Nghiên Cứu Phương Pháp Nhân Nhanh Giống Xoan Đào Bằng Phương Pháp In Vitro Phục Vụ Chuyển Gen

Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi cây Xoan Đào ..... Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường tới khả năng tái sinh chồi nách ở

BÁO CÁO KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

Thái Nguyên, năm 2013

Phần 1 MỞ ĐẦU 2

1.1 Đặt vấn đề 3

1.2 Mục tiêu 4

1.3 Nội dung 4

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

2.1 Giới thiệu chung cây Xoan Đào 5

2.1.1 Đặc điểm hình thái 5

2.1.2 Phân bố địa lý 5

2.1.3 Giá trị kinh tế 5

2.2 Phương pháp nhân giống cây xoan đào 5

2.2.1 Phương pháp nhân giống hữu tính 5

2.2.2 Phương pháp nhân giống vô tính (phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật) 7

2.3 Tình hình nghiên cứu cây Xoan đào trên Thế Giới và Trong nước 14

2.3.1 Tình hình nghiên cứu cây Xoan Đào trên Thế giới 14

Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

3.1 Đối tượng, vật liệu và phạm vi nghiên cứu 16

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu 16

3.3 Điều kiện nuôi cấy 16

3.4 Hóa chất và thiết bị 16

3.4.1 Hóa chất 16

3.4.2 Thiết bị 16

3.5 Nội dung nghiên cứu 17

3.6 Phương pháp nghiên cứu 17

3.6.1 Chuẩn bị các yếu tố thí nghiệm 17

3.6.2 Phương pháp nghiên cứu nội dung 1 tạo vật liệu vô trùng 18

3.6.3 Phương pháp nghiên cứu nội dung 3 – Nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh 21

4.2 Nội dung 2: 25

4.2.1 Ảnh hưởng của một số loại môi trường (MS, B5, WPM ) tới khả năng tái sinh chồi cây Xoan Đào (sau 60 ngày nuôi cấy) 25

4.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi cây Xoan Đào 26

4.3 Nội dung 3: 30

Phần 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 31

5.1 Kết luận 31

5.2 Đề nghị 31

TÀI LIỆU THAM KHẢO 32

PHỤ LỤC 1

2,4-D : 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid

NAA : α-Naphlene axetic acid

BAP : 6-Benzylaminopurine

Kinetin : 6-Furfurylaminopurine

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của chất khử trùng đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy

(sau 10 ngày nuôi cấy) 24 Bảng 4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường tới khả

năng tái sinh chồi nách ở cây Xoan Đào (sau 50 ngày nuôi cấy) 25 Bảng 4.3 Ảnh hưởng của hàm lượng Kinetine đến khả năng nhân nhanh

chồi Xoan Đào (sau 60 ngày nuôi cấy) 27 Bảng 4.4 Ảnh hưởng của hàm lượng BA đến khả năng nhân nhanh chồi

Xoan Đào (sau 60 ngày nuôi cấy) 28 Bảng 4.5 Ảnh hưởng của nồng độ BA, Kinetine kết hợp với NAA tới khả

năng nhân nhanh chồi Xoan Đào tái sinh từ chồi (sau 60 ngày

nuôi cấy) 29 Bảng 4.6 Ảnh hưởng của hàm lượng NAA đến khả năng ra rễ của Chồi

Xoan Đào (sau 30 ngày nuôi cấy) 30

TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ

- Tên đề tài: “Nghiên cứu phương pháp nhân nhanh giống xoan đào bằng phương pháp in vitro phục vụ chuyển gen”

- Mã số: T2012 – 01

- Chủ nhiệm đề tài: ThS Nguyễn Thị Tình

- Tel 0985782815 E-mail: nguyentinhdhnl@yahoo.com.vn

- Cơ quan chủ trì đề tài: Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

- Cơ quan và cá nhân phối hợp thực hiện: Khoa CNSH & CNTP – Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

- Thời gian thực hiện : Từ 2/2012 – 2/2013

- Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến khả năng tái sinh cây Xoan Đào

- Ảnh hưởng của nồng độ BA, Kinetine, đến khả năng nhân nhanh cây Xoan Đào

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ auxin đến khả năng ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh cây Xoan Đào

3 Kết quả chính đạt được (Khoa học, ứng dụng, đào tạo, kinh tế - xã hội,…)

- Sản phẩm khoa học: 1 báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học

- Sản phẩm ứng dụng: quy trình tái sinh chồi cây Xoan Đào bằng phương pháp in vitro

SUMMARY OF RESULTS TOPICS SCIENCE AND TECHNOLOGY BASE

- Title:“Micropropagation of Melia azedarach Linn for gene transformation”

- Codes: T2012 – 01

- Producer: Nguyen Thi Tinh

- Tel 0985782815 E-mail: nguyentinhdhnl@yahoo.com.vn

- Implementing Institution: Thai Nguyen University of Agriculture and Forestry (TUAF)

- Institutional and personalcoordinated Execution: Biotechnology anh food technologyfaculty - Thai nguyen University of agriculture and and Forestry (TUAF)

