ĐA DẠNG DI TRUYỀN 5 QUẦN THỂ gà nội

phân tử được sử dụng trong công tác đánh giá các đặc điểm và mối quan hệ di truyền của các giống gà, trong đó các microsatellite là một trong những loại chỉ thị được sử dụng rộng rãi trê

Trang 1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Lê Quang Nam

ĐA DẠNG DI TRUYỀN 5 QUẦN THỂ GÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - Năm 2012

Trang 2

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Lê Quang Nam

ĐA DẠNG DI TRUYỀN 5 QUẦN THỂ GÀ NỘI

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS Nguyễn Văn Mùi

Hà Nội - Năm 2012

Trang 3

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 6

Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 8

1.1 Nguồn gốc và phân loại gà nhà 8

1.2 Các kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng trong nghiên cứu 8

1.2.1 PCR 8

1.2.2 Kỹ thuật microsatellite 8

1.2.3 Một số nghiên cứu sử dụng kỹ thuật microsatellite 9

1.3 Các đặc điểm di truyền quần thể 10

1.3.1 Các đại lượng di truyền đặc trưng cho các quần thể gà 10

1.3.2 Mối quan hệ di truyền giữa các quần thể gà 12

Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Đối tượng nghiên cứu và địa điểm thu mẫu 15

2.1.1 Gà Trới 15

2.1.2 Gà Móng 15

2.1.3 Gà Tè (gà lùn) 15

2.1.4 Gà Tiên Yên 16

2.1.5 Gà Tò 16

2.2 Các kỹ thuật thực nghiệm được sử dụng trong nghiên cứu 17

2.2.1 Lấy mẫu máu, tách và đánh giá chất lượng ADN 17

2.2.2 PCR đa mồi và xác định kích thước alen 19

2.3 Phân tích thống kê 21

2.3.1 Các đại lượng di truyền đặc trưng cho các quần thể gà 21

2.3.2 Kiểm định ý nghĩa của các giá trị thống kê 22

2.3.3 Cây quan hệ di truyền 25

Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

3.1 Kết quả tách ADN và phân tích đoạn 26

3.2 Kết quả đánh giá các đặc điểm di truyền 27

3.2.1 Thống kê từng locus và quần thể gà 27

3.2.2 Sự sai khác, khoảng cách và cây quan hệ di truyền 42

KẾT LUẬN 45

ĐỀ NGHỊ: 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

Tiếng Việt 47

Tiếng Anh 47

Tiếng Pháp 51

PHỤ LỤC 52

Trang 4

DANH SÁCH HÌNH ẢNH VÀ BIỂU ĐỒ

Hình 1 Gà mái Trới 18

Hình 2 Gà trống Trới 18

Hình 3 Đàn gà Móng 18

Hình 4 Đàn gà Tè 18

Hình 5 Gà mái Tiên Yên 18

Hình 6 Gà trống Tiên Yên 18

Hình 7 Gà mái Tò 18

Hình 8 Gà trống Tò 18

Hình 9 Ảnh điện di ADN trên gel agarose 26

Hình 10 Ảnh phân tích đoạn sản phẩm mix multiplex PCR 5 mồi 26

Hình 11 Tần số alen thuộc locus MCW0295 30

Hình 12 Tần số alen thuộc locus ADL0112 30

Hình 19 Tần số alen thuộc locus LEI0094 31

Hình 34 Cây quan hệ di truyền của 5 quần thể gà nghiên cứu 44

Trang 5

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1 Các cặp mồi microsatellite được sử dụng trong nghiên cứu 20

Bảng 2 Giả thiết H 0 và đối thiết H 1 trong kiểm định cân bằng Hardy - Weinberg 23

Bảng 3 Giả thiết H 0 và đối thiết H 1 trong kiểm định sai khác di truyền 23

Bảng 4 Giả thiết H 0 và đối thiết H 1 trong kiểm định khoảng cách di truyền 24

Bảng 5 Dải alen quan sát ở 5 quần thể gà 27

Bảng 6 Số alen, độ phong phú alen trên mỗi locus ở mỗi quần thể gà 28

Bảng 7 Giá trị He obs , He exp và F is ở từng locus và từng quần thể gà 38

Bảng 8 Sai khác di truyền và khoảng cách di truyền giữa các quần thể gà 42

Bảng 9 Kết quả đo OD dung dịch ADN sau khi tách 52

Trang 6

CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT VÀ VIỆT HÓA

ADN: deoxyribonucleic acid

Allele: alen

Allelic richness: độ phong phú (giàu có) alen

Bottleneck effect: hiệu ứng thắt cổ chai

Gene diversity: độ đa dạng gen, tần số dị hợp tử mong đợi

Gene flow: dòng chảy gen

Gene pool: vốn gen

Genetic distance, D S: khoảng cách di truyền

Genetic drift: sự lạc dòng (hoặc phiêu bạt, trôi dạt) di truyền

Genetic variation: biến dị di truyền

NST: nhiễm sắc thể

PCR: polymerase chain reaction

Multiplex PCR: PCR đa mồi

Phylogenetic tree: cây quan hệ di truyền, hoặc cây phả hệ, hoặc cây tiến hóa, hoặc cây phát sinh loài

Pivate allele: alen riêng

Topology tree: cấu trúc nhánh cây

UPGMA: unweighted pair - group method with arithmetic mean

Trang 7

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên em xin chân thành cảm ơn thầy hướng dẫn, PGS TS Nguyễn Văn Mùi

đã dành nhiều thời gian và công sức tận tình quan tâm hướng dẫn em trong suốt quá trình học tập và viết luận văn này Tôi xin chân thành cảm ơn các đồng nghiệp thuộc Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Động vật - Viện Chăn nuôi đã có những nhận xét, góp ý về mặt chuyên môn trong quá trình hoàn thành luận văn Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô, gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã quan tâm, động viên, bố trí công việc và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khóa học thạc sỹ này

Trang 8

MỞ ĐẦU

Tài nguyên di truyền động vật là vốn sinh học căn bản để phát triển chăn nuôi

và quan trọng đối với an ninh lương thực và sự phát triển nông thôn bền vững Tuy nhiên, các nguồn lực này thường bị bỏ quên và được quản lý kém Những năm gần đây

đã chứng kiến sự giảm sút đáng kể về đa dạng di truyền - một xu hướng mà có thể bị đẩy nhanh bởi những thay đổi nhanh chóng của môi trường ảnh hưởng đến ngành chăn nuôi hiện nay

