Nghiên cứu định lượng paraquat trong mẫu huyết tương người bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (tóm tắt)

Trong chẩn đoán và điều trị ngộ độc cấp PQ, xét nghiệm định lượng PQ trong huyết tương đóng vai trò đặc biệt quan trọng, giúp xác định mức độ nặng của ngộ độc, tiên lượng bê

ĐẶT VẤN ĐỀ

Paraquat (viết tắt của paraquaternary bipyridyl) là một

thuốc diệt cỏ hiện đang được sử dụng rộng rãi ở Việt Nam Tuy nhiên, paraquat (PQ) lại là một chất hóa học vô cùng độc với người Tại Trung tâm Chống độc bệnh viện Bạch Mai, trong những năm gần đây, số lượng bệnh nhân ngộ độc PQ không ngừng gia tăng và trở thành một vấn nạn vô cùng nghiêm trọng Tỉ lệ tử vong do ngộ độc PQ rất cao, thường khoảng 70-80%

Trong chẩn đoán và điều trị ngộ độc cấp PQ, xét nghiệm định lượng PQ trong huyết tương đóng vai trò đặc biệt quan trọng, giúp xác định mức độ nặng của ngộ độc, tiên lượng bệnh nhân cũng như đánh giá hiệu quả của các biện pháp điều trị, đặc biệt là lọc máu hấp phụ Vì vậy, chúng tôi tiến hành

nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu định lượng Paraquat trong mẫu huyết tương người bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao” với hai mục tiêu:

1 Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết tách Paraquat trong huyết tương người và phân tích bằng HPLC để định lượng paraquat.

2 Xác định giá trị sử dụng của phương pháp và áp dụng định lượng paraquat trong huyết tương bệnh nhân ngộ độc paraquat tại Trung tâm chống độc bệnh viện Bạch Mai, Hà Nội.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

Paraquat là từ viết tắt của paraquaternary bipyridyl, tên

khoa học là 1,1'-dimethyl-4,4' bipyridilium

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao xác định paraquat trong huyết tương

Có rất nhều tác giả đã sử dụng phương pháp HPLC để định lượng PQ trong dịch sinh học

Paixão P định lượng PQ trong huyết thanh và huyết tương

người được làm đơn giản và nhanh bằng phương pháp HPLC

sử dụng 1,19-diethyl-4,49- bipyridyldiylium (diethyl paraquat) làm nội chuẩn Hệ thống HPLC gồm bơm mẫu model 1100, ổn định nhiệt, detector UV-VIS Vòng bơm mẫu 50 µl, cột NovaPar C18 (150×4,6 mm, 5µm) Tiền cột C18 (100×4,6 mm, 10µm) PQ và chất nội chuẩn được rửa giải ở 25oC với tốc độ dòng 0,8 ml/phút và bước sóng hấp thụ 258 nm Pha động gồm acid 1 - octanesulphonic 3,0 mM; acid orthophosphoric 0,1 M trong 900 ml nước khử khoáng điều chỉnh pH đến 3,0 bằng diethylamine Acetonitrile nồng độ 10% (v/v)

Chen Lu và cộng sự đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng

hiệu năng cao để xác định PQ trong huyết thanh người Pha

động acetonitrile-đệm (10:90), dung dịch đệm chứa natri heptanesulfonate 0,02 M và acid phosphoric 0,26 M, điều chỉnh

pH đến 2,0 bằng triethylamine Tốc độ dòng 1,2 ml/phút, bước sóng phát hiện 256 nm, nhiệt độ cột 40oC Đường chuẩn tuyến tính với nồng độ PQ huyết thanh từ 0,1 - 40 mg/l (r = 0,9999) Giới hạn phát hiện là 0,1 mg/l (S/N = 3)

Các phương pháp xử lý mẫu huyết tương phân tích Paraquat

Một trong những yếu tố quyết định đến hiệu quả của phương pháp định lượng đó là phương pháp xử lý mẫu

Có rất nhiều nghiên cứu sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn để

xử lý mẫu sinh học trong phân tích PQ Một số tác giả dùng đệm phosphate để thêm vào mẫu thử trước khi cho qua cột chiết pha rắn

Kyoko KATO, P Paixão đều dùng acid perchloric để loại

protein Tuy nhiên, một số công trình khác sử dụng acid trichloracetic để kết tủa protein trong mẫu huyết tương rất đơn giản và cho hiệu quả cao vì vậy có thể áp dụng rộng rãi ở các đơn vị xét nghiệm

Qua tài liệu tham khảo cho thấy việc định lượng PQ trong mẫu huyết tương được thực hiện bằng phương pháp