- Research effect of media culture onregenerateMelia azedarach Linn

- Effect of BA, Kinetine on micropropagation of Melia azedarach Linn

- Research effect of Auxin on rooting, product completeMelia azedarach Linn

plants

- Scientific outcomes: 1 scientific research report

- Applied outcomes: The process of shoot regeneration of Melia azedarach

Linn by in vitro method

Phần 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Xoan Đào có tên khoa học là Melia azedarach Linn là một loài thực vật thuộc họ Xoan (Meliaceae) phân bố chủ yếu ở Việt Nam, Lào, Campuchia Riêng ở

Việt Nam dọc theo từ Bắc vào Nam hầu như tỉnh nào cũng có sự phân bố của cây Xoan Đào, chúng mọc tự nhiên hoặc được trồng Đây là loài cây thân gỗ có kích thước lớn có thể cao đến 30m đường kính gần 100cm Gỗ Xoan Đào có lõi màu hồng hay nâu nhạt, dác xám trắng; gỗ nhẹ mềm tỷ trọng 0.565, lực kéo ngang thớ 22kg/cm2, nén dọc thớ 339kg/cm2 Gỗ xoan sau khi ngâm khá bền khó bị mối mọt, cho nên gỗ xoan thường dùng làm xây dựng, trang trí nội thất và điêu khắc Ngoài

ra lá, rễ xoan còn dùng làm phân xanh, thuốc sát trùng, hạt có thể ép dầu và chữa một số bệnh, ta có thể trồng xoan để che bóng và phòng hộ

Xoan ta là loài cây ưa sáng, ưa khí hậu nóng ẩm, sinh trưởng và phát triển mạnh trên nhiều vùng đất khác nhau từ đất chua đến đất kiềm hoặc hơi mặn, trồng sau khoảng 5-6 năm là có thể thu hoạch và nếu trồng lấy gỗ lớn thì kéo dài từ 8-10 năm Đặc biệt cây Xoan có khả năng tái sinh (mọc lại từ gốc cũ đã thu hoạch cây) từ 3-4 lần

Với đặc điểm sinh học như trên cũng như giá trị sử dụng về nhiều mặt nên xoan là loài cây trồng lâm nghiệp có nhiều tiềm năng phát triển rộng rãi Do đặc

điểm khí hậu, thổ nhưỡng ở nước ta rất phù hợp cho quá trình sinh trưởng và phát

triển của cây xoan, điều đó được thể hiện qua diện tích trồng xoan hàng năm ngày càng tăng Mặt khác do nhu cầu thị trường gỗ xoan rất lớn, cũng như giá trị kinh tế cao hơn nhiều so với gỗ cây bạch đàn Chính vì thế mà cây xoan có nhiều tiềm năng phát triển rộng khắp trong nước Khi diện tích trồng xoan tăng đồng nghĩa với việc tăng nguồn giống ban đầu Do vậy nhu cầu giống Xoan Đào rất lớn nhưng hiện nay nguồn cung cấp giống chủ yếu bằng phương pháp truyền thống như gieo hạt, hom,

rễ nên khả năng cung cấp giống với số lượng lớn đúng mùa vụ trồng rừng gặp nhiều khó khăn Mặt khác do phương pháp nhân giống bằng hạt còn có nhiều nhược điểm khác như:

- Cây sinh trưởng và phát triển không đồng đều do có sự phân ly trong di truyền

- Khả năng kháng bệnh của cây thấp

Để khắc phục những hạn chế trên, trong thời gian qua chúng tôi đã nghiên

cứu kỹ thuật nhân giống in vitro cây xoan bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào nhằm giải quyết những khó khăn trên đồng thời là tiền đề cho những nghiên cứu chuyển gen tăng trưởng GA20 vào cây Xoan Đào nhằm bảo đảm đặc tính di truyền,

ít thoái hóa, sinh trưởng và phát triển nhanh, cây có độ đồng đều cao, đảm bảo lượng lớn cây giống trồng đúng thời vụ

Có thể nói đây là bước đột phá quan trọng nhằm giải quyết những khó khăn

về giống, đồng thời sản xuất, cung ứng nguồn giống cho các đơn vị trồng rừng kinh

tế, phát triển rừng nguyên liệu, đảm bảo tiêu chuẩn chất lượng, nâng cao năng suất cây trồng trên địa bàn tỉnh ta cũng như các tỉnh lân cận

Chính vì những lí do trên mà chúng tôi nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu phương pháp nhân nhanh giống xoan đào bằng phương pháp in vitro phục vụ chuyển gen”

1.2 Mục tiêu

Xác định được môi trường tái sinh, môi trường nhân nhanh, ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của cây Xoan đào phục vụ các nghiên cứu chuyển gen tăng trưởng GA20 cho các thí nghiệm tiếp theo

1.3 Nội dung

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùng, thành phần chất khử trùng đến tỷ lệ mẫu sạch bệnh nấm và vi khuẩn

- Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến khả năng tái sinh cây Xoan Đào

- Ảnh hưởng của nồng độ BA, Kinetine, đến khả năng nhân nhanh cây Xoan Đào

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ auxin đến khả năng ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh cây Xoan Đào

