Trong chu trình sống của HIV-1, protease là enzyme không thể thiếu.Enzyme này cắt các chuỗi polyprotein gag, gag-pol tại những vị trí nhất định đểtạo thành các protein cấu trúc và chức n
Trang 1MỞ ĐẦU
Virus suy giảm miễn dịch ở người (Human immunodeficiency virus - HIV)
là nguyên nhân chính gây ra hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AcquiredImmunodeficiency Syndrome - AIDS) và là một trong những virus gây bệnh nguyhiểm nhất hiện nay Theo các tài liệu đã công bố, có ít nhất hai type HIV gây nênAIDS đó là HIV type 1 (HIV-1) và HIV type 2 (HIV-2), nhưng HIV-1 là nguyênnhân chính gây ra AIDS trên toàn thế giới
Theo số liệu của Tổ chức Y tế Thế giới, tính đến cuối năm 2009 có khoảng 33,3triệu người đang sống chung với HIV/AIDS, khoảng 1,8 triệu người đã chết vì AIDS
và có thêm 2,6 triệu trường hợp mới bị nhiễm virus này Ở Việt Nam, theo báo cáo Cụcphòng chống HIV/AIDS - Bộ Y tế tính đến 31/3/2011, toàn quốc đã phát hiện ngườinhiễm HIV tại hơn 75,2% xã/phường, gần 97,9% quận/huyện và 63/63 tỉnh/thành phố.Tổng số trường hợp nhiễm HIV là 235.535 người, số bệnh nhân AIDS là 94.613 người,
số trường hợp tử vong đến cuối kỳ báo cáo là 49.912 người
Trong chu trình sống của HIV-1, protease là enzyme không thể thiếu.Enzyme này cắt các chuỗi polyprotein (gag, gag-pol) tại những vị trí nhất định đểtạo thành các protein cấu trúc và chức năng cần thiết cho virus hoàn chỉnh Vì thếprotease được xem là một trong các đích tác động quan trọng nhất cho liệu pháp tìm
ra thuốc điều trị HIV/AIDS Tuy nhiên, do HIV sao chép nhanh, enzyme phiên mãngược có tỷ lệ sai sót cao tạo ra sự biến đổi liên tục trong cấu trúc hệ gen của cácnhóm HIV dẫn đến tình trạng kháng thuốc Mặc dù ngày càng nhiều chất ức chếprotease chống HIV được sản xuất và thương mại hóa nhưng việc tìm các chất ứcchế mới của protease vẫn luôn được quan tâm
Bên cạnh đó, các đột biến kháng PI tương đối đặc hiệu cho từng loại thuốcriêng biệt, do đó thay thế một loại thuốc khác trước khi có sự tích lũy đột biến thìcác phác đồ sau vẫn thành công (Hoffmann và tập thể, 2007) Vì vậy, xét nghiệmkháng thuốc thường theo hướng phát hiện đột biến trong gen mã hóa protease HIV
có vai trò rất quan trọng trong việc xây dựng phác đồ điều trị HIV/AIDS
Trang 2Ở Việt Nam, gen mã hóa protease HIV mang đột biến kháng thuốc là vấn đềcòn ít được nghiên cứu Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào xác định nhóm virusgây bệnh chủ yếu ở người Việt Nam và tìm ra một số đột biến liên quan khángthuốc Đặc biệt, chưa có nghiên cứu nào về biểu hiện gen mã hóa protease HIVmang đột biến kháng thuốc phân lập từ các bệnh nhân người Việt Nam.
Đề tài nghiên cứu của chúng tôi được đặt ra là nhằm phát hiện một số độtbiến kháng thuốc trong gen mã hóa của protease của HIV, đồng thời bước đầu biểu
hiện gen này trong vi khuẩn E coli để làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo.
Các nghiên cứu của luận văn được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm trọngđiểm Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại họcQuốc gia Hà Nội
Trang 3Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1 Giới thiệu chung về HIV
1.1.1 HIV/AIDS
Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải được gọi tắt là AIDS, do virus HIV gây ra
sự suy giảm miễn dịch ở người được phát hiện ở Mỹ năm 1981, đến nay đã trởthành “căn bệnh thế kỷ” trên toàn thế giới
Về phân loại, HIV là các Retrovirus có bộ máy di truyền thuộc họ
Retroviridae với hai type chính là HIV type 1 (HIV-1) và HIV type 2 (HIV-2),
trong đó HIV-1 gây ra 98% sự lan truyền còn HIV-2 chỉ chiếm ưu thế ở vùng tâychâu Phi, ít lan truyền trên thế giới [1, 15] Vì vậy, HIV-1 được xem như là nguyênnhân chính gây nên AIDS
HIV-1 được chia thành 3 nhóm là M (main), O (outlier), nhóm N (new) trong
đó hơn 90% sự lây nhiễm của HIV thuộc nhóm M Trong nhóm M gồm các phânnhóm A, B, C, D, F, G, H, J, K và nhiều dạng tái tổ hợp khác (circulatingrecombinant form-CRF) Các phân nhóm khác nhau chủ yếu ở cấu trúc của cácprotein vỏ và đặc trưng cho sự truyền nhiễm theo khu vực địa lý Đây là một đặcđiểm đáng lưu ý trong các nghiên cứu để tìm ra thuốc điều trị cho các bệnh nhânHIV/AIDS theo từng khu vực [14]
Về cấu trúc, HIV có dạng hình cầu với kích thước khoảng 120 nm, được mô
tả ở hình 1 Lớp vỏ ngoài cùng của virus HIV bao gồm một lớp màng lipid kép có
nguồn gốc từ tế bào chủ, trên lớp vỏ này có chứa khoảng 72 bản sao protein env của virus, mỗi protein env lại chứa một mũ được tạo thành từ 3 phân tử gp120 còn thân
được tạo thành từ 3 phân tử gp41 có chức năng neo giữ lõi virus với vỏ bao ngoài.Lõi virus có dạng như hạt đậu tạo thành từ 2.000 bản sao của protein p24 Trong lõibao gồm hệ gen của HIV là hai sợi RNA (+) đơn, mỗi sợi có kích thước khoảng 10
kb gồm 9 gen mã hóa cho 15 protein khác nhau Cuối mỗi chuỗi RNA là các trình
tự được gọi là trình tự lặp lại tận cùng dài (LTRs) đóng vai trò trong việc kiểm soát
sự nhân lên cũng như điều hòa quá trình tổng hợp protein của virus Giống như các
retrovirus khác, HIV có 3 gen chính gag, pol và env mã hóa cho các protein tham
Trang 4gia vào quá trình sao chép và trưởng thành của virus Sản phẩm ban đầu của gen
gag là một protein 56 kDa, sau đó được chế biến thành ít nhất 3 sản phẩm p17, p24
và p15 là các protein cấu trúc của virus Gen pol mã hóa cho các enzyme reverse
transcriptase (RT), intergrase và protease trong đó enzyme RT có chức năng phiên
