NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA PROTEIN GIÀU METHIONINE TRÊN CÂY ARABIDOPSIS THALIANA

Những điều kiện bất lợi, nguyên nhân tạo các dạng oxy phản ứng Các dạng oxy phản ứng ROS là những phân tử hóa học trong cấu trúc chứa oxy, có khả năng phản ứng mạnh.. Khi điều kiện môi

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-Lê Thị Ngọc Quỳnh

NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA PROTEIN GIÀU METHIONINE

TRÊN CÂY ARABIDOPSIS THALIANA

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Chương 1- TỔNG QUAN 1.1 Methionine và protein giàu Methionine

1.1.1 Tổng quan chung về Methionine

Met, axit amin chứa sulfur (methionine và cysteine) và các axit amin khác như lysine, threonine và isoleucine đều được tổng hợp từ họ aspartate Aspartate kinase là enzyme đầu tiên trong con đường chuyển hóa chung từ aspartate thành lysine, threonine, Met và isoleucine Enzyme này xúc tác quá trình phosphoryl hóa aspartate bằng cách thủy phân ATP tạo thành β-aspartyl phosphate Thông thường, có ít nhất hai dạng aspartate kinase được tìm thấy trong thực vật β-aspartyl phosphate sẽ được chuyển hóa thành aspartate-semialdehyde và sau đó là homoserine, bởi sự xúc tác tương ứng của aspartic semialdehyde dehydrogenase và homoserine kinase Tuy nhiên, trong thực vật, điểm trung gian tạo thành threonine và sinh tổng hợp Met là O-phosphohomoserine (OPH), cơ chất chung cho hai enzyme threonine synthase (TS) và cystathionine gamma-synthase (CgS) OPH có thể chuyển hóa trực tiếp thành threonine bởi sự tham gia của TS hoặc là tham gia vào cơ chế ba bước để tạo thành Met: phản ứng trùng ngưng cysteine và OPH tạo thành cystathionine, sau đó thành homocysteine

và cuối cùng là thành Met, tương ứng nhờ enzyme cystathionine β-lyase và homocysteine methyltransferase Cuối cùng, chỉ có khoảng 20% Met được sử dụng làm thành phần tạo nên protein, trong khi có đến 80% Met sẽ được biến đổi để tạo thành SAM, cũng là sản phẩm cuối cùng trong con đường sinh tổng hợp Met

1.1.2 Các protein giàu Methionine

Met được mã hóa chỉ bởi duy nhất bộ ba AUG, đây là mã mở đầu, xác lập tín hiệu bắt đầu quá trình dịch mã sinh tổng hợp chuỗi polypeptit trên phân tử mRNA Do

đó, ở nhóm sinh vật nhân chuẩn và vi khuẩn cổ, Met thường xuất hiện ở đầu N terminal) trong chuỗi peptide Ở thực vật, một vài protein giàu Met (MRP) đã được nghiên cứu từ rất sớm trên nhiều loại cây trồng khác nhau như: quả hạnh nhân của

(N-Brazil, hạt hướng dương, ngô, và lúa Các MRP được tìm thấy trong hạt đều có hàm lượng Met trong khoảng 11-22%

Gen mã hóa cho một MRP có tên gọi là 2S albumin đã được nghiên cứu khá kỹ

do protein này chứa hàm lượng cao Met, làm tăng giá trị cho cây trồng, đặc biệt là cho các cây họ đậu và các loại cây trồng thu củ và rễ luôn có hàm lượng thấp các axit amin chứa sulfur như Met 2S albumin từ quả hạnh nhân của Brazil chứa 18% methionine, 2S albumin từ hoa hướng dương chứa 16% methionine Tuy nhiên, việc cải thiện hàm lượng Met trong các loại hạt đậu vẫn không đủ để đáp ứng về hàm lượng Met cần thiết trong thức ăn chăn nuôi Vai trò của Met trong phân tử protein liên quan đến tính kỵ nước, tạo nên sự cuộn gấp để tạo thành các bậc cấu trúc không gian cho protein Met được tìm thấy nhiều tại phần lõi kỵ nước trong cấu trúc không gian của protein, trong khi ở các protein màng tế bào, Met liên kết với lớp lipit kép Tuy nhiên, đối với các protein có chứa Met bộc lộ bên ngoài bề mặt tiếp xúc thì rất dễ bị oxy hóa thành Met

sulfoxide (MetO) do tác động của các dạng oxy phản ứng Do đó, MRP được xem như

protein mô hình để nghiên cứu một cách hiệu quả về sự oxy hóa Met trong các loài sinh vật khác nhau