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung cây Xoan Đào

- Cụm hoa hình chùy mọc ở nách lá, hoa đều, lưỡng tính

- Quả hạch, vỏ ngoài nạc, vỏ trong hóa gỗ, quả có 4 – 5 ô, mỗi ô chứa 1 hạt [8]

2.2 Phương pháp nhân giống cây xoan đào

2.2.1 Phương pháp nhân giống hữu tính

2.2.1.1 Làm đất gieo

- Chọn đất cát pha nhẹ, mịn, kích thước hạt dưới 2 mm, mặt luống rộng 1m,

gờ luống cao 15 – 20 cm, chân luống rộng 1,2m Sau khi san phẳng mặt luống, tưới nước cho đất đủ ẩm để gieo hạt Khử trùng đất trước khi gieo hạt 1 ngày bằng Benlat (6g Benlat hòa tan trong 10 lít nước phun đều cho 100 m2 để phun lên đất [8]

2.2.1.2 Xử lý hạt giống

Hạt giống trước khi gieo được ngâm trong thuốc tím (KMnO4) nồng độ 0,05% trong 10 phút, sau đó vớt ra rửa sạch và ngâm hạt vào nước ấm 45oC trong 8 giờ, sau đó cho hạt xuống hố, phủ đất lên trên một lớp dày 10cm rồi chất rơm hoặc

cỏ khô lên trên và đốt sau đó tưới nước giữ ẩm, khi hạt nứt nanh đem gieo [8]

2.2.1.3 Chuẩn bị bầu đất

Dùng túi bầu PE 10 x 15 cm đựng hỗn hợp ruột bầu, thành phần ruột bầu gồm 80% đất tầng AB + 20% phân hữu cơ đã hoai (phân chuồng, phân xanh, phân rác) Đất làm ruột bầu được đập sàn nhỏ trộn đều với phân và tiến hành đóng bầu Bầu đất đóng xong được xếp đứng, thẳng hàng theo từng luống có chiều rộng 0,8 –

1 m, chiều dài tùy ý, khoảng cách giữa 2 luống là 0,4 m [8]

2.2.1.4 Gieo hạt

Gieo hạt vào bầu đất đã được chuẩn bị sẵn, gieo vào mỗi bầu 1 hạt, sau đó lấp một lớp đất mịn vừa kín hạt Mỗi hạt sau này có thể mọc lên 3 – 4 cây do vậy phải tỉa bớt, mỗi bầu chỉ để lại 1 cây tốt nhất, có thể chọn những cấy tốt cấy vào những bầu hạt không mọc, chỉ cấy cây khi còn nhỏ (khoảng 2 tháng tuổi), cây cao dưới 15 cm

Hoặc gieo hạt trên luống, khi cây mạ đạt chiều cao từ 10 – 15 cm thì nhổ cấy vào bầu [8]

2.2.1.5 Chăm sóc cây con

Luôn đảm bảo cho cây đủ ẩm trong 03 tháng đầu, mỗi ngày tưới 3 – 4 lít/m2/1 lần, 15 ngày làm cỏ phá váng 1 lần và tưới nước phân chuồng hoai hoặc phân NPK pha loãng 1% Nếu cây bị vàng còi hoặc bạc lá dùng sulphát đạm và supe lân để tưới cho cây, pha nồng độ 0,1% - 0,2% tưới 2,5 lít/m2 hai ngày tưới 1 lần, sau khi tưới nước phân phải tưới rửa sạch bằng nước lã

Phòng trừ bệnh thối cổ rễ cho cây con bằng dung dịch Booc đo 1% họăc thuốc Benlate (1g/1lít) phun đều trên mặt luống Nếu bệnh xuất hiện pha nồng độ 6g/10 lít nước phun cho 100 m2, tuần hai lần, phun liên tục trong 2 – 3 tuần

Thời gian nuôi cây trong vườn ươm từ 3 - 4 tháng, cây có chiều cao 35 - 40

cm, đường kính cổ rễ 3,5 – 4,0 mm thì đem xuất vườn

2.2.1.6 Phòng trừ sâu bệnh

Cây con ở giai đoạn vườn ươm phải được thường xuyên chăm sóc, làm sạch

cỏ để tránh sâu, bệnh gây hại Để ngăn ngừa nấm hại, dùng Boocđo nồng độ 1% phun đều lên trên mặt lá với liều lượng phun 1 lít/4m2, 2 tuần/1 lần

Khi phát hiện nấm bệnh thì tưới dung dịch boocđo 1% hay COC 85 liều lượng 25 gram/1 - 2 bình 8 lít, phun sương đều trên mặt lá với liều lượng phun 1 lít/4m2, 10 – 15 ngày phun 1 lần, liên tục 2 – 3 lần liền Nếu sâu ăn lá hoặc một số côn trùng khác có thể dùng Bassa 50ND pha 1/400 – 1/600 hoặc dùng Methyl parathion 0,1% để phun Nên phun thuốc vào buổi chiều Sau khi phun thuốc 2 – 3 giờ thì tưới lại bằng nước sạch [8]

