NGHIÊN CỨU TRÌNH TỰ MỘT SỐ GEN ĐỘC LỰC CỦA YERSINIA PESTIS VÀ PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR XÁC ĐỊNH YERSINIA PESTIS GÂY BỆNH Ở VIỆT NAM

NGHIÊN CỨU TRÌNH TỰ MỘT SỐ GEN ĐỘC LỰC CỦA YERSINIA PESTIS VÀ PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR XÁC ĐỊNH YERSINIA PESTIS GÂY BỆNH Ở VIỆT NAM Đinh Thị Thu Hằng*; Nguyễn Thái Sơn**;

NGHIÊN CỨU TRÌNH TỰ MỘT SỐ GEN ĐỘC LỰC CỦA

YERSINIA PESTIS VÀ PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR

XÁC ĐỊNH YERSINIA PESTIS GÂY BỆNH Ở VIỆT NAM

Đinh Thị Thu Hằng*; Nguyễn Thái Sơn**; Nguyễn Văn An** Cao Thị Dinh***; Triệu Thị Nguyệt***

TÓM TẮT

Mục tiêu: xác định trình tự đầy đủ gen ypo2088 (trên nhiễm sắc thể [NST]), pla, caf1 (trên

hai plasmid độc lực là pPCP1 và pMT1) của chủng vi khuẩn (VK) Yersinia pestis Yp1 phân lập

ở Việt Nam và phát triển kỹ thuật PCR đa mồi xác định nhanh, chính xác Y pestis gây bệnh

Vật liệu và phương pháp: chủng Y pestis Yp1 có đầy đủ độc lực được lưu giữ tại “Ngân hàng

Chủng và Gen” của Học viện Quân y Toàn bộ chiều dài gen ypo2088, pla và caf1 sau khi khuếch đại chính xác được tách dòng và phân tích trình tự Từ kết quả phân tích trình tự kết hợp với trình tự các chủng tham chiếu trên Ngân hàng Gen, 3 cặp mồi là ypo2088F/R, plaF/R

và caf1F/R đã thiết kế để khuếch đại đồng thời gen đích tương ứng trong phản ứng PCR đa mồi xác định VK dịch hạch gây bệnh Kết quả và kết luận: tách dòng và phân tích trình tự đầy

đủ 3 gen là ypo2088, pla và caf1 của chủng VK Y pestis Yp1 phân lập ở Việt Nam Xác định được 1 đột biến sai nghĩa trên gen pla, hai gen còn lại có mức độ tương đồng 100% khi so

sánh với trình tự tham chiếu (mã số CP000900) Kết quả một lần nữa chứng minh, trình tự gen

ypo2088, pla và caf1 r ất ổn định, không có sự khác biệt đáng kể giữa các chủng Y pestis

Trình tự đầy đủ 3 gen này đã được đăng ký trên Ngân hàng Gen Quốc tế với mã số lần lượt là KM880027, KM880025 và KM880026 Đã thiết kế thành công phản ứng PCR đa mồi khuếch đại đồng thời 3 gen đích xác định chính xác VK dịch hạch gây bệnh

* Từ khóa: Caf1 (F1 capsule antigene); Độc lực; PCR đa mồi; Yersinia pestis

Study on the Complete Sequences of Virulence Genes of Yersinia Pestis and Development of a Multiplex PCR Assay for Detection of Pathogenic Yersinia Pestis in Vietnam

Summary

Objectives: Sequence analysis of the entire ypo2088 gene (within bacterial chromosome), pla and caf1 genes (on the virulence plasmids pPCP1 and pMT1) of the pathogenic Yersinia pestis strain Yp1 isolated in Vietnam and development of a multiplex PCR assay for rapid and accurate detection of pathogenic Y pestis Materials and methods: Y pestis strain Yp1 with full virulence was provided by Strain and Gene Bank of Vietnam Military Medical University Total DNA was extracted from culture media following autoclaved inactivation Subsequently, full-length ypo2088,

* Học viện Quân y

** Bệnh viện Quân y 103

*** Đại học Khoa học tự nhiên

Người phản hồi (Corresponding): Đinh Thị Thu Hằng (hangdinhbio@gmail.com)

Ngày nhận bài: 02/03/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 16/03/2015

Ngày bài báo được đăng: 31/03/2015

pla and caf1 genes were amplified using high-fidelity PCR The purified PCR products were cloned in pJET1.2/blunt by conventional recombinant methods and they were sequenced from both ends According to these sequencing results and the reference sequences in Genbank, three primer pairs, including ypo2088F/R, plaF/R and caf1F/R, were designed in a multiplex PCR assay for detection of pathogenic Y pestis Results and conclusions: One missense mutation was identified in pla gene, two remaining genes were found to be 100% similar in sequence to the reference sequences of Y pestis Angola (accession number KP000900) These results again demonstrate that ypo2088, pla, caf1 gene sequences are very conservative, with no significant difference among Y pestis strains The complete sequences of these genes were submitted to Genbank with accession number KM880027, KM880025 and KM880026, respectively A multiplex PCR assay that amplifies these three target genes was successfully developed for rapid and accurate detection of pathogenic Y pestis

*

Key words: Caf1 (capsule fraction 1 gene); Multiplex PCR; pla (plasminogen gene); Yersinia pestis

