NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA PROTEIN GIÀU METHIONINE TRÊN CÂY ARABIDOPSIS THALIANA

BẢNG KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt, ABRE ABA responsive element Yếu tố đáp ứng ABA AtMRP Arabidopsis thaliana Methionine-rich protein Protein giàu Methionin trên Arabidopsis

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Lê Thị Ngọc Quỳnh

NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA PROTEIN GIÀU METHIONINE

TRÊN CÂY ARABIDOPSIS THALIANA

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Cán bộ hướng dẫn: TS Lê Tiến Dũng PGS TS Nguyễn Quang Huy

Hà Nội  2015

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Tiến Dũng và PGS.TS Nguyễn Quang Huy, những người Thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu khoa học và thực hiện luận văn này

Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy, cô giáo trong Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tận tình giảng dạy, dìu dắt tôi trong thời gian học tập tại Trường Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể cán bộ và học viên tại Phòng thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp đã hết lòng giúp đỡ tôi thực hiện thành công luận văn này

Cuối cùng, nhưng không kém phần quan trọng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã khích lệ, động viên, giúp đỡ và là chỗ dựa vững chắc cho tôi trong thời gian qua

Luận văn được thực hiện trong khuôn khổ đề tài nghiên cứu cơ bản “Nghiên cứu protein mẫn cảm với oxy hóa methionine và vai trò của enzyme methionine sulfoxide reductase của cây nông nghiệp” do Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia

tài trợ mã số 106-NN.02-2013.46

Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2015

Học viên

Lê Thị Ngọc Quỳnh

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các ROS trong cơ thể sinh học 9

Bảng 1.2 Một số yếu tố cis đáp ứng với điều kiện bất lợi 12

Bảng 1.3 Số lượng gen MsrA và MsrB ở một số nhóm sinh vật 17

Bảng 2.1 Các hóa chất chính được sử dụng trong nghiên cứu 23

Bảng 2.2 Các thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu 24

Bảng 2.3 Trình tự của một số yếu tố điều hòa cis trong điều hòa biểu hiện gen

đáp ứng với điều kiện bất lợi 27

Bảng 3.1 Phân loại chức năng gen mã hóa MRP trong Arabidopsis theo MAPMAN 31

Bảng 3.2 Các MRP được dự đoán có đích tác động là ty thể và lục lạp 35

Bảng 3.3 Gen AtMRP đáp ứng phiên mã với hạn hán và độ mặn cao 38

Bảng 3.4 Kết quả phân loại chức năng gen bằng MAPMAN của các gen đáp ứng

phiên mã với điều kiện bất lợi 41

Bảng 3.5 Một số yếu tố cis có mặt trên promoter của các gen AtMRP 42

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Quá trình sinh tổng hợp Methionine 4

Hình 1.2 Sự tạo thành Met sulfoxide và Met sulfone từ Met 13

Hình 1.3 Phản ứng khử MetO về Met của các Msr 16

Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm được sử dụng trong nghiên cứu 25

Hình 3.1 Sự phân bố gen mã hóa MRP trong các quá trình sinh học khác nhau của Arabidopsis 31

Hình 3.2 Phân loại chức năng của các gen AtMRP theo quá trình sinh học 32

Hình 3.3 Phân loại chức năng của các gen AtMRP theo thành phần tế bào 33

Hình 3.4 Phân loại gen AtMRP theo tham gia vào chức năng phân tử 33

Hình 3.5 Dự đoán vị trí của các MRP trong tế bào của Arabidopsis thaliana bằng

phần mềm ChloroP, pSORT và CELLO 34

Hình 3.6 Dự đoán vị trí của MRP trong tế bào của Arabidopsis thaliana bằng

phần mềm Blast2GO 36

Hình 3.7 Biểu đồ Venn thể hiện số lượng gen mã hóa MRP đáp ứng tăng và giảm

gấp hơn 2 lần trong các điều kiện chịu mặn và hạn hán 37

Hình 3.8 Số lượng các gen AtMRP có chứa các yếu tố cis khác nhau 44

Hình 3.9 Dòng cây RBC1 được nảy mầm, A môi trường ½ MS đặc chứa kháng sinh hygromycin 15mg/l, B môi trường ½ MS đặc 45

Hình 3.10 Hình thái dòng cây RBC1 và cây đối chứng kiểu dại trên đĩa thạch 46

Hình 3.11 Hình thái dòng cây RBC1 và cây đối chứng trên giá thể đất 48

Hình 3.12 Đĩa thạch mang cây RBC1 và cây kiểu dại trên môi trường ½ MS 50

Hình 3.13 Thử nghiệm chịu mặn trên dòng cây đối chứng và dòng RBC1 51

Hình 3.14 Thử nghiệm cadmium trên dòng cây đối chứng và dòng RBC1 52

Hình 3.15 Thử nghiệm paraquat trên dòng cây đối chứng và dòng cây RBC1 54

BẢNG KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt,

ABRE ABA responsive element Yếu tố đáp ứng ABA

AtMRP Arabidopsis thaliana

Methionine-rich protein

Protein giàu Methionin trên

Arabidopsis thaliana

ATP Adenosine triphosphate Adenosin triphotphat

bHLH basic Helix loop helix Cấu trúc xoắn vòng xoắn bZIP Basic region-leucine zipper Khóa kéo cơ bản vùng leucine CELLO subCELlular LOcalization

MetO Methionine sulfoxide Methionin sufoxit

MetO2 Methionine sulfone Methionin sulfone

MRP Methionine-rich protein Protein giàu methionin

MS Murashige & Skoog Môi trường MS

Msr Methionine sulfoxide

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp PEL Pseudo-Etiolation in Light Sự giả vàng úa dưới ánh sáng PSORT Protein Subcellular

lOcalization pRedicTion

Dự đoán vị trí cư trú của protein trong tế bào RBC1 RIKEN Bioresource Center Dòng cây chuyển gen từ TT

Tài nguyên Sinh học RIKEN ROS Reactive oxygen species Các dạng oxy phản ứng

RSRE Rapid Stress Response

Element

Yếu tố đáp ứng nhanh với điều kiện lạnh

SAM S - Adenosyl Methionine S - Adenosyl Methionine

TS Threonine synthase Threonine synthaza

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1- TỔNG QUAN 2

1.1 Methionine và protein giàu Methionine 2

1.1.1 Tổng quan chung về Methionine 2

1.1.2 Các protein giàu Methionine 5

1.2 Quá trình oxy hóa và sửa chữa oxy hóa Methionine 7

1.2.1 Những điều kiện bất lợi, nguyên nhân tạo các dạng oxy phản ứng 7

1.2.2 Quá trình oxy hóa Methionine bởi các dạng oxy phản ứng 12

1.2.3 Quá trình sửa chữa oxy hóa Methionine 15

1.3 Tình hình nghiên cứu về protein có methionine mẫn cảm với các dạng oxy

phản ứng 19

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 19

1.3.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 21

Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 23

2.1 Vật liệu 23

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 23

2.1.2 Hóa chất 23

2.1.3 Thiết bị 24

2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

2.2.1 Phương pháp tiếp cận bằng tin sinh học 24

2.2.2 Phương pháp tiếp cận bằng thực nghiệm 28

Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 Phân tích tin sinh học cho các gen mã hóa MRP 30

3.1.1 Tìm kiếm và xác định các gen mã hóa MRP trên cây Arabidopsis 30

3.1.2 Đánh giá biểu hiện gen mã hóa MRP trên cây Arabidopsis trong điều kiện thường và điều kiện bất lợi 37

3.1.3 Dự đoán yếu tố điều hòa cis trên promoter của các gen mã hóa MRP đáp ứng điều kiện bất lợi 41

3.2 Phân tích thực nghiệm trên cây Arabidopsis tăng cường biểu hiện gen At3G55240 (dòng RBC1) 44

3.2.1 Kiểm tra tỷ lệ đồng hợp tử/dị hợp tử của dòng cây chuyển gen 44

3.2.2 Đánh giá hình thái của dòng cây chuyển gen 45

3.2.3 Đánh giá đáp ứng của dòng cây chuyển gen với các điều kiện bất lợi 49

KẾT LUẬN 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

Tài liệu tiếng Việt 59

Tài liệu tiếng Anh 59

PHỤ LỤC i

MỞ ĐẦU

Ở thực vật, sự hình thành và loại bỏ các dạng oxy phản ứng (ROS) được kiểm soát chặt chẽ thông qua con đường dẫn truyền tín hiệu Tuy nhiên, trong tình trạng môi trường bất lợi, nồng độ ROS tăng lên một cách đột ngột do mất kiểm soát, gây

ra tổn thương cho các chất phân tử lớn trong tế bào như lipit, protein, axit nucleic dẫn đến giảm tuổi thọ hoặc sức sống của sinh vật

Các dạng oxy phản ứng ảnh hưởng bất lợi tới sinh trưởng của tế bào thông qua nhiều quá trình khác nhau, trong đó bao gồm cả oxy hóa Methionine (Met), một axit amin chứa lưu huỳnh có mặt trong phân tử protein, tạo thành Met sulfoxide (MetO) Đây là một trong những nguyên nhân gây mất hoạt tính, mất đi khả năng điều hòa trao đổi chất của protein, dẫn đến làm giảm sức đề kháng, giảm sức sống của cây trồng Trong cơ thể sinh vật, MetO được sửa chữa bằng enzyme Methionine sulfoxide reductase (Msr) Quá trình sửa chữa này tạo ra những tác động tích cực, đặc biệt là tăng khả năng đề kháng cao, chống lại sự oxy hóa gây ra bởi các điều kiện bất lợi từ môi trường trên thực vật

Nghiên cứu quá trình oxy hóa Met và sửa chữa MetO thông qua những hiểu biết về các protein giàu Met là đích tác động của Msr sẽ cho phép tiếp cận vấn đề này, tạo tiền đề cho nghiên cứu phát triển các giống cây trồng có khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi Tuy nhiên, các protein giàu Met hiện chưa được công bố một cách hệ thống ở cả những nghiên cứu trong và ngoài nước Xuất phát từ những

lý do trên, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu vai trò của protein giàu methionine

trên cây Arabidopsis thaliana”.