2.2.2 Phương pháp nhân giống vô tính (phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật)

2.2.2.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật (in vitro)

- Tính toàn năng (Totipotence ) của tế bào

Nguyên lí cơ bản của nhân giống nuôi cấy mô tế bào là tính toàn năng của tế bào thực vật Mỗi tế bào bất kì của cơ thể thực vật đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đầy đủ của hệ gen (genome) của thực vật đó Kiểu hình là kết quả tương tác giữa kiểu gen và môi trường Do đó, khi gặp điều kiện thuân lợi

cơ quan, mô, tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thể mới hoàn chỉnh mang những đặc tính di truyền giống như cây mẹ [3]

- Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào

Cơ thể thực vật hình thành là một chính thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử) Ở giai đoạn

đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang

chức năng riêng biệt (chuyên hóa) Sau đó, từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau

Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hóa, đảm bảo các chức năng khác nhau Quá trình phân hóa tế bào có thể biểu thị:

Tế bào phôi sinh → Tế bào dãn → Tế bào phân hoá có chức năng riêng biệt Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào, ngược lại với sự phân hóa tế bào

phân hóa tế bào

tế bào phôi sinh tế bào dãn tế bào chuyên hóa

phản phân hóa tế bào

Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa, ức chế các gen Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen được hoạt hóa (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ta tính trạng mới, còn một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử DNA của mỗi tế bào khiến cho quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn

được hài hòa

Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của khối mô sẽ tạo điều kiện cho sự hoạt hóa các gen của tế bào [4]

- Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật

Môi trường nuôi cấy là điều kiện tối cần thiết, yếu tố quyết định cho sự phân hoá tế bào và cơ quan nuôi cấy

a Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật

Điều kiện vô trùng

Nuôi cấy invitro là nuôi cấy trong điều kiện vô trùng Nếu không đảm bảo điều

kiện vô trùng mẫu nuôi cấy, môi trường hoặc thao tác nuôi cấy sẽ bị nhiễm Điều kiện vô

trùng có ý nghĩa quyết định đến sự thành bại của nuôi cấy mô in vitro [1]

Phương pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hoá học, đèn tím có khả năng diệt nấm và vi khuẩn

Vô trùng ban đầu là một thao tác khó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa quyết

định Việc lựa chọn chất khử trùng, thời gian khử trùng, nồng độ chất khử trùng

thích hợp sẽ mang lại hiệu quả vô trùng mẫu tốt, tỷ lệ sống cao Thông thường hay

sử dụng một số hoá chất như: HgCl2 0,1%, nước Clolox, cồn 700, Ca(ClO)2…để khử trùng

Điều kiện ánh sáng và nhiệt độ

- Ánh sáng

Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy chịu ảnh hưởng từ các yếu tố như: Thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng Thời gian chiếu sáng tác động đến quá trình phát triển của mô nuôi cấy Thời gian chiếu sáng thích hợp với đa số các loài cây là 12-18 h/ngày [1]

Cường độ ánh sáng tác động đến sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy Theo Ammirato (1986): Cường độ ánh sáng cao kích thích sự sinh trưởng của mô sẹo Ngược lại, cường độ ánh sáng thấp kích thích sự tạo chồi Nhìn chung cường độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là 1000-7000 lux, ngoài ra chất lượng

ánh sáng cũng ảnh hưởng tới sự phát sinh hình thái của mô thực vật in vitro: Ánh

sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng trắng Nếu mô nuôi cấy trong ánh sáng xanh thì sẽ ức chế vươn cao nhưng lại có ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của mô sẹo Hiện nay trong các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô để cung cấp nguồn ánh sáng có cường độ 2000-2500 lux người ta sử dụng các đèn huỳnh quang đặt cách bình nuôi cấy từ 35-40cm

- Nhiệt độ

Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan trọng ảnh hưởng tới sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hoá trong cây Tuỳ thuộc vào xuất xứ của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp Nhìn chung nhiệt độ thích hợp nhất cho sự sinh trưởng tốt ở nhiều loài cây là 25±20C

b Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật

Môi trường dinh dưỡng phải có đầy đủ các chất dinh dưỡng, các chất cần thiết cho sự phân chia, phân hoá tế bào cũng như sự sinh trưởng bình thường của cây

Thành phần hoá học của môi trường đóng vai trò quyết định đến sự thành công hay thất bại của nuôi cấy tế bào và mô thực vật Mỗi một loại vật liệu khác nhau có những đòi hỏi khác nhau về thành phần môi trường, khi bắt đầu nghiên cứu

một số loài mới hoặc giống mới cần phải chọn lựa cho đối tượng nghiên cứu một loại môi trường cơ bản phù hợp

Từ những năm 1933, Tukey đã nghiên cứu tạo ra môi trường nuôi cấy thực vật, cho đến nay đã có rất nhiều loại môi trường khác nhau được sử dụng cho mục

