạo hương: Lactococcus lactis ssp lactis và Lactococcus lactis ssp cremoris

- Loại D: Gồm các chủng có khả năng lên men citrate – đóng vai trò tạo

hương: Lactococcus lactis ssp lactis biovar diacetylactis

- Loại B (hoặc L): Chỉ gồm các chủng Leuconostoc có khả năng lên men

citrate để tạo hương

- Loại BD (hoặc LD): Gồm cả các chủng có khả năng tạo chất thơm như Lc

lactis ssp lactis biovar diacetylactis và các chủng thuộc chi Leuconostoc

Sản xuất phomat có thể là nhờ chủng ưa ấm đơn lẻ hoặc kết hợp các chủng với nhau Trong hỗn hợp giống khởi động thì các chủng sinh axit thường chiếm ưu thế 90 – 99%, còn các chủng tham gia tạo hương chỉ chiếm 1 – 10% [45]

1.3.1.2 Các chủng vi khuẩn lactic ưa nhiệt

Các chủng lactic ưa nhiệt được sử dụng trong sản xuất các loại phomat cần nhiệt độ nấu cao: Emmental, Mozzarela Các LAB ưa nhiệt thuộc hai chi là

Lactobacillus và Streptococcus Mặc dù Lactobacillus là một nhóm lớn gồm 64 loài

nhưng chỉ một vài trong số chúng có khả năng lên men sữa Các loài Lactobacillus

đã được thương mại hóa chủ yếu là: Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus,

Lactobacillus delbrueckii ssp lactis và Lactobacillus helveticus Ở chi Streptococcus, trong số 27 loài thì chỉ có duy nhất Streptococcus thermophilus được

sử dụng làm giống khởi động trong sản xuất thực phẩm và các sản phẩm từ sữa Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu của các chủng ưa nhiệt là từ 37oC – 42oC

1.3.1.3 Các chủng khởi động “thủ công”

Giống khởi động “thủ công” (hay tự nhiên), bắt nguồn từ việc sử dụng một phần sản phẩm của mẻ lên men trước để cấy sang mẻ mới Một số loại phomat Ý và Thụy Sĩ, nước sữa (whey) tách ra từ sữa đông của lô sản xuất trước được ủ trong điều kiện chọn lọc như nhiệt độ cao và độ pH thấp để thu nhận whey “khởi động” Thành phần hệ vi sinh vật của giống khởi động tự nhiên này là rất phức tạp, tương đối biến đổi và thường không xác định Mặc dù hiệu suất không ổn định, trái ngược với xu hướng hiện nay trong công nghệ tạo chủng khởi động (hiệu suất phải ổn

định), việc thay thế bằng những chủng khởi động xác định đôi khi tạo ra sản phẩm ít hương thơm hơn [45]

Trong nhóm này, bên cạnh các chủng khởi động cố hữu còn có các chủng

thuộc chi Enterococcus thường có mặt với số lượng lớn Chúng có một số ưu điểm:

sản xuất ra axit nhanh, chịu được nhiệt độ đun sôi, có khả năng thích ứng nhanh với muối Nhược điểm chính là loài này có nguồn gốc từ phân và một số chủng được

coi là tác nhân gây bệnh Theo Lopez-Diaz và cs (2000) [40], enterococci đại diện

cho các hệ vi sinh vật chiếm ưu thế ở phomat truyền thống làm từ sữa chưa qua

thanh trùng nên được sử dụng như chủng khởi động Enterococcus feacalis đã được

sử dụng để thúc đẩy quá trình chín của phomat [45] Ngoài ra, Enterococcus còn

ảnh hưởng có lợi đến sự sinh trưởng của loài LAB khác vì các hoạt động phân giải protein mạnh của chúng [40]

Pediococci không được sử dụng như là chủng khởi động trong bất kỳ sản

phẩm sữa nào mặc dù chúng có thể được tìm thấy trong các mẫu phomat đã ủ chín

Chỉ có hai loài Pediococcus pentosaceus và Pediococcus acidilactici được tìm thấy

trong các sản phẩm từ sữa Gần đây, chủng pediococci có khả năng sử dụng lactose

đã được sử dụng thay thế S thermophilus vì các chủng thuộc loài này dễ bị phage

xâm nhiễm [33]