Sự phát triển chăn nuôi ở thế kỷ 20 tập trung vào một số lượng rất nhỏ các giống trên toàn thế giới, thường xuyên không xem xét cách ảnh hưởng của môi trường sản xuất đến khả năng tồn tại, sản xuất và sinh sản của động vật Nhiều giống bản địa,

mà một số trong đó đang bị đe dọa tuyệt chủng, có các tính trạng như khả năng phục hồi trước áp lực khí hậu và khả năng kháng bệnh và ký sinh trùng, khiến chúng thích nghi tốt với điều kiện địa phương, và có tầm quan trọng tiềm năng rất lớn đối với sản xuất chăn nuôi trong tương lai1

Việc bảo tồn nguồn di truyền tự nhiên không chỉ phục vụ cho lý do đạo đức và

mỹ thuật mà nó còn liên quan tới cuộc sống của con người trên toàn cầu thông qua việc

sử dụng các sản phẩm từ nông nghiệp, trồng trọt và chăn nuôi Ngoài việc tạo ra nguồn thực phẩm, thì nguồn tài nguyên động vật còn được ví như “kho lưu trữ” các tính trạng quý trong quá trình sản xuất nguồn thực phẩm Các loài gia cầm bản địa là một trong những nguồn gen quý đã có sự thay đổi để phù hợp với các điều kiện môi trường Những giống gà bản địa có thể có những gen hoặc alen phù hợp với các điều kiện môi trường sinh ra nó [33] Việc bảo tồn các giống bản địa đóng vai trò quan trong đối với công tác chọn và tạo giống hiện tại cũng như trong tương lai

Việc đánh giá các vốn gen sẽ đóng góp một phần vào công tác bảo tồn các giống

gà địa phương, đặc biệt việc sử dụng các phương pháp sinh học phân tử làm công việc đánh giá sự đa dạng di truyền là rất quan trọng [32] Hiện nay có nhiều loại chỉ thị

1 http://www.fao.org/biodiversity/geneticresources/bio-domesticanimals/en/

Trang 9

phân tử được sử dụng trong công tác đánh giá các đặc điểm và mối quan hệ di truyền của các giống gà, trong đó các microsatellite là một trong những loại chỉ thị được sử dụng rộng rãi trên thế giới

Ở nước ta hiện nay tuy có nhiều nghiên cứu tập trung mô tả đặc điểm ngoại hình, sinh trưởng phát dục và khả năng sinh sản của các giống gà nội nhưng lại có ít nghiên cứu sử dụng các chỉ thị phân tử để xác định các đặc điểm di truyền từng giống, mối quan hệ di truyền giữa các giống, và nguồn gốc, phân loại các giống gà nội Việc này làm giảm hiệu quả đầu tư vào công tác bảo tồn, khai thác và sử dụng hiệu quả nguồn gen của các giống gà nội ở nước ta

Từ năm 1990 Bộ Khoa học - Công nghệ và Môi trường (nay là Bộ Khoa học và Công nghệ) thay mặt Nhà nước Việt nam đã xây dựng một chương trình Bảo tồn nguồn gen động - thực và vi sinh vật Việt nam “Đề án Bảo tồn nguồn gen vật nuôi Việt nam” là một hợp phần của chương trình này và được giao cho Viện Chăn Nuôi thực hiện Luận văn này là kết quả của một đề tài nhánh thuộc hợp phần trên, được thực hiện trên 5 giống gà nội Việt nam là gà Trới, gà Móng, gà Tè, gà Tiên Yên và gà

Tò tại các cơ sở nuôi dưỡng chúng và tại Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế

bào Động vật thuộc Viện Chăn nuôi Quốc gia Đề tài chúng tôi thực hiện có tên là Đa

dạng di truyền 5 quần thể gà nội, có mục đích góp phần làm sáng tỏ tính đa dạng di

truyền, cấu trúc sinh sản và mối quan hệ di truyền giữa các quần thể gà nội kể trên, qua

đó cung cấp các thông tin khoa học tin cậy cần thiết cho quá trình bảo tồn nguồn gen

gà nội Việt nam

Trang 10

Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Nguồn gốc và phân loại gà nhà

Các giống gà đã được con người thuần hóa từ gà rừng hơn 2000 năm trước [11]

Gà rừng thân hình nhỏ, trứng bé, đẻ rộng theo mùa, có thể bay xa Nhìn chung gà Châu

Á thuộc chủng Gallus gallus, nhưng cũng có thể từ gà có dái tai đỏ Gallus gallus murghi vùng ven Ấn Độ, từ Gallus gallus của Mianma, từ Gallus gallus bankiva rải rác

khắp vùng Đông Nam Á; cũng có thể là sự phối hợp của cả 3 loại đó Chính nguồn gốc

đa dạng ấy tạo nên cho gà bản địa một tiềm năng di truyền phong phú biểu hiện qua kiểu hình: hình dạng, màu sắc lông, dạng mào, dái tai, dạng đuôi, kết cấu giữa cổ-ngực [2] Trong lịch sử sinh học, có một điều khá thú vị là chính những giống gà Á Đông, Đông Nam Á như gà Brahman, gà Cochinchine, gà chọi… đã tham gia vào việc hình thành các giống gà công nghiệp hiện nay [2]

1.2 Các kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng trong nghiên cứu

1.2.1 PCR

PCR là một phương pháp mang tính cách mạng được phát triển bởi Kary Mullis trong những năm 80 PCR dựa trên việc sử dụng khả năng tổng hợp sợi ADN mới bổ

sung với sợi khuôn sẵn có Do ADN polymerase chỉ có thể thêm một nucleotide vào

nhóm 3’-OH có trước, nên nó cần mồi để gắn nucleotide đầu tiên Yêu cầu này khiến cho nhà nghiên cứu có thể khuếch đại một vùng trình tự cụ thể mong muốn Kết thúc phản ứng PCR, trình tự cụ thể sẽ được tích lũy trong hàng tỉ bản sao2 Phản ứng PCR chỉ đòi hỏi một lượng ADN làm khuôn ban đầu rất nhỏ Trong trường hợp ADN

genome động vật có vú, 1.0 µg ADN là tối ưu cho mỗi phản ứng, có chứa xấp xỉ 3x105

bản sao của một gen trên NST Đối với nấm men, vi khuẩn và plasmid, lượng ADN tối

ưu được sử dụng cho mỗi phản ứng tương ứng là 10 ng, 1 ng và 1 pg [35]

1.2.2 Kỹ thuật microsatellite

2 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/probe/doc/TechPCR.shtml

Trang 11

Microsatellite là loại ADN lặp đi lặp lại được tạo thành từ các đoạn lặp dài từ 2 đến 8 nucleotide3 Chúng có thể có độ đa hình cao và thường là các chỉ thị phân tử trong nghiên cứu di truyền quần thể Các microsatellite có thể tìm thấy mọi nơi trong

hệ gen, cả vùng mã hoá và không mã hoá [41] Các microsatellite được sử dụng để lập bản đồ và nghiên cứu đa dạng di truyền trên gà ngay từ thời điểm nó được ứng dụng là

do trình tự của chúng có độ đa hình cao, phân bố rải rác toàn bộ hệ gen [37], và rất nhiều locus microsatellite nghiên cứu trên gà đã được công bố và lập bản đồ [12], [21] Thông tin về các microsatellite gà có thể dễ dàng nhận được qua các trang web nhưhttp://www.thearkdb.org/arkdb/, http://aviandiv.tzv.fal.de/primer_table.html