HPLC Trong đó mẫu huyết tương được loại bỏ protein bằng cách kết tủa với TCA và định lượng trên hệ HPLC cột tách C8 dung môi pha động theo thể tích (5:95) gồm ACN – Đệm photphat pH=2,5 gồm (natri heptanesulfonate; KCl; PEG ; triethylamine; MeOH)

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Mẫu trắng: là huyết tương người của viện Huyết học và truyền máu trung ương

- Mẫu chuẩn: là mẫu trắng được thêm lượng xác định PQ tạo thành mẫu

- Mẫu thử: là huyết tương bệnh nhân ngộ độc PQ thu được từ mẫu máu, ly tâm lấy phần huyết tương

2.2 Chất chuẩn, hoá chất, thiết bị

2.2.1 Chất chuẩn

Chất chuẩn Paraquat dichloride.x-hydrate của hãng Sigma

- Aldrich độ tinh khiết 99,5%

2.2.2 Thiết bị,

- Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1200, detector mảng Diode (DAD), thư viện phổ độc chất sử dụng detector mảng Diode.Cột pha đảo Agilent C8 (150 mm x 4,6 mm; 5 µm) và cột bảo vệ C8 (20 mm x 4,0 mm, 5 μm).m)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng paraquat.

2.3.1.1 Chuẩn bị mẫu chuẩn

2.3.1.2 Phương pháp tách PQ từ huyết tương

Để đánh giá khả năng tách PQ ra khỏi nền mẫu huyết tương, các mẫu chuẩn chiết PQ trong nền mẫu được chuẩn bị bằng cách cho TCA, lắc xoáy, ly tâm, lọc rồi chạy sắc ký Dựa trên tR, AS, RSD đánh giá tính phù hợp của điều kiện đo

* Cột sắc ký: sử dụng cột pha đảo Agilent C8 (150 mm x 4,6 mm; 5 µm) và cột bảo vệ C8 (20 mm x 4,0 mm, 5 μm).m)

* Bước sóng (λ): trong khoảng 210 - 400 nm theo máy ): trong khoảng 210 - 400 nm theo máy sắc

ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1200, detector DAD

* Thể tích tiêm mẫu: thay đổi thể tích tiêm mẫu từ 10 - 50 µl

* Pha động:

- Hệ A: Kênh 1 là hỗn hợp dung dịch NaOH 0,0125M trong nước và kênh 2 là dung dịch NaOH 0,0125M trong methanol Tốc độ dòng 0,5 ml/phút Tỷ lệ thể tích 2 kênh tương ứng là 90 : 10

- Hệ B: Gồm kênh 1 là ACN kênh 2 là dung dịch đệm pH

= 3 (10:90, v/v) Thành phần đệm gồm acid 1 - octanesulphonic 3,0 mM; acid orthophosphoric 0,1 M trong 900 ml nước khử khoáng điều chỉnh pH đến 3,0 bằng diethylamine

- Hệ C: ACN – dung dịch đệm (5:95, v/v) pH = 2,5 gồm 1,1 g natri heptanesulfonate; 2 g KCl; 2 ml polyetylenglycol 400; 0,5 ml triethylamine; 200 ml MeOH thêm nước xấp xỉ

1000 ml Điều chỉnh pH bằng H3PO4 đặc Định mức vừa đủ

1000 ml bằng nước deion

* Giá trị pH pha động cũng được khảo sát trong khoảng từ 2,5 đến 4,5

* Khảo sát thành phần dung dịch đệm: nồng độ natri heptanesulfonate, KCl & polyethylenglycol

* Tốc độ dòng: thay đổi tốc độ pha động từ 0,2 - 0,8 ml/phút để xác định được tốc độ phù hợp cho một thời gian lưu tối ưu

2.3.2 Đánh giá phương pháp phân tích PQ trong huyết tương

- Tính chọn lọc

- Khoảng nồng độ tuyến tính

- Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

- Đánh giá độ đúng (độ thu hồi) và độ chụm (độ lặp lại)

- Độ ổn định

2.3.3 Phân tích PQ trong mẫu huyết tương bệnh nhân - áp

dụng thực tế tiên lượng bệnh nhân và đánh giá hiệu quả lọc máu hấp phụ

- Đối tượng nghiên cứu: 31 bệnh nhân ngộ độc PQ điều trị tại Trung tâm Chống độc bệnh viện Bạch Mai từ tháng 3 đến tháng 5 năm 2015