1.2 Quá trình oxy hóa và sửa chữa oxy hóa Methionine

1.2.1 Những điều kiện bất lợi, nguyên nhân tạo các dạng oxy phản ứng

Các dạng oxy phản ứng (ROS) là những phân tử hóa học trong cấu trúc chứa oxy,

có khả năng phản ứng mạnh Khi nồng độ ROS càng tăng cao thì càng đem lại nhiều hậu quả nghiêm trọng Nghiên cứu cũng chỉ ra ROS có thể đóng các vai trò phá hủy, bảo vệ hoặc truyền tín hiệu, tùy thuộc vào các quá trình cân bằng giữa sự sản sinh và loại bỏ ROS tại các trung tâm hoạt động theo thời gian Khi điều kiện môi trường thay đổi, những tín hiệu đáp ứng sớm được tạo ra bao gồm: tăng tỷ lệ ion đi qua màng tế bào, tăng cường Ca2+ có mặt trong bào tương, kích hoạt protein MAPKs và đặc biệt là sản sinh ra ROS chỉ sau một vài phút bị kích thích bởi các tác nhân sinh học và phi sinh học ROS được sinh ra ở các bào quan khác nhau và dẫn

đến sự thay đổi của hệ phiên mã trong nhân tế bào, do vậy thông tin phải được chuyển từ các bào quan đến nhân tế bào Các tín hiệu thông qua ROS cần phải được tiếp nhận và khuếch đại, thường là thông qua kinase hay phosphatase Hydrogen peroxide có khả năng oxy hóa trực tiếp hai axit amin có chứa lưu huỳnh là Cys và Met Đặc biệt, việc oxy hóa cysteine đã được tập trung ở nhiều nghiên cứu khác nhau, tình trạng oxy hóa khác nhau cũng dẫn đến những thay đổi khác nhau đối với protein Ngược lại, sự oxy hóa Met nhận được ít sự quan tâm hơn Trong thực vật, chức năng của protein bị thay đổi do quá trình oxy hóa Met đã từng được công bố.

1.2.2 Quá trình oxy hóa Methionine bởi các dạng oxy phản ứng

Khi ROS tồn tại ở hàm lượng cao, Met tự do cũng như Met trên các phân tử protein dễ dàng bị oxy hóa để tạo thành Met sulfoxide (MetO) và Met sulfone (MetO2) khi gắn thêm các nguyên tử oxy MetO tồn tại với hai dạng đồng phân quang học là

methionine-S-sulfoxide (Met-S-O) và methionine-R-sulfoxide (Met-R-O) Ngược lại

với MetO2 (một hợp chất hiếm khi được tìm thấy trong các hệ thống sinh học), cần một lực oxy hóa mạnh và không có tính thuận nghịch thì quá trình chuyển hóa giữa Met và MetO lại có tính thuận nghịch

Protein là mục tiêu mạnh nhất của quá trình oxy hóa gây ra bởi các gốc tự do so với các đại phân tử khác như lipid và DNA, chiếm đến 68% phân tử bị oxy hóa trong tế bào Trong tự nhiên, Met đóng vai trò như chất chống oxy hóa, bảo vệ protein cũng như các đại phân tử khác Dưới điều kiện hiếu khí, có tới 6% Met trong protein có thể cùng bị oxy hóa đồng thời Tuy nhiên, không phải tất cả các gốc Met trong protein có cùng mức nhạy cảm đối với quá trình oxy hóa; mức này phụ thuộc vào việc các tác nhân oxy hóa có thể tiếp cận Met ở các vị trí khác nhau bên trong cấu trúc protein như nằm ở bề mặt hay trong phần lõi protein Shechter đã phát hiện chỉ các gốc Met trong chuỗi peptide và protein đã bị biến tính đều bị oxy hóa hoàn toàn, trong khi đối với các protein tự nhiên thì chỉ các gốc Met nằm ở bề mặt mới có thể bị oxy hóa

1.2.3 Quá trình sửa chữa oxy hóa Methionine

Oxy hóa Met xảy ra trong điều kiện hiếu khí là điều không thể tránh khỏi, chính

vì vậy các tế bào trong sinh vật sống đã phát triển nhiều cơ chế phức tạp cũng như các enzyme để chống lại quá trình oxy hóa Met Ngược lại với MetO2, MetO có thể được chuyển hóa một cách thuận nghịch thành Met nhờ xúc tác của enzyme Msr MsrA có

thể tham gia khử dạng Met-S-O tự do và Met-S-O trên protein trong khi MsrB khử Met-R-O tự do thành Met kém hiệu quả hơn so với dạng liên kết trong protein do ái lực

thấp hơn với cơ chất này ở dạng tự do Cả MsrA và MsrB đều là những enzyme có tính bảo thủ cao trong vi khuẩn nhân thực, tế bào nhân thực bao gồm cả tế bào người và hầu hết các sinh vật có chứa cả 2 dạng enzyme MsrA và MsrB MsrA là một dạng enzyme phổ biến, được tìm thấy trong hầu hết các sinh vật từ vi khuẩn đến cây trồng đến động vật có vú, trong đó có cả người Gần đây, một họ enzyme Msr mới được tìm thấy ở