1.2.3 Một số nghiên cứu sử dụng kỹ thuật microsatellite

Microsatellite được Tổ chức Nông Lương Liên Hợp Quốc - FAO dùng làm

công cụ phân tử đầu tiên cho dự án MoDAD (Measurement of Domestic Animal Diversity) nhằm đánh giá sự đa dạng di truyền của động vật bản địa Hiện nay các microsatellite là công cụ tốt nhất cho việc nghiên cứu các locus liên quan đến tính trạng số lượng và cho việc đánh giá sự đa dạng di truyền của các quần thể vật nuôi

Kết quả nghiên cứu các giống gà nội địa Trung Quốc cho thấy khi phân tích

bằng microsatellite thì tần số dị hợp tử quan sát được là cao nhất (75.91%), tiếp theo là

phương pháp RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA) (26.32%), cuối cùng là phương pháp phân tích allozyme (22.09%) [44] Dùng microsatellite khi nghiên cứu trên quần thể gà có thể thu được hơn 12 alen trên một locus và tần số dị hợp tử có thể lên đến 90% [40] Khi sử dụng 14 locus microsatellite để phân tích mối quan hệ di truyền giữa các quần thể gà bản địa khác nhau (chủ yếu từ Đức và Ucraina

với tổng số 224 cá thể của 20 quần thể) và với gà rừng, việc lập cây quan hệ di truyền

đã được tiến hành và thu được 3 nhóm chính [32] 42 chỉ thị microsatellite đã được sử dụng để phân tích 23 dòng gà cao sản của các giống gà Leghorn, gà rừng, gà Fayoumi

và gà Tây Ban Nha, qua đó tính được được khoảng cách di truyền giữa gà rừng với các

3 http://www.nature.com/nrg/journal/v5/n1/glossary/nrg1247_glossary.html

Trang 12

dòng gà khác [45] 22 chỉ thị microsatellite đã được sử dụng để xác định tần số dị hợp

tử và khoảng cách di truyền của các giống gà: Châu Phi, Châu Á và Nam Mỹ Kết quả

cho thấy các giống gà có sự đặc trưng theo từng khu vực

29 locus microsatellite đã được dùng để đánh giá sự đa dạng di truyền của gà H’mông ở Sơn La, với 36 cá thể thu từ 3 làng [13] Nghiên cứu đã chỉ ra có sự khác biệt di truyền giữa 3 nhóm gà theo khoảng cách địa lý, các quần thể gà đều ở trạng thái cân bằng Hardy - Weinberg và không bị ảnh hưởng bởi giao phối cận huyết Việc nghiên cứu quần thể gà Hà Giang đã kết luận rằng, trong sự vắng mặt của bất cứ cấu

trúc quần thể gà nào trong phạm vi tỉnh, thì gà H’mong lại chia sẻ vốn gen chung với

các giống gà khác [8] Số lượng lớn alen chung giữa gà Hà Giang và gà rừng, cũng như các kết quả phân tích cụm Bayes đã đề xuất rằng dòng chảy gen đã diễn ra từ gà rừng tới gà Hà Giang [8] Việc sử dụng 29 microsatellite khi nghiên cứu 9 giống gà nội và 2

giống gà Trung Quốc đã xác định rằng các giống gà Việt nam tạo nên vốn gen khác với các giống gà Trung Quốc, các giống gà miền Bắc tạo nên một vốn gen không có cấu

trúc [14] Sự khác biệt của các giống gà Việt nam quan sát được giữa miền Bắc và Duyên hải miền Trung cũng như đồng bằng Cửu Long chỉ ra rằng sự phân nhóm các giống gà Việt nam có quan hệ tới sự phân cách về địa lý của chúng [14]

1.3 Các đặc điểm di truyền quần thể

1.3.1 Các đại lượng di truyền đặc trưng cho các quần thể gà

Độ phong phú alen ở mỗi locus và mẫu, kí hiệu là R s, và tổng thể các mẫu kí

hiệu là R t là một thước đo số lượng các alen độc lập cỡ mẫu, do vậy cho phép so sánh giữa các mẫu có cỡ khác nhau Do số alen quan sát phụ thuộc cao vào cỡ mẫu nên Petit

và cộng sự [30] đã đề ra nguyên tắc ước tính số lượng dự kiến của các alen trong một

phân mẫu 2n gen, dựa trên 2N gen đã được lấy mẫu (N ≥ n), trong đó N là số nhỏ nhất

các cá thể được lập kiểu gen đối với một locus trong một mẫu

Các quần thể trong thực tế thường có sự sai khác giữa tần số dị hợp tử quan sát

và tần số dị hợp tử mong đợi Tần số dị hợp tử quan sát là tỉ lệ số cá thể dị hợp thu

Trang 13

được trong nghiên cứu và tần số dị hợp tử mong đợi, hay còn được gọi là độ đa dạng

gen, của một locus được tính dựa trên tần số quan sát của các alen thuộc locus đó, với giả định quần thể nghiên cứu ở trạng thái cân bằng Hardy - Weinberg

H ệ số cận huyết (ký hiệu là F is) xét tại một locus ở một cá thể là xác xuất để 2 alen thuộc locus đó, cùng sinh ra từ một alen tổ tiên, giống hệt nhau4 Giá trị F is ∈ [-1;

1] F is = 0 phản ánh quần thể giao phối ngẫu nhiên F is > 0, quần thể thiếu hụt dị hợp tử

do giao phối cận huyết hoặc đồng giao, hoặc do sự chọn lọc các cá thể đồng hợp nếu

có sự mất cân bằng liên kết giữa locus được chọn (một alen thích hợp) và một chỉ thị

F is < 0, quần thể dư thừa dị hợp tử, là kết quả của phép lai F 1 hoặc dị giao Sự chọn lọc

cá thể dị hợp nếu có sự mất cân bằng liên kết giữa locus được chọn và chỉ thị cũng tạo

ra F is < 0 Về ý nghĩa định tính5, giá trị F is = 0.125 là kết quả ghép cặp giữa anh chị em hoặc cùng cha hoặc cùng mẹ, giữa chú (bác) ruột - cháu gái, cô (dì) ruột - cháu trai