mã ngược RNA của virus thành cDNA; enzyme intergrase chèn cDNA vào nhiễmsắc thể của tế bào chủ còn protease tham gia vào quá trình cắt các phân tử proteintiền thân dưới dạng polypeptide thành các protein cấu trúc và chức năng cần cho sự
hình thành của thể virus Gen env mã hóa cho các glycoprotein capsid của virus; sản phẩm của gen env (gp160) được cắt bởi protease của tế bào chủ thành gp120 và
gp41 sau đó lắp ráp lại thành cấu trúc tam phân trong lớp vỏ virus Ngoài 3 gen
chính, HIV còn có 6 gen khác (tat, rev, nef, vif, vpr và vpu) chứa thông tin mã hóa
cho các protein có khả năng kiểm soát sự tái bản, các cách lây nhiễm khác nhauhoặc nguy cơ nhiễm các loại bệnh khác nhau [5, 17, 22]
Hình 1: Cấu tạo của HIV [40]
HIV truyền nhiễm theo 4 con đường, bao gồm con đường tiêm truyền dodùng chung kim tiêm, lây nhiễm do truyền máu và các sản phẩm của máu, từ mẹ bịnhiễm bệnh sang thai nhi và qua quan hệ tình dục không an toàn [1, 15]
Quá trình tiến triển của bệnh được chia thành 3 thời kì Sự lây nhiễm HIVban đầu gọi là quá trình nhiễm sơ cấp, thường kéo dài từ 3-6 tuần, sau đó virus đikhắp cơ thể, nhân bản mạnh trong khi không có bất cứ đáp ứng miễn dịch thích hợp
Trang 5nào được phát hiện [1, 7, 15] Người bệnh sốt nhẹ, có triệu chứng như cảm cúm,hạch lympho sưng to, cũng có khi không thấy triệu chứng gì Tiếp theo là giai đoạntiềm ẩn kéo dài từ 1 đến 12 năm (tùy theo từng người nhiễm) Trong giai đoạn này,quá trình sao chép của virus giảm và số lượng tế bào lympho T CD4+ tăng lên, virusHIV có thể được phát hiện bằng PCR hoặc RT-PCR trong các lympho của máu vàtrong các mô bạch huyết [1] Khoảng vài năm sau, mật độ các virus trong máu tăngnhanh và giữ ở mức đó cho tới lúc chết, các kháng thể kháng virus giảm dần Giai đoạnnày gọi là giai đoạn toàn phát hay giai đoạn cuối Lúc này hội chứng lâm sàng của bệnhsuy giảm miễn dịch xuất hiện, các vi sinh vật cơ hội có điều kiện tấn công, người bệnhchết dần [7, 16, 28]
Chính những đặc trưng phân tử trong cách tấn công hệ thống miễn dịchcủa HIV mà AIDS trở thành một trong những bệnh nguy hiểm nhất trong lịch
sử loài người
1.1.2 Tình hình nhiễm HIV/AIDS
Đại dịch HIV/AIDS đã và đang là một thách thức to lớn đối với tiến trìnhphát triển xã hội Sau gần 3 thập kỷ phát hiện, bắt đầu ở các nước phát triển, HIV/AIDS đã lan rộng trên toàn thế giới, đặc biệt phát triển ở khu vực châu Phi và các nướcchâu Á Đến nay vẫn chưa có vaccine phòng ngừa HIV và thuốc chữa trị đặc hiệu
Theo thông báo của Tổ chức y tế thế giới (WHO) và Chương trình phối hợpphòng chống AIDS của Liên hiệp quốc (UNAIDS) đến cuối năm 2009 ước tínhkhoảng 33,3 triệu người đang mang căn bệnh HIV/AIDS, trong đó số đối tượng mới
là 2,6 triệu người và có khoảng 1,8 triệu bệnh nhân đã chết vì AIDS Tại khu vựcchâu Á, có khoảng 4,87 triệu người đang sống cùng với HIV/AIDS ở các khu vựcĐông Nam và Nam Á; tình hình phát triển của bệnh này ngày càng tăng với nhữngdiễn biến phức tạp Theo dự đoán, khu vực này sẽ trở thành trung tâm của đại dịchHIV/AIDS trong vài thập kỉ tới [37]
Ở Việt Nam, theo UNAIDS [36], tính đến ngày 30/9/2010 trên cả nước có180.631 trường hợp nhiễm HIV/AIDS, trong đó có 42.339 bệnh nhân AIDS và tổng
số người chết vì AIDS được báo cáo là 48.368 Cho đến nay, đã có trên 74% xã,
Trang 6phường và 97,8% quận, huyện trên toàn quốc báo cáo có người nhiễm HIV/AIDS.Thành phố Hồ Chí Minh vẫn là địa phương có tỷ lệ bệnh nhân HIV/AIDS cao nhấtvới 23% tổng số bệnh nhân trong cả nước Phân tích hình thái lây nhiễm cho thấy,trong số những người mới được phát hiện nhiễm HIV trong 3 quí đầu năm 2010 có49% bị nhiễm qua đường máu, 38% qua đường tình dục, 3% qua đường mẹ - con và10% không rõ đường lây Tỷ lệ nam giới nhiễm HIV chiếm 70,8% và nữ giới chiếm29,2% Phần lớn người nhiễm HIV được phát hiện trong 9 tháng qua ở tuổi từ 20-39(chiếm 82%), trẻ em dưới 15 tuổi chiếm gần 3% Theo đánh giá chung, tình hìnhnhiễm HIV/AIDS có xu hướng giảm nhưng đại dịch HIV/AIDS vẫn trong giai đoạntập trung – xảy ra chủ yếu trong các nhóm có hành vi nguy cơ cao, đặc biệt trongnhóm tiêm chích ma túy và nhóm người mại dâm
Do những hậu quả to lớn của đại dịch HIV/AIDS đối với sự phát triển xã hộitrên phạm vi toàn cầu, việc tìm ra vaccine phòng ngừa hiệu quả và thuốc đặc trị chocăn bệnh này là vấn đề cấp thiết đối với các nhà khoa học y học và sinh học phân tử
1.1.3 Phương pháp điều trị HIV/AIDS
Cách điều trị HIV/AIDS phổ biến nhất là dùng thuốc chống virus, đây làthuốc có tác dụng ức chế sự phát triển và nhân lên của HIV ở những giai đoạn khácnhau trong vòng đời của virus Hiện tại có một số nhóm chất chống HIV đang được
sử dụng dựa trên cơ chế tương đồng về cấu trúc dẫn đến cạnh tranh hoạt động.Chúng được chia thành 5 nhóm chính gồm: các chất có bản chất nucleoside (NRTI)
ức chế enzyme phiên mã ngược RT, các chất ức chế protease (PI), các chất ức chếenzyme phiên mã ngược không phải loại nucleoside (NNRTI), các chất ức chếenzyme phiên mã ngược dạng nucleotide (NTRTI) và các chất ức chế hòa nhậpkhông cho virus nhân bản HIV/AIDS còn có thể được điều trị bằng các thuốc điềuhòa miễn dịch như alpha-interferon, interleukin 2, loprinasine với tác dụng tăngcường khả năng bảo vệ hệ miễn dịch Ngoài ra, bệnh nhân HIV/AIDS còn có thểđược điều trị với một số thuốc phòng ngừa các bệnh cơ hội [15]
Trang 7Tuy nhiên, do HIV có tỷ lệ đột biến cao dẫn đến tình trạng kháng thuốc vàviệc sử dụng thuốc điều trị trong thời gian dài dẫn đến các tác dụng phụ Chính vìvậy, hướng nghiên cứu tìm ra các loại thuốc chống HIV/AIDS mới cũng như liệupháp điều trị bằng cách kết hợp các loại thuốc khác nhau đã và đang là vấn đề cấpbách hiện nay.
