NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẬP CHỐNG CHỊU HẠN HÁN CỦA KHOAI TÂY

Ở Việt Nam, các nghiên cứu về khoai tây tập trung chủ yếu vào việc khảo nghiệm, lai giống, tạo củ nhỏ và một số bệnh cây hầu như chưa có nghiên cứu nào về cơ chế tập chống chịu của loại

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Công trình được hoàn thành tại:

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội

Người hướng dẫn khoa học: TS Lê Quỳnh Mai

Phản biện 1: TS Lê Thị Nguyên Bình

Phản biện 2: TS Phạm Thị Lý Thu

Luận văn được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận văn thạc sĩ họp tại:

Khoa Sinh học - Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên

Vào hồi 14 giờ 00 ngày 3 tháng 2 năm 2016

Có thể tìm hiểu luận văn tại:

- Trung tâm thư viện Đại học Quốc gia Hà Nội

MỞ ĐẦU

Khoai tây (Solanum tuberosum L.) là thành phần quan trọng trong hệ

thống lương thực thế giới (FAO) Ở Việt Nam, các nghiên cứu về khoai tây tập trung chủ yếu vào việc khảo nghiệm, lai giống, tạo củ nhỏ và một số bệnh cây hầu như chưa có nghiên cứu nào về cơ chế tập chống chịu của loại cây này trước các điều kiện phi sinh học Trên cơ sở đó, chúng tôi lựa chọn đề tài:

“Nghiên cứu khả năng tập chống chịu hạn hán của khoai tây (Solanum

tuberosum L.)”

Các nghiên cứu trong luận văn này nằm trong đề tài “Nghiên cứu các mối

liên quan giữa khả năng tập chống chịu của khoai tây trước các yếu tố nhiệt độ cao, hạn hán, độ mặn cao” được Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc

gia (NAFOSTED) tài trợ với mã số 106.06-2012.14

Các mục tiêu được đặt ra cho đề tài như sau:

- Đánh giá khả năng tập chống chịu hạn của khoai tây giống

- Xác định cường độ hạn trong giai đoạn tập chống chịu cho hiệu quả nâng cao khả năng chống chịu hạn của khoai tây

- Đánh giá sự thay đổi hàm lượng proline, một chất điều hòa thẩm thấu trong tế bào được coi là chỉ thị cho quá trình đáp ứng bất lợi về áp suất thẩm thấu của thực vật, ở cây khoai tây đã qua tập chống chịu hạn

- Xác định biểu hiện một số gen yếu tố phiên mã ở khoai tây tương đồng

với các gen liên quan đến khả năng đáp ứng với hạn ở A thaliana

Chương 1- TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung về khoai tây

1.1.1 Nguồn gốc lịch sử

Cây khoai tây (Solanum tuberosum L.) là cây thân thảo, có củ thuộc họ

cà, có nguồn gốc ở vùng cao nguyên thuộc dãy núi Andes (Nam Mỹ) ở độ cao 2000-5000m

1.1.2 Phân loại học

Phân loại học của khoai tây trong hệ thống học thực vật (USDA, NRCS, 2010):

Giới: Plantae (plants)

Ngành: Magnoliophyta (flowering plants)

Lớp: Magnoliopsida (dicotyledons)

Bộ: Solanales

Họ: Solanaceae

Chi: Solanum L

Loài: Solanum tuberosum L

1.1.3 Đặc điểm của cây khoai tây

Thân cây khoai tây là một hệ thống gồm thân, tia củ và củ Lá khoai tây là

lá kép lông chim, không đối xứng Hoa khoai tây mọc thành chùm, là hoa lưỡng tính Khoai tây là cây tự thụ phấn nhưng cũng có trường hợp giao phấn Sau thời kỳ ra hoa, một vài loài kết quả

1.1.4 Vai trò của khoai tây

Khoai tây là thực phẩm cung cấp năng lượng và là nguồn dinh dưỡng có giá trị Ngoài việc dùng khoai tây làm lương thực và thực phẩm, các nước phát triển sử dụng khoai tây làm thức ăn cho gia súc Bên cạnh đó, khoai tây còn được dùng nhiều trong công nghiệp sản xuất axit hữu cơ như axit lactic, axit xitric; các dung môi hữu cơ như ethanol, butanol, xeton, …