Giá trị F is = 0.25 là kết quả của sự ghép cặp giữa anh chị em ruột, giữa cha - con, mẹ -

con Giá trị F is tổng thể các locus ở mỗi giống gà sẽ được sử dụng để xác định trạng thái cân bằng Hardy - Weinberg ở mỗi giống

Định luật cân bằng Hardy - Weinberg được phát biểu như sau6: biến dị di truy ền trong một quần thể sẽ duy trì không đổi từ thế hệ này đến thế hệ khác nếu không

có các yếu tố gây rối Khi việc giao phối là ngẫu nhiên trong một quần thể lớn mà không có các trường hợp gây rối, thì định luật dự đoán rằng cả tần số alen và kiểu gen

sẽ duy trì không đổi bởi chúng ở trong trạng thái cân bằng

Các yếu tố gây rối bao gồm đột biến, chọn lọc tự nhiên, giao phối không ngẫu nhiên, lạc dòng di truyền và dòng chảy gen Đột biến phá vỡ trạng thái cân bằng tần số alen bằng cách thêm alen mới vào một quần thể Tương tự, chọn lọc tự nhiên và giao

phối không ngẫu nhiên dẫn đến các thay đổi trong tần số gen, do một vài alen trợ giúp

4 identical by descend: http://www.evolution-textbook.org/content/free/glossary/glossary.html

5 How to compute an inbreeding coefficient (the path method)

http://www.braquedubourbonnais.info/en/inbreeding-calculation.htm

6 http://www.nature.com/scitable/definition/hardy-weinberg-equilibrium-122

Trang 14

hoặc gây hại tới sự thành công sinh sản của các cá thể mang chúng Sự lạc dòng di truy ền làm tần số của một alen nào đó trở nên lớn hơn hoặc nhỏ hơn và thường xảy ra

ở các quần thể nhỏ Dòng chảy gen giữa 2 quần thể xảy ra sẽ chuyển các alen mới vào quần thể Do các tác động gây rối này thường xảy ra trong tự nhiên, nên trạng thái cân bằng Hardy - Weinberg hiếm khi xuất hiện ở các quần thể trong thực tế Do vậy ta có thể suy đoán được nguyên nhân gây ra hiện tượng mất cân bằng này

1.3.2 Mối quan hệ di truyền giữa các quần thể gà

Độ sai khác di truyền giữa các quần thể gà được xác định qua giá trị F st Giá trị

F st ∈[0; 1] Theo Wright [43], với giá trị F st = 0 thì hai quần thể không khác biệt di

truyền Với giá trị F st = 1 thì hai quần thể không có alen chung, chúng khác hẳn nhau

Với giá trị F st∈ [0; 0.05] thì độ khác biệt di truyền nhỏ; giá trị F st ∈ [0.05; 0.15] thì độ

khác biệt di truyền trung bình; giá trị F st ∈ [0.15; 0.25] thì độ khác biệt di truyền quan

trọng; giá trị F st∈ [0.25; 1] thì độ khác biệt di truyền cực kỳ quan trọng

Kho ảng cách di truyền (ký hiệu là D S) được định nghĩa7 là mức độ biệt hóa di truyền giữa 2 quần thể, được đo bằng cách so sánh tần số alen, hoặc kích thước alen đối với các marker microsatellite giữa các quần thể Giá trị DS = 0 nếu kết quả phân

tích không có sự khác biệt Giá trị D S tối đa bằng 1 trong trường hợp không có alen

chung ở mỗi locus Giá trị lý thuyết của D S có thể chỉ ra cấu trúc quần thể hoặc dưới

quần thể nếu ở đó có sự giao phối ngẫu nhiên và có độ lạc dòng di truyền thấp

Nhiều nhà nghiên cứu đã sử dụng các locus microsatellite trong việc nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa của các quần thể hoặc các loài quan hệ gần gũi, và vài đã đề xuất

các cách tính khoảng cách di truyền mới cho mục đích này Tuy nhiên, hiệu quả của những cách đo khoảng cách này trong việc thu được cấu trúc nhánh cây chính xác trong việc lập cây quan hệ di truyền vẫn còn không rõ ràng Giá trị D S theo Cavalli-

Sforza và Edwards [9] và Nei [26] thường thể hiện xác xuất đạt được cấu trúc nhánh cây chính xác cao hơn các cách tính khoảng cách khác [39] Trong việc ước lượng thời

7 http://www.nature.com/nrg/journal/v5/n1/glossary/nrg1247_glossary.html

Trang 15

gian tiến hóa, giá trị D S theo Nei [26] và Golstein [19] thích hợp hơn cách tính D S khác [39]

Giá trị D S theo Reynolds [31] được thiết kế riêng cho các allozyme Giá trị D S

theo Nei [26], [27] dựa trên giả định rằng mọi sự khác biệt giữa các quần thể đều do sự

l ạc dòng di truyền và do đột biến Giá trị D S được tính theo Cavalli-Sforza và Edwards

[9] cùng với giá trị D S được tính theo Golstein [19] dựa trên giả định duy nhất về sự lạc dòng di truy ền Ngoài ra, cách tính giá trị D S theo Nei (1978) [27] ưu việt hơn cách tính

giá trị D S theo Nei (1972)[26] ở sự bao hàm việc hiệu chỉnh độ chệch cỡ mẫu

Lượng cá thể và số locus lấy mẫu có ảnh hưởng đến kết quả tính khoảng cách di truy ền, nên tối thiểu 25 cá thể mỗi quần thể phải được sử dụng và từ 25 đến 30 locus

microsatellite với 4 đến 10 alen mỗi locus phải được lập kiểu gen [7] Cùng với những điều đã trình bày ở trên, và do 5 quần thể gà nghiên cứu có sự chênh lệch lớn về cỡ mẫu, gà Trới, gà Móng, gà Tè, gà Tiên Yên và gà Tò trong nghiên cứu có 60, 54, 42,

59 và 35 cá thể theo thứ tự, nên cách tính giá trị D S theo công bố của Nei năm 1978 [27] là phù hợp nhất cho nghiên cứu này

Cây quan h ệ di truyền là sự biểu diễn bằng độ thị mối quan hệ tiến hóa giữa các

sinh vật hoặc các gen8 Takezaki và Nei [39] đã so sánh và xác định được phương pháp

UPGMA [38] và phương pháp neighbor joining [34] thường cho kết quả tốt nhất khi

lập cây UPGMA là phương pháp đơn giản nhất, nhưng nhược điểm lớn của nó là giả định tốc độ tiến hoá của tất cả các quần thể giống nhau [28] Ví dụ như, tốc độ đột biến

là không đổi theo thời gian và đối với mọi dòng giống ở cây quan hệ di truyền Điều

này có nghĩa rằng mọi lá (nút đầu cuối của cây) đều cùng khoảng cách từ rễ Trong

thực tế, các nhánh cá thể rất khó có khả năng cùng tốc độ đột biến, nên UPGMA thường tạo ra cấu trúc nhánh cây sai Phương pháp này tạo ra cây có rễ, nhưng việc tái

lập rễ lại không thực hiện được Việc lập cây dựa vào phương pháp này sẽ không chính

xác khi quần thể gặp hiệu ứng thắt cổ chai (một hiện tượng tiến hóa trong đó tỉ lệ đáng