1.2 Protease của HIV-1 (gọi tắt là protease HIV-1)
Protease HIV-1 là một enzyme không thể thiếu trong chu trình sống củavirus Protease cần thiết để phân cắt các tiền chất polyprotein virus gag và gag-polthành những protein cấu trúc và chức năng trong quá trình trưởng thành của virus[39] Các nghiên cứu cho thấy, khi ức chế hoạt tính của protease hoặc gây đột biếntrên gen mã hóa cho protease, các hạt virus được hình thành nhưng không có khảnăng xâm nhiễm vào tế bào vật chủ [19] Với vai trò đặc biệt quan trọng như trên,protease HIV-1 là một trong các đích nghiên cứu nhằm tìm ra loại thuốc ngăn chặn
sự nhân lên của HIV
1.2.1 Gen mã hóa protease HIV- 1
Hệ gen của HIV-1 nằm trong phần lõi của virus và bao gồm hai sợi RNA (+)đơn, mỗi sợi có chiều dài khoảng 9,8 kb và có 9 gen mã hóa cho 15 protein khác nhau
Trên mỗi sợi RNA có 3 gen cấu trúc là gag, pol và env; trong đó gag có nghĩa
“group-antigen” (kháng nguyên nhóm), pol là “polymerase” và env là “envelope” (vỏ) Các
gen gag và env mã hóa cho nucleocapsid và glycoprotein của màng virus; gen pol mã
hóa cho 3 enzyme: reverse transcriptase, integrase và protease Ngoài ra, HIV-1 còn có
6 gen (vif, vpu, vpr, tat, rev và nef) ở vùng RNA 9 kb (Hoffmann và tập thể, 2007)
Do tốc độ sinh sản nhanh của HIV – 1, có khoảng 10 triệu hạt virus mới đượctạo ra mỗi ngày và tỷ lệ sai sót rất cao của enzyme reverse transriptase (1/10.000base) dẫn đến tình trạng kháng thuốc phổ biến ở những bệnh nhân nhiễm bệnh thậmchí khi chưa dùng thuốc Nghiên cứu trên các bệnh nhân nhiễm chủng CRF01_AEthất bại trong điều trị HAART ở Nonthaburi, Thailand được đăng ký trên GenBankvới số hiệu từ FJ463512- FJ463596, phát hiện các đột biến phụ (minor) kháng thuốc
Trang 8PI là M36I và H69K ở hầu hết các bệnh nhân, I13V, E35D và L89M ở hơn 84% cácbệnh nhân được điều trị ATV, ATV/r, IDV/r, NFV, TPV/r.
Các nghiên cứu về gen mã hóa protease HIV-1 ở Việt Nam chủ yếu tập trungvào xác định nhóm virus gây bệnh chủ yếu ở người Việt Nam và tìm ra một số đột biếnliên quan đến tính kháng thuốc Năm 2003, Nguyễn Hoàng Lan và tập thể [21] đã tiếnhành đọc trình tự các gen mã hóa RT, protease và env trên các bệnh nhân nhiễm HIV-1
ở miền Nam, chủ yếu là ở thành phố Hồ Chí Minh 198 trong số 200 bệnh nhân nghiêncứu thuộc phân nhóm CRF01_AE Nghiên cứu cũng xác định được 6,5% đột biếnkháng thuốc chính khi sử dụng HAART đối với 200 bệnh nhân này Ishizaki và tập thể[15] cũng tiến hành đọc trình tự gen mã hóa protease và RT trên đối tượng các bệnhnhân nhiễm HIV-1 ở Hải Phòng Phân tích hình thái di truyền của hơn 1.000 bệnh nhâncũng cho thấy phân nhóm HIV-1 gây bệnh của yếu là CRF01_AE (chiếm 98,3%).Phân tích đột biến kháng thuốc trên 294 bệnh nhân đã chỉ ra có 0,3% đột biến liên quanđến kháng thuốc ức chế protease tại vị trí M46I
Trong các đột biến kháng thuốc thì phổ các đột biến kháng PI rất rộng có thể
do sự đa hình xảy ra ở 49 gốc axit amin trong tổng số 99 axit amin của protease.Mặc dù có sự kháng chéo từ mức độ vừa đến mức độ cao giữa các PI, các đột biếnchính là tương đối đặc hiệu cho từng thuốc riêng biệt Phần lớn các dữ liệu về độtbiến chính phát sinh từ các bệnh nhân điều trị PI không tăng cường (PI thế hệ thứnhất) Đột biến chính rất hiếm gặp ở các phác đồ điều trị bằng PI tăng cường(Hoffmann và tập thể, 2007) Khi điều trị saquinavir không tăng cường chủ yếu xảy
ra đột biến G48V và làm giảm độ nhạy với saquinavir 10 lần; nếu kèm thêm độtbiến L90M, mức độ nhạy cảm với saquinavir giảm rõ hơn trên 100 lần (Jacobsen
và tập thể, 1995) Trong khi đó, phải cần ít nhất 4 trong số các đột biến L10I/R/V,G48V, I54V/L, A71V/T, V77A, V82A, I84V và L90M mới có thể làm giảm hiệulực của saquinavir tăng cường (Valer và tập thể, 2002)
1.2.2 Cấu trúc của protease HIV-1
Có nhiều cách phân loại protease, dựa vào vị trí cắt trên chuỗi polypeptide,protease được chia thành hai nhóm chính: exopeptidase và endopeptidase.Exopeptidase cắt liên kết peptide ở gần đầu N hoặc đầu C của cơ chất, trong khi đó
Trang 9endopeptidase cắt liên kết peptide nội chuỗi Dựa vào cấu trúc của “nhóm chức” cómặt trong trung tâm hoạt động, protease lại được chia thành bốn nhóm chính:protease serine, protease aspartyl, protease cysteine/thiol và protease chứa kim loại(metallo protease), tiếp đó protease lại tiếp tục được phân chia thành nhiều họ khácnhau dựa vào trình tự axit amin [34] Theo cách phân loại này, protease HIV-1 làmột protease aspartyl hay protease axit.
Navia và tập thể tại phòng thí nghiệm Mecrk [27] là nhóm đầu tiên tạo đượccấu trúc tinh thể của protease HIV-1 vào năm 1989, kể từ đó cấu trúc của protease
đã được nghiên cứu rộng rãi cả về chức năng, tính đặc hiệu cơ chất cũng như sự liênkết với các chất ức chế Protease HIV-1 là một dimer, chứa hai tiểu phần giống hệtnhau được sắp xếp gần như theo kiểu đối xứng, mỗi tiểu phần có khối lượng khoảng
11 kDa gồm 99 axit amin (Hình 2) Sự tương tác giữa chúng tạo thành cấu trúckhông gian với 3 miền (domain) chính quyết định chức năng và các tính chất kháccủa protease HIV-1 [39] Đầu tiên là miền kết thúc (terminal domain) gồm phiếngấp nếp β được tạo thành từ 4 đầu cuối của cả 2 tiểu phần (axit amin 1-4 và 90-95của mỗi tiểu phần), vòng quay tạo thành từ các axit amin 4-9 và vòng xoắn α (cácaxit amin 86-94 của mỗi tiểu phần) Miền này khá quan trọng trong việc hình thành
và ổn định dạng dimer của một protease có hoạt tính Tiếp theo là 2 miền lõi (coredomain) với sự tham gia của các axit amin từ 10-32 và 63-85 của mỗi tiểu phần.Trung tâm hoạt động của enzyme với một trình tự bảo thủ cao Asp25-Thr26-Gly27được tạo thành ở mặt phân giới của các miền lõi từ cả 2 tiểu phần Miền lõi có tínhquyết định đối với sự ổn định của dimer cũng như hoạt tính xúc tác của protease.Miền cuối cùng còn được gọi là “mũ” (flap domain) gồm một vòng được tiếp xúcphần lớn với dung môi (gốc 33-43) trước một cấu trúc cặp tóc có chứa mũ (các axitamin 44-63) Các chất ức chế hoặc cơ chất liên kết giữa hai tiểu phần bằng liên kếthydro và tương tác Van der Waals với vị trí hoạt động gồm hai bộ ba đặc trưng vàhai mũ linh hoạt Các mũ gấp xuống cơ chất hoặc các chất ức chế và hoạt độngtrong suốt quá trình xúc tác cùng với việc liên kết cơ chất cũng như loại trừ phân tử