1.2 Hạn và đáp ứng của thực vật ở cạn trước điều kiện hạn

Ngày nay, do biến đổi khí hậu toàn cầu, hiện tượng hạn, mặn, úng, nóng, lạnh, … (các yếu tố cực đoan phi sinh học, abiotic stress) xảy ra ngày càng

nhiều Trong đó, hạn là một trong các yếu tố môi trường ảnh hưởng lớn nhất tới sinh trưởng và năng suất cây trồng

1.2.1 Đặc điểm thích nghi của thực vật chịu hạn

Tính chịu hạn của những thực vật ở cạn hạn sinh có bản chất di truyền, thể hiện ra ở các thích nghi về hình thái và sinh lý

1.2.2 Ảnh hưởng của hạn đến sinh trưởng và phát triển của thực vật

Ảnh hưởng của hạn đến sự sinh trưởng và hấp thu nước

Đáp ứng đầu tiên của thực vật đối với điều kiện bất lợi gây ra bởi hạn là ngừng sinh trưởng Sự hạn chế sinh trưởng xảy ra ở chồi, ở rễ Trong điều kiện hạn, các phân tử carbohydrate cung cấp cho quá trình sinh trưởng trong điều kiện bình thường được dùng cho sinh trưởng rễ hoặc để tổng hợp các chất điều chỉnh thẩm thấu

Ảnh hưởng của hạn đến quang hợp

Sự thiếu hụt nước đã làm tăng cường tổng hợp ABA Sự hạn chế carbon dioxide do kéo dài thời gian đóng khí khổng dẫn đến sự tích lũy các hợp chất làm giảm khả năng vận chuyển electron, làm giảm các phân tử oxy và tăng cường các dạng ROS Các phân tử bị oxy hóa bởi ROS có thể bị biến đổi cấu trúc và cơ chế tổng hợp, gây rối loạn phản ứng sinh lý, sinh hóa nội bào, dẫn đến sai hỏng hoặc mất chức năng, thậm chí gây chết tế bào

Ảnh hưởng của hạn đến hô hấp nội bào

Trong điều kiện hạn, các quá trình mà chúng sửa dụng sản phẩm của hô hấp bị ảnh hưởng và dẫn đến sự tăng cường hô hấp

Ảnh hưởng của hạn đến hormone

Khi thiếu nước, ABA được tổng hợp ở rễ và vận chuyển lên lá làm khí khổng đóng lại và cản trở quá trình sinh trưởng của thực vật Bên cạnh sự tăng cường hàm lượng ABA, hàm lượng auxin cũng có sự biến đổi khi thực vật chống chịu với hạn Sự giảm nhanh chóng hàm lượng zeatin và gibberellin nội

1.2.3 Đáp ứng hạn của thực vật

Thực vật đáp ứng với điều kiện bất lợi từ môi trường qua 2 con đường: phụ thuộc ABA và không phụ thuộc ABA Các tín hiệu được dẫn truyền đến nhân gây ra sự tăng cường biểu hiện của các gen mã hóa yếu tố phiên mã Các yếu tố phiên mã gây ra sự tăng cường biểu hiện của các gen liên quan đến tính chống chịu Các đáp ứng này sẽ bị mất đi khi điều kiện bất lợi mất đi

1.3 Ảnh hưởng của môi trường hạn đến khoai tây

Hạn thường tác động mạnh ở 3 giai đoạn: sinh trưởng sinh dưỡng, phình

to củ và chín.Đã có những nghiên cứu chứng minh sự đáp ứng hạn của khoai tây

có liên quan đến biểu hiện gen Khoai tây tăng cường biểu hiện gen StMYB1R-1

cho khả năng chống chịu cao với hạn mà đồng thời lại không ảnh hưởng tới các tính trạng nông học khác Trong điều hiện hạn khoai tây tăng cường biểu hiện của một số gen mã hóa yếu tố phiên mã họ NAC