đích này, trong đó có một số môi trường cơ bản được sử dụng rất phổ biến như MS,

+ Các vitamin và amino acid

+ Chất bổ sung, chất làm thay đổi trạng thái môi trường

+ Các chất điều hoà sinh trưởng

Các muối khoáng đa lượng và vi lượng

Đối với cây trồng, các chất khoáng đa và vi lượng đóng vai trò rất quan

trọng Ví dụ Mg là một phần của phân tử diệp lục, Ca cấu tạo màng tế bào, nitơ là thành phần quan trọng của vitamin, amino acid và protein Ngoài ra, các nguyên tố

vi lượng như Fe, Zn, Mo, Mn là thành phần của một số enzym cần thiết cho hoạt

Nguồn cacbon

Khi nuôi cấy in vitro, các tế bào thực vật thường không có khả năng quang

hợp, do đó đòi hỏi phải cung cấp nguồn cacbon cho các hoạt động dinh dưỡng của

tế bào

Nguồn cacbon được ưa chuộng nhất hiện nay trong nuôi cấy là đường saccarose, một số trường hợp sử dụng glucose và fructose thay thế cho saccarose nhưng chúng thường nghèo hydrat cacbon so với nhu cầu của thực vật

Ngoài ra, khi khử trùng môi trường, cần chú ý không nên kéo dài thời gian

để tránh xảy ra hiện tượng caramen hoá, làm cho môi trường chuyển sang màu vàng

dẫn đến ức chế sự sinh trưởng và phát triển của tế bào [3]

Các vitamin và axit amin

Ảnh hưởng của các vitamin đến sự phát triển của tế bào nuôi cấy invitro ở

các loài khác nhau là khác nhau

Hầu hết tế bào nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp tất cả các loại vitamin

cơ bản nhưng với số lượng dưới mức yêu cầu Để mô có thể sinh trưởng, tốt nhất phải bổ sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại vitamin và amino acid Trong các loại vitamin, B1 được xem là vitamin quan trọng nhất cho sự phát triển của thực vật Axit nicotinic (B3) và pyridoxin (B6) cũng có thể được

bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm tăng cường sức sống cho mô [3]

Các chất bổ sung

- Nước dừa

Công bố đầu tiên về sử dụng nước dừa trong nuôi cấy mô thuộc về Van Overbeek Sau đó tác dụng tích cực của nước dừa trong môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được nhiều tác giả ghi nhận Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng và chất kích thích sinh trưởng [2] Nước dừa đã

được sử dụng để kích thích phân hoá và nhân nhanh chồi ở nhiều loại cây Nước

dừa thường được lấy từ quả dừa để sử dụng tươi hoặc sau bảo quản Thông thường nước dừa thường được xử lý để loại trừ các protein, sau đó được lọc qua màng lọc

để khử trùng trước khi bảo quản lạnh Protein trong nước dừa không gây ảnh hưởng đến sinh trưởng của mô hoặc tế bào nuôi cấy, nhưng sẽ dẫn đến kết tủa dung dịch

khi bảo quản lạnh Chất cặn có thể được lọc hoặc để lắng dưới bình rồi gạn bỏ phần cặn Nước dừa thường sử dụng với hàm lượng 5-20% thể tích môi trường, kích

thích phân hoá và nhân nhanh chồi [5]

- Dịch chiết nấm men

Có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và phát triển của mô và tế bào Dịch chiết nấm men là chế phẩm thường dùng trong nuôi cấy vi sinh vật, mô tế bào động vật với hàm lượng thích hợp

Ngoài ra, có thể sử dụng dịch thuỷ phân casein hydrolyase (0,1-1%) hoặc bột chuối với hàm lượng 40g bột khô trong 100g/l (xanh) nhằm tăng cường sự phát triển của mô sẹo hay cơ quan nuôi cấy [5]

Các chất điều tiết sinh trưởng

Các chất điều tiết sinh trưởng gồm chất kích thích và ức chế Trong nhân giống cây trồng, người ta thường sử dụng chất kích thích sinh trưởng để kích thích

sự phát sinh cơ quan

- Auxin

Chất auxin tự nhiên được tìm thấy nhiều ở thực vật là indol axetic acid (IAA) IAA có tác dụng kích thích sinh trưởng kéo dài tế bào và điều khiển sự hình thành rễ Ngoài IAA, còn có các dẫn xuất của nó là napthyl axetic acid (NAA) và 2,4-dichlorophenoxy acetic acid (2,4 D) Các chất này cũng đóng vai trò quan trọng trong sự phân chia của mô và trong quá trình hình thành rễ NAA được Went và Thimann (1937) phát hiện, chất này có tác dụng tăng hô hấp của tế bào và mô nuôi cấy, tăng hoạt tính enzym và ảnh hưởng mạnh đến trao đổi chất của nitơ, tăng khả năng tiếp nhận và sử dụng đường trong môi trường NAA là auxin nhân tạo, có hoạt tính mạnh hơn auxin tự nhiên IAA, NAA có vai trò quan trọng đối với phân chia tế bào và tạo rễ Kết quả nghiên cứu của Butenko (1964) cho thấy NAA tác động ở mức độ phân tử trong tế bào theo ba cơ chế đó là cơ chế thứ nhất: NAA gắn với phân tử enzym và kích thích enzym hoạt động Sarkissian đã phát hiện tác dụng của auxin kích thích hoạt tính của ATPase, cơ chế thứ hai: Auxin tác động vào gen và các enzym phân giải acid nucleic, cơ chế thứ ba: Auxin tác động thông qua sự thay