E.coli, chỉ có tính đặc hiệu trong hoạt tính khử Met-R-O dạng tự do và không có khả

năng khử MetO liên kết trong protein được gọi là fRMsr (free Met-R-O) Đặc biệt,

fRMsr chỉ được tìm thấy trong một vài sinh vật đơn bào Tuy nhiên trong điều kiện môi trường sống có nhiều bất lợi như hiện nay, đảm bảo cân bằng giữa việc sản sinh

và loại bỏ ROS bị phá vỡ bởi nhiều tác nhân bất lợi như ánh sáng cao, hạn hán, nhiệt

độ thấp hoặc cao và những tổn thương cơ học Chính điều đó đã gây ra ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và phát triển của cây trồng dẫn đến những thiệt hại lớn về sản lượng

1 3 Tình hình nghiên cứu về protein có methionine mẫn cảm với các dạng oxy phản ứng

1.3.1.Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Các ảnh hưởng của MetO đến các protein trong chuỗi dẫn truyền tín hiệu cũng được ghi nhận Nhóm nghiên cứu Takahashi và cs đã nghiên cứu trên protein Calmodulin tham gia vào quá trình dẫn truyền tín hiệu trong tế bào và chức năng ổn định ROS trên đối tượng thực vật Mối liên quan giữa quá trình oxy hóa Met với sự

mất ổn định cấu trúc của protein calmodulin và sự mất chức năng của protein này cũng được ghi nhận

Rosen và cs sử dụng phương pháp khối phổ để phân tích khả năng phân giải

protein của các tế bào E.coli khi bị xử lý bởi H2O2, HOCl hoặc với bạch cầu trung tính (neutrophil) Các phân đoạn peptide được phân tích bằng sắc ký lỏng kết hợp với đầu

dò ion hóa kết hợp phương pháp khối phổ Peptide được phát hiện tăng 16 Da Tuy nhiên, đáng tiếc rằng nghiên cứu này lại không chỉ ra được danh sách hoàn chỉnh các protein và vị trí các gốc Met bị mẫn cảm với quá trình oxy hóa

Le và cs (2009) cũng đã chỉ ra rằng việc biểu hiện quá mức gen mã hóa Msr có thể đem lại tính kháng tác nhân oxy hóa cho tế bào nấm men hoặc tế bào động vật Bên cạnh đó, Liang và cs đã tách dòng, biểu hiện, tinh sạch và phân tích khối phổ cho bốn MRP mới (chứa > 20% Met, chứa ít hay thiếu cystein) để nghiên cứu quá trình oxy hóa Met và quá trình sửa chữa được diễn ra nhờ Msr Thông qua đó, natri hypochlorite (NaOCl) được chỉ ra là có hiệu quả cao trong việc tạo MetO trên MRP

Năm 2015, Jacques và cs đã sử dụng một phương pháp mới được gọi là COFRADIC để khảo sát phân bố của các vị trí MetO trên hệ protein của cây mô hình

trong điều kiện bất lợi oxy hóa Sử dụng cây Arabidopsis thaliana bị bất hoạt enzyme

catalase 2, nhóm tác giả đã tìm thấy gần 500 vị trí Met bị oxy hóa trong 400 protein, đồng thời cũng định lượng protein giữa cây đột biến bất hoạt enzyme catalase 2 và cây kiểu dại Tuy nhiên người ta vẫn không biết được các ứng viên tiềm năng để tiếp cận bằng phương pháp sắc kí ái lực và khối phổ Hiện nay, có bao nhiêu protein mẫn cảm với oxy hóa Met và trong số đó có bao nhiêu protein có thể được sửa chữa bởi Msr vẫn

là điều chưa được biết đến

1.3.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Ở Việt Nam, bước đầu đã có một số nghiên cứu về ảnh hưởng của các dạng oxy phản ứng đến cây trồng như Mai Văn Chung đã công bố một số kết quả bước đầu về biểu hiện của các dạng oxy phản ứng trong phản ứng bảo vệ của cây đậu (Pisum

sativum L.) khi chịu sự tấn công của rệp đậu (Acyrthosiphon pisum Harris) - loại côn

trùng chích hút nhựa cây có mức độ pháhoại được đánh giá là nguy hiểm đối vớinhiều cây trồng họ Fabaceae Bên cạnh đó, điều kiện tách chiết cũng là nhân tố ảnh hưởng lớn đến hoạt tính chống oxy hóa của diệp hạ châu, một loài dược liệu quý được trồng phổ biến theo quy mô công nghiệp tại nhiều tỉnh của Việt Nam