Luận văn nằm trong khuôn khổ đề tài nghiên cứu cơ bản “Nghiên cứu protein mẫn cảm với oxy hóa methionine và vai trò của enzyme methionine sulfoxide reductase của cây nông nghiệp” do Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia

tài trợ

Chương 1- TỔNG QUAN 1.1 Methionine và protein giàu Methionine

1.1.1 Tổng quan chung về Methionine

Methionine (Met) là một α – axit amin chứa lưu huỳnh, được sử dụng trong nhiều con đường chuyển hóa tế bào như thành phần cấu tạo nên protein, bộ ba mở đầu (AUG) mã hóa cho tín hiệu bắt đầu quá trình sinh tổng hợp chuỗi polypeptide Ngoài ra Met đóng vai trò như một phân tử tham gia vào quá trình điều hòa thông qua dạng dẫn xuất là S - Adenosyl Methionine (SAM) [40] SAM đóng vai trò chìa khóa cho nhiều con đường chuyển hóa khác nhau thông qua việc cung cấp nhóm methyl (-CH3) trong tế bào Bên cạnh đó, SAM cũng là tiền chất cho các hợp chất chuyển hóa như: ethylene (CH2=CH2) - hormone quan trọng liên quan đến sự kiểm soát của nhiều quá trình ở thực vật như làm chín và già hóa, vitamin B1, 3-dimethylsulphoniopropionate (chất bảo vệ thẩm thấu, giúp thực vật chống lại những điều kiện bất lợi về thẩm thấu), và đóng vai trò như là nguồn sulfur của khí quyển: dimethylsulphide [8] SAM là hợp chất cung cấp nhóm propyl amin cho quá trình sinh tổng hợp các polyamine, spermidine, spermine, những chất đóng vai trò quyết định cho quá trình phát triển của thực vật bao gồm sự tăng trưởng và biệt hóa tế bào,

tế bào chết theo chương trình (apoptosis), cân bằng nội môi và điều hòa biểu hiện gen [7] Dẫn xuất của Met, S-methylmethionine, được sử dụng như phân tử vận chuyển chính để giảm lượng sulfur trong một số loài động vật, đây cũng là hợp chất liên quan đến việc hình thành dạng lưu động và dạng dự trữ của Met [14]

Met là một axit amin thiết yếu, được cung cấp thông qua thức ăn của động vật không nhai lại Động vật có vú nói chung và con người nói riêng chỉ có thể tổng hợp

ra khoảng một nửa số axit amin trong tổng số 20 axit amin cơ bản cấu tạo nên protein

Do đó, những axit amin không thể tổng hợp được cần phải được bổ sung qua chế độ

ăn uống Cây trồng phổ biến như ngũ cốc (lúa, gạo ) và các loại đậu thường có hàm lượng Met thấp [40] Ở các nước đang phát triển, cải thiện chất lượng dinh dưỡng là cách để giải quyết nhiều vấn đề khi mà thức ăn có nguồn gốc từ thực vật là nguồn

cung cấp protein chủ yếu cho con người cũng như cho gia súc và gia cầm Để giải quyết nhu cầu cung cấp các axit amin thiết yếu trong thức ăn chăn nuôi, các phụ gia

có thể được thêm vào hoặc là sử dụng đa dạng nguồn thực vật Do đó, nâng cao hàm lượng các axit amin thiết yếu trong cây trồng nông nghiệp là mong muốn của nhiều nhà nghiên cứu, người chăn nuôi và người tiêu dùng [29]

Met, axit amin chứa sulfur (methionine và cysteine) và các axit amin khác như lysine, threonine và isoleucine đều được tổng hợp từ họ aspartate Aspartate kinase

là enzyme đầu tiên trong con đường chuyển hóa chung từ aspartate thành lysine, threonine, Met và isoleucine Enzyme này xúc tác quá trình phosphoryl hóa aspartate bằng cách thủy phân ATP tạo thành β-aspartyl phosphate [77] Thông thường, có ít nhất hai dạng aspartate kinase được tìm thấy trong thực vật β-aspartyl phosphate sẽ được chuyển hóa thành aspartate-semialdehyde và sau đó là homoserine, bởi sự xúc tác tương ứng của aspartic semialdehyde dehydrogenase và homoserine kinase Trong

vi khuẩn và nấm, homoserine là điểm trung gian tạo thành threonine và Met [77] Tuy nhiên, trong thực vật, điểm trung gian tạo thành threonine và sinh tổng hợp Met là O-phosphohomoserine (OPH), cơ chất chung cho hai enzyme threonine synthase (TS)

và cystathionine gamma-synthase (CgS) OPH có thể chuyển hóa trực tiếp thành threonine bởi sự tham gia của TS hoặc là tham gia vào cơ chế ba bước để tạo thành Met: phản ứng trùng ngưng cysteine và OPH tạo thành cystathionine, sau đó thành homocysteine và cuối cùng là thành Met, tương ứng nhờ enzyme cystathionine β-

lyase và homocysteine methyltransferase [40] (Hình 1.1) Cuối cùng, chỉ có khoảng

20% Met được sử dụng làm thành phần tạo nên protein, trong khi có đến 80% Met sẽ được biến đổi để tạo thành SAM, cũng là sản phẩm cuối cùng trong con đường sinh tổng hợp Met [32]

Hình 1.1 Quá trình sinh tổng hợp Methionine [40]

Việc tạo cây trồng biến đổi gen tác động vào hoạt động của các enzyme đã giúp tăng cường hiểu biết về quá trình sinh tổng hợp các amino axit chứa sulfur [73] Các nghiên cứu hiện nay đều khẳng định rằng có thể kiểm soát quá trình sinh tổng hợp Met trong thực vật thông qua mức độ cạnh tranh giữa CgS và TS với cơ chất chung của chúng là OPH [10, 40, 93] Khi hoạt động của TS giảm: thể đột biến

Arabidopsis (mto2) thể hiện hoạt tính của enzyme TS thấp, Met tự do được tạo thành

trong lá non tăng gấp 20 lần, kèm theo giảm 6% lượng threonine so với đối chứng, nhưng không có sự khác biệt ở cây trưởng thành [10] Kết quả này khẳng định rằng,

cây Arabidopsis non điều hòa sinh tổng hợp Met thông qua tương tác qua lại giữa CgS và TS [10] Trên khoai tây (Solanum tuberosum), Zeh và cs đã sử dụng RNA đối

mã (RNA antisense) của TS dưới sự kiểm soát của promoter CaMV35S Kết quả cho thấy các dòng chuyển gen có hoạt tính của TS giảm xuống 6%, đồng thời giảm 45% mức độ threonine, trong khi mức độ của Met tăng lên gấp 239 lần so với cây không chuyển gen Kết quả này đã tái khẳng định tỉ lệ enzyme TS đóng vai trò là điểm kiểm soát chính trong quá trình sinh tổng hợp Met trong khoai tây Điều này góp phần xây dựng chiến lược tăng cường hàm lượng Met và cải thiện chất lượng protein trong thực vật [93]

1.1.2 Các protein giàu Methionine

Met được mã hóa chỉ bởi duy nhất bộ ba AUG, đây là mã mở đầu, xác lập tín hiệu bắt đầu quá trình dịch mã sinh tổng hợp chuỗi polypeptit trên phân tử mRNA

Do đó, ở nhóm sinh vật nhân chuẩn và vi khuẩn cổ, Met thường xuất hiện ở đầu N (N-terminal) trong chuỗi peptide Tuy nhiên, Met có khả năng bị loại bỏ trong quá trình cải biến protein sau dịch mã Trung bình một protein chứa khoảng 1,5% gốc

Met trong toàn bộ chuỗi polypeptide [26] Trong Escherichia coli, hàm lượng Met

trung bình khoảng từ 1-3% (các protein giàu Met nhất: nhân tố kéo dài chuỗi polypeptide TU: 2,8%; các protein liên quan đến các điều kiện bất lợi oxy hóa KatE: 1,3%; HypT: 2%; MsrA: 3,3%) [26] Giá trị Met tương tự cũng đã được công bố với các protein nấm men và protein ở động vật [26]

Ở thực vật, một vài protein giàu Met (MRP) đã được nghiên cứu từ rất sớm trên nhiều loại cây trồng khác nhau như: quả hạnh nhân của Brazil [5], hạt hướng dương [50], ngô [49, 66], và lúa [60] Các MRP được tìm thấy trong hạt đều có hàm

lượng Met trong khoảng 11-22% [6] Prolamin từ ngô (Zea mays) được gọi là zein,

trong đó chiếm số lượng lớn là α-zein, các nhóm nhỏ hơn là β, γ, δ-zein [22] β-zein

và δ-zein là MRP với các gốc Met tập trung chủ yếu gần đầu C của phân tử Trong

đó, β-zein trong ngô có trọng lượng phân tử khoảng 17,5 kDa với 160 axit amin, với

18 gốc Met và 7 gốc cysteine [76] δ-zein được hình thành từ hai tiểu phần có trọng lượng phân tử khoảng 14,4 kDa và 21,1 kDa Cả hai tiểu phần này đều giàu Met: tiểu phần 21,2 kDa có chứa 26,9% Met, tiểu phần 14,4 kDa có chứa 22,8% Met [76] Phân

tử β-zein do một gen quy định trong khi đó δ-zein do 2 gen khác nhau mã hóa [76]