đổi tính thẩm thấu của màng Dùng phương pháp đánh dấu phân tử có thể thấy

NAA dính kết vào màng tế bào làm cho màng hoạt động như một bơm proton và bơm ra ngoài ion H+ làm màng tế bào mềm và kéo dài ra, do đó tế bào lớn lên và sinh trưởng Trong tế bào, NAA có tác dụng lên sự tổng hợp acid nucleic

Trong cây auxin được tổng hợp ở các mô non đặc biệt là lá đang phát triển

và vùng đỉnh chồi Từ những vùng này auxin được chuyển xuống các phần phía dưới của cây [5]

Những nghiên cứu của Miller và Skoog (1963) đã cho thấy không phải các chất kích thích sinh trưởng ngoại sinh tác dụng độc lập với hoocmon sinh trưởng nội sinh Phân chia tế bào, phân hoá và biệt hoá được điều khiển bằng sự tác động tương

hỗ giữa các hoocmon ngoại sinh và nội sinh Tác động phối hợp của auxin và cytokinin có tác dụng quyết định đến sự phát triển và phát sinh hình thái của tế bào và

mô Những nghiên cứu của Skoog cho thấy tỷ lệ auxin/cytokinin cao thì thích hợp cho sự hình thành rễ, và thấp thì thích hợp cho quá trình phát sinh chồi Nếu tỷ lệ này

ở mức độ cân bằng thì thuận lợi cho phát triển mô sẹo (callus) Das (1958) và Nitsch

(1968) khẳng định rằng chỉ khi tác dụng đồng thời của auxin và cytokinin thì mới kích thích mạnh mẽ sự tổng hợp DNA, dẫn đến quá trình mitos và cảm ứng cho sự phân chia tế bào Theo Dmitrieva (1972) giai đoạn đầu của quá trình phân bào được cảm ứng bởi auxin còn giai đoạn tiếp theo thì cần tác động tổng hợp của cả hai chất

kích thích Skoog và Miller (1957) đã khẳng định vai trò của cytokinin trong quá trình phân chia tế bào cụ thể là cytokinin điều khiển quá trình chuyển pha trong mitos

và giữ cho quá trình này diễn ra một cách bình thường Cytokinin được tổng hợp bởi

rễ và hạt đang phát triển [3]

- Gibberellin

Gibberellin được phát hiện đầu tiên bởi nhà nghiên cứu người nhật Kurosawa (1920) khi nghiên cứu bệnh ở mạ lúa do nấm Gibberella Fujikuroi gây ra Năm 1939 đã tách chiết được gibberellin từ nấm G Fujikuroi và được gọi là gibberellin A Gibberellin có tác dụng kéo dài tế bào, nhất là thân và lá vì vậy khi

xử lý với các cây đột biến lùn và các cây này có thể khôi phục lại bình thường Về sau, các nghiên cứu khám phá ra là trong cơ thể thực vật cũng có các chất giống như Gibberellin cả về cấu tạo và tác dụng Những chất này đặt tên theo thứ tự là A1, A2, A3, A4 Do gibberellin tồn tại trong thực vật, nó tham gia vào các quá trình sinh trưởng và phát triển trong sự tương tác với các chất điều hoà sinh trưởng khác

Trong cây gibberellin được tổng hợp ở lá đang phát triển, quả và rễ sau đó

được vận chuyển đi khắp nơi trong cây và có nhiều trong phloem và xylem [3]

2.3 Tình hình nghiên cứu cây Xoan đào trên Thế Giới và Trong nước

2.3.1 Tình hình nghiên cứu cây Xoan đào trên Thế giới

Xoan Đào là một loại gỗ được đánh giá cao do gỗ có đường kính khá to, độ cứng cao hơn Xoan thường Gỗ Xoan đào thường được sử dụng đóng sàn gỗ, đóng tàu, làm đồ nội thất và xây dựng Xoan đào được trồng tự nhiên ở Ấn Độ, Myanmar, Thái Lan và Lào Tuy nhiên, do nhu cầu thị trường ngày càng tăng, khai thác ồ ạt vì vậy Xoan đào đang nhanh chóng cạn kiệt Ở Thái Lan, gỗ Xoan đào rừng tự nhiên đã giảm từ 2,3 triệu ha vào năm 1954 khoảng 150.000 ha vào năm