Trang 10nước từ vị trí hoạt động Có một phân tử nước được giữ lại hình thành nên cầu nối
giữa chất ức chế và nhóm –NH- của Ile 50/50’ –NH- ở các mũ Phân tử nước nàyrất thiết yếu cho sự thủy phân của protease và có thể bị thay thế bởi một nhóm
cacbonyl có trong một chất ức chế thích hợp nào đó Các nghiên cứu cũng đã chứng
minh rằng các mũ của protease thực sự mềm dẻo và tính chất mềm dẻo này có thểquan trọng đối với hoạt tính của enzyme Nếu đột biến xuất hiện ở vị trí mũ có thểlàm giảm mạnh hoạt tính của enzyme [11, 39]
Hình 2: Cấu trúc không gian của protease HIV-1 [39]
1.2.3 Chức năng của protease HIV-1
Protease là enzyme không thể thiếu có vai trò quan trọng trong quá trình táibản của HIV-1 Nó cắt phân tử polyprotein (gag, gag-pol) thành các protein cấutrúc, có chức năng cần thiết cho virus trưởng thành Cụ thể, protease HIV-1 nhận
biết 9 trình tự peptide khác nhau trên polypeptide gag để tạo ra các protein cấu trúc:
matrix, capsid, nucleocapsid cùng với các protein có khối lượng phân tử bé p2, p1
và p6 có vai trò trong quá trình lắp ráp và xác định hình thái của lớp vỏ trưởngthành; thủy phân polypeptide gag-pol tạo thành 3 enzyme: protease, RT và
Trang 11intergrase cần thiết cho quá trình sao chép của virus HIV và thủy phân polypeptide
env thành các protein vỏ gp120 và gp41 của HIV-1 [4, 39] (Hình 3)
Mặc dù, các tế bào ở động vật có vú cũng có protease aspartyl và cácprotease khác nhưng chúng không có khả năng phân cắt các polyprotein gag, gag-pol như protease của HIV-1 Ngoài ra, protease HIV-1 không những cắt cácpolyprotein của chính nó mà còn thủy phân rất nhiều protein của vật chủ như actin,Bcl2, procaspase 8 [29] Đây chính là cơ sở để tạo ra các cơ chất đặc hiệu củaprotease HIV-1 [4]
Hình 3: Sơ đồ phân cắt polyprotein gag và gag-pol của HIV-1 để hình thành
các protein chức năng [39]
Hoạt tính của protease HIV-1 bị ức chế bởi pepstatin A [21] giống như cácprotease aspartyl khác Khi ức chế hoạt tính của protease hoặc gây đột biến trên gen
mã hóa cho protease, các hạt virus được hình thành nhưng không đóng gói phù hợp
để tạo thành thể virus trưởng thành, nên chúng không có khả năng xâm nhiễm vào
tế bào vật chủ Ngoài ra, protease HIV-1 còn đóng vai trò trong quá trình phát sinhbệnh Khi chuyển vào tế bào người hoặc virus, protease HIV-1 gây độc và cắt nhiềuprotein của vật chủ như actin, Bcl2 và procaspase 8 Các nghiên cứu cũng khẳngđịnh, sử dụng các chất ức chế protease có thể ngăn chặn hiện tượng chết theochương trình do protease HIV-1 gây nên [34]
Trang 121.2.4 Tạo protease HIV-1 tái tổ hợp
Do vai trò quan trọng của protease HIV-1, việc sản xuất và tinh sạch vớilượng đủ lớn enzyme này là cần thiết cho các nghiên cứu nhằm phát triển các loạithuốc ức chế protease trong điều trị bệnh HIV/AIDS Chính vì vậy từ khi HIV đượcphát hiện cho đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu để sản xuất protease HIV-
1 bằng cách biểu hiện trên vi khuẩn E coli hoặc trên nấm men Saccharomyces cerevisiae hoặc bằng cách tổng hợp hóa học monomer 99 axit amin Tuy nhiên, quá
trình sản xuất protease HIV-1 gặp nhiều trở ngại trong việc biểu hiện và tinh sạch
Năm 1989, Darke và tập thể [8] đã sử dụng promoter trp của vector pPRT để
biểu hiện protease HIV-1 Protease sau khi được tinh sạch qua hệ thống cột sephadex A-25 và phosphocellulose có khối lượng khoảng 11 kDa, bao gồm 99 axitamin, có hoạt tính phân cắt protein gag p55 thành p24 và p17 cũng như phân cắt cơchất tổng hợp Kết quả nghiên cứu tính chất cũng cho thấy, hoạt tính của proteasetinh sạch bị ức chế bởi pepstatin A và khi gây đột biến thay Asp-25 thành Asn-25,protease chỉ còn 1% hoạt tính so với dạng protease nguyên bản ban đầu
DEAE-Năm 1990, Cheng và tập thể [6] đã sử dụng tế bào E coli JM105 đồng nhiễm
với phage αCE6 để biểu hiện và tinh sạch protease HIV-1 với số lượng lớn ProteaseHIV-1 thu được chủ yếu ở dạng thể vùi, sau đó được hòa tan bằng ure 8 M, tinh sạchqua cột lọc gel ACA54 rồi được hồi tính để thu được dạng hoạt động và thử hoạt tínhvới cơ chất tổng hợp Kết quả, protease HIV-1 được tinh sạch với hiệu suất 20 mg từ
1 lít môi trường nuôi cấy, có khả năng phân giải peptide với hoạt độ 450 nmol/phút/
mg protein, một bước tinh sạch qua cột tiếp theo làm tăng hoạt độ lên 800 nmol/phút/
mg Khi so sánh với protease HIV-1 thu được từ các điều kiện không biến tính chothấy protease ở dạng biến tính sau đó sẽ được hồi tính hiệu quả
Năm 1992, Rangwala và tập thể [32] đã biểu hiện protease HIV-1 ở vi khuẩn
E coli và thu được protease tái tổ hợp chiếm từ 8 đến 10% protein tổng số của tế
bào bằng cách thay đổi một số thông số như: promoter; sử dụng các codon ưa thích
đối với E coli; thêm trình tự giàu A+T ở vùng 5’ mã hoá; gen được biểu hiện dưới
dạng protein dung hợp với hai trình tự tự cắt trong tế bào
Trang 13Leuthardt và Roesel [23] đã nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch protease
HIV-1 tái tổ hợp bằng hệ thống vector pDS56/3H-3H ở E coli Bằng hệ thống biểu hiện
này, protease được gắn thêm 3 gốc Histidine (His) ở đầu cùng N và đầu cuối C đểthuận tiện cho quá trình tinh sạch Nghiên cứu cho thấy 90% protease HIV-1 saubiểu hiện thu được ở phân đoạn kết tủa (pellet) của tế bào vi khuẩn và được hòa tanhiệu quả bằng đệm ly giải có guanidine 6 M Sau khi tinh sạch bằng hệ thống cộttrao đổi anion và sắc ký ái lực Ni-agarose, protease tái tổ hợp được hồi tính và cóhoạt tính cắt cơ chất gag p55 của HIV-1 và cơ chất tổng hợp đặc hiệu giống nhưprotease tự nhiên
Năm 2007, Chen và tập thể [5] đã sử dụng hệ thống biểu hiện bên ngoài tế