8 http://www.nature.com/scitable/definition/phylogenetic-tree-25

Trang 16

kể của quần thể hoặc loài bị giết hoặc bị ngăn chặn sinh sản), hoặc gặp hiện tượng lạc dòng di truy ền mạnh

Phương pháp neighbor joining [34] được sử dụng rộng rãi để xây dựng cây quan h ệ di truyền từ dữ liệu khoảng cách di truyền Không như phương pháp UPGMA,

phương pháp này không yêu cầu giả định tốc độ tiến hóa không đổi nên không tạo ra

cây có rễ Mục tiêu của phương pháp neighbor joining là tối thiểu hóa chiều dài nhánh

của cây Khi cho trước khoảng cách chính xác, phương pháp này đảm bảo sẽ tạo ra cây đúng so với thực tế Atteson [6] đã chứng minh rằng nếu khoảng cách di truyền có sai

số rất nhỏ, thì vẫn nhận được cây quan hệ di truyền đúng, nghĩa là phương pháp neighbor joining có tính nghiêm ngặt, vững chắc Đây là một đặc điểm quan trọng mà một vài phương pháp khác không có, ví dụ như phương pháp UPGMA [38] Phương

pháp neighbor joining còn có ưu điểm là cho giá trị bootstrap cao hơn [16]

Bootstrap là sự kiểm định đơn giản nhất về độ chính xác của cây quan hệ di truy ền [17] Lập bootstrap về cơ bản là kiểm tra xem liệu tập dữ liệu có hỗ trợ hay xác

nhận cây ta vừa lập hay không Việc này được thực hiện bằng cách lấy ngẫu nhiên các mẫu con trong tập dữ liệu, dựng cây từ chúng và tính toán tần số mà các phần khác nhau của cây được tạo ra trong những mẫu con ngẫu nhiên này Nếu nhóm X được tìm

thấy ở mọi cây lập từ các mẫu con, thì sự xác nhận bootstrap của nó là 100%, và nếu nhóm đó được tìm thấy chỉ 2/3 các cây mẫu con, thì sự xác nhận bootstrap của nó là

67% Mỗi mẫu con đều cùng cỡ với dữ liệu gốc, được tạo ra bằng việc lấy mẫu ngẫu

nhiên có hoàn lại Đây là một kiểm định đơn giản, nhưng các phân tích bootstrap của các cây quan hệ di truyền đã biết (các quần thể virus tiến hóa trong phòng thí nghiệm) chỉ ra rằng, nói chung bootstrap là một thước đo tin cậy về tính chính xác của cây quan

h ệ di truyền, và giá trị 70% hoặc cao hơn cho biết xác suất cây đúng với thực tế là trên

95% [22]

Như vậy, dùng phương pháp neighbor joining dựng cây quan hệ di truyền dựa trên giá trị D S theo Nei (1978) [27] là phù hợp trong nghiên cứu này

Trang 17

Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu và địa điểm thu mẫu

Đối tượng nghiên cứu gồm 60 cá thể gà Trới và 59 cá thể gà Tiên Yên lấy tại Trung tâm Chuyển giao Tiến bộ Kỹ thuật Nông Lâm nghiệp Hải Ninh, thị xã Móng Cái - Quảng Ninh; 54 cá thể gà Móng (xuất xứ từ tỉnh Hà Nam) và 42 cá thể gà Tè (xuất xứ từ tỉnh Phú Thọ) đang được nuôi tại Trung tâm Nghiên cứu Gia cầm Thụy Phương thuộc Viện Chăn Nuôi Quốc Gia, Từ Liêm, Hà nội; và 35 cá thể gà Tò lấy tại huyện Quỳnh Phụ tỉnh Thái Bình Các cá thể gà được chọn theo nguyên tắc hạn chế tối

đa mối quan hệ huyết thống giữa chúng

2.1.1 Gà Trới

Theo Nguyễn Văn Tòng và Nguyễn Đình Duẩn [3], gà Trới (hình 1, 2) có các màu vàng, vàng đen, xám tro, thân hình bình thường mình dài cổ chân cao, có con chỏm lông đầu, có con chỏm lông dưới cằm Một số con không có lông đầu, cằm nhưng vẫn thể hiện thân hình ngực nở thăn chắc đặc trưng của giống Tỷ lệ nuôi sống qua các giai đoạn cao 90-95% Khối luợng cơ thể ổn định Tuổi thành thục là 23 tuần tuổi Năng suất trứng/mái/năm là 90 - 120 quả Tỷ lệ thịt cao, thịt thơm ngon giàu a xít amin

2.1.2 Gà Móng

Theo Hồ Xuân Tùng và cộng sự [4], gà Móng (hình 3) trống có màu lông nâu

đỏ, đỏ tía; con mái có lông màu đất thó, màu bạc Cả gà trống và gà mái đều có mào

nụ, chân vàng, mỏ vàng, thân hình chắc chắn Giai đoạn từ 9 đến 20 tuần tuổi tỷ lệ nuôi sống của gà Móng con trống đạt 94%, con mái đạt 98% Tuổi thành thục sinh dục trung bình của gà Móng là 161 ngày, sản lượng trứng/mái/năm đạt 83.6 quả Khối lượng trứng bình quân của gà Móng lúc 38 tuần tuổi là 48 gam Tỷ lệ trứng có phôi khá cao, đạt 87.2%; tỷ lệ nở/trứng có phôi khá thấp, đạt 82.1%

2.1.3 Gà Tè (gà lùn)

Trang 18

Theo Vũ Ngọc Sơn và cộng sự [5], gà Tè (hình 4) có chân thấp, chiều cao chân

từ 4-5cm, da chân có màu vàng, bàn chân 4 ngón, chân không có lông Gà mái trưởng thành có màu lông vàng nâu đất hoặc vàng rơm, gà trống lông nâu đỏ và điểm xuyết lông đen ở cánh và đuôi, kiểu mào đơn có 5 răng cưa, không có mào nụ Giai đoạn gà hậu bị từ 30 - 140 ngày tỷ lệ nuôi sống đạt 95.6% và trong giai đoạn sinh sản tỷ lệ nuôi sống bình quân/tháng là 98.5% Gà Tè phát dục sớm, gà trống bắt đầu gáy lúc 58 ngày tuổi Tuổi đẻ trứng đầu lúc 132 ngày, sản lượng trứng thống kê được trong 72 tuần (52 tuần sinh sản) đạt 68 - 71 quả, gà có tính ấp bóng rất cao tương tự như gà Ri, gà đẻ bình quân mỗi lứa từ 15-17 trứng lại đòi ấp Khối lượng trứng cân tại tuần 38 đạt 48.5gam, trứng có vỏ màu trắng hồng và chất lượng trứng thơm ngon như trứng gà Ri