2000 [6] Nhu cầu sử dụng gỗ Xoan đào ngày càng tăng ở các nước như: ở châu Á (Indonesia, Malaysia) Châu Phi (Bờ Biển Ngà,Congo, Nigeria), và Mỹ Latinh (Brazil, Costa Rica,Panama và Honduras) Nhu câu sử dụng gỗ Xoan đào ước tính 75% gỗ cứng nhiệt đới của thế giới [7] Thiết lập rừng trồng Xoan sử dụng hạt giống không còn là lựa chọn do một số vấn đề như tăng trưởng giữa các cá thể không đồng đều (Kaosa-ARD et al., 1998) Theo Monteuuis và Goh thì với phương

pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật tạo ra một số lượng cây lớn, giống nhau, giống với cây mẹ tạo ra nó Bằng phương pháp nhân giống vô tính dòng vô tính vật liệu trồng được lựa chọn cho năng suất cao và nâng cao chất lượng

gỗ [7] Trung tâm Lâm nghiệp, Tawau, Sabah Nodal tiến hành nhân giống từ tám dòng xoan bằng phương pháp vô tính đã thu được hàng loạt cây con bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật [8]

2.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam việc nhân giống cây Xoan bằng phương pháp nuôi cấy mô tế

bào thực vật được thực hiện tại phòng công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ Sinh học phục vụ công tác chuyển gen GA20 vào cây Xoan phục vụ tăng trưởng tuy nhiên Việc nghiên cứu nhân giống cây Xoan đào đến nay vẫn chưa được tiến hành, tìm ra môi trường thích hợp phục vụ công tác chuyển gen

Phần 3

ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng, vật liệu và phạm vi nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: Cây Xoan Đào

- Vật liệu nghiên cứu: Đỉnh Sinh trưởng, đoạn cành bánh tẻ

- Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu khả năng tái sinh chồi từ đỉnh sinh trưởng,

nhân nhanh và ra rễ, của cây Xoan Đào, bằng phương pháp nuôi cấy in vitro

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu

Địa điểm: Phòng nuôi cấy mô tế bào thực vật và nhà lưới - Khoa CNSH &

CNTP - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 03/2012 đến 2/2013

3.3 Điều kiện nuôi cấy

Các thí nghiệm nuôi cấy trong phòng được duy trì trong điều kiện:

- Cân phân tích 10-4, cân kỹ thuật 10-2

- Bếp ga

- Lò vi sóng

- Tủ sấy

- Nồi hấp vô trùng

- Box cấy vô trùng

3.5 Nội dung nghiên cứu

- Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất khử trùng, nồng độ chất khử

trùng, thời gian khủ trùng đến khả năng tạo mô sạch nấm, vi khuẩn cây Xoan Đào

- Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại môi trường, chất kích

thích sinh trưởng đến khả năng tái sinh, nhân nhanh, của cây Xoan Đào

- Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất kích thích sinh trưởng

đến khả năng ra rễ ở cây Xoan Đào

3.6 Phương pháp nghiên cứu

3.6.1 Chuẩn bị các yếu tố thí nghiệm

- Chuẩn bị môi trường nuôi cấy in vitro

- Sử dụng môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) bổ sung agar 7 g/l +

đường 30 g/l + THT 2 g/l )- Bình nuôi cấy sử dụng là bình trụ 250 ml

- Các chất kích thích sinh trưởng sử dụng thuộc nhóm auxin và cytokinin bổ sung vào môi trường nuôi cấy với hàm lượng khác nhau tùy từng thí nghiệm

- Giá trị pH của môi trường nuôi cấy trước khi khử trùng nằm trong khoảng 5,8 - 6,0

- Thể tích môi trường nuôi cấy trong mỗi bình nuôi cấy là 50-70 ml/bình

- Môi trường được hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C, áp suất 1,0 atm trong 20 phút

– Áp dụng các điều kiện phòng thí nghiệm, thao tác phòng thí nghiệm

+ Điều kiện ánh sáng

Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy phụ thuộc rất nhiều vào các yếu tố như: Thời gian chiếu sáng, cường độ chiếu sáng, chất lượng ánh sáng Thời gian chiếu sáng có vai trò quan trọng trong quá trình phát triển của mô nuôi cấy, với đa

số các loài cây thời gian chiếu sáng thích hợp là từ 12-18 giờ/ngày

Cường độ chiếu sáng tác động đến sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, theo Ammirato (1986): Cường độ ánh sáng thích hợp cho nuôi cấy mô là từ 2000 -

2500 lux, ngoài ra chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng đến sự phát sinh hình thái

của mô thực vật in vitro: Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so với

ánh sáng trắng, ánh sáng xanh ức chế vươn cao nhưng lại có ảnh hưởng tốt đến sự sinh trưởng của mô sẹo

Để cung cấp nguồn ánh sáng có cường độ 2000-2500 lux người ta sử dụng

các giàn đèn huỳnh quang đặt cách bình nuôi cấy từ 35 - 40cm

+ Nhiệt độ

Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan trọng ảnh hưởng

đến sự sinh trưởng, phát triển của các tế bào, mô cây Tùy thuộc vào xuất xứ của

mẫu nuôi cấy ta cần điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng tốt ở nhiều loại cây là 25oC ± 2oC

- Áp dụng phương pháp lấy mẫu

Lựa chọn mẫu cây Xoan Đào không bị nhiễm nấm và vi khuẩn, tiến hành lấy đỉnh sinh trưởng mang về phòng thí nghiệm Khi lấy mẫu tránh dập nát, tránh để mẫu bị mất nước bằng cách cho vào túi nilon bọc kín lại hoạc bổ sung một lượng nước sạch vào bình đựng mẫu hoặc vào túi nilon rồi buộc hoặc đậy nắp bình lại