- Thu thập các số liệu bệnh nhân khi nhập viện từ bệnh án

- Lấy mẫu định lượng PQ huyết tương khi vào viện, trước và sau các lần lọc máu hấp phụ

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Tối ưu hóa các điều kiện chạy sắc lý lỏng hiệu năng cao

3.1.1 Xác định bước sóng phát hiện chất phân tích với detector DAD

Kết quả trên cho thấy PQ hấp thụ ánh sáng cực đại tại bước sóng 259 nm Do đó chúng tôi chọn bước sóng phát hiện chất phân tích đối với PQ là 259 nm

3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của thể tích mẫu tiêm vào cột

Kết quả cho thấy, với lượng mẫu tiêm vào cột là 30 μm).l thì cho kết quả tách tốt nhất Vì vậy, chúng tôi chọn thể tích mẫu tiêm vào cột là 30 μm).l cho các khảo sát tiếp theo

3.1.3 Khảo sát lựa chọn loại pha động

Hình 1: Sắc đồ phân tích PQ với hệ dung môi C

(ACN - dung dịch đệm tỷ lệ 5:95, v/v)

Kết quả khảo sát cho thấy sử dụng hệ pha động ACN

- đệm (5:95, v/v) pha tĩnh cột C8 là phù hợp nhất, có khả năng tách tốt và chọn lọc đối với PQ trong huyết tương, cho pic cân đối và có thời gian lưu hợp lý

3.1.4 Khảo sát thành phần pha động

- Pha động: ACN – Đệm (5:95, v/v) Đệm gồm 1,10 g natri heptanesulfonate; 2,00 g KCl; 2,00 ml polyethylenglycol 400; 0,05% triethylamine; 200 ml MeOH; thêm nước xấp xỉ 1000 ml Điều chỉnh pH đến 2,5 bằng dung dịch H3PO4 đặc Định mức vừa đủ 1000 ml bằng nước deion

- Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút

3.1.5 Đường chuẩn, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng.

Kết quả trên cho thấy, sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ PQ có sự tuyến tính trong khoảng từ 0,05 µg/ml đến

10 µg/ml Trong khoảng nồng độ này, phương trình đường chuẩn có dạng y = 0,84 + 205,06x với hệ số số tương quan R2 = 0,9999

3.2 Khảo sát phương pháp xử lý mẫu

Điều kiện xử lý mẫu PQ ra khỏi nền mẫu huyết tương khi có TCA ly tâm và lọc lấy dung dịch xác định trên hệ thống HPLC

Khảo sát độ ổn định mẫu phân tích

Nhận xét thấy, các giá trị RSD nhỏ (< 2%) chứng tỏ phương pháp này có độ tái lặp tương đối tốt và giá trị sử dụng cao, có thể ứng dụng để phân tích mẫu sau nhiều ngày kể từ khi lấy mẫu

3.3 Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp

3.3.1 Đánh giá độ chọn lọc

Hình 2: Độ chọn lọc PQ của phương pháp

Trên sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng tại vị trí tương ứng với thời gian lưu của PQ không xuất hiện pic lạ Sắc ký đồ huyết tương có PQ cân đối, sắc nét, tách riêng biệt Kết quả trên xác nhận phương pháp vừa xây dựng có tính chọn lọc tốt đối với PQ

3.3.2 Đánh giá độ đúng của phương pháp

3.3.2.1 Đánh giá độ thu hồi của phương pháp

Kết quả độ thu hồi của PQ khá cao, đạt 100,56% Vì vậy có thể kết luận rằng phương pháp xử lý mẫu này là đáng tin cậy

3.3.2.2 Đánh giá độ đúng của phương pháp phân tích

Đối với phương pháp phân tích PQ cho kết quả ttính < tbảng chứng tỏ sự sai khác giữa giá trị phân tích lại và giá trị thêm chuẩn không có ý nghĩa thống kê

3.3.2 Đánh giá độ lặp lại và tái lặp lại

3.3.2.1 Đánh giá độ lặp lại của thiết bị

Kết quả cho thấy các giá trị RSD < 3% chứng tỏ điều kiện và hệ thống sắc ký HPLC đã lựa chọn là ổn định, phù hợp để định lượng PQ

3.3.2.2 Đánh giá độ chụm (độ lệch chuẩn lặp lại và tái lặp) của phương pháp phân tích

Nhận xét thấy, các giá trị RSDR nhỏ (< 1%) chứng tỏ phương pháp này có độ tái lặp tốt và giá trị sử dụng cao, có thể ứng dụng để phân tích ở nhiều phòng thí nghiệm khác nhau