1.4 Tính tập chống chịu của thực vật

Khả năng tập chống chịu (acclimation) với yếu tố bất lợi từ môi trường của thực vật cho phép thực vật tăng cường tính chống chịu với các điều kiện bất lợi ở ngưỡng lớn sau giai đoạn được tiếp xúc với các điều kiện bất lợi ở ngưỡng nhỏ và vừa

Hình 1.3 Sơ đồ đơn giản của một quá trình nhận, truyền tín hiệu gây ra đáp

ứng tập chống chịu

Cơ chế tập chống chịu được biết đến bao gồm cơ chế nhận tín hiệu từ các biểu hiện bất lợi từ môi trường, tiếp đến là quá trình truyền tín hiệu đó từ “cảm biến” vào nhân Trong nhân, một số gen đặc hiệu liên quan đến việc đáp ứng lại với yếu tố bất lợi sẽ được hoạt hóa và các protein được biểu hiện các đáp ứng thích hợp (Hình 1.3) Các đáp ứng đó sẽ đảm bảo tái lập cân bằng nội môi trong

tế bào, bảo vệ chức năng màng sinh chất và protein nhằm chống chịu lại điều kiện bất lợi Rất nhiều gen được hoạt hóa theo chiều hướng giữ cân bằng trao đổi nước và các ion của tế bào, bảo vệ chức năng các chaperone, giảm oxi hóa

và bảo vệ áp suất thẩm thấu Riêng trong cơ chế cân bằng thẩm thấu của mô, tế bào, các cây có xu hướng tăng sinh proline và một số loại đường như galactinol, glucose, fructose, sucrose, raffinose những chất này được biết đến là các chất bảo vệ thẩm thấu khi thực vật cần chống lại những bất lợi từ môi trường Những hoạt động đáp ứng qua gen biểu hiện như thế của thực vật đa phần được điều hòa qua các yếu tố phiên mã

Các cơ chế liên quan đến quá trình đáp ứng của thực vật với các yếu tố bất lợi từ môi trường từ lâu đã trở thành tâm điểm của các nghiên cứu về sinh học nói chung và thực vật nói riêng [21] Đề tài “Nghiên cứu tính tập chống

chịu hạn hán của khoai tây (Solanum tuberosum L.)” được thực hiện theo định

hướng đó và mong muốn góp phần tìm hiểu thêm về sức sống của thực vật trong các biến đổi của môi trường

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu tính tập chống chịu hạn được tiến hành trên cây khoai tây có nguồn gốc từ hạt, giống HH7

2.1.2 Hóa chất

2.1.3 Thiết bị

2.2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp vào mẫu, nuôi cấy in vitro và tạo tập chống chịu

Hạt khoai tây giống HH7 được khử trùng và được gieo trên môi trường khoáng cơ bản Murashige & Skoog (MS, 1962), có bổ sung 30g/l sucrose, 7g/l agar và sorbitol với hàm lượng khác nhau Các nồng độ sorbitol sử dụng là: 0 mM; 50 mM; 100 mM; 200 mM Tỷ lệ nảy mầm của hạt được đánh giá và các hạt nảy mầm trên môi trường có bổ sung sorbitol được coi là đã qua giai đoạn tập chống chịu

2.2.2 Phương pháp cấy chuyển mẫu và đánh giá các chỉ số sinh lý

Sau 30 ngày gieo hạt, cắt lấy phần thân cây con có chiều cao 1,5 cm mang

2 lá chuyển sang môi trường có nồng độ sorbitol tương đương với giai đoạn nảy mầm và cao hơn (Hình 2.2)

Hình 2.2 Sơ đồ cấy chuyển mẫu sau khi gieo trên các môi trường tập chống chịu

Sau 4 - 6 tuần, tiến hành đánh giá khả năng tập chống chịu bằng cách so sánh giữa mẫu đã qua tập chống chịu và mẫu chưa qua tập chống chịu trong từng nhóm TN, thông qua một số chỉ số: hệ số nhân chồi, chiều cao chồi, số lá,