3.6.2 Phương pháp nghiên cứu nội dung 1 tạo vật liệu vô trùng

Vấn đề chọn nguyên liệu ban đầu cho nhân giống là rất quan trọng, nó không những quyết định sự thành công ban đầu mà cả quá trình nhân giống tiếp theo Trên một cây có thể lấy nhiều bộ phận khác nhau để nuôi cấy, vì thế kỹ thuật nuôi cấy cũng khá đa dạng Tùy theo mục đích và khả năng ứng dụng mà người ta có thể lựa chọn phương pháp nuôi cấy thích hợp

Theo Nguyễn Quang Thạch: Nuôi cấy in vitro là nuôi cấy trong điều kiện vô

trùng Đây là điều kiện rất quan trọng, nếu không đảm bảo tốt điều kiện vô trùng thì mẫu nuôi cấy hoặc môi trường sẽ bị nhiễm, mô nuôi cấy sẽ bị chết Điều kiện vô

trùng có ý nghĩa quyết định đến sự thành công của nuôi cấy mô in vitro

Phương pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hóa học, tia cực tím có khả năng diệt nấm và vi khuẩn

Vô trùng ban đầu là một thao tác khó, là khâu đầu tiên có ý nghĩa quyết định

đến thành công của toàn bộ quá trình nuôi cấy in vitro Nếu tìm được nồng độ và

thời gian khử trùng thích hợp sẽ cho tỉ lệ sống cao hơn, thưởng sử dụng các hóa chất khử trùng như: HgCl2 0,1%; NaClO 10%; Javen; cồn 760, clorox

Các phương tiện khử trùng được sử dụng như: Nồi hấp vô trùng; tủ sấy; buồng; tủ cấy vô trùng; phòng nuôi cấy

Thí nghiệm 1: nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất khử trùng, nồng độ chất khử trùng, thời gian khử trùng đến khả năng tạo mô sạch nấm, vi khuẩn

+ Cách bố trí thí nghiệm

CT1: (Đ/C) Sử dụng nước cất khử trùng

CT2: Ngâm trong dung dịch NaClO 1%

CT3: Ngâm trong dung dịch Ca(ClO)2 1%

CT4: Ngâm trong dung dịch HgCl2 0,1%

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, mỗi công thức

3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 10 bình sử dụng môi trường MS có bổ sung agar 7 g/l, đường 30g/l

3.6.3 Phương pháp nghiên cứu nội dung 2 - Tái sinh chồi và nhân nhanh chồi

- Áp dụng phương pháp tái sinh chồi nách từ đoạn thân

Để tái sinh chồi từ đoạn thân hay bất kỳ một bộ phận nào của cây thì Môi trường nuôi cấy là một trong 3 yếu tố quyết định thành công trong nuôi cấy mô tế bào thực vật Quá trình hình thành chồi, mô sẹo, phôi… chết ngoài yếu tố chất kích

thích sinh trưởng quyết định, thành phần khoáng cũng ảnh hưởng rất lớn đến khả năng tái sinh của mẫu cấy Việc lựa chọn môi trường nuôi cấy, phương pháp pha chế

môi trường nuôi cấy là một khâu rất quan trọng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

Chúng tôi tiến hành thử nghiệm môi trường nuôi cấy trên 3 nền môi trường

là môi trường MS, B5 và WPM Tiến hành pha dung dịch mẹ theo các nhóm Sau

đó tiến hành pha theo các công thức thí nghiệm sau đó tiến hành khử trùng môi trường nuôi cấy ở 121oC trong 15 phút, để môi trường nguội (môi trường đông đặc lại tiến hành đưa mẫu vào môi trường nuôi cấy

Trong nội dung nghiên cứu 2 chúng tôi tiến hành thử nghiệm trên 3 đối tượng môi trường đã được công bố, thí nghiệm được bố trí như sau:

+ Cách bố trí thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của một số loại môi trường (MS, B5, WPM) tới khả năng tái sinh chồi cây Xoan Đào

+ CT1: MS

+ CT2: B5

+ CT3: WPM

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, mỗi công thức

3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 10 bình sử dụng môi trường MS (B5, WPM)

có bổ sung agar 7 g/l, đường 30g/l

- Áp dụng phương pháp nhân nhanh

Mẫu sau khi tái sinh lựa chọn những mẫu đều nhau tiến hành đưa vào môi trường nhân nhanh Môi trường nhân nhanh là môi trường dựa trên môi trường đã thử nghiệm trong khâu vào mẫu đồng thời bổ sung vào môi trường nuôi cấy thành phần nhóm cytokine (BA, BAP, Kinetine) Sau đó tiến hành cấy chuyển sau 4- 6 tuần khi các mầm tái sinh đã tiến hành nhân thì tách các chồi đó sang môi trường ra rễ

khả năng nhân nhanh chồi cây Xoan Đào

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, mỗi công thức

3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 10 bình sử dụng môi trường có bổ sung agar 7g/l, đường 30g/l

+ CT1: 0,0 mg/l