Tuy nhiên, đó mới chỉ là những nghiên cứu rất sơ lược, bước đầu về ảnh hưởng của các dạng oxy phản ứng với thực vật tại Việt Nam Tính đến thời điểm hiện nay, vẫn chưa có bất kỳ công bố chính thức nào về các protein chứa Met mẫn cảm với các tác nhân oxy hóa, sự oxy hóa Met và ảnh hưởng qua lại của chúng đến hoạt động của Msr trên thực vật

Đồng thời, để phát hiện và chứng minh các protein đích tiềm năng cho việc can thiệp bằng kĩ thuật di truyền, chúng ta cần phải biết protein nào là mẫn cảm với oxy hóa Met và bao nhiêu trong số chúng có thể sửa chữa bởi Msr Chính vì vậy, chúng tôi

đã tiến hành “Nghiên cứu vai trò của protein giàu Methionine trên cây Arabidopsis thaliana” Nghiên cứu này hứa hẹn mở ra một hướng nghiên cứu mới về protein chứa

Met mẫn cảm với quá trình oxy hóa tại Việt Nam

Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu

Sau khi tìm được các gen mã hóa MRP đáp ứng phiên mã với điều kiện bất lợi,

các dòng Arabidopsis biểu hiện quá mức các gen này được tìm kiếm trên cơ sở dữ liệu

của Trung tâm Tài nguyên Sinh học RIKEN (RIKEN BRC, Nhật Bản) Hạt

Arabidopsis thaliana biểu hiện quá mức gen mã hóa MRP nằm trong thư viện dòng

FOX (Full-length cDNA Over-eXpressing), được cung cấp bởi Trung tâm Tài nguyên Sinh học RIKEN, Tsukuba, Nhật Bản Trong thư viện dòng FOX, cDNA hoàn chỉnh

của Arabidopsis được điều khiển bởi promoter 35S và được chèn vào plasmid mang

gen chống chịu kháng sinh hygromycin Plasmid được chuyển vào cây Arabidopsis

bằng phương pháp nhúng hoa

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành theo quy trình được trình bày trong Hình 2.1

2.2.1 Phương pháp tiếp cận bằng tin sinh học

2.2.1.1 Phương pháp chú giải chức năng gen mã hóa MRP

Danh sách các gen mã hóa MRP được cung cấp bởi nhóm nghiên cứu thuộc Viện Di truyền Nông nghiệp

Trình tự polypeptide của gen mã hóa MRP với định dạng fasta được đưa vào phần mềm MAPMAN (http://mapman.gabipd.org) và phần mềm Blast2goBasic phiên bản 3.0 (https://www.blast2go.com) để tiến hành phân loại chức năng gen

Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm được sử dụng trong nghiên cứu

Trong nghiên cứu này, để dự đoán vị trí cư trú của MRP trong tế bào, tệp fasta

chứa toàn bộ trình tự của MRP trên Arabidopsis thaliana được sử dụng làm đầu vào

để tìm kiếm trên 3 cơ sở dữ liệu trực tuyến phổ biến bao gồm ChloroP (http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/), pSORT (http://www.psort.org/), và CELLO (http://cello.life.nctu.edu.tw/)

2.2.1.2 Đánh giá biểu hiện gen mã hóa MRP trên cây Arabidopsis trong điều kiện bình thường và điều kiện bất lợi

Sử dụng dữ liệu microarray của những nghiên cứu trước đó để đánh giá mức độ biểu hiện của MRP dưới điều kiện khô hạn, điều kiện chịu mặn Các thử nghiệm này được tiến hành theo quy trình như sau:

Xử lý hạn: kết quả phân tích được thu thập từ GEO của NCBI Số hiệu truy cập

là GSE42290, công bố ngày 15 tháng 02 năm 2013, cập nhật lần cuối ngày 22 tháng 04 năm 2015, nền tảng là Platforms GPL12621, mẫu phân tích là Samples từ GSM 1037236-GSM 1037247

Xử lý mặn: dữ liệu của nghiên cứu được truy cập theo số hiệu series GSE32087, mẫu phân tích là Samples từ GSM795503 - GSM795514 Tất cả các dữ liệu này được thu thập để phân tích và tiến hành khai thác dữ liệu