Gen mã hóa cho một MRP có tên gọi là 2S albumin đã được nghiên cứu khá

kỹ do protein này chứa hàm lượng cao Met, làm tăng giá trị cho cây trồng, đặc biệt

là cho các cây họ đậu và các loại cây trồng thu củ và rễ luôn có hàm lượng thấp các axit amin chứa sulfur như Met 2S albumin từ quả hạnh nhân của Brazil chứa 18% methionine, 2S albumin từ hoa hướng dương chứa 16% methionine [7] Protein 2S albumin cũng được biểu hiện trong một số loài thực vật như thuốc lá, hạt cải dầu và đậu tương [7] Hạt của một số loài đậu đã được tăng gấp đôi hàm lượng Met trong các protein do chuyển gen 2S albumin từ hoa hướng dương Tuy nhiên, việc cải thiện hàm lượng Met trong các loại hạt đậu vẫn không đủ để đáp ứng về hàm lượng Met cần thiết trong thức ăn chăn nuôi Bên cạnh đó, protein 2S albumin từ quả hạnh nhân Brazil và hoa hướng dương đã được biết là nguyên nhân gây dị ứng trong một số trường hợp [47] Chính vì vậy, việc phân lập và nghiên cứu protein giàu Met còn là

cơ sở để ứng dụng kỹ thuật di truyền nhằm cải thiện hàm lượng Met ở cây trồng

Năm 2000, Chakraborty và cs đã tinh sạch được protein mã hóa bởi gen AmA1 tách chiết từ hạt rau dền đỏ (Amaranthus hypochondriacus)[20] Protein AmA1 có hàm lượng cân bằng các axit amin thiết yếu gồm lysine, tryptophan, tyrosine, và axit amin chứa lưu huỳnh Đặc biệt là AmA1 không gây dị ứng do không tạo ra phản ứng với IgE Biểu hiện quá mức gen này trên khoai tây làm tăng hàm lượng Met 3-7 lần

so với kiểu dại [20]

Năm 2005, Izquierdo và Godwin đã tách dòng trình tự cDNA hoàn chỉnh mã

hóa cho δ-Kafirin, protein dự trữ giàu Met có mặt trong hạt cây cao lương (Sorghum bicolor L.) và biểu hiện thành công Protein δ-Kafirin có trọng lượng phân tử khoảng

16 kDa với 147 axit amin trong đó 17% là Met [44] Sử dụng PCR phiên mã ngược

và Realtime PCR cho thấy δ-kafirin chỉ biểu hiện ở những hạt đang trong giai đoạn

phát triển [44] So sánh trình tự DNA cho thấy gen mã hóa cho δ-Kafirin có độ tương đồng cao với gen mã hóa cho tiểu phần 14,4 kDa của δ-zein ngoại trừ thiếu đi một phần quy định vùng giàu Met Do vậy, hàm lượng Met có mặt trong δ-Kafirin thấp hơn trong δ-zein [76]

Vai trò của Met trong phân tử protein liên quan đến tính kỵ nước, tạo nên sự cuộn gấp để tạo thành các bậc cấu trúc không gian cho protein Met được tìm thấy nhiều tại phần lõi kỵ nước trong cấu trúc không gian của protein, trong khi ở các protein màng tế bào, Met liên kết với lớp lipit kép Tuy nhiên, đối với các protein có chứa Met bộc lộ bên ngoài bề mặt tiếp xúc thì rất dễ bị oxy hóa thành Met sulfoxide

(MetO) do tác động của các dạng oxy phản ứng [15] Do đó, MRP được xem như

protein mô hình để nghiên cứu một cách hiệu quả về sự oxy hóa Met trong các loài sinh vật khác nhau

1.2 Quá trình oxy hóa và sửa chữa oxy hóa Methionine

1.2.1 Những điều kiện bất lợi, nguyên nhân tạo các dạng oxy phản ứng

Quá trình sinh trưởng, phát triển và năng suất tối ưu của thực vật chịu ảnh hưởng nghiêm trọng bởi điều kiện bất lợi, đặc biệt là trong bối cảnh khí hậu trái đất

có nhiều thay đổi bất thường như hiện nay Gần đây, tổ chức Nông Lương Liên Hợp Quốc (FAO) đã chỉ ra rằng, điều kiện bất lợi từ môi trường sống ảnh hưởng đến 37% năng suất cây trồng trên toàn thế giới [46] Hạn hán và mặn hóa là nhân tố bất lợi chính mà cây trồng gặp phải Quá trình sống của thực vật và tạo sản phẩm thứ cấp phụ thuộc chủ yếu vào nước Gần 20% diện tích đất trên toàn thế giới đang bị thiếu nước cho sản xuất cây trồng và con số này sẽ ngày càng tăng lên khi diện tích đất trồng ngày càng bị sa mạc hóa [17] Điều kiện thiếu nước sẽ làm cho thực vật đóng các khí khổng, giảm hô hấp và quang hợp, giảm thể tích nước trong các mô thực vật, dẫn đến quá trình sinh trưởng chậm lại Do khí khổng đóng nên lượng CO2 trong lá

bị giảm xuống, ức chế quá trình cố định carbon nhưng lại làm tăng lượng các dạng oxy phản ứng (ROS) có mặt trong thực vật, dẫn đến điều kiện bất lợi do oxy hóa [38] Đất nhiễm mặn cũng gây ảnh hưởng lớn đến cây trồng, làm giảm đến 23% năng suất

cây trồng trên toàn thế giới [86] Tăng cường nồng độ muối trong đất làm giảm khả năng hấp thụ nước của thực vật Khi một lượng lớn Na+ và Cl- được đưa vào cây thông qua rễ, cả hai ion Na+ và Cl- đều gây ảnh hưởng tiêu cực đến sự phát triển do giảm quá trình trao đổi chất và giảm hiệu suất quang hợp [25]

Do quá trình công nghiệp hóa tăng nên tình trạng đất bị nhiễm ion kim loại nặng cũng là một vấn đề đáng được đề cập đến Các kim loại nặng cadmium (Cd), bạc, thủy ngân xâm nhập vào các hệ sinh thái từ nhiều nguồn khác nhau: khói bụi, nước thải của các xí nghiệp sản xuất chì, thiếc, sắt, thép, nước thải trong ngành đúc điện, trong phân lân bón cho cây trồng, trong các nhiên liệu diesel [34] Cd dễ dàng được cây hấp thụ và chuyển lên mạch xylem của lá, gây ức chế tăng trưởng, ảnh hưởng đến khả năng quang hợp, sự hấp thu các hợp chất vi lượng và đa lượng dẫn đến giảm năng suất cây trồng [11] Điều quan trọng là Cd sẽ đi vào chuỗi thức ăn và gây ra mối đe dọa cho sức khỏe con người cũng như các nhóm động vật khác [21] Kim loại này có thể gây độc tế bào theo cách trực tiếp hay gián tiếp và có thể được giải thích thông qua cấu trúc hóa học của nó Cd có thể liên kết với nhóm -SH của các protein và enzyme, làm cho protein, enzyme bị mất đi cấu hình, không hoạt động được chức năng, đặc biệt là với nhóm enzyme làm nhiệm vụ thu dọn ROS [24] Bên cạnh đó, cơ chế gây độc quan trọng của cadmium với tế bào thực vật do sự tương đồng về mặt hóa học của Cd2+ và các ion kim loại liên kết với vị trí hoạt động của enzyme hay các yếu tố truyền tin Cd2+ ảnh hưởng đến cơ chế nội cân bằng của các ion kim loại thiết yếu và các ion kim loại hóa trị 2 như Fe và Zn, giải phóng ion Fe/Cu

tự do gây kích thích hiệu ứng Fenton gây ra ROS, tăng các quá trình tổn thương do oxy hóa [24] Chính vì vậy, Cd cũng như các ion kim loại nặng khác, dẫn đến điều kiện bất lợi do oxy hóa và tăng cường hàm lượng ROS trong thực vật bằng cách gây rối loạn quá trình loại bỏ ROS của các chất chống oxy hóa [24]

Paraquat (1,1 dimethyl-4,4’-bipyridynium dichloride) là thuốc diệt cỏ dạng bipyridinium, lần đầu tiên được công nhận hoạt tính diệt thực vật vào năm 1955 [39] Cho đến nay, paraquat vẫn giữ được tầm quan trọng của nó bên cạnh các loại thuốc diệt cỏ khác có nguồn gốc từ glyphosate và glufosinate Paraquat là thuốc diệt cỏ có

hoạt lực nhanh, làm đảo chiều chiều dòng điện tử của quang hệ I (PSI) xảy ra trong lục lạp Kết quả là gây nên sự tích lũy superoxide trong lục lạp [39] Superoxide được tạo

ra một cách liên tục và nhanh chóng sẽ lấn át các cơ chế bảo vệ nội sinh của thực vật

và gây ra hàng loạt ảnh hưởng tiêu cực đến thực vật Paraquat có thể dễ dàng thâm nhập xuyên qua lớp biểu bì lá, làm giảm khả năng quang hợp một cách nhanh chóng, gây mất sức trương và làm vỡ màng tế bào Các dấu hiệu này được nhận thấy chỉ sau vài giờ xử lý với paraquat trong điều kiện ánh sáng liên tục và cuối cùng là các mẫu

mô bị mất nước và mất màu hoàn toàn [39] Lá cây Arabidopsis thaliana 3 tuần tuổi

kiểu dại được ngâm trong dung dịch paraquat 4 µM Sau 2 ngày thí nghiệm dưới điều kiện ánh sáng liên tục, lá cây bị mất màu hoàn toàn do paraquat là hợp chất sản sinh ROS làm phân hủy diệp lục và phá vỡ các tế bào [91]