1.3.2 Chức năng cần thiết của giống khởi động công nghiệp

Trong công nghiệp sản xuất phomat, điều quan trọng là tạo ra sản phẩm có chất lượng cao và ổn định Điều này phụ thuộc chủ yếu vào giống khởi động sử dụng Nhiều nghiên cứu về vai trò và những thuộc tính cần thiết của giống khởi động cho sản xuất phomat đã được thực hiện [19, 22, 39] Giống khởi động trong sản xuất phomat cần có những đặc điểm: có khả n ăng đông tụ nhanh , sinh axit, ảnh hưởng tích cực đến sự hình hương thơm, tổng hợp exopolysaccharide [16, 22]

1.3.2.1 Sản xuất axit

Sản xuất axit là đặc điểm phổ biến nhất của các chủng lactic khởi động Chúng chuyển hóa lactose thành axit lactic, làm giảm pH của sữa Sự axit hóa này không chỉ gây đông tụ sữa mà còn tăng cường sự tách nước ra khỏi quện sữa trong sản xuất

phomat Môi trường pH thấp cũng ức chế đáng kể sự phát triển của các vi sinh vật gây hỏng sữa Ngoài ra, sinh axit còn ảnh hưởng tích cực đến sự hình thành kết cấu, mùi và vị của phomat [49] Các LAB lên men lactose lên men đồng hình (sản phẩm chính là axit lactic) và lên men dị hình (ngoài axit lactic còn có các sản phẩm khác như ethanol, axit acetic, CO2)

1.3.2.2 Tổng hợp exopolysaccharide (EPS)

EPS là polysaccharide ngoại bào, có thể gắn chặt vào thành tế bào tạo thành lớp vỏ bao quanh tế bào vi khuẩn hoặc tồn tại dưới dạng một chất nhờn lỏng (ropy polysaccharide) giải phóng vào môi trường EPS có thể cấu tạo từ một loại monomer (homopolysaccharide) hoặc từ nhiều loại monomer khác nhau

(heteropolysaccharide) Một số LAB như Lc lactis ssp lactis, Lb delbrueckii ssp bulgaricus và S thermophilus tổng hợp nên các heteropolysaccharides [16]

Trong môi trường tự nhiên, EPS có chức năng bảo vệ tế bào vi khuẩn khỏi các tác động của sự mất nước, áp lực thẩm thấu, sự tấn công của thực khuẩn, chất kháng sinh, các chất độc hại và tăng khả năng bám dính vào bề mặt chất rắn [50] Nhờ đặc tính tăng cường độ nhớt, nhiều chủng khởi động sinh EPS đã được sử dụng trong sản xuất công nghiệp Các chủng này đóng góp vào việc tạo nên cấu trúc mịn, chắc và ổn định của quện sữa

1.3.2.3 Khả năng tạo hương

Khả năng tổng hợp cấu tử hương của chủng khởi động sẽ ảnh hưởng tới chất lượng của sản phẩm Trong phomat, các hợp chất tạo hương được chia thành hai nhóm: Các hợp chất hình thành trong giai đoạn lên men sữa và trong giai đoạn ủ chín Nhóm đầu tiên bao gồm các axit hữu cơ: axit lactic và axit axetic được tổng

hợp bởi Lc lactis ssp lactis và Lc lactis ssp cremoris và acetaldehyde, diacetyl, acetoin được Lc lactis ssp lactis biovar diacetylactis và các loài Leuconostoc

chuyển hóa từ nguồn citrate có trong sữa Nhóm thứ hai gồm các hợp chất hình thành từ quá trình phân giải protein và axit amin Khả năng chuyển hóa axit

amin thành các hợp chất thơm của LAB đã được nghiên cứu Các loài Lc lactis subsp lactis, Lc lactis supsp cremoris, Lb helveticus, Lb bulgaricus, Lb casei

đều có khả năng chuyển hóa ethionine thành methonethiol, dimethyledisulphide và

dimethyltrisulphide [57]

1.3.3 Kết hợp chủng vi khuẩn ưa ấm và ưa nhiệt trong sản xuất phomat

Trong công nghiệp sản xuất giống khởi động, nhiều chế phẩm kết hợp chủng lactic ưa ấm và ưa nhiệt để lên men sữa như: Feta Cheese Starter Culture gồm 2

chủng ưa ấm: Lactococcus lactis subsp lactis, Lc lactis subsp cremoris và 3 chủng

ưa nhiệt Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus,

gồm chủng thuộc loài S thermophiphus kết hợp với chủng thuộc phân loài

Lactococcus lactis subsp [64]

Nhiều nghiên cứu cho thấy sử dụng hỗn hợp chủng ưa ấm và ưa nhiệt đã đẩy nhanh quá trình axit hóa so với chỉ dùng chủng ưa ấm để lên men sữa và đôi khi, cải thiện đặc tính về hương vị và cấu trúc của sản phẩm [14] Theo Tison và cs., (1982) [53], Garrault (2006) [32], Oberg và Broadbent (1993) [44], Streptococcus