Năm yếu tố cis (ABRE, MYCR, MYBR, ICEr2, RSRE) liên quan đến đáp ứng

với điều kiện bất lợi sẽ được xác định theo trình tự nhận biết Trình tự 1-kb ngược

dòng từ vị trí bắt đầu phiên mã (+1) của mỗi gen AtMRP được tìm kiếm yếu tố cis nhờ

phần mềm MEGA 4

2.2.2 Phương pháp tiếp cận bằng thực nghiệm

2.2.2.1 Đánh giá hình thái cây chuyển gen At3G55240

Hạt Arabidopsis chuyển gen và đối chứng sau khi khử trùng được gieo trên đĩa

petri chứa môi trường ½ MS đặc có và không có kháng sinh hygromycin, trong điều kiện của phòng nuôi cấy mô tế bào, quang chu kỳ sáng: tối là 16:8 giờ, nhiệt độ phòng

nuôi 24±2oC Quan sát hình thái cây trong đĩa thạch ½ MS ở các giai đoạn khác nhau Chọn các cây 14 ngày tuổi (có kích thước tương đương nhau) trên môi trường ½ MS chuyển sang giá thể đất Quan sát sự thay đổi hình thái cây trên giá thể đất ở tuần tuổi khác nhau

2.2.2.2 Đánh giá mức độ đáp ứng của cây chuyển gen trong các điều kiện bất lợi Thử nghiệm tính kháng mặn: Gieo hạt cây chuyển gen và cây đối chứng trên

môi trường ½ MS có và không có kháng sinh hygromycin Chuyển cây 12 ngày tuổi sang môi trường ½ MS, có bổ sung NaCl ở nồng độ 175 mM Cây sống sót trên môi trường có bổ sung NaCl sẽ được đếm từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 7

Thử nghiệm tính kháng với kim loại nặng cadmium: Gieo hạt cây chuyển gen và

cây đối chứng trên môi trường ½ MS có và không có kháng sinh hygromycin Chuyển cây 12 ngày tuổi sang môi trường ½ MS, có bổ sung cadmium cloride ở nồng độ 750

µM Cây sống sót trên môi trường có bổ sung CdCl2 sẽ được đếm từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 8

Thử nghiệm với paraquat trên lá cây Arabidopsis: Thí nghiệm được tiến hành

dựa trên nghiên cứu trước đây của Yang và cs (2007) có cải biến Gieo hạt cây chuyển

gen và đối chứng trên môi trường ½ MS đặc có và không có kháng sinh Hygromycin

Chọn các cây 14 ngày tuổi (có kích thước tương đương nhau) trên môi trường ½ MS chuyển sang giá thể đất Lá cây 3 tuần tuổi được cắt ra và ngâm trong dung dịch paraquat ở các nồng độ khác nhau: 0µM (đối chứng), 0,5µM, 1µM và 2µM, được giữ trong điều kiện tránh ánh sáng trong vòng 1-2h sau đó được chuyển ra điều kiện ánh sáng liên tục ở 24 oC và quan sát sự mất màu xanh của lá sau 24 giờ

Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân tích tin sinh học cho các gen mã hóa MRP

3.1.1 Tìm kiếm và xác định các gen mã hóa MRP trên cây Arabidopsis

Tất cả những gen mã hóa cho protein có kích thước lớn hơn 95 gốc axit amin

và chứa hàm lượng Met từ 6 % được coi là MRP Danh sách 121 gen AtMRP được

cung cấp bởi nhóm nghiên cứu thuộc Viện Di truyền Nông nghiệp MAPMAN là một công cụ cho phép chú giải chức năng gen Kết quả phân tích cho thấy khoảng 50 % gen

AtMRP chưa rõ hoặc chưa xác định được chức năng trong tế bào Số còn lại đóng vai

trò quan trọng trong tế bào (Bảng 3.1) Trong đó, điều hòa phiên mã RNA (có 20

AtMRP tham gia, chiếm 18 %), biến đổi protein (12 AtMRP tương đương 11 %) và con

đường tín hiệu Ca2+ (tương ứng với 6 AtMRP, chiếm 5 %) là 3 nhóm chức năng chính được quan tâm khi phân tích MRP Những phân tích trên MRP đã biết chức năng đều

cho thấy vai trò thiết yếu của các protein giàu Met nói riêng tham gia vào trong tế bào thực vật MRP

Bảng 3.1 Phân loại chức năng gen mã hóa MRP trong Arabidopsis theo Mapman

Nhóm chức năng gen AtMRP

(Một số gen có thể được phân loại vào nhiều hơn một nhóm chức năng)