Các dạng oxy phản ứng (ROS) là khái niệm để chỉ các dẫn xuất của oxy có khả năng oxy hóa mạnh ROS được chia thành hai nhóm: nhóm các gốc tự do (có chứa electron liên kết chưa cặp đôi) và nhóm các dẫn xuất không phải gốc tự do Các ROS không phải gốc tự do dễ dàng chuyển hóa thành các gốc tự do trong quá trình phản ứng oxy hóa Một số ROS là gốc tự do điển hình bao gồm hydroxyl, superoxide và nitric oxide; trong khi oxy mức đơn và peroxynitrile là các ROS không phải gốc tự do thường

gặp trong các quá trình sinh hóa (Bảng 1.1) [19]

Bảng 1.1 Các ROS trong cơ thể sinh học [19]

trong tế bào, những nơi xảy ra chuỗi dẫn truyền điện tử như lục lạp, ti thể, peroxisome [31], có khoảng 1-2% oxy trong các mô tế bào thực vật sẽ tạo thành ROS [31] Dưới điều kiện ánh sáng, lục lạp và peroxisome là nơi hình thành đa số ROS có mặt trong các mô, tế bào thực vật, nhưng trong điều kiện không có ánh sáng thì ty thể lại là bào quan chính tạo nên ROS [31] Khi được duy trì ở nồng độ thấp, ROS đóng vai trò như tín hiệu phân tử để kiểm soát quá trình sinh trưởng, phát triển của thực vật, kích thích các con đường giúp cây chống chịu lại với các điều kiện bất lợi, tín hiệu cho quá trình già hóa và đưa tế bào vào con đường chết theo chu trình [13]

Tuy nhiên, khi gặp điều kiện sống bất lợi từ môi trường (như hạn hán, lạnh, nóng, nấm bệnh ), nồng độ ROS tăng lên một cách đột ngột, có thể làm tổn thương các cấu trúc tế bào do tác động tiêu cực làm thay đổi tính thấm, độ dẫn điện, phân giải thành phần phospholipid, dẫn đến phá hủy màng nội chất, gây chết các tế bào, tổn thương các cơ quan [31] Khi nồng độ ROS càng tăng cao thì càng đem lại nhiều hậu quả nghiêm trọng Nghiên cứu cũng chỉ ra ROS có thể đóng các vai trò phá hủy, bảo vệ hoặc truyền tín hiệu, tùy thuộc vào các quá trình cân bằng giữa sự sản sinh và loại bỏ ROS tại các trung tâm hoạt động theo thời gian [31] Khi điều kiện môi trường thay đổi, những tín hiệu đáp ứng sớm được tạo ra bao gồm: tăng tỷ lệ ion đi qua màng tế bào, tăng cường Ca2+ có mặt trong bào tương, kích hoạt protein MAPKs và đặc biệt là sản sinh ra ROS chỉ sau một vài phút bị kích thích bởi các tác nhân sinh học và phi sinh học ROS được sinh ra ở các bào quan khác nhau và dẫn đến sự thay đổi của hệ phiên mã trong nhân tế bào, do vậy thông tin phải được chuyển từ các bào quan đến nhân tế bào Các tín hiệu thông qua ROS cần phải được tiếp nhận và khuếch đại, thường là thông qua kinase hay phosphatase Cuối cùng, sự thay đổi trong biểu hiện gen xảy ra nhờ hoạt động của các nhân tố phiên mã và các yếu tố có mặt trên promoter Vùng promoter của một

số gen cảm ứng bởi điều kiện bất lợi chứa yếu tố cis [90] Các nhân tố phiên mã khác nhau tương tác với yếu tố cis và hình thành phức hệ khởi đầu quá trình phiên

mã Phức hệ khởi đầu phiên mã hoạt hóa RNA polymerase để bắt đầu quá trình phiên mã của gen đáp ứng khi bị tổn thương [90] Axit abscisic (ABA) đóng vai

trò quan trọng trong đáp ứng của thực vật với điều kiện bất lợi như hạn hán và chịu mặn, cũng như đóng vai trò trong quá trình nảy mầm và trạng thái ngủ của hạt [25] Vùng promoter của một số gen cảm ứng bởi ABA khi so sánh với các promoter của gen khác thì được nhận thấy là thường chứa vùng trình tự bảo toàn ACGTGGC, được gọi là yếu tố đáp ứng với ABA (ABRE) [2] ABRE đầu tiên

được tìm thấy trên gen Em của lúa mì, có chức năng chính trong quá trình phát sinh phôi của hạt, và gen RAB16 của lúa gạo, đóng vai trò trong quá trình trưởng thành của hạt và các mẫu mô thực vật bị mất nước [90] ABRE là yếu tố cis chính

có mặt trong các gen cảm ứng với ABA [2] Bên cạnh đó, các yếu tố điều hòa trên promoter của những gen phụ thuộc vào phản ứng với ABA còn chứa trình tự nhận biết cho các protein MYB và MYC Trình tự DNA đặc hiệu MYC và MYB là CACATG (MYCR) và (A/C)ACC(A/T)A(A/C)C (MYBR), được phát hiện trên

vùng promoter của gen RD22 Các nhân tố phiên mã AtMYC và AtMYB bám vào

trình tự DNA đặc hiệu MYCR và MYBR và hoạt hoá biểu hiện gen chức năng

trong điều kiện mất nước [2] Trong khi ABRE, MYBR, MYCR là trình tự cis cảm

ứng điều kiện khô hạn thì ICEr2 – cảm ứng biểu hiện CBF vùng 2 (Induction of

CBF Expression region 2) lại là yếu tố cis cảm ứng trong điều kiện lạnh [90] Cuối cùng, khi gây tổn thương cho mô lá A thaliana bằng cách tạo ra các điều kiện cực

đoan, một số gen đáp ứng nhanh với điều kiện bất lợi đã được tìm thấy Trên vùng promoter của các gen phản ứng nhanh với điều kiện bất lợi, người ta đã tìm thấy

một yếu tố cis mới và được gọi là yếu tố đáp ứng nhanh với điều kiện bất lợi (RSRE - Rapid Stress Response Element) [12] Các yếu tố cis tham gia điều hòa

biểu hiện gen trong điều kiện bất lợi được thể hiện qua Bảng 1.2

Bảng 1.2 Một số yếu tố cis đáp ứng với điều kiện bất lợi

Tài liệu tham khảo

ABRE (C/G/T)ACGTG(G/T)(A/C) bZIP Hạn hán, đáp ứng

phụ thuộc ABA [90] MYBR (C/G/T)ACGTG(G/T)(A/C) MYB Hạn hán, đáp ứng

Chịu lạnh, hạn hán, bị côn trùng

và vi khuẩn tấn công

[12]

Hydrogen peroxide có khả năng oxy hóa trực tiếp hai axit amin có chứa lưu huỳnh là Cys và Met Đặc biệt, việc oxy hóa cysteine đã được tập trung ở nhiều nghiên cứu khác nhau, tình trạng oxy hóa khác nhau cũng dẫn đến những thay đổi khác nhau đối với protein [23, 88] Ngược lại, sự oxy hóa Met nhận được ít sự quan tâm hơn Trong thực vật, chức năng của protein bị thay đổi do quá trình oxy hóa Met

đã từng được công bố [45]

1.2.2 Quá trình oxy hóa Methionine bởi các dạng oxy phản ứng

Khi ROS tồn tại ở hàm lượng cao, Met tự do cũng như Met trên các phân tử protein dễ dàng bị oxy hóa để tạo thành Met sulfoxide (MetO) và Met sulfone (MetO2) khi gắn thêm các nguyên tử oxy (Hình 1.2) [26] MetO tồn tại với hai dạng

đồng phân quang học là methionine-S-sulfoxide (Met-S-O) và sulfoxide (Met-R-O) Ngược lại với MetO2 (một hợp chất hiếm khi được tìm thấy trong các hệ thống sinh học), cần một lực oxy hóa mạnh và không có tính thuận nghịch thì quá trình chuyển hóa giữa Met và MetO lại có tính thuận nghịch

methionine-R-Hình 1.2 Sự tạo thành Met sulfoxide và Met sulfone từ Met [26]

Protein là mục tiêu mạnh nhất của quá trình oxy hóa gây ra bởi các gốc tự do

so với các đại phân tử khác như lipid và DNA, chiếm đến 68% phân tử bị oxy hóa trong tế bào [70] Trong tự nhiên, Met đóng vai trò như chất chống oxy hóa, bảo vệ protein cũng như các đại phân tử khác Dưới điều kiện hiếu khí, có tới 6% Met trong protein có thể cùng bị oxy hóa đồng thời Tuy nhiên, không phải tất cả các gốc Met trong protein có cùng mức nhạy cảm đối với quá trình oxy hóa; mức này phụ thuộc vào việc các tác nhân oxy hóa có thể tiếp cận Met ở các vị trí khác nhau bên trong cấu trúc protein như nằm ở bề mặt hay trong phần lõi protein Shechter đã phát hiện chỉ các gốc Met trong chuỗi peptide và protein đã bị biến tính đều bị oxy hóa hoàn toàn, trong khi đối với các protein tự nhiên thì chỉ các gốc Met nằm ở bề mặt mới có thể bị oxy hóa [74]

Glutamine synthetase có nguồn gốc từ Escherichia coli đã được sử dụng để

nghiên cứu ảnh hưởng của H2O2 đến các gốc Met Kết quả cho thấy là những gốc Met nằm trên bề mặt đều bị oxy hóa trong khi những gốc nằm trong phần lõi hầu như không bị ảnh hưởng bởi H2O2 Trong tổng số 16 gốc Met có mặt trong glutamine synthetase thì có đến 8 gốc bị oxy hóa nhưng hoạt tính của enzyme lại không hề bị thay đổi [26] Điều này được giải thích là do glutamine synthetase có các gốc Met ở tập trung xung quanh trung tâm hoạt động của enzyme để bảo vệ chúng khỏi các dạng

oxy phản ứng Do đó, Met không những có nhiệm vụ bảo vệ các axit amin khác mà còn bảo vệ các protein tránh bị mất chức năng dưới tác động của ROS [26]