số rễ, trọng lượng tươi, trọng lượng khô, hàm lượng Chl và hàm lượng proline

Hệ số nhân chồi

Hệ số nhân chồi = 𝑆ố 𝑚ẫ𝑢 𝑡𝑟𝑜𝑛𝑔 𝑚ô𝑖 𝑡𝑟ườ𝑛𝑔 𝑇ổ𝑛𝑔 𝑠ố 𝑐ℎồ𝑖 𝑐ủ𝑎 𝑚ẫ𝑢

Chiều cao chồi

Chiều cao chồi = 𝑇ổ𝑛𝑔 𝑐ℎ𝑖ề𝑢 𝑐𝑎𝑜 𝑐á𝑐 𝑐ℎồ𝑖 𝑇ổ𝑛𝑔 𝑠ố 𝑐ℎồ𝑖 𝑐ủ𝑎 𝑚ẫ𝑢 (cm)

Trọng lượng tươi và trọng lượng khô

Trọng lượng tươi = Tổng trọng lượng tươi của các mẫu

Tổng số mẫu

Trọng lượng khô = Tổng trọng lượTổng số mẫung kh ô của các mẫu

2.2.3 Phương pháp xác định hàm lượng chlorophyll

Hàm lượng Chl được xác định dựa theo phương pháp của của Robert J Porra [60] Hàm lượng Chl được tính toán theo công thức:

Chla (µg/ml) = [12.7 × (A664) – 2.69 × (A646)] × hệ số pha loãng

Chlb (µg/ml) = [22.9 × (A646) – 4.68 × (A664)] × hệ số pha loãng

2.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng proline mẫu

Hàm lượng proline của mẫu được xác định bằng phương pháp so màu (Bates và cs., 1973) Hàm lượng proline trong mẫu được tính toán bằng cách so sánh với đường chuẩn

Hình 2.3 Đường chuẩn proline

Công thức xác định nồng độ proline là:

x = (A520 + 0,001) / 0,007 (mM) Nồng độ proline mM được quy ra hàm lượng µg/mg theo công thức:

2.2.5 Xác định biểu hiện của một số gen mã hóa cho yếu tố phiên mã ở khoai tây (Solanum tuberosum L.) tương đồng với các gen liên quan đến khả năng tập chống chịu ở Arabidopsis thaliana

Kết quả đánh giá khả năng tập chống chịu thông qua các chỉ số nuôi cấy

mô, hàm lượng Chl và proline cho biết nồng độ sorbitol trong môi trường là 50

mM mang lại hiệu quả tập chống chịu hạn cao nhất cho khoai tây HH7 Tiến hành xác định biểu hiện của một số gen mã hóa yếu tố phiên mã trong cây con khoai tây thu được từ môi trường MS có bổ sung 50 mM sorbitol (mẫu TN) và môi trường không có sorbitol ( mẫu ĐC)

y = 0.007x - 0.001 R² = 0.993

-0.1

0 0.1

2.2.5.1.Thu mẫu

Chồi khoai tây in vitro giống HH7 được cấy chuyển đồng thời trên môi

trường MS không có sorbitol và môi trường MS có bổ sung 50 mM sorbitol Thu mẫu ở 10 mốc thời gian: 0h, 1h, 2h, 4h, 6h, 8h, 12h, 24h, 72h và 120h

2.2.5.2.Tách RNA tổng số

RNA tổng số được tách bằng TRIzol RNA trong pha nước được hút ra sau đó tủa bằng isopropanol và NaCl 2M, li tâm và rửa lại bằng ethalnol 70%

và sau đó thu hồi RNA tinh khiết

2.2.5.3.Kiểm tra, định lượng và xác định độ tinh sạch RNA tổng số

RNA được kiểm tra sơ bộ bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose Hàm lượng RNA tổng số được xác định bằng máy đo quang phổ định lượng và chất lượng được đánh giá sơ bộ qua đường cong hấp thụ Các mẫu RNA có giá trị

2.2.5.6.Kiểm tra chất lượng cDNA

Chất lượng cDNA được kiểm tra bằng qPCR Cặp mồi được sử dụng để kiểm tra chất lượng cDNA là cặp mồi GAPDH 3’ (G3) và GAPDH 5’ (G5)