ưa ấm, có thể trì hoãn sinh axit ở giai đoạn bảo quản và do đó làm tăng thời gian ổn định về chất lượng sản phẩm Tuy nhiên, chủng ưa nhiệt này không tạo nên hương thơm đặc trưng của phomat tươi vì không có khả năng chuyển hóa citrate thành diacetyl – một hợp chất hương chính của phomat tươi [41] Để hạn chế nhược điểm này, có thể kết hợp các loài ưa ấm có khả năng chuyển hóa citrate với các loài ưa nhiệt [31]

1.3.4 Tình hình nghiên cứu tạo giống khởi động sản xuất phomat ở Việt Nam

Hiện nay, nhiều nghiên cứu liên quan đến phân lập, tuyển chọn vi khuẩn lactic cho lên men thực phẩm, axit lactic, probiotics đã được công bố: Nguyễn La Anh và cs., (2003) [3]; Nguyễn Thị Hồng Hà và cs (2003) [6]; Nguyễn Hoài Hương và cs (2011) [7]; Nguyễn La Anh và cs (2013) [1]

Các nghiên cứu về công nghệ sản xuất chế phẩm vi sinh đang được quan tâm: Nguyễn La Anh và cs (2010) [2] đã nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm

lactic dùng cho tôm chua

Nghiên cứu về giống khởi động cho lên men sữa chưa có nhiều công bố: Trần Thị Ngọc Mai (2010) [8] đã nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cộng

sinh giữa chủng vi khuẩn lactic Lactobacillus spp và nấm men Saccharomyces

cerevisiae nhằm tạo ra hạt Kefir ổn định về chất lượng ứng dụng cho cho sản xuất

sữa chua Hiện nay, hướng nghiên cứu tạo giống khởi động phục vụ cho sản xuất phomat chưa có tài liệu nào được công bố

CHƯƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguồn sữa và chủng vi sinh vật nghiên cứu

Nguồn sữa: Sữa được dùng để lên men là loại sữa tươi thanh trùng Mộc Châu

không đường có hàm lượng (tính trên 100ml): Chất béo 3,5g ± 0,3; Protein 3,1g ± 0,1; Canxi 115mg ± 11

Lactococcus và Streptococcus được lưu giữ tại Bộ Sưu tập giống của Viện Công

nghiệp thực phẩm

2.2 Hóa chất

Các hóa chất dùng để pha môi trường nuôi cấy vi sinh vật: pepton, sodium acetate, triamonium citrate, Tween 80, MgSO4, MnSO4, K2HPO4, NaOH … xuất xứ Trung Quốc, cao nấm men, glucose, agar xuất xứ Việt Nam, và một số hóa chất khác

Bộ kit kiểm tra khả năng sử dụng các nguồn cacbon, hoạt tính enzyme: API 50 CHL và API ZYM (Biomerieux – Pháp)

2.3 Thiết bị

Nồi hấp thanh trùng : Sturdy SA-300VF, Sturdy industrial, Nhật Bản

Máy ly tâm : SORVALL RC 6, Đức

Tủ cấy vô trùng : Bassaire, Anh

Máy đo pH : Martini intrusments, Mauritius, EU

Glucose 20 Pepton 10 Cao nấm men 15 MgSO4.7H2O 4ml MnSO4.H2O 5ml CH3COONa.3H2O 8.29

K2HPO4.3H2O 2.15 Tween 80 1 Triamonium citrate 2.62

pH : 6,5-6,8 Môi trường MRS – agar có bổ sung thêm agar 20g và 3g CaCO3 /lít

Môi trường MRS – lactose, MRS – maltose, MRS – manlto dextrin thay thế nguồn đường glucose bằng đường lactose, maltose, maltose dextrin

Môi trường được hấp vô trùng 121oC trong 15 phút

2.4.2 Môi trường thử citrate

Thành phần môi trường M:

Thành phần Hàm lượng (g/L) Sữa gầy 10g Peptone 2,5g Glucose 5g Agar 20g pH: 6,6

- Dung dịch A: Potasium ferry cyanide 10%

- Dung dịch B: 1g ferric citrate + 1g sodium citrate trong 40ml nước

Hấp tiệt trùng môi trường M, dung dịch A, B ở 115oC/ 15 phút Sau khi hấp vô trùng, thêm 10 ml mỗi dung dịch A, B vào 1 lít môi trường M