α-2 Macroglobulin là chất ức chế protease, hoạt động chủ yếu ở những vị trí

bị viêm nhiễm, là nơi rất dễ bị ROS tấn công [48] Mỗi một tiểu phần α-2 macroglobulin có thể loại bỏ được ít nhất 10 mol dạng oxy hoạt động, tương ứng với một lượng gốc Met chuyển hóa thành MetO [69] Nếu dạng oxy phản ứng hoạt động mạnh, sẽ dẫn đến quá trình oxy hóa gốc tryptophan và làm bất hoạt protease Chính

vì vậy, Met đóng vai trò như “vệ sĩ phân tử” bảo vệ các gốc tryptophan đơn mang tính chất quan trọng trong protein [48]

Các gốc Met trong protein thường được bố trí sao cho chúng tạo thành liên kết

kỵ nước với các axit amin mạch vòng như tryptophan, phenylalanine và tyrosine [87] Liên kết này khá phổ biến và giúp ổn định cấu trúc phân tử protein với mỗi liên kết chứa 1,0–1,5 kcal/mol, xấp xỉ bằng năng lượng của liên kết ion trong muối ăn NaCl [87] Các axit amin mạch vòng rất dễ bị tấn công bởi ROS, bởi vậy thiết lập tương tác với các gốc Met là cách để chúng tránh khỏi sự tấn công bởi ROS Tuy nhiên, quá trình oxy hóa Met cũng sẽ phá vỡ các liên kết kỵ nước, do đó phá vỡ cấu trúc không gian ba chiều của protein [48] Ảnh hưởng của quá trình oxy hóa lên đặc tính của các protein là rất khác nhau Đối với một số enzyme, oxy hóa Met thành MetO hay thậm chí là thay thế Met bằng các axit amin khác có thể chỉ có ảnh hưởng nhỏ đến hoạt tính của enzyme nhưng cũng có thể dẫn đến mất hoạt tính xúc tác, mất đi khả năng điều hòa các quá trình trao đổi chất [79]

Khi nghiên cứu trên Arabidopsis thaliana, Gustavsson và cs đã nghiên cứu

ảnh hưởng của ROS trên Hsp21, protein sốc nhiệt có hoạt tính giống như chaperone Hsp21 có mặt ở lục lạp, với đầu C bảo thủ và đầu N biến đổi Điều thú vị là đầu N lại chứa những trình tự giàu Met có tính bảo thủ cao Cấu trúc bậc 2 của chuỗi protein này được dự đoán là do sự có mặt của trình tự giàu Met tạo nên chuỗi xoắn α lưỡng cực do tất cả Met đều nằm về một bên của phân tử Khi các gốc Met này bị oxy hóa dẫn đến Hsp21 bị mất đi chức năng do cấu trúc không gian của phân tử protein bị phá

vỡ [35] Sau đó, để nghiên cứu tầm quan trọng của các gốc Met có mặt trên phân tử,

thể đột biến Hsp21 trên Arabidopsis thaliana đã được tạo ra bằng cách thay thế tất cả

các gốc Met thành leucine Nguyên nhân là do Met và leucine đều là các axit amin

kỵ nước, tương tự nhau về mặt cấu trúc nhưng khác nhau là leucine không có sulfur

do đó không bị ảnh hưởng bởi quá trình oxy hóa bởi ROS Kết quả cho thấy là thể đột biến Hsp21 không bị mất đi hoạt tính enzyme, nhưng mất đi khả năng kiểm soát quá trình oxy hóa khử [36]

Calmodulin chứa trình tự giàu Met, là protein có bốn vị trí gắn với canxi riêng biệt Khi được gắn với canxi, calmodulin sẽ hoạt hóa nhiều protein tham gia vào các chuỗi dẫn truyền tín hiệu tế bào như các nhân tố phiên mã, protein kinase, phosphatase và các kênh vận chuyển ion [81] Chuỗi Met có mặt trên phân tử đặc biệt phù hợp với chức năng này do là chuỗi không phân nhánh, góc xoắn linh hoạt, có

phân tử lưu huỳnh phân cực nên ái lực van der Waal mạnh Ái lực này sẽ bị giảm

đáng kể khi Met bị chuyển hóa thành MetO Do đó các MRP có Met bị chuyển hóa

thành MetO dưới ảnh hưởng của ROS sẽ có cấu trúc bậc 2 chuyển từ dạng xoắn α sang dạng gấp nếp β [35] Đặc biệt là việc oxy hóa Met nằm gần đầu C dẫn đến việc

calmodium bị mất đi khả năng hoạt hóa Ca-ATPase trên màng tế bào chất [30] Như vậy, ROS làm thay đổi cấu trúc của protein do làm thay đổi cơ chế liên kết, calmodulin bị giảm liên kết tạo chuỗi với Ca-ATPase trên màng tế bào chất, mất đi khả năng hoạt hóa các enzyme tham gia vào chuỗi dẫn truyền tín hiệu [30] Trong sinh vật sống, MetO được sửa chữa thành Met bởi sự xúc tác của enzyme Methionine sulfoxide reductase (Msr)

1.2.3 Quá trình sửa chữa oxy hóa Methionine

Trong suốt quá trình tiến hóa, thực vật đã sản sinh ra hệ thống kiểm soát và điều hòa ROS một cách chặt chẽ Đáng chú ý là 2 cơ chế liên quan đến vai trò của: (i) Các chất chống oxy hóa nội bào không có hoạt tính enzyme (non‒enzymatic antioxidant) gồm ascorbate, glutathione, tocopherol, flavonoids, alkaloids và carotenoid (ii) Hệ thống các enzyme loại bỏ ROS (enzymatic antioxidant) ở thực vật gồm superoxide dismutase, catalase, ascorbate peroxidase, methionine sulfoxide

reductase (Msr), peroxiredoxin và glutathione peroxidase [46] Ở Arabidopsis thaliana, có ít nhất 152 gen đã được biết đến, mã hóa cho các enzyme tham gia vào

quá trình sản sinh và loại bỏ ROS trong tế bào [46]

Oxy hóa Met xảy ra trong điều kiện hiếu khí là điều không thể tránh khỏi, chính vì vậy các tế bào trong sinh vật sống đã phát triển nhiều cơ chế phức tạp cũng như các enzyme để chống lại quá trình oxy hóa Met Ngược lại với MetO2, MetO có thể được chuyển hóa một cách thuận nghịch thành Met nhờ xúc tác của enzyme Msr

Msr đầu tiên đã được mô tả trong E.coli vào năm 1981 [16] và sau đó được biết đến

là MsrA Hai mươi năm sau đó, MsrB cũng đã được phát hiện Người ta thấy rằng,

MsrA tham gia quá trình khử Met-S-O trong khi MsrB khử Met-R-O về dạng Met

(Hình 1.3) MsrA có thể tham gia khử dạng Met-S-O tự do và Met-S-O trên protein

trong khi MsrB khử Met-R-O tự do thành Met kém hiệu quả hơn so với dạng liên kết

trong protein do ái lực thấp hơn với cơ chất này ở dạng tự do [55] Cả MsrA và MsrB đều là những enzyme có tính bảo thủ cao trong vi khuẩn nhân thực, tế bào nhân thực bao gồm cả tế bào người và hầu hết các sinh vật có chứa cả 2 dạng enzyme MsrA và MsrB MsrA là một dạng enzyme phổ biến, được tìm thấy trong hầu hết các sinh vật

từ vi khuẩn [63] đến cây trồng [72] đến động vật có vú [63], trong đó có cả người

[51] Gần đây, một họ enzyme Msr mới được tìm thấy ở E.coli, chỉ có tính đặc hiệu trong hoạt tính khử Met-R-O dạng tự do và không có khả năng khử MetO liên kết trong protein được gọi là fRMsr (free Met-R-O) Đặc biệt, fRMsr chỉ được tìm thấy

trong một vài sinh vật đơn bào [26]

Hình 1.3 Phản ứng khử MetO về Met của các Msr

Arabidopsis thaliana chứa 5 gen mã hóa cho 5 protein MsrA khác nhau bao

gồm MsrA1, MsrA2, MsrA3 nằm trong bào tương, MsrA4 nằm trong lục lạp và MsrA5 với đích đến là các con đường tiết trong cơ thể [45] Chín MsrB có mặt trong

Arabidopsis cũng có đích đến là các bào quan khác nhau; MsrB1 và B2 có mặt trong

lục lạp, MsrB3 đích đến là con đường tiết, trong khi 6 MsrB còn lại có mặt trong bào tương của tế bào [45] Phân tích biểu hiện của những gen này dựa vào kỹ thuật

microarray (vi dãy) cho thấy msrB1, msrB2 và msrB6 được biểu hiện chủ yếu ở lá trong khi các msrB5, msrB7, msrB8 và msrB9 lại được tìm thấy chủ yếu trong rễ cây Arabidopsis [56] Các loài thực vật khác như các cây thuộc họ bạch dương có chứa 5

gen mã hóa cho MsrA và 4 gen mã hóa cho MsrB, ở lúa gồm 4 protein MsrA và 3 protein MsrB, trong khi ở động vật có vú số lượng Msr tổng số trung bình chỉ khoảng

4 gen mã hóa cho Msr (Bảng 1.3) [45]

Bảng 1.3 Số lượng gen MsrA và MsrB ở một số nhóm sinh vật [45]