bào (E coli cell-free system) của hãng Roche, Grenzacherstrasse (Thụy Sỹ) để biểu hiện trực tiếp protease HIV-1 trong điều kiện in vitro Để nhân bản DNA cho biểu hiện protein in vitro, hai phản ứng PCR đã được tiến hành Phản ứng PCR thứ nhất
nhân bản đoạn gen mã hóa protease HIV-1 đặc hiệu Trong phản ứng PCR thứ hai,C-terminal His-tag và các nhân tố điều hòa cần thiết cho biểu hiện protein ở hệthống tế bào nhân sơ dựa trên T7 polymerase (T7 promoter, vị trí liên kết ribosomecủa vi khuẩn, T7 terminator, mã mở đầu, mã kết thúc) được bổ sung vào Sản phẩmPCR cuối cùng có thể biểu hiện trực tiếp protein không cần bất kỳ bước tinh sạchnào Phân tích phân đoạn hòa tan và không tan của hệ thống biểu hiện bằng điện diprotein cho thấy thu nhận được protease mong muốn chủ yếu ở phân đoạn hòa tan
Khi được biểu hiện ở E coli, protease HIV-1 có khả năng gây độc giết chết tế
bào [34] Để hạn chế tính độc này, một vài nhóm nghiên cứu đã nhân dòng và biểuhiện protease HIV-1 bằng cách sử dụng các hệ thống biểu hiện và quy trình biểu hiệnkhác nhau như sử dụng các promoter trp, λPL, T7, araBAD và tac [8, 18, 35] Nghiên
cứu biểu hiện protease dưới dạng dung hợp với nhiều protein khác nhau để tăng tínhtan của protease như -galactosidase, dihydrofolate reductase, -lactamase, maltosehoặc gắn với phân tử IgG [10, 24, 35] Protease được liên kết với IgG bởi liên kếtpeptide Asp-Pro, liên kết này không bị cắt bởi protease của virus Protein dung hợp
có khối lượng phân tử 25,4 kDa vẫn có hoạt tính xúc tác, cắt cơ chất peptide tại đúng
Trang 14vị trí liên kết Tyr-Pro Protease nguyên bản có thể được thu lại bằng cách ủ proteasedung hợp với axit formic, cắt liên kết Asp-Pro [10] Komai và tập thể [18] đã biểu
hiện protease HIV-1 trên hệ thống vector có sử dụng T7 promoter trong tế bào E coli chủng BL21 (DE3) với chế phẩm protease có hoạt tính cao gấp mười lần so với
khi sử dụng các vector tương tự Nghiên cứu của nhóm tác giả cho thấy hệ thống
biểu hiện này cũng phù hợp với việc biểu hiện các protein độc khác trong E coli
Nhìn chung, các nghiên cứu về biểu hiện protease HIV-1 cho thấy quá trìnhsản xuất enzyme này gặp nhiều khó khăn do: protease gây độc với tế bào chủ;protein đích được biểu hiện chủ yếu ở dạng không hòa tan (90% ở dạng thể vùi);hàm lượng thu được rất thấp chỉ có thể phát hiện bằng phương pháp thẩm tách miễndịch [19, 23] Tuy nhiên, các nghiên cứu cũng cho thấy, bằng việc đồng biểu hiệnvới plasmid pLysS, pLysE có thể hạn chế được tính độc và protease HIV-1 khiđược biểu hiện cùng với các protein dung hợp sẽ làm tăng hiệu suất biểu hiện, tăngtính tan và thuận tiện cho tinh sạch nhưng vẫn đảm bảo hoạt tính [10, 23-24, 35]
Ở Việt Nam, protease HIV-1 là một trong số những enzyme được nghiên cứunhiều nhất trong những thập kỷ qua và các nghiên cứu chủ yếu là điều tra, tách chiết
và nghiên cứu một số tính chất trên đối tượng vi sinh vật Tuy nhiên, protease
HIV-1 từ các bệnh nhân Việt Nam là vấn đề chưa được nghiên cứu nhiều
Năm 2010, Nguyễn Thị Hồng Loan và tập thể [2] đã thành công trong biểu
hiện và tinh sạch protease HIV-1 trên hệ thống vector pET32a, ở tế bào E coli.
Protease HIV-1 biểu hiện có hoạt tính cắt cơ chất tổng hợp giống trong tế bào chủ
Xuất phát từ thực tế, ở tế bào E coli, protease HIV-1 thường chỉ có hoạt tính
khi được biểu hiện ở dạng tự cắt tại liên kết Phe (Tyr)-Pro để giải phóng chuỗipolypeptide với axit amin mở đầu chuỗi là Pro [8] Các nghiên cứu cũng cho thấy,protease HIV-1 khi được biểu hiện cùng các protein dung hợp sẽ làm tăng hiệu suấtbiểu hiện, tăng độ hòa tan và thuận tiện cho quá trình tinh sạch mà vẫn đảm bảođược hoạt tính tự cắt [25, 32, 35, 37]
Trang 15Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nguyên liệu
2.1.1 Mẫu huyết thanh
Mẫu huyết thanh đã bất hoạt virut lấy từ các bệnh nhân đang điều trịkháng virut tại Bệnh viện Nhiệt đới Trung ương
Các chủng vi khuẩn E coli DH5α; E coli BL21 (DE3) pLysS; E coli BL21
(DE3) RIL được mua từ hãng Novagen
2.1.3 Hóa chất
Thang chuẩn protein nhuộm sẵn, hỗn hợp dNTP (dATP, dCTP, dGTP vàdTTP) của hãng Fermentas Các oligonucleotide được thiết kế và đặt mua từ hãngInvitrogen Kit tinh sạch DNA trên gel điện di của hãng Bioneer và Fermentas Cáchoá chất giải trình tự do hãng Beckman Coulter cung cấp Kháng thể đơn dòngkháng protease HIV-1 được mua từ hãng Gene-Tex Gel sắc ký ái lực His-bind củahãng Novagen Các hoá chất còn lại đều đạt độ tinh khiết dùng cho nghiên cứu sinhhọc phân tử
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Tách chiết RNA hệ gen HIV-1 và tổng hợp cDNA
RNA của HIV-1 được tách và tinh sạch từ các mẫu huyết thanh bệnh nhânnhiễm HIV-1 theo kit QIAamp Ultrasen virus của Qiagen với các dung dịch (đệm) kèmtheo với các ký hiệu là AR, AB, AW1, AW2, AVE Quy trình thực hiện như sau:
Huyết thanh (400 µl) đã được tách sẵn từ máu tổng số được chuyển sang ốngeppendorf, 400 µl dung dịch đệm phosphate chứa muối (PBS) và 640 µl đệm AC,0,56 µl dung dịch chất mang RNA (RNA carrier) được bổ sung nhằm tăng khả nănggắn RNA virus, hỗn hợp được trộn đều và ủ ở nhiệt độ phòng 10 phút Mẫu sau đó
Trang 16được ly tâm ở 3.000 vòng/phút trong 3 phút ở nhiệt độ phòng để loại bỏ dịch nổi.Kết tủa được hoà tan trở lại trong 240 µl đệm AR đã được làm nóng tới 60oC, 16 µlproteinase K được bổ sung, hỗn hợp được trộn đều trên máy vortex 3-5 lần, mỗi lần5-10 giây Tiếp theo, hỗn hợp được ủ tiếp ở 40oC trong 10 phút và lắc đều cứ sau 5phút 1 lần 240 µl đệm AB được bổ sung vào hỗn hợp và trộn đều bằng máy vortex.Sau đó, hỗn hợp được đưa vào cột QIAamp Spin và được ly tâm ở 7.000 vòng/phúttrong 1 phút ở nhiệt độ phòng Có thể lặp lại bước này nhiều hơn 1 lần để RNA gắnvới cột được nhiều nhất Cột sau đó được chuyển sang ống eppendorf mới và đượcrửa 2 lần bằng đệm AW1 và AW2 kết hợp ly tâm ở 14.000 vòng/phút trong 3 phút.Cuối cùng, cột được chuyển sang một ống eppendorf mới 60 µl đệm AVE được bổsung, hỗn hợp được ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 1 phút để thu hồi lại RNA.Mẫu được bảo quản ở -20oC đến khi sử dụng.