2.1.4 Gà Tiên Yên

Theo Nguyễn Văn Tòng và Nguyễn Đình Dũng [3], gà Tiên Yên (hình 5, 6) có các màu vàng, vàng đen, hoa mơ mình dài xương nhỏ cổ ngắn chân thấp, chân có 4

ngón có vẩy sừng Tỷ lệ nuôi sống qua các giai đoạn cao 90 - 95% Khối lượng cơ thể

ổn định Tuổi thành thục là 21 - 22 tuần tuổi Năng suất trứng / mái / năm là 110 - 125 quả Tỷ lệ ấp nở cao, tỷ lệ thịt cao, thịt thơm ngon giàu acid amin Chúng thích nghi tốt với điều kiện khí hậu của địa phương, tỷ lệ nuôi sống ở các giai đoạn đẻ đều cao trên 96%

đỏ tía, dọc chân có 2 vạch đỏ tía như gà mái nhưng đậm hơn và có 2 hàng vảy xếp song song

Trang 19

Gà Tò thành thục sinh sản khá sớm 148 ngày tuổi, tuổi đẻ đạt 30% vào tuần tuổi

30 Gà Tò đẻ mỗi lần 14 - 17 quả/đợt Sản lượng trứng 120 - 140 quả/năm, tỷ lệ phôi trung bình đạt 91.08%, tỷ lệ ấp nở của gà Tò (nở/trứng ấp) thấp đạt 67.55% Gà Tò có đôi chân to chắc, cao, khi ấp dễ đè vỡ trứng và dẫm chết con khi mới nở Trong quá trình nuôi dưỡng, chọn lọc và nhân thuần từ 2006 đến 2009, gà Tò càng được nhân thuần thì sức sống càng cao, với tỷ lệ nuôi sống trong giai đoạn từ 0 - 17 tuần tuổi ở các năm 2006, 2007, 2008, 2009 lần lượt là 90.76%, 92.77%, 93.06% và 93.96% [1]

2.2 Các kỹ thuật thực nghiệm được sử dụng trong nghiên cứu

2.2.1 Lấy mẫu máu, tách và đánh giá chất lượng ADN

Lấy mỗi cá thể khoảng 1 ml máu từ tĩnh mạch cánh bằng loại kim và ống lấy mẫu chuyên dụng, chuyển ngay mẫu máu sau khi lấy vào tube eppendorf 1.5 ml có nắp kín chứa 50 µl dung dịch EDTA 0.5M, lắc nhẹ cho đều sau đó chuyển mẫu vào hộp

lạnh để bảo quản

ADN được tách bằng bộ kit Quiagen (Đức) tách ADN từ máu theo qui trình sau:

lấy 50 µl máu gà và 150 µl đệm TE cho vào ống eppendorf 1.5 ml Thêm 20 µl protein

K và 200 µl đệm AL Lắc đều 15” và ủ 56 oC trong 10’ Bổ sung 200 µl cồn tuyệt đối

Lắc đều, rồi ly tâm nhẹ để lắng các giọt dịch trên thành ống xuống Chuyển dung dịch

thu được vào cột lọc đặt trong ống 2 ml Ly tâm 1’ tại tốc độ 8000 vòng/phút sau đó chuyển cột lọc sang ống 2 ml mới Thêm 500 µl đệm AW1, ly tâm 1’ tại tốc độ 8000 vòng/phút Chuyển cột lọc sang ống mới Thêm 500 µl đệm AW2, ly tâm 3’ tại tốc độ

12000 vòng/phút Chuyển cột lọc sang ống 1.5 ml mới Thêm 200 µl đệm TE, ủ ở nhiệt

độ phòng trong 3’, sau đó ly tâm 1’ tại tốc độ 8000 vòng/phút Bỏ cột lọc giữ lại ống có dung dịch chứa ADN Bảo quản ADN lâu dài tại -200C

Trang 20

Hình 1 Gà mái Trới Hình 2 Gà trống Trới

Hình 5 Gà mái Tiên Yên

Hình 6 Gà trống Tiên Yên

Trang 21

ADN tổng số sau khi tách sẽ được điện di trên gel agarose 1% để đánh giá Để xác định độ tinh sạch và nồng độ của ADN, ta tính chỉ số OD của ADN ở bước sóng

260 nm và 280 nm, sau đó tính tỷ số giữa hai chỉ số OD đó Nồng độ của dung dịch axit nucleic được xác định bằng cách đo độ hấp thụ tại bước sóng 260 nm trong máy quang phổ kế Một đơn vị (1.0) giá trị hấp thụ bước sóng 260 nm (A260) tương đương với nồng độ ADN là 50mg/ml Nếu giá trị hấp thụ bước sóng 280 nm (A280) cũng

được xác định, thì tỷ số A260/A280 là chỉ số cho thấy độ lẫn các chất như phenol hoặc protein Tỷ lệ A260/A280 là 1.8 - 2.0 phản ánh ADN đủ độ tinh khiết [36]

2.2.2 PCR đa mồi và xác định kích thước alen

Nghiên cứu này sử dụng 22 locus được lấy từ dự án AVIANDIV9 Locus LEI0194 được sử dụng theo Mcconnell và cộng sự [23] Thông tin chi tiết về 23 locus microsatellite trong nghiên cứu được thể hiện ở bảng 1

Bộ kít Multiplex Master Mix PCR của hãng Quiagen được sử dụng để thực hiện các phản ứng PCR đa mồi khuếch đại cùng lúc nhiều locus microsatellite Các mồi xuôi được gắn màu huỳnh quang là đen, lam và lục Sản phẩm PCR được đưa vào máy CEQ8000 để phân tích xác định kích thước của chúng 5 mix PCR đa mồi được chuẩn hóa để khuyếch đại các locus Mix I gồm 5 locus MCW0295, ADL0112, MCW0216, MCW0014, MCW0098 gắn mồi tại 57 oC Mix II gồm 5 locus MCW0111, MCW0078, MCW0222, LEI0094, MCW0183 gắn mồi tại 57 oC Mix III gồm 4 locus ADL0278, LEI0194, MCW0069, MCW0034 gắn mồi tại 58 oC Mix IV gồm 4 locus MCW0103, ADL0268, MCW0037, MCW0067 gắn mồi tại 58 oC Mix V gồm 5 locus MCW0206, MCW0081, MCW0248, LEI0166, MCW0330 gắn mồi tại 57 oC