2.2.5.7.Chọn gen đích

2.2.5.8.Thiết kế mồi

2.2.5.9.Xác định tương quan mức độ biểu hiện

Gen tham chiếu và gen đích đã chọn được tiến hành qPCR với các cặp

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hưởng của sorbitol đến tỷ lệ nảy mầm của hạt khoai tây Hồng Hà

7

Kết quả cho thấy giống khoai tây đang nghiên cứu chịu ảnh hưởng rõ rệt của điều kiện hạn Khả năng nảy mầm của hạt giảm khi nồng độ sorbitol tăng (Hình 3.1)

Hình 3.1 Tỷ lệ nảy mầm của hạt khoai tây HH7 sau 30 ngày gieo trên

môi trường có bổ sung sorbitol

Hình 3.2 Cây khoai tây trên đĩa thạch sau 30 ngày gieo hạt

Quan sát các cây con khoai tây sau 30 ngày gieo hạt, ta thấy các cây con trong môi trường có nồng độ sorbitol cao hơn nảy mầm chậm hơn và có thân ngắn hơn (hình 3.2)

3.2 Đánh giá các chỉ số nuôi cấy mô sau giai đoạn tập chống chịu

3.2.1 Hệ số nhân chồi

Hệ số nhân chồi chịu ảnh hưởng không nhỏ của hàm lượng sorbitol tăng cao trong môi trường nuôi cấy Các mẫu chưa qua tập chống chịu khi chuyển sang các môi trường có nồng độ sorbitol tăng có hệ số nhân chồi giảm dần Các mẫu đã qua tập chống chịu không thể hiện khả năng nhân chồi trong nuôi cấy khi được chuyển sang các môi trường tiếp tục duy trì mức độ hạn nhân tạo hoặc nâng cao mức hạn

Hình 3.3: Hệ số nhân chồi của khoai tây HH7 trên môi trường có các nồng

độ sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm 3.2.2 Chiều cao chồi

Hình 3.4 Chiều cao chồi của khoai tây HH7 trên môi trường có các nồng độ sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm

Ở những mẫu chưa qua tập chống chịu, chiều cao chồi trung bình chịu ảnh hưởng lớn bởi hàm lượng sorbitol trong môi trường Những mẫu đã qua tập

chống chịu trong các môi trường chứa sorbitol không thể hiện rõ sự phát triển

về chiều cao chồi Nhìn chung có thể nhận thấy các công thức TN có hệ số nhân tương đối cao thì chiều cao chồi thấp và ngược lại Điều này thể hiện sinh khối

của mẫu in vitro có những giới hạn nhất định trong điều kiện hạn Việc đánh giá

khối lượng mẫu sẽ cho thông tin quan trọng hơn về sinh trưởng của khoai tây trong điều kiện hạn nhân tạo

3.2.3 Số lá

Trong môi trường không có sorbitol, số lá trung bình của mẫu đạt giá trị thấp nhất sau cả 4 tuần và 6 tuần (Hình 3.5) Ở những mẫu đã qua tập chống chịu, trong các công thức 50-50, 100-100, 100-200 và 200-200, cho số lá trung bình lớn hơn so với những mẫu chưa qua tập chống chịu khi được cấy chuyển sang môi trường có nồng độ sorbitol tương đương hoặc cao hơn cả sau 4 tuần

và 6 tuần Tuy nhiên sự khác biệt này tương đối nhỏ

Hình 3.5 Số lá trung bình của khoai tây HH7 trên môi trường có các nồng

độ sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm

Hình 3.6 Số rễ trung bình của khoai tây HH7 trên môi trường có các nồng

độ sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm

Biểu đồ về số rễ của mẫu chồi nuôi cấy cho thấy có xu hướng tăng khi hàm lượng sorbitol trong môi trường tăng ở những mẫu đã qua tập chống chịu

so với những mẫu chưa qua tập chống chịu trong cùng môi trường nuôi cấy Đặc biệt là, những mẫu đã qua tập chống chịu ở ngưỡng 50 mM và 100 mM sorbitol trong các công thức chuyển môi trường 50-50 và 100-100 có số rễ trung bình cao hơn cả mẫu trong điều kiện môi trường không bị hạn

3.2.5 Trọng lượng tươi và trọng lượng khô

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5