2.2.2 Tổng hợp cDNA từ RNA virus
RNA của HIV-1 được chuyển thành cDNA bằng enzyme M-MLV reversetranscriptase của Hãng Enzynomics
cDNA được tổng hợp theo quy trình: 10 l RNA của HIV-1 và 1 l mồingẫu nhiên (0,2 g) được biến tính ở 70oC trong 5 phút, làm lạnh trên đá Hỗn hợpphản ứng sau đó được bổ sung 2 l đệm M-MLV reverse transcriptase 10x, 2,5 lhỗn hợp dNTP (dATP, dCTP, dGTP và dTTP) 2 mM, 3,5 l H2O, 0,5 µl chất ứcchế ribonuclease và 0,5 l M-MLV reverse transcriptase, hỗn hợp phản ứng được ủ
ở 37oC trong 90 phút, phản ứng được kết thúc bằng xử lý nhiệt ở 70oC trong 10 phút
và làm lạnh trên đá Các mẫu cDNA sau đó được bảo quản ở -20oC để dùng cho cácthí nghiệm tiếp theo
2.2.2 Tách chiết và định lượng DNA
DNA plassmid được tách chiết theo kit của Hãng Fermentas
Nguyên lý: Màng tế bào bị dung giải bằng SDS để giải phóng plasmid Trong
môi trường kiềm, trong khi DNA nhân sẽ bị biến tính và kết tủa khi hỗn hợp đượctrung hòa bằng axit thì plasmid do có cấu trúc siêu xoắn nên quá trình biến tính xảy
ra ở mức độ vừa phải và sẽ nhanh chong được hồi tính khi trung hòa, do vậy,
Trang 17plasmid được tách riêng khỏi DNA nhân Mặc khác, sự phá vỡ màng tế bào đượcđiều khiển bằng thời gian tiếp xúc với SDS sao cho màng nhân không bị phá hủy,
sự giải phóng DNA nhân là tối thiểu
Quy trình: Một khuẩn lạc trên đĩa thạch được cấy vào 1,5 ml môi trường LB
lỏng có chứa kháng sinh phù hợp, được nuôi cấy lắc ở 370C, 180 vòng/phút trong
14-16 giờ Dịch nuôi cấy được ly tâm ở 8.000 vòng/phút trong 2 phút ở 250C để thu tếbào Sau đó, tủa tế bào được hòa trong 250 l dung dịch I đã được bổ sung RNase và
ủ ở nhiệt độ phòng 5 phút, tiếp tục bổ sung 250 l dung dịch II, lắc đều rồi ủ ở nhiệt
độ phòng trong 5 phút và trung hòa bằng 350 l dung dịch III, ủ trên đá từ 3-5 phút.Sau các bước phá màng, giải phóng DNA, hỗn hợp được ly tâm 13.000 vòng/phúttrong 20 phút, thu dịch trong Dịch này được nạp lên cột (kèm theo kit) và để tĩnh mộtphút ở nhiệt độ phòng Trong giai đoạn này, DNA plasmid có ái lực với gel sẽ đượcgiữ lại trên cột Cột được rửa với 500 l đệm PE 2 lần, ly tâm 13.000 vòng/phút trong
1 phút để loại dịch rửa Cột được ly tâm thêm một lần nữa nhằm loại hết EtOH cònsót lại sau bước rửa DNA plasmid được đẩy ra khỏi gel bằng 30-50 l đệm EB Độtinh sạch của DNA plasmid sau đó được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose
DNA plasmid sau khi tinh sạch được định lượng bằng cách đo độ hấp thụ ánhsáng tử ngoại của các axit nucleic ở bước sóng 260 nm (A260) A260 = 1 tương đươngvới hàm lượng DNA là 50 μg/ml và tương đương với hàm lượng RNA là 40 μg/ml.DNA plasmid được cho là sạch khi giá trị A260/A280 nằm trong khoảng 1,8-2,0
2.2.3 Điện di DNA trên gel agarose
Nguyên tắc: Các phân tử DNA là các polyanion nên trong môi trường trung
tính và kiềm, dưới tác dụng của điện trường chúng sẽ di chuyển về cực dương Mức
độ di chuyển của các phân tử DNA trong điện trường phụ thuộc chủ yếu vào kíchthước của chúng và nồng độ gel
Quy trình tiến hành: Gel agarose được chuẩn bị trong đệm TAE với nồng
độ EDTA 1-2 mM để tránh sự phân cắt DNA bởi nuclease Mẫu DNA đượctrộn với đệm mẫu có chứa chất chỉ thị màu là bromophenol xanh, xylene cyanol
và Ethidium bromide 50 g/ml sau đó tra vào Đường chạy Điện di được tiến
Trang 18hành với điện thế ổn định khoảng 10 volt/cm gel và chạy trong vòng 25-30phút Sau khi kết thúc điện di bản gel được lấy ra soi và chụp ảnh dưới ánhsáng tử ngoại của máy soi gel Doc (Bio-Rad).
2.2.4 Nhân bản các đoạn gen bằng kỹ thuật PCR
Sử dụng cặp mồi HIV Fw/Rv được thiết kế để nhân bản đặc hiệu đoạn gen
mã hóa cho protease HIV-1 từ nghiên cứu của Nguyễn Thị Hồng Loan và tập thể[2] Để thuận tiện cho quá trình biểu hiện sau này, có vị trí cắt giới hạn của enzyme
BamHI trên mồi xuôi và enzyme XhoI trên mồi ngược Ngoài ra, trên mồi xuôi còn
có thêm 21 nucleotide mã cho trình tự tự cắt gồm 7 axit amin,
Gly-Thr-Val-Ser-Phe-Asn-Phe, tương ứng với vị trí cắt đặc hiệu giữa p17 và p24 trên gen gag của
HIV-1 Trình tự cặp mồi như sau (vị trí cắt enzyme giới hạn được thể hiện bằng chữ
có gạch chân; trình tự tự cắt được thể hiện bằng chữ in nghiêng):
Taq DNA polymerase (5 đơn vị/l) 0,5
Trang 19
Với chu trình nhiệt như sau:
Sản phẩm của phản ứng PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 2%
2.2.5 Nhân dòng đoạn gen mã hóa protease HIV-1
Sản phẩm PCR được tổng hợp với sự xúc tác của enzyme Taq DNApolymerase sẽ có đầu adenosine monophosphate (A) do hoạt tính gắn thêm đầutận cùng không phụ thuộc vào trình tự DNA khuôn của enzyme Taq DNApolymerase Trong khi đó, vector nhân dòng pGEM-T của hãng Promega đượcthiết kế có chứa một gốc thymidine monophosphate (T) ở đầu 3’
Thành phần của phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pGEM-T được thể hiện ở bảng 2
Bảng 2 Thành phần của phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pGEM-T
Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 22oC trong 3 tiếng, sau đó sử dụng cho biến nạp vào
tế bào khả biến E coli chủng DH5α
Tế bào khả biến E coli DH5 được lấy ra từ tủ lạnh sâu -80oC để trên đá 10phút cho tan dần, sau đó được bổ sung hỗn hợp phản ứng gắn ở trên, trộn nhẹ và để
94oC-40 giây
53oC-30 giây
72oC-30 giây
40 chu kỳ
Trang 20trên đá 20 phút tạo điều kiện cho vector bám lên thành tế bào Hỗn hợp biến nạpđược làm sốc nhiệt ở 42oC trong 45 giây, làm lạnh trên đá 2 phút rồi bổ sung 500 lmôi trường LB lỏng vào hỗn hợp biến nạp Các tế bào sau biến nạp được giữ trong tủ