Các alen được xác định kích thước bằng máy CEQ8000 của hãng Beckman

Coulter Thành phần trong mỗi giếng được đưa vào máy CEQ8000 gồm: 25 µl đệm SLS, 0.17 µl size standard 400, 06 - 0.8 µl sản phẩm PCR Phần mềm CEQ Genetic

System sẽ cho ra danh sách các alen của từng locus ở mỗi cá thể

9 http://aviandiv.tzv.fal.de/

Trang 22

Bảng 1 Các cặp mồi microsatellite được sử dụng trong nghiên cứu

Locus NST Trình tự mồi (5' -> 3') xuôi (ở trên), mồi ngược (ở dưới) Tmồi o gắn GeneBank Mã Khoảng alen

ATCACTACAGAACACCCTCTC MCW

GGCTTAAGCTGACCCATTAT ADL

GGGTTTTACAGGATGGGACG MCW

TATTGGCTCTAGGAACTGTC MCW

GGCTGCTTTGTGCTCTTCTCG MCW

CCACACGGAGAGGAGAAGGTCT MCW

GCTCCATGTGAAGTGGTTTA MCW

GCAGTTACATTGAAATGATTCC MCW

GATCTCACCAGTATGAGCTGC LEI

ATCCCAGTGTCGAGTATCCGA MCW

CCAGCAGTCTACCTTCCTAT ADL

TCCTTGGCATGTACATATGA LEI

I, II, III: kí hiệu mix PCR đa mồi

Khoảng alen: lấy theo dự án AVIANDIV(http://aviandiv.tzv.fal.de/)

Trang 23

Bảng 1 (tiếp): Các cặp mồi microsatellite được sử dụng trong nghiên cứu

Locus NST Trình tự mồi (5' -> 3') xuôi (ở trên), mồi ngược (ở dưới) Tmồi o gắn GeneBank Mã Khoảng alen

GCACTCGAGAAAACTTCCTGCG MCW

TGCACGCACTTACATACTTAGAGA MCW

AACTGCGTTGAGAGTGAATGC MCW

CTCCACCCCTCTCAGAACTA ADL

ACCGGTGCCATCAATTACCTATTA MCW

GCACTACTGTGTGCTGCAGTTT MCW

ACATCTAGAATTGACTGTTCAC MCW

GTTGTTCAAAAGAAGATGCATG MCW

0248V

W2

GTTGCTGAGAGCCTGGTGCAG MCW

CTCCTGCCCTTAGCTACGCA LEI

TGGACCTCATCAGTCTGACAG MCW

III, IV, V: kí hiệu mix PCR đa mồi

Khoảng alen: lấy theo dự án AVIANDIV (http://aviandiv.tzv.fal.de/)

2.3 Phân tích thống kê

Dữ liệu microsatellite được xử lý bởi các phần mềm FSTAT v2.9.3 [20], Genetix v4.03 [46], Microsatellite Analyser (MSA) v4.05 [15], 2 chương trình neighbor và consensus thuộc gói phần mềm Phylip v3.69 [18]; và phần mềm Treeview v1.6.6 [29]

2.3.1 Các đại lượng di truyền đặc trưng cho các quần thể gà

Trang 24

Độ phong phú alen được tính theo công thức:

1

2 2 1 2 2

u s

i n

i

n R

N n

các alen loại i trong số 2N gen Để tính R t thì n được giữ nguyên, N sẽ là số lượng cá

thể tất cả các mẫu được lập kiểu gen ở locus xem xét

Công thức tính độ đa dạng gen được đánh giá thông qua ước lượng không chệch

k , p ik là tần số của allele A i ở mẫu k và H ok là tỉ lệ dị hợp tử quan sát ở mẫu k

H ệ số cận huyết (F is) được tính theo công thức: 1

Độ sai khác di truyền giữa các cặp quần thể gà được tính dựa trên giá trị F st theo

Weir và Cockerham [42] Khoảng cách di truyền D S được tính theo công bố của Nei

năm 1978 [27] Do hai công thức tính F st và D S rất phức tạp, chỉ phù hợp với các chương trình máy tính nên không được trình bày trong nghiên cứu này

2.3.2 Kiểm định ý nghĩa của các giá trị thống kê

Theo hệ quả của định luật Hardy - Weinberg thì với F is = 0, quần thể ở trạng thái cân bằng Hardy - weinberg Nhưng giá trị quan sát này ở các quần thể tự nhiên hầu hết đều khác 0, và ta cần phải xác định ý nghĩa thống kê của sự khác 0 đó bằng việc đặt

ra và kiểm định giả thiết H 0 và đối thiết H 1 tương ứng (bảng 2)

Các giả thiết H 0 được lần lượt kiểm định tại 3 mức ý nghĩa α = 0.05, 0.01,

0.001, tương ứng với 2300, 11500 và 115000 quần thể ảo được phần mềm FSTAT giả lập phù hợp với giả thiết H 0 Để thực hiện các giả lập, phần mềm FSTAT lấy ngẫu

Trang 25

nhiên các alen giữa các cá thể ở các quần thể gà tùy theo tần số alen quan sát Một

phân phối gồm 2300, 11500, và 115000 giá trị F is giả lập tương ứng sẽ được so sánh

với giá trị F is quan sát Việc so sánh này sẽ cho ra giá trị P, là tỉ lệ giữa số lượng giá trị

F is giả lập ≥ giá trị F is quan sát, cung cấp một ước lượng không chệch cho xác suất đúng của giả thiết H0 Nếu giá trị P < α, ta bác bỏ giả thiết H 0 chấp nhận đối thiết H 1:

giá trị Fis quan sát ≠ 0 có ý nghĩa thống kê tại mức ý nghĩa α, và quần thể không cân bằng Hardy - Weinberg Nếu giá trị P ≥ α, ta chấp nhận giả thiết H 0 : giá tr ị F is quan sát khác 0 do sai s ố ngẫu nhiên, và quần thể ở trạng thái cân bằng Hardy-Weinberg ở

mức ý nghĩa α

Bảng 2 Giả thiết H 0 và đối thiết H 1 trong kiểm định cân bằng Hardy - Weinberg

F isgà Móng ≠ 0 do sai số ngẫu nhiên F isgà Móng ≠ 0 có ý nghĩa thống kê

F isgà Tiên Yên ≠ 0 do sai số ngẫu nhiên F isgà Tiên Yên ≠ 0 có ý nghĩa thống kê

Nếu F st = 0 thì các quần thể không sai khác di truyền Các giá trị F st trong thực

tế hầu hết đều > 0, và ta cần phải xác định ý nghĩa thống kê của sự lớn hơn đó bằng

việc đặt ra và kiểm định giả thiết H 0 và đối thiết H 1 tương ứng (bảng 3)