2.4.3 Môi trường thử hoạt tính protease ngoại bào

Thành phần môi trường casein – agar:

Thành phần Hàm lượng (g/l) Casein 8

Agar 20 Cân 8g casein pha trong 500ml nước, gia nhiệt có khuấy nhẹ đến 80o

C, lọc bỏ cặn bằng giấy lọc Định mức đến 1000ml, thêm 20g agar, đun sôi và tiệt trùng ở 121oC/15 phút Khi nhiệt độ xuống đến 70-80oC, đổ ra đĩa petri, phơi khô và cất vào nơi quy định

2.4.4 Môi trường thử khả năng đông tụ sữa

Thành phần môi trường litmus - lactose

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Phương pháp vi sinh

Hoạt hóa giống: Giống có thể được hoạt hóa từ ống bảo quản đông khô, bảo quản lạnh sâu hay ống bảo quản trong thạch đứng sang ống nghiệm nút bông môi trường MRS ở nhiệt độ 30oC/24 giờ

Nhân giống: nhằm mục đích tăng số lượng mật độ tế bào vi sinh vật để bổ sung vào môi trường lên men Tại hoạt hóa lần 1, giống bảo quản ở lạnh sâu, đông khô được bổ sung vào 5 ml môi trường MRS - glucose lỏng nuôi ở 30ºC, 18 – 20 giờ Sau 20 giờ, lấy mẫu soi kính kiểm tra hình thái tế bào bằng kính hiển vi nhằm xác định có đúng chủng loại cần sử dụng, giống có bị tạp nhiễm hay không rồi mới tiếp tục nhân giống Hoạt hóa lần 2, giống hoạt hóa lần 1 được bổ sung một lượng bằng 10% thể tích môi trường MRS – glucose lỏng nuôi ở 30ºC, 18 – 20 giờ Giống hoạt hóa lần 2, có thể được bổ sung và nuôi cấy ở 30ºC, 18 – 20 giờ trong các bình tam giác môi trường MRS – glucose lỏng để đạt được lượng tế bào lớn đủ phục vụ cho quá trình lên men

Lên men: Sau khi có giống được hoạt hóa trong bình tam giác, giống được xử lý

và bổ sung vào môi trường sữa Điều kiện lên men: nhiệt độ 30ºC, đến thời gian đông

tụ

2.5.2 Phương pháp bảo quản giống

Bảo quản bằng phương pháp cấy truyền: Bảo quản giống bằng phương pháp cấy

truyền định kỳ sang các ống môi trường MRS thạch đứng (hoặc được nêu cụ thể trong từng trường hợp), nuôi trong 18 giờ ở 30oC, sau đó giữ trong tủ lạnh 3-5o

C Cấy truyền được thực hiện mỗi tháng mội lần (hoặc được nêu cụ thể trong từng điều kiện)

Bảo quản bằng phương pháp lạnh sâu: Bảo quản giống trong môi trường Glycerol

40%, giữ ta ̣i nhiê ̣t đô ̣ –80C

Bảo quản bằng phương pháp đông khô: Bảo quản trong môi trường Liquid – drying

(g/l): sodium glutamate- 30, ribitol- 15; L-cystein hydrochloride monohydrate- 0,5 trong đệm potasium phosphate 1M

2.5.3 Xác định mật độ tế bào

2.5.3.1 Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đo độ đục

Mật độ vi sinh vật có thể xác định một cách gián tiếp thông qua đo độ đục Khi một pha lỏng có chứa nhiều phân tử không tan thì sẽ hình thành một hệ huyền phù và có độ đục bởi các phần tử hiện diện trong môi trường lỏng cản ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới Tế bào vi sinh vật là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trường cũng làm cho môi trường trở nên đục Độ đục của huyền phù tỷ lệ với mật độ tế bào Trong một giới hạn nhất định của độ đục và mật độ tế bào, có thể xác lập được quan hệ tỷ lệ tuyến tính giữa mật độ tế bào và độ đục Do vậy có thể định lượng mật độ tế bào một cách gián tiếp thông qua đo độ đục bằng máy so màu

ở bước sóng λ= 600nm Trong trường hợp này trước tiên cần thiết lập được đường quan hệ tuyến tính giữa độ đục và mật độ tế bào bằng cách sử dụng một số huyền phù tế bào có độ đục xác định và mật độ tế bào của mỗi huyền phù được xác định bằng một phương pháp trực tiếp khác

Quy trình xác định mật độ tế bào bằng độ đục gồm các bước như sau :