3.3.3 Độ ổn định

Độ ổn định trong thời gian phân tích

Nhận xét thấy, các giá trị RSD nhỏ (< 1%) chứng tỏ phương pháp này có độ tái lặp tốt và giá trị sử dụng cao, có thể ứng dụng để phân tích ở các thời điểm khác nhau sau khi xử lý mẫu trong vòng 5 tiếng

3.4 Phân tích mẫu PQ trong huyết tương bệnh nhân - áp dụng thực tế tiên lượng bệnh nhân và đánh giá hiệu quả lọc máu hấp phụ

31 bệnh nhân ngộ độc PQ đủ tiêu chuẩn được chọn vào nghiên cứu Trong đó 16 bệnh nhân (BN) nam (51,6%) Tuổi trung bình: 32,1  15,2 (14-63 tuổi) Hầu hết ngộ độc do tự tử (93,6%) Tỷ lệ tử vong 74,2%

Kết quả biểu diễn sự phụ thuộc nồng độ PQ trong huyết tương khi vào viện theo thời gian từ khi uống thuốc đến khi xét nghiệm (hình 3.20) cho thấy hầu hết BN đến viện trong vòng

10 giờ có nồng độ PQ cao hơn 10 g/ml đều tử vong

Hình 3: Kết quả định lượng nồng độ PQ khi vào viện ở bệnh nhân

sống và tử vong

Căn cứ vào công thức tính chỉ số độ nặng của ngộ độc PQ (hay thang điểm SIPP): SIPP=[PQ huyết tương (g/ml)]×[thời gian từ uống đến bắt đầu điều trị (h)], điểm SIPP của nhóm BN

nghiên cứu trung bình là 51,5 (thấp nhất: 1,1, cao nhất 354,6)

Chúng tôi khảo sát chi tiết hơn giá trị của thang điểm SIPP được trình bày dưới dang đường cong ROC Diện tích dưới đường cong (AUC) của SIPP là 0,886 Như vậy, điểm SIPP có giá trị tốt dùng để tiên lượng tử vong Giá trị thang điểm SIPP

= 25 có độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhất (tương ứng 0,82 và 0,88), điểm SIPP trên 40 có độ nhạy 0,73 và độ đặc hiệu đạt 100% có nghĩa BN có điểm SIPP trên 40 đều tử vong

Hình 4: Thang điểm SIPP tiên lượng tử vong

KẾT LUẬN

1 Đã xây dượng được quy trình phân tích PQ trong mẫu huyết tương

- Tối ưu hóa các điều kiện để tách PQ và xá định bằng phương pháp HPLC, detetor DAD (λ): trong khoảng 210 - 400 nm theo máy =259 nm) Các điều kiện tối ưu bao gồm: cột pha đảo Agilent C8 ((150 mm x 4,6 mm; 5 µm) và cột bảo vệ C8 (20 mm x 4,0 mm, 5 μm).m) Pha động đệm photphat pH = 2,5 theo thể tích (5:95) gồm ACN – Đệm gồm (natri heptanesulfonate; KCl; polyethylenglycol; triethylamine; MeOH)

- Điều kiện xử lý mẫu PQ ra khỏi nền mẫu huyết tương khi có TCA ly tâm và lọc lấy dung dịch xác định trên hệ thống HPLC

2 Phương pháp phân tích PQ trên nền mẫu huyết tương thu được phương trình đường chuẩn trong khoảng nồng độ từ 0,040 - 10 µg/ml y = (0.84±0.32) + (205.06 ± 0.08) x có LOD = 0,013 µg/ml; LOQ = 0,040 µg/ml và

hệ số tương quan R2 = 0.9999 Độ lặp lại của thiết bị và phương pháp phân tích (RSD đều nhỏ hơn 3%) và độ tái lặp lại (RSDR nhỏ hơn 1%); độ ổn định trong thời gian

phân tích và độ ổn định trong thời gian bảo quản (RSD đều nhỏ hơn 2%); tính tuyến tính (giá trị R2 = 0,9999); độ thu hồi (hiệu suất thu hồi của PQ trung bình 100,56%)

3 Phương pháp định lượng PQ xây dựng được đã được

áp dụng để định lượng PQ trong mẫu huyết tương trên

31 bệnh nhân ngộ độc cấp tại Trung tâm Chống độc – Bệnh viện Bạch Mai, cho thấy giá trị của nồng độ PQ lúc BN vào viện , trước và sau lọc hấp phụ có giá trị trong việc tiên lượng tử vong và cung cấp công cụ rất hữu ích để đánh giá hiệu quả của lọc máu hấp phụ