ấm 37oC trong 10 phút và tiếp đến nuôi lắc ở tốc độ 180 vòng/phút ở 37oC trong 60phút 50-100 l hỗn hợp biến nạp được cấy trải trên đĩa LB đặc có chứa ampicillin g/ml, cơ chất X-gal 20 mg/ml và chất cảm ứng IPTG 0,1 mM và nuôi trong tủ ấm 37oCqua đêm Các thể biến nạp được sơ bộ nhân ra bằng màu sắc của khuẩn lạc và đượckiểm tra sự có mặt của gen đích bằng PCR và xác định trình tự gen
2.2.6 Giải trình tự các đoạn gen mã hóa protease HIV-1 bằng phương pháp Sanger
Plasmid từ các thể biến nạp được tách và tinh sạch bằng kit của HãngFermentas như được mô tả ở mục 2.2.2 và được sử dụng để xác định trình tự đoạn genđích
Nguyên tắc: Xác định trình tự dựa trên phương pháp kết thúc kéo dài chuỗi
nhờ dideoxyribonucleotide của Sanger và tập thể [31] Các ddNTP do không chứanhóm –OH tại vị trí 2’ của gốc đường nên khi được enzyme DNA polymerase gắnvào chuỗi DNA đang tổng hợp thì chúng sẽ không thể tham gia hình thành liên kếtphosphodiester với nucleotide mới và khiến cho quá trình kéo dài chuỗi bị ngừnglại Như vậy, từ một đoạn DNA ban đầu, nhiều sợi đơn mới được đánh dấu ở mộtđầu tận cùng bằng ddNTP sẽ được tổng hợp và các sợi này có độ dài khác biệt nhaumột nucleotide Các sợi đơn mới tổng hợp được phân tách trên gel điện diacrylamide dạng mao quản Máy đọc trình tự sẽ tự động phân tích các kết quả đểđưa ra trình tự đoạn DNA gốc
Quy trình tiến hành: Khuôn cho phản ứng PCR được chuẩn bị để xác định
trình tự, sản phẩm PCR đoạn gen mã hoá cho protease HIV-1 được pha loãng ởnồng độ thích hợp (khoảng 50-100 pmol)
Thành phần phản ứng PCR cho xác định trình tự gồm: 6 l hỗn hợp DTCS(Dye terminator cycle sequencing) Master mix, 1 l khuôn, 1 l mồi (mồi xuôihoặc mồi ngược), H2O vô trùng vừa đủ 20 l
Trang 21Phản ứng PCR được thực hiện 35 chu kỳ gồm 3 bước: 96oC trong 30 giây,
56oC trong 30 giây, 60oC trong 4 phút Sản phẩm của phản ứng PCR này được xử lýtrước khi đưa vào máy đọc trình tự Quá trình xử lý mẫu gồm các bước sau:
- Dung dịch dừng phản ứng gồm: 20 l CH3COOK 3 M pH 5,2, 20 l EDTA
100 mM pH 8, 10 l glycogen và trộn đều 5 l dung dịch dừng phản ứng được bổsung vào 1 phản ứng PCR 20 l và trộn đều
- Bổ sung vào hỗn hợp 60 l ethanol 95% giữ ở -20oC Sau đó, hỗn hợp phảnứng được ly tâm ngay ở 13.000 vòng/phút trong 20 phút ở 40C Dịch nổi được hút
bỏ và thu kết tủa Kết tủa được rửa 2 lần, mỗi lần bằng 200 l ethanol 70% giữ ở
-20oC và được ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 5 phút Dịch nổi được hút bỏ cẩnthận bằng pipet, kết tủa được để khô ở nhiệt độ phòng sau đó được hoà tan trở lạibằng 40 l dung dịch SLS (sample loading solution) Mẫu sau khi xử lý được giảitrình tự bằng hệ thống đọc trình tự CEQ-8000 của hãng Beckman Coulter
2.2.7 Biểu hiện gen mã hóa protease HIV-1 ở E coli
Để gắn đoạn gen mã hóa protease HIV-1 vào vector biểu hiện pET32a, cảplamid tái tổ hợp pGEM-Prot và vector pET32a đều được cắt bằng hai enzyme
BamHI và XhoI để tạo các đầu dính, thành phần phản ứng cắt được nêu ở bảng 3,
thời gian phản ứng là 3h giờ, ở 37oC
Bảng 3 Thành phần của phản ứng cắt enzyme giới hạn
Thành phần phản ứng Vector pET32a Plasmid pGEM-Prot
Trang 22(gel binding buffer–GB) chứa NaI được bổ sung vào mẫu, hỗn hợp được ủ ở 60oCcho tới khi gel tan hoàn toàn (5-10 phút) Trong trường hợp kích thước đoạn DNAcần tinh sạch nhỏ hơn 200 bp hay lớn hơn 3 kb, hỗn hợp được bổ sung isopropanol
để tăng khả năng thu hồi DNA Sau khi được trộn đều, hỗn hợp được nạp lên cộtkèm theo kit Cột được ly tâm trong 1 phút để loại bỏ đệm gắn mẫu, sau đó rửa hailần bằng 500 l đệm rửa (washing buffer-WB) có chứa EtOH, ly tâm trong 1 phút
để loại bỏ dịch rửa Sau đó, cột được tiếp tục ly tâm trong 1 phút để loại bỏ hoàntoàn EtOH DNA gắn trên cột được thu lại bằng cách bổ sung 30 l dung dịch đệmrửa chiết (elution buffer–EL) vào cột gel và ly tâm trong 1 phút
Sau khi thu đã thu được hai sản phẩm gen mã hóa protease HIV-1 và vectorpET32a đã được tinh sạch, phản ứng gắn được thực hiện ở 22oC trong 3 giờ vớithành phần phản ứng gồm: 7 l vector pET32a (đã xử lý bằng enzyme giới hạn), 10
l gen mã hóa protease HIV-1 (đã xử lý bằng enzyme giới hạn), 2 l đệm T4 DNAligase 10x, 1l T4 DNA ligase Tổng thể tích phản ứng là 20 l, hỗn hợp phản ứng
được biến nạp vào tế bào E coli BL21 (DE3) có RIL và sự có mặt của gen đích
trong các thể biến nạp được xác định bằng PCR
Tế bào E coli BL21 (DE3) có RIL mang plasmid pET32a-Prot chứa gen mã
hoá proteasae HIV-1 được nuôi qua đêm ở 37oC, 200 vòng/phút trong môi trường
LB có chứa 50 μg/ml ampicilin và 34 μg/ml chloramphenicol, dịch khởi đầu sau đóđược trẻ hoá trong 150 ml LB lỏng theo tỷ lệ 1:30-1:50 Môi trường chứa tế bào tiếptục được nuôi cấy cho tới khi A600 đạt tới giá trị từ 0,7 đến 0,8; IPTG được bổ sungđạt nồng độ cuối cùng 0,1 mM để cảm ứng quá trình biểu hiện protein Sau 3 đến 4giờ cảm ứng, tế bào được thu bằng ly tâm 6.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC vàhoà trở lại trong đệm có bổ sung PMSF 1 mM Dịch tế bào được làm lạnh trên đá,siêu âm để phá màng tế bào, giải phóng protein, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 20phút ở 4oC để thu dịch chiết
2.2.8 Tinh sạch protease HIV-1 bằng cột sắc ký ái lực His-bind (Novagen)
Nguyên tắc: các protein chứa trình tự Histidine (His-tag) có ái lực cao với ion
Ni2+ Do vậy, những protein này có thể được tinh sạch bằng sắc ký ái lực trên gel
Trang 23His-bind (có giá thể được gắn thêm gốc Ni2+), sau đó protein đích gắn trên cột được thu lạibằng cách rửa chiết protein ra khỏi gel với Imidazol, là chất có cấu tạo tương tự His.