Sinh vật nhân sơ quang

Sinh vật nhân sơ không

Sinh vật nhân chuẩn

không quang hợp

Việc ứng dụng các kỹ thuật di truyền để bất hoạt hay biểu hiện quá mức các gen Msr đã chỉ ra 2 chức năng chính của chúng trong tế bào: bảo vệ tế bào chống lại các điều kiện cực đoan do oxy hóa và điều hòa chu trình sống Bất hoạt các gen

mã hóa cho MsrA làm tăng độ nhạy cảm của vi khuẩn, nấm men, giun tròn

(Caenorhabditis elegans), chuột và thực vật với các điều kiện bất lợi oxy hóa

Ngược lại, tăng cường biểu hiện của các gen mã hóa cho MsrA làm tăng khả năng

chống lại điều kiện bất lợi oxy hóa ở ruồi giấm (Drosophila), các tế bào động vật

có vú và thực vật [83] MsrA2 có vai trò điều hòa quá trình phát triển của A thaliana

dưới điều kiện bình thường Khi gen mã hóa cho MsrA2 bị bất hoạt thì quá trình sinh trưởng và phát triển của cây bị chậm lại dưới điều kiện ngày ngắn, tuy nhiên lại không bị ảnh hưởng dưới điều kiện ngày dài [26] Enzyme MsrB7và MsrB8

trong bào tương của A thaliana giúp cây chống lại những ảnh hưởng tiêu cực khi

bị xử lý với H2O2 và methyl viologen, là gốc hoạt động của paraquat một trong những thuốc trừ cỏ được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp [26, 56] MsrB2 trong một loài ớt (Capsicum annuum) đóng vai trò quan trọng trong cơ chế kháng lại mầm bệnh [26] Tuy nhiên, các protein đích của cả MsrA và MsrB trên thực vật vẫn chưa được biết đến nhiều Do vậy tác động của Msr này lên các quá trình đặc biệt của tế bào vẫn chưa được làm rõ [56, 83]

Có thể thấy rằng, khử MetO thành Met với sự tham gia của enzyme Msr là một quá trình được ghi nhận ở hầu hết các tế bào sinh vật trong sinh giới Quá trình này liên quan trực tiếp đến các vấn đề lão hóa, khả năng đề kháng của sinh vật đến

sự thay đổi của môi trường Tuy nhiên trong điều kiện môi trường sống có nhiều bất lợi như hiện nay, đảm bảo cân bằng giữa việc sản sinh và loại bỏ ROS bị phá vỡ bởi nhiều tác nhân bất lợi như ánh sáng cao, hạn hán, nhiệt độ thấp hoặc cao và những tổn thương cơ học [9] Chính điều đó đã gây ra ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và phát triển của cây trồng dẫn đến những thiệt hại lớn về sản lượng

1.3 Tình hình nghiên cứu về protein có methionine mẫn cảm với các dạng oxy phản ứng

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trên thế giới, các công trình nghiên cứu về sự oxy hóa Met bởi ROS trên các phân tử MRP và quá trình sửa chữa bởi enzyme Msr đã được thực hiện khá công phu

Từ năm 1989, Reddy và cs đã chỉ ra α-2-macroglobulin đóng vai trò như chất ức chế protease và hoạt động tại những vị trí sưng tấy, nơi có khả năng bị tấn công cao bởi ROS Tại đó, mỗi tiểu phần của α-2-macroglobulin có khả năng thu dọn ít nhất 10 mole chất oxy hóa với lượng tương ứng chuyển hóa Met thành MetO Nhưng nếu cứ tiếp tục phải đối mặt với các tác nhân oxy hóa, tryptophan sẽ bị chịu tác dụng của ROS, dẫn đến bất hoạt α-2-macroglobulin [68] Năm 2002, Gustavsson và cs đã gây sốc nhiệt nhẹ protein Hsp21 nằm trong lục lạp Kết quả là protein này bị bất hoạt do các Met trên bề mặt phân tử chuyển hóa thành MetO Cuối cùng, protein lại được hoạt hóa do tác dụng của Msr làm giảm lượng MetO [37]

Các ảnh hưởng của MetO đến các protein trong chuỗi dẫn truyền tín hiệu cũng được ghi nhận [18, 28, 46] Nhóm nghiên cứu Takahashi và cs đã nghiên cứu trên protein Calmodulin tham gia vào quá trình dẫn truyền tín hiệu trong tế bào và chức năng ổn định ROS trên đối tượng thực vật [81] Mối liên quan giữa quá trình oxy hóa Met với sự mất ổn định cấu trúc của protein calmodulin [26] và sự mất chức năng của protein này [26, 46, 78] cũng được ghi nhận

Việc phát hiện một cách có hệ thống các protein có Met mẫn cảm với tác nhân oxy hóa, sự oxy hóa Met cũng như sửa chữa bởi Msr đã được rất nhiều nhà khoa học tập trung nghiên cứu Các phương pháp xác định bao gồm khối phổ, sửa đổi các gốc Met và MetO kết hợp với phân tích axit amin, dựa vào phân tích phóng xạ, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và phương pháp miễn dịch sử dụng các kháng thể đặc hiệu với các dạng MetO [26]

Rosen và cs sử dụng phương pháp khối phổ để phân tích khả năng phân giải

protein của các tế bào E.coli khi bị xử lý bởi H2O2, HOCl hoặc với bạch cầu trung

tính (neutrophil) Các phân đoạn peptide được phân tích bằng sắc ký lỏng kết hợp với đầu dò ion hóa kết hợp phương pháp khối phổ Peptide được phát hiện tăng 16 Da [71] Đây là kết quả của quá trình oxy hóa Met thành MetO Nhóm tác giả đã phát

hiện có khoảng 10-50% các gốc Met trong protein E.coli bị oxy hóa khi tiếp xúc với

HOCl hoặc bạch cầu phụ thuộc vào điều kiện thí nghiệm Protein nằm ở vỏ tế bào có mức độ mẫn cảm cao đối với sự oxy hóa Met, trong khi Met gắn trên các protein thuộc tế bào chất và nội màng hầu như không bị oxy hóa [71] Điều này cho thấy các protein nội bào được bảo vệ trước tác dụng của HOCl Tuy nhiên, đáng tiếc rằng nghiên cứu này lại không chỉ ra được danh sách hoàn chỉnh các protein và vị trí các gốc Met bị mẫn cảm với quá trình oxy hóa

Shechter và cs đã sử dụng phương pháp sửa đổi bằng hóa học để xác định các gốc MetO khi vẫn có mặt gốc Met trong phân tử protein Protein đã bị oxy hóa được

xử lý với cyanogen bromide trong điều kiện 80% axit formic Phản ứng của protein

có chứa Met với cyanogen bromide làm đứt liên kết peptide tại vị trí carboxyl của phân tử Met Phản ứng này làm đứt các liên kết peptide trong chuỗi peptide một cách

có định hướng Sau khi xử lý, các gốc Met sẽ bị chuyển hóa thành homoserine còn gốc MetO được giữ nguyên Mẫu protein lại tiếp tục được đông khô và thủy phân trong môi trường HCl 6N có chứa dithioerythritol để toàn bộ MetO sẽ bị khử để trở

về dạng Met (trên 95% tổng số lượng MetO sẽ bị chuyển hóa) Cuối cùng, homoserine

và Met sẽ được đo bằng phương pháp phân tích axit amin, tương ứng với hàm lượng Met và MetO để chỉ ra tổng số gốc Met mẫn cảm với quá trình oxy hóa của protein [75] Tuy nhiên, phương pháp này không sử dụng được để phân tích axit amin tự do

Năm 2008, Le và cs đã rất nỗ lực khi nghiên cứu sự oxy hóa Met và sự khử MetO thông qua việc sử dụng protein có Met mẫn cảm với các tác nhân oxy hóa Nhóm tác giả đã thành công khi phân lập và biểu hiện ba MRP và phát triển các phương pháp kiểm tra quá trình oxy hóa Met và khử MetO thông qua điện di protein SDS-PAGE và tạo kháng thể nhận biết MetO nhờ kỹ thuật lai miễn dịch [53] Le và

cs (2009) cũng đã chỉ ra rằng việc biểu hiện quá mức gen mã hóa Msr có thể đem lại tính kháng tác nhân oxy hóa cho tế bào nấm men hoặc tế bào động vật [52] Bên cạnh

đó, Liang và cs đã tách dòng, biểu hiện, tinh sạch và phân tích khối phổ cho bốn MRP mới (chứa > 20% Met, chứa ít hay thiếu cystein) để nghiên cứu quá trình oxy hóa Met và quá trình sửa chữa được diễn ra nhờ Msr [57] Thông qua đó, natri hypochlorite (NaOCl) được chỉ ra là có hiệu quả cao trong việc tạo MetO trên MRP

Gần đây, Tarrago và cs đã sử dụng sắc ký ái lực như là một cách tiếp cận để

dò tìm các protein là cơ chất (đích tác động) của Msr mà cụ thể là AtMsrB1 Kết quả

đã chỉ ra 24 protein có vai trò trong quá trình quang hợp, dịch mã và tham gia vào quá trình bảo vệ cây chống lại những bất lợi về oxy hóa cũng như có vai trò trong quá trình sinh tổng hợp đường và các axit amin Bên cạnh đó, đa số đích tác động của MsrB1 là các protein chứa hàm lượng cao Met [84] Năm 2015, Jacques và cs đã sử dụng một phương pháp mới được gọi là COFRADIC để khảo sát phân bố của các vị trí MetO trên hệ protein của cây mô hình trong điều kiện bất lợi oxy hóa [45] Sử

dụng cây Arabidopsis thaliana bị bất hoạt enzyme catalase 2, nhóm tác giả đã tìm

thấy gần 500 vị trí Met bị oxy hóa trong 400 protein, đồng thời cũng định lượng protein giữa cây đột biến bất hoạt enzyme catalase 2 và cây kiểu dại Catalase 2 là enzyme catalase chính có mặt ở trong lá, với nhiệm vụ là bảo vệ các tế bào khỏi các tổn thương oxy hóa bằng cách xúc tác quá trình chuyển hóa hydrogen peroxide thành nước và oxy phân tử Hoạt tính của haiglutathione S-transferase (GSTF) là GSTF9

và GSTF23 có dấu hiệu giảm rõ rệt trong điều kiện cực đoan [45]