Bảng 3 Giả thiết H 0 và đối thiết H 1 trong kiểm định sai khác di truyền

F st(Trới-Móng) > 0 do sai số ngẫu nhiên F st(Trới-Móng) > 0 có ý nghĩa thống kê

F st(Trới-Tè) > 0 do sai số ngẫu nhiên F st(Trới-Tè) > 0 có ý nghĩa thống kê

F st(Trới-Tiên Yên) > 0 do sai số ngẫu nhiên F st(Trới-Tiên Yên) > 0 có ý nghĩa thống kê

F st(Trới-Tò) > 0 do sai số ngẫu nhiên F st(Trới-Tò) > 0 có ý nghĩa thống kê

F st(Móng-Tè) > 0 do sai số ngẫu nhiên F st(Móng-Tè) > 0 có ý nghĩa thống kê

F st(Móng-Tiên Yên) > 0 do sai số ngẫu nhiên F st(Móng-Tiên Yên) > 0 có ý nghĩa thống kê

F st(Móng-Tò) > 0 do sai số ngẫu nhiên F st(Móng-Tò) > 0 có ý nghĩa thống kê

F st(Tè-Tiên Yên) > 0 do sai số ngẫu nhiên F st(Tè-Tiên Yên) > 0 có ý nghĩa thống kê

F st(Tè-Tò) > 0 do sai số ngẫu nhiên F st(Tè-Tò) > 0 có ý nghĩa thống kê

F st(Tiên Yên-Tò) > 0 do sai số ngẫu nhiên F st(Tiên Yên-Tò) > 0 có ý nghĩa thống kê

Trang 26

Phần mềm genetix tạo một quần thể ảo bằng cách hoán vị các kiểu gen dựa theo

tần số các kiểu gen quan sát được giữa các cặp quần thể gà với nhau Sau đó nó sẽ tính

giá trị F st ảo, và thực hiện 10000 lần như vậy để tạo ra một phân phối 10000 giá trị F st

ảo Tỉ lệ các Fst ảo ≥ F st quan sát sẽ cung cấp một ước lượng không chệch cho xác suất đúng của giả thiết H0 tại mức ý nghĩa α

Nếu D S giữa 2 quần thể bằng 0 thì giữa chúng không có sự biệt hóa Hầu hết giá

trị D S giữa các quần thể trong tự nhiên thu được đều > 0, và ta cần phải xác định ý

nghĩa thống kê của sự lớn hơn đó bằng việc đặt ra và kiểm định giả thiết H 0 và đối thiết

H 1 tương ứng (bảng 4)

Bảng 4 Giả thiết H 0 và đối thiết H 1 trong kiểm định khoảng cách di truyền

D S (Trới -Móng) > 0 do sai số ngẫu nhiên D S(Trới-Móng) > 0 có ý nghĩa thống kê

D S(Trới -Tè) > 0 do sai số ngẫu nhiên D S(Trới-Tè) > 0 có ý nghĩa thống kê

D S(Trới-Tiên Yên) > 0 do sai số ngẫu nhiên D S(Trới-Tiên Yên) > 0 có ý nghĩa thống kê

D S(Trới-Tò) > 0 do sai số ngẫu nhiên D S(Trới-Tò) > 0 có ý nghĩa thống kê

D S(Móng-Tè) > 0 do sai số ngẫu nhiên D S(Móng-Tè) > 0 có ý nghĩa thống kê

D S(Móng-Tiên Yên) > 0 do sai số ngẫu nhiên D S(Móng-Tiên Yên) > 0 có ý nghĩa thống kê

D S(Móng-Tò) > 0 do sai số ngẫu nhiên D S(Móng-Tò) > 0 có ý nghĩa thống kê

D S(Tè-Tiên Yên) > 0 do sai số ngẫu nhiên D S(Tè-Tiên Yên) > 0 có ý nghĩa thống kê

D S(Tiên Yên-Tò) > 0 do sai số ngẫu nhiên D S(Tiên Yên-Tò) > 0 có ý nghĩa thống kê

Phần mềm genetix sẽ tiến hành 10000 hoán vị ngẫu nhiên các cá thể giữa 2 quần thể để tạo ra một miền nhiều giá trị D S giả lập phù hợp với giả thiết H 0 Tỉ lệ các giá trị

D S giả lập ≥ giá trị D S quan sát cung cấp một ước lượng cho xác xuất đúng của giả thiết

H 0 Nếu tỉ lệ so sánh này thấp hơn mức ý nghĩa α, ta bác bỏ giả thiết H 0, chấp nhận đối

thiết H 1 Và ngược lại, nếu tỉ lệ so sánh này cao hơn hoặc bằng mức ý nghĩa α, ta chấp

nhận giả thiết H 0 , bác bỏ đối thiết H 1

Trang 27

2.3.3 Cây quan hệ di truyền

Việc vẽ cây quan hệ di truyền được thực hiện theo quy trình sau: phần mềm MSA tiến hành 1000 lần bootstrap tạo ra 1000 ma trận giá trị D S tính theo Nei [27];

chương trình neighbor thuộc gói phần mềm phylip dựng cây dựa vào ma trận trên theo phương pháp neighbor joining [34], dữ liệu thu được từ chương trình neighbor được

xử lý bằng chương trình consensus cũng thuộc gói phần mềm phylip; cuối cùng là phần mềm treeview được dùng để chỉnh sửa và xuất ảnh cây vừa lập được

Trang 28

Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả tách ADN và phân tích đoạn

Tổng số 250 mẫu máu gà đã được tách ADN và điện di kiểm tra trên gel agarose 1% Ảnh điện di (hình 9) thể hiện ADN được tập trung thành một vạch sáng rõ chứng

tỏ ADN không bị đứt gẫy trong quá trình tách Giá trị OD (260/280) thu được phần lớn đều từ 1.8 đến 2.0 nên dung dịch ADN thu được đạt yêu cầu [36]

Hình 9 Ảnh điện di ADN trên gel agarose Sản phẩm PCR đa mồi được đưa vào máy CEQ8000 để xác định kích thước từng alen ở mỗi locus (hình 10), sau đó kết quả phân tích được tập hợp lại để tiến hành các phân tích thống kê

Hình 10 Ảnh phân tích đoạn sản phẩm mix multiplex PCR 5 mồi

Hình 10 biểu thị kết quả phân tích đoạn sản phẩm PCR mix I của một cá thể gà

Tè gồm: locus MCW0295 có 2 alen (87 và 95 bp), locus ADL0112 có 2 alen (124 và

Định dạng
Số trang	57
Dung lượng	1,33 MB