Tiến hành: Gel His-bind ở dạng trương nở sẵn được nhồi vào cột (kích thước
1x2 cm) để có thể tích cột gel 2 ml Cột gel được xử lý Ni2+ nồng độ 50 mM để tạophức hệ gắn; sau đó được cân bằng với đệm A (Tris-HCl 20 mM pH 7,9 có chứaNaCl 100 mM, ure 8 M, và Imidazol 5 mM) Phân đoạn kết tủa tế bào chứa proteaseHIV-1 được cho lên cột với tốc độ 10 ml/giờ Các protein không gắn với gel đượcloại bỏ dần bằng cách rửa cột với đệm A có Imidazol 20 mM đến khi OD280‹ 0,1
2.2.9 Điện di trên gel polyacrylamide có chứa SDS (SDS-PAGE) theo phương pháp của Laemmli [20]
Gel polyacrylamide hai lớp, trong đó gel cô là 4% và gel tách là 15% với tỷ
lệ thành phần được ghi ở bảng 4
Bảng 4: Thành phần gel cô và gel tách acrylamide
Trang 24Mẫu protein được trộn vào đệm mẫu (nồng độ 4X gồm Tris-HCl, glycerol,SDS, β-mercaptoethanol, bromophenol blue) theo tỷ lệ thể tích 3:1, xử lý nhiệt ở
950C trong 5 phút, làm lạnh nhanh trên đá và dùng để tra Đường chạy chạy điện di
Đệm chạy điện di là Tris-Glycine pH 8,8 có chứa SDS 1%, quá trình điện diđược thực hiện với hiệu điện thế ổn định 10 volt/cm gel cho đến khi vạch màu chỉthị (bromophenol xanh) chạm mép bản gel thì dừng lại
Gel được nhuộm bằng dung dịch CBB 0,5% pha trong hỗn hợp methanol:axit axetic: H2O với tỷ lệ thể tích là 3: 6: 1 trong khoảng 20 phút, màu thuốc nhuộmđược tẩy bằng hỗn hợp đã dùng để pha CBB cho tới khi bản gel có nền sáng
2.2.10 Nhận dạng protease HIV-1 bằng thẩm tách miễn dịch (Western blotting)
Nguyên tắc: Dựa trên sự tương tác đặc hiệu giữa protease HIV-1 (kháng nguyên)
và kháng thể đơn dòng kháng protease Phức hợp protease-kháng thể tiếp tục được nhậnbiết bởi kháng thể thứ cấp có gắn enzyme phosphatase kiềm, cuối cùng phức hợpproteasse- kháng thể sơ cấp-kháng thể thứ cấp được phát hiện bằng cách cho ủ trongdung dịch cơ chất Nhờ sự có mặt của enzyme trên kháng thể thứ cấp mà cơ chất chuyển
từ không màu thành sản phẩm có màu, dễ dàng nhận biết bằng mắt thường
Các bước tiến hành:
Protein sau khi được tách bằng điện di trên gel SDS-PAGE, được chuyển lên màng
PVDF bằng phương pháp điện chuyển trong đệm Tris-Glycine có chứa 10%methanol Trong quá trình điện chuyển, vị trí các băng protein được giữ nguyên
Màng được cố định bằng dung dịch BSA 1% trong đệm Tris-HCl 10 mM, pH
7,4 qua đêm ở 4oC hoặc bằng cách lắc nhẹ 30 phút đến 1 giờ ở nhiệt độ phòng
Màng được rửa 3 lần bằng đệm PBS 1X, pH 7,4 có bổ sung Tween 80 0,1%
để loại bỏ BSA thừa
Màng sau đó được ủ với kháng thể đơn dòng kháng protease HIV-1 (kháng
thể sơ cấp), lắc nhẹ trong ít nhất 1 giờ, ở 37oC
Kháng thể sơ cấp bám không đặc hiệu trên màng được loại bỏ bằng cách
tráng rửa màng 3 lần trong đệm PBS 1X, pH 7,4 có bổ sung Tween 80 0,1%
Trang 25Sau đó màng được ủ với kháng thể thứ cấp thích hợp có gắn phosphatasekiềm Kháng thể thứ cấp bám không đặc hiệu cũng được loại bỏ bằng cáchtráng rửa màng trong đệm PBS 1X, pH 7,4 có bổ sung Tween 80 0,1%.
Các băng protein được hiện màu bằng cách ủ màng trong dung dịch cơ chất
p- nitro blue tetrazolium chloride và 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate(NBT/BCIP) pha trong đệm Tris-HCl 0,1 M, pH 9,5 có MgCl2 5 mM vàNaCl 0,1 M Phản ứng được làm ngừng trong đệm PBS 1X, pH 7,4 có chứaEDTA 20 mM, pH 8,0 khi các băng protein hiện rõ
2.2.11 Phân tính hoạt độ của protease HIV-1 theo phương pháp của Richard
và tập thể [31]
Nguyên tắc của phương pháp : Protease HIV-1 chỉ nhận ra và phân cắt tại vị
trí đặc hiệu nếu cơ chất có chứa bất kì một trong 7 liên kết của trình tự tương ứngtrên polyprotein gag của virus Bằng cách tổng hợp một cơ chất Lys-Ala-Arg-Val-Leu*Nph-Glu-Ala-Met có chứa vị trí phân cắt đặc hiệu của protease HIV-1 với sự
có mặt của nhóm 4-NO2- phenylalanine (Nph) thay cho phenylalanine, cơ chất cókhả năng hấp phụ ở bước sóng 300 nm Dưới tác dụng hoạt tính phân cắt củaprotease, liên kết bị phân giải cho độ giảm hấp phụ ở bước sóng 300 nm trên máyquang phổ kế [9, 29]
Tiến hành: Thành phần của phản ứng được trình bày ở bảng 5 Hỗn hợp phản
ứng được trộn đều, đo ở bước sóng 300 nm trong 10 phút trên hệ thống máy quangphổ khả biến DU800 của hãng Beckman Coulter
Bảng 5 Thành phần của phản ứng hoạt tính protease HIV-1
Thành phần Thể tích (μl)
dd H2O khử ion, khử trùng 136
Cơ chất tổng hợp đặc hiệu 12Protease HIV-1 tái tổ hợp 2
Trang 26Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Phát hiện đột biến kháng thuốc PI trong gen mã hóa protease HIV-1
3.1.1 Xác định trình tự đoạn gen mã hóa protease HIV-1
Trong một nghiên cứu trước đây, Nguyễn Thị Hồng Loan và tập thể [3] đãtiến hành nhân bản đoạn gen mã hóa cho protease của HIV đã sử dụng kỹ thuậtPCR lồng với hai cặp mồi HIV Fw1/Rv1 (cặp mồi ngoài) và HIV FW2/RV2 (cặpmồi trong) Trong nghiên cứu này, các tác giả (chúng tôi là đồng tác giả) đã nhânbản thành công đoạn gen kích thước khoảng 0,34 kb mã hóa cho protease HIV từ 8trong số 50 bệnh nhân được bệnh viện xác nhận là nhiễm HIV-1 Trong số 8 mẫudương tính này chỉ có 2 bệnh nhân thuộc nhóm đã và đang điều trị thuốc khángvirus (trong đó có thuốc ức chế protease-PI) Đoạn gen cũng đã được nhóm tác giảnhân dòng và lưu giữ trong vector pCR2.1 dưới dạng pCR2.1-Prot Vì vậy chúng tôi
đã chọn vector pCR2.1-Prot mang đoạn gen của 01 bệnh nhân điều trị thuốc khángvirus ký hiệu là 02VN.HN27510cho các nghiên cứu tiếp theo
Trước hết, chúng tôi đã tiến hành giải trình tự đoạn gen thu được sau đó được
so sánh với trình tự của đoạn gen tương ứng của HIV thuộc phân nhóm CRF01_AE,
mã số EU518273 của Trung Quốc [41]
Kết quả giải trình tự (hình 4) cho thấy đoạn gen mã hóa protease HIV-1 từvector tái tổ hợp pCR2.1-Prot có độ tương đồng 96% so với đoạn gen mã hóaprotease HIV-1 phân nhóm CRF01_AE mã số EU518273 của Trung Quốc Các vịtrị có sự sai khác về trình tự nucleotide so với trình tự EU518273 trên Ngân hànggen là: A6G, A37G, A43G, T105A, A120G, G225A, A248C, T282C, T285C,C297T Trình tự gen này đã được chúng tôi đăng ký trong Ngân hàng gen quốc tếvới số hiệu HQ890881