Mặc dù việc oxy hóa và khử gốc oxy hóa ở các gốc Met trong calmodulin và các protein truyền tín hiệu canxi khác đã được chứng minh là tham gia vào việc điều hòa chức năng protein [26, 28, 78], tuy nhiên người ta vẫn không biết được các ứng viên tiềm năng để tiếp cận bằng phương pháp sắc kí ái lực và khối phổ [26, 45, 84] Hiện nay, có bao nhiêu protein mẫn cảm với oxy hóa Met và trong số đó có bao nhiêu protein có thể được sửa chữa bởi Msr vẫn là điều chưa được biết đến

1.3.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Ở Việt Nam, bước đầu đã có một số nghiên cứu về ảnh hưởng của các dạng oxy phản ứng đến cây trồng như Mai Văn Chung đã công bố một số kết quả bước đầu

về biểu hiện của các dạng oxy phản ứngtrong phảnứng bảo vệ của cây đậu (Pisum sativum L.) khi chịu sự tấn công của rệp đậu (Acyrthosiphon pisum Harris) - loại côn

trùng chích hút nhựa cây có mức độ pháhoại được đánh giá là nguy hiểm đối vớinhiều cây trồng họ Fabaceae [1] Bên cạnh đó, điều kiện tách chiết cũng là nhân tố ảnh hưởng lớn đến hoạt tính chống oxy hóa của diệp hạ châu, một loài dược liệu quý được trồng phổ biến theo quy mô công nghiệp tại nhiều tỉnh của Việt Nam [3]

Tuy nhiên, đó mới chỉ là những nghiên cứu rất sơ lược, bước đầu về ảnh hưởng của các dạng oxy phản ứng với thực vật tại Việt Nam Tính đến thời điểm hiện nay, vẫn chưa có bất kỳ công bố chính thức nào về các protein chứa Met mẫn cảm với các tác nhân oxy hóa, sự oxy hóa Met và ảnh hưởng qua lại của chúng đến hoạt động của Msr trên thực vật

Đồng thời, để phát hiện và chứng minh các protein đích tiềm năng cho việc can thiệp bằng kĩ thuật di truyền, chúng ta cần phải biết protein nào là mẫn cảm với oxy hóa Met và bao nhiêu trong số chúng có thể sửa chữa bởi Msr Chính vì vậy,

chúng tôi đã tiến hành “Nghiên cứu vai trò của protein giàu Methionine trên cây

Arabidopsis thaliana” Nghiên cứu này hứa hẹn mở ra một hướng nghiên cứu mới

về protein chứa Met mẫn cảm với quá trình oxy hóa tại Việt Nam

Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu

Sau khi tìm được các gen mã hóa MRP đáp ứng phiên mã với điều kiện bất

lợi, các dòng Arabidopsis biểu hiện quá mức các gen này được tìm kiếm trên cơ sở

dữ liệu của Trung tâm Tài nguyên Sinh học RIKEN (RIKEN BRC, Nhật Bản) Hạt

Arabidopsis thaliana kiểu dại chủng Columbia (Col-0) được sử dụng cho các thí nghiệm Hạt Arabidopsis thaliana biểu hiện quá mức gen mã hóa MRP nằm trong

thư viện dòng FOX (Full-length cDNA Over-eXpressing), được cung cấp bởi Trung tâm Tài nguyên Sinh học RIKEN, Tsukuba, Nhật Bản Trong thư viện dòng FOX,

cDNA hoàn chỉnh của Arabidopsis được điều khiển bởi promoter 35S và được chèn

vào plasmid mang gen chống chịu kháng sinh hygromycin Plasmid được chuyển vào

cây Arabidopsis bằng phương pháp nhúng hoa Dòng cây chuyển gen biểu hiện quá mức gen At3G55240 đã được nghiên cứu bởi Ichikawa và cs (2006) [43]

2.1.2 Hóa chất

Các hóa chất chính sử dụng được liệt kê trong Bảng 2.1

Bảng 2.1 Các hóa chất chính được sử dụng trong nghiên cứu

1 Murashige & Skoog medium

chứa các vitamin Duchefa (Hà Lan) Môi trường nảy

mầm hạt và thử mức độ nhạy cảm với điều kiện bất lợi

4 Paraquat diclorua Syngenta (Indonesia)

5 Cadmium clorua Himedia (Ấn Độ)

2.1.3 Thiết bị

Các thiết bị và máy móc thuộc Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia Công nghệ Tế bào Thực vật - Viện Di truyền Nông nghiệp sử dụng trong nghiên cứu được

thống kê trong Ba ̉ ng 2.2

Bảng 2.2 Các thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu

1 Cân phân tích Sartorius (Đức)

4 Nồi hấp tiệt trùng tự động Tomy (Nhật Bản)

5 Tủ an toàn sinh học Esco (Mỹ)

6 Tủ lạnh –20C và 4C Panasonic (Nhật Bản)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành theo quy trình được trình bày trong Hình 2.1

2.2.1 Phương pháp tiếp cận bằng tin sinh học

2.2.1.1 Phương pháp chú giải chức năng gen mã hóa MRP

Danh sách các gen mã hóa MRP được cung cấp bởi nhóm nghiên cứu thuộc Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia Công nghệ Tế bào Thực vật - Viện Di truyền

Nông nghiệp Trình tự polypeptide của Arabidopsis thaliana lấy từ cơ sở dữ liệu

Phytozome v9.0 được sử dụng để tìm kiếm tất cả các protein có ít nhất 95 axit amin

và chứa nhiều hơn 6 % Met bằng một đoạn mã chạy trên nền java

Trình tự polypeptide của gen mã hóa MRP với định dạng fasta được đưa vào phần mềm MAPMAN (http://mapman.gabipd.org) [85] và phần mềm Blast2go Basic phiên bản 3.0 (https://www.blast2go.com) [33] để tiến hành phân loại chức năng gen

thành 3 nhóm: tham gia vào các quá trình sinh học, có chức năng phân tử và là thành phần của tế bào

Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm được sử dụng trong nghiên cứu

Dự đoán vị trí cư trú của protein hỗ trợ cho việc xác định chức năng và tìm hiểu sự tương tác với phân tử khác trong tế bào Tế bào nhân chuẩn có mức độ tổ chức cao nên chức năng của protein trong các quá trình sinh học có mối liên hệ chặt chẽ với vị trí cư trú của chúng trong tế bào Trong những năm gần đây, nhiều công

Danh sách các gen

mã hóa MRP

Chú giải chức năng các gen mã hóa MRP

Yếu tố cis đáp ứng với điều

kiện bất lợi trên promoter

gen mã hóa MRP

Yếu tố cis đáp ứng với điều kiện bất lợi trên promoter gen mã hóa MRP

Cây Arabidopsis biểu

hiện quá mức hoặc bị đột biến gen ứng viên

Đánh giá hình thái Thử nghiệm điều kiện bất lợi

Thử kháng mặn nặng CadmiumThử kim loại Thử paraquat

TIN SINH HỌC

THỰC NGHIỆM

cụ dự đoán được phát triển Phần lớn các công cụ này dựa vào thuật toán nội suy, xác định vị trí cư trú của protein thông qua việc tìm hiểu đặc điểm vị trí các trình tự đặc hiệu của các protein đã biết [58] Mặc dù vậy, cho đến nay, các phương pháp này vẫn còn bị hạn chế về phạm vi và độ chính xác Cụ thể, TargetP chỉ tập trung xác định được 3 vị trí: lục lạp, ty thể và chuỗi peptide có vùng tín hiệu tiết (secretory pathway signal peptide) Trong đó, TargetP sử dụng ChloroP để dự đoán protein nằm trong lục lạp pSORT lại chỉ xác định được 2 vị trí là lục lạp và ty thể [58] Trong nghiên cứu này, để dự đoán vị trí cư trú của MRP trong tế bào, tệp fasta chứa

toàn bộ trình tự của MRP trên Arabidopsis thaliana được sử dụng làm đầu vào để

tìm kiếm trên 3 cơ sở dữ liệu trực tuyến phổ biến bao gồm ChloroP (http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/) [27], pSORT (http://www.psort.org/) [41], và CELLO (http://cello.life.nctu.edu.tw/) [92] Trong đó, vị trí cư trú nằm trên lục lạp được dự đoán bằng ChloroP và pSORT Vị trí cư trú nằm trên ty thể được

dự đoán bằng pSORT và CELLO

2.2.1.2 Đánh giá biểu hiện gen mã hóa MRP trên cây Arabidopsis trong điều kiện bình thường và điều kiện bất lợi

Sử dụng dữ liệu microarray của những nghiên cứu trước đó để đánh giá mức

độ biểu hiện của MRP dưới điều kiện khô hạn, điều kiện chịu mặn [64, 65] Các thử nghiệm này được tiến hành theo quy trình như sau:

Xử lý hạn đã được thực hiện như sau: hạt giống của cây Arabidopsis kiểu dại

(chủng Columbia) được gieo trên môi trường nảy mầm GM đặc có bổ sung 3% sucrose và giữ ở 4°C trong 4 ngày Sau đó, hạt được chuyển ra phòng nuôi trong điều kiện nhiệt độ 22°C, quang chu kỳ sáng:tối là 16:8 giờ, cường độ ánh sáng 60 µmol

m-2 s-1 photon ) Cây 2 tuần tuổi sẽ được chuyển sang môi trường giá thể đất và tưới nước đầy đủ trong tuần đầu tiên Cây bắt đầu chuyển sang giai đoạn 3 tuần tuổi sẽ được ngừng tưới nước trong vòng 10 ngày Sau 10 ngày thí nghiệm, các lá xếp theo dạng hoa hồng (rosette) ở cả cây đối chứng và cây chịu hạn sẽ được thu mẫu, làm lạnh nhanh bằng nitơ lỏng và bảo quản ở ‒80°C cho đến khi tách RNA để phân tích microarray Kết quả phân tích được thu thập từ GEO của NCBI Số hiệu truy cập là

GSE42290, công bố ngày 15 tháng 02 năm 2013, cập nhật lần cuối ngày 22 tháng 04 năm 2015, nền tảng là Platforms GPL12621, mẫu phân tích là Samples từ GSM 1037236-GSM 1037247 [65]

Xử lý mặn đã được thực hiện như sau: hạt giống của cây Arabidopsis kiểu

dại (chủng Columbia) được gieo trên môi trường nảy mầm GM đặc có bổ sung 3% sucrose và giữ ở 4°C trong 4 ngày Sau đó, hạt được chuyển ra phòng nuôi trong điều kiện nhiệt độ 22°C, quang chu kỳ sáng:tối là 16:8 giờ, cường độ ánh sáng 60 µmol m-2 s-1 photon) Cây 10 ngày tuổi trên môi trường GM đã được chuyển sang môi trường ½ MS đặc không có sucrose, chứa 0 mM NaCl (đối chứng) hoặc 200

mM NaCl và được giữ trong vòng 24 giờ Thí nghiệm được lặp lại 3 lần (10 cây/lần) Mẫu lá sau khi thu được làm lạnh nhanh bằng nitơ lỏng và bảo quản ở ‒80°C cho đến khi tách RNA để xác định biểu hiện gen Dữ liệu của nghiên cứu được truy cập theo số hiệu series GSE32087, mẫu phân tích là Samples từ GSM795503 - GSM795514 [64] Tất cả các dữ liệu này được thu thập để phân tích và tiến hành khai thác dữ liệu

Yếu tố cis đáp ứng với điều kiện bất lợi trên promoter của gen mã hóa MRP Năm yếu tố cis (ABRE, MYCR, MYBR, ICEr2, RSRE) liên quan đến đáp ứng với

điều kiện bất lợi sẽ được xác định theo trình tự nhận biết như Bảng 2.3 Trình tự

1-kb ngược dòng từ vị trí bắt đầu phiên mã (+1) của mỗi gen AtMRP được tìm kiếm yếu tố cis nhờ phần mềm MEGA 4 [82]

Bảng 2.3 Trình tự của một số yếu tố điều hòa cis trong điều hòa biểu hiện gen

đáp ứng với điều kiện bất lợi [90]

ABRE (C/G/T)ACGTG(G/T)(A/C) MYBR (A/C)ACC(A/T)A(A/C)C

2.2.2 Phương pháp tiếp cận bằng thực nghiệm

2.2.2.1 Đánh giá hình thái cây chuyển gen At3G55240

Hạt giống Arabidopsis chuyển gen và hạt đối chứng được xử lý sơ bộ bằng

ethanol 70% trong 5 phút, sau đó được khử trùng tiếp bằng dung dịch NaClO nồng

độ 1% trong thời gian 1 phút Tiếp theo rửa hạt 5 lần bằng nước cất vô trùng để loại

bỏ các phần dư thừa của hóa chất vô trùng có thể ảnh hưởng đến sự nảy mầm của hạt

và sinh trưởng của cây con sau này

Hạt Arabidopsis chuyển gen và đối chứng sau khi khử trùng được gieo trên

đĩa petri chứa môi trường ½ MS đặc có và không có kháng sinh hygromycin, trong điều kiện của phòng nuôi cấy mô tế bào, quang chu kỳ sáng: tối là 16:8 giờ, nhiệt độ phòng nuôi 24±2oC Quan sát hình thái cây trong đĩa thạch ½ MS ở các giai đoạn khác nhau Chọn các cây 14 ngày tuổi (có kích thước tương đương nhau) trên môi trường ½ MS chuyển sang giá thể đất Quan sát sự thay đổi hình thái cây trên giá thể đất ở tuần tuổi khác nhau

2.2.2.2 Đánh giá mức độ đáp ứng của cây chuyển gen trong các điều kiện bất lợi Thử nghiệm tính kháng mặn: Gieo hạt cây chuyển gen và cây đối chứng trên

môi trường ½ MS có và không có kháng sinh hygromycin Chuyển cây 12 ngày tuổi sang môi trường ½ MS, có bổ sung NaCl ở nồng độ 175 mM Cây sống sót trên môi trường có bổ sung NaCl sẽ được đếm từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 7

Thử nghiệm tính kháng với kim loại nặng cadmium: Gieo hạt cây chuyển gen

và cây đối chứng trên môi trường ½ MS có và không có kháng sinh hygromycin Chuyển cây 12 ngày tuổi sang môi trường ½ MS, có bổ sung cadmium cloride ở nồng

độ 750 µM Cây sống sót trên môi trường có bổ sung CdCl2 sẽ được đếm từ ngày thứ

3 đến ngày thứ 8

Thử nghiệm với paraquat trên lá cây Arabidopsis: Thí nghiệm được tiến hành

dựa trên nghiên cứu trước đây của Yang và cs (2007) [91] có cải biến Gieo hạt cây

chuyển gen và đối chứng trên môi trường ½ MS đặc có và không có kháng sinh

Hygromycin Chọn các cây 14 ngày tuổi (có kích thước tương đương nhau) trên môi trường ½ MS chuyển sang giá thể đất Lá cây 3 tuần tuổi được cắt ra và ngâm trong

dung dịch paraquat ở các nồng độ khác nhau: 0µM (đối chứng), 0,5µM, 1µM và 2µM, được giữ trong điều kiện tránh ánh sáng trong vòng 1-2h sau đó được chuyển ra điều kiện ánh sáng liên tục ở 24 oC và quan sát sự mất màu của lá sau 24 giờ

Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân tích tin sinh học cho các gen mã hóa MRP

3.1.1 Tìm kiếm và xác định các gen mã hóa MRP trên cây Arabidopsis

Tất cả những gen mã hóa cho protein có kích thước lớn hơn 95 gốc axit

amin và chứa hàm lượng Met từ 6 % được coi là MRP Danh sách 121 gen AtMRP

được cung cấp bởi nhóm nghiên cứu thuộc Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Quốc

gia Công nghệ Tế bào Thực vật - Viện Di truyền Nông nghiệp (Phụ lục) Trong

số toàn bộ AtMRP, hàm lượng Met lớn 7 % được tìm thấy ở 47 gen (chiếm 38,8

% tổng số gen mã hóa cho MRP), đặc biệt có 2 gen AT4G16980 và AT1G33820

mã hóa cho phân tử protein có kích thước tương ứng là 164 và 182 axit amin, chứa 15,95 % và 16,02 % Met

MAPMAN là một công cụ cho phép chú giải chức năng gen Theo Thimm và

cs (2004), MAPMAN xác định chức năng của gen có thể tham gia vào một phần của quá trình trao đổi chất, hoặc có chức năng cụ thể (như tổng hợp protein), đáp ứng sinh học (như gen tham gia vào trao đổi chất và/ hoặc đáp ứng với hormone), hoặc

mã hóa cho các họ enzyme mà chức năng của chúng chưa rõ [85] Kết quả phân tích

cho thấy khoảng 50 % gen AtMRP chưa rõ hoặc chưa xác định được chức năng trong

tế bào Số còn lại đóng vai trò quan trọng trong tế bào (Hình 3.1 và Bảng 3.1) Trong

đó, điều hòa phiên mã RNA (có 20 AtMRP tham gia, chiếm 18 %), biến đổi protein (12 AtMRP tương đương 11 %) và con đường tín hiệu Ca2+ (tương ứng với 6 AtMRP, chiếm 5 %) là 3 nhóm chức năng chính được quan tâm khi phân tích MRP Bên cạnh

đó, một số MRP cũng phân bố rải rác trong các chu trình quan trọng khác như liên kết và vận chuyển kim loại, tương tác với yếu tố bất lợi, xử lý RNA sau phiên mã, chu kỳ tế bào, liên quan đến sự phát triển của tế bào Những phân tích trên MRP đã biết chức năng đều cho thấy vai trò thiết yếu của các protein giàu Met nói riêng tham gia vào trong tế bào thực vật

Bảng 3.1 Phân loại chức năng gen mã hóa MRP trong Arabidopsis theo MAPMAN

Kiểm soát ion kim loại 2 Phản ứng điều kiện bất lợi 1

Điều hòa phiên mã RNA 20

Truyền dẫn tín hiệu (Ca2+) 6

Vận chuyển (kim loại) 6 Chưa biết chức năng 56

(Một số gen có thể được phân loại vào nhiều hơn một nhóm chức năng)

Hình 3.1 Sự phân bố gen mã hóa MRP trong các quá trình sinh học khác nhau của

Arabidopsis

Sản phẩm của các gen AtMRP cũng được phân loại dựa vào phần mềm

BLAST2GO phiên bản 3.0 để phân loại thành nhóm chức năng: quá trình sinh học

(Hình 3.2), thành phần của tế bào (Hình 3.3) và chức năng phân tử (Hình 3.4)

Kết quả phân loại chức năng gen nhờ phần mềm BLAST2GO cũng cho thấy tầm quan trọng của MRP, tham gia vào nhiều chức năng trong các quá trình sinh học của thực vật, giữ chức năng phân tử cũng như tham gia vào các thành phần quan trọng của tế bào

Hình 3.2 Phân loại chức năng của các gen AtMRP theo quá trình sinh học

(Các gen có thể được phân loại vào nhiều hơn một nhóm chức năng)

Hình 3.3 Phân loại chức năng của các gen AtMRP theo thành phần tế bào

(Các gen có thể được phân loại vào nhiều hơn một nhóm chức năng)

Hình 3.4 Phân loại gen AtMRP theo tham gia vào chức năng phân tử

(Các gen có thể được phân loại vào nhiều hơn một nhóm chức năng)