ĐẶT VẤN ĐỀ

Y pestis là VK Gram âm, không sinh bào

tử thuộc chi Yersinia - họ Enterobacteriaceae

Trong 11 loài thuộc chi Yersinia, chỉ có

ba loài gây bệnh ở người là Y pestis,

Y pseudotuberculosis và Y enterocolitica

Loài nguy hiểm nhất, Y pestis gây bệnh

dịch hạch và viêm phổi cấp tính phân biệt

với hai loài còn lại [8, 10] Tiềm năng hủy

diệt của dịch hạch đã được chứng minh

qua thùc tÕ lµ 200 triệu ca tử vong trong

lịch sử, dẫn đầu danh sách các bệnh

truyền nhiễm nguy hiểm Theo Tổ chức Y

tế Thế giới, từ 1989 đến 2003, thế giới đã

ghi nhận 38.310 ca nhiễm và 2.845 ca tử

vong, tập trung chủ yếu ở châu Phi và

châu Á - nơi thiếu hoặc chưa đáp ứng

đầy đủ của hệ thống giám sát, các cơ sở

chẩn đoán hay báo cáo dịch [5] Đặc biệt,

những năm gần đây, mối quan tâm đối

với VK dịch hạch được đặt ở mức cao, do

khả năng sử dụng Y pestis như một loại

vũ khí sinh học [8]

Trên thế giới, toàn bộ hệ gen của

một số chủng chuẩn như Y pestis KIM5

(thuộc về biovar Mediaevalis), CO92 (chủng biovar Orientalis) đã được giải trình tự, tạo thuận lợi cho nghiên cứu, xác định

(chủng CO92) bao gồm một “NST” 4,65

Mb và ba plasmid lần lượt là pLcr, pPCP1

và pMT1 Ngoài các sản phẩm do hệ gen trên NST, yếu tố độc lực của Y pestis là

do gen trên các plasmid này đảm nhiệm Trong đó, pPCP1 và pMT1 là 2 plasmid

được xác định chỉ có riêng ở Y pestis [8]

pPCP1 (kích thước 9,6 kb), có gen quan trọng là pla mã hóa chất hoạt hóa plasminogen Pla, đóng vai trò quan trọng

đối với khả năng xâm nhập của Y pestis

vào cơ thể qua da [4] Plasmid còn lại

là pMT1 có kích thước tương đối lớn (110 kb) tiêu biểu với các gen mã hóa cho kháng nguyên vỏ F1, gen biểu hiện phospholipase D (PID), cả hai đều có vai trò trong lây lan dịch hạch [8]

Ở Việt Nam, bệnh dịch hạch còn xuất hiện rải rác ở khu vực Tây Nguyên như Gia Lai, ĐắK Lắk [5] Nghiên cứu về

yếu tập trung về dịch tễ học, thống kê,

giám sát bệnh trên cơ sở các vùng sinh

thái Những kết quả nghiên cứu về phân

tử VK dịch hạch còn hạn chế và đơn lẻ

trên một số gen đích [1, 5] Nghiên cứu

này tách dòng và giải trình tự toàn bộ gen

đặc trưng trên NST - ypo2088 và gen độc

lực trên plasmid pPCP1, pMT1 tương

ứng là pla và caf1 của chủng Y pestis

Yp1 phân lập ở Việt Nam Đồng thời,

nhóm tác giả đã phát triển kỹ thuật PCR

đa mồi (multiplex PCR - mPCR) sử dụng

3 gen đích này để xác định chính xác VK

dịch hạch có độc lực trong tự nhiên

Nghiên cứu đã góp phần làm phong phú

thêm những kết quả về đa dạng di truyền

các gen độc lực của VK dịch hạch cũng

như cung cấp công cụ phân tử hữu hiệu

cho phép chẩn đoán nhanh và chính xác

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

1 Chủng vi khuẩn

Chủng Y pestis Yp1 có độc lực và

chủng đối chứng âm E coli ATCC 25922

do Ngân hàng Chủng và Gen của Học

viện Quân y cung cấp, xác định đặc điểm

hình thể, tính chất sinh vật hóa học bằng card định danh GN46 (Vitek 2 - BioMérieux)

và thử nghiệm độc lực trên chuột nhắt trắng để khảo sát khả năng gây chết hàng loạt

2 Tách chiết ADN và PCR

Chủng VK được bất hoạt ở điều kiện

121oC/20 phút, sau đó tách ADN tổng số theo quy trình của nhà sản xuất (ADN genome QIAGen minikit) Thiết kế các cặp mồi tách dòng dựa trên trình tự gen

ypo2088, pla và caf1 trên Ngân hàng Gen

và được tổng hợp bởi IDT (Mỹ) Sử dụng sinh phẩm Phusion High-Fidelity ADN polymerase (Thermo scientific) để phân lập gen đích với chu trình nhiệt, nhiệt độ gắn mồi TaoC và thời gian kéo dài chuỗi như sau: biến tính 98oC trong 30 giây, khuếch đại 30 - 32 chu kỳ (98oC, 8 giây;

TaoC, 20 giây; 72oC, 30 - 35 giây), sau đó hoàn thành kéo dài chuỗi ở 72º trong

6 phút Trong đó, nhiệt độ gắn mồi

TaoC và thời gian kéo dài chuỗi phụ thuộc vào trình tự mồi và kích thước sản phẩm

Bảng 1: Thông tin các mồi sử dụng trong nghiên cứu

C)

KÍCH THƯỚC (bp)

PCR/giải trình tự

trình tự

caf1R/XhoI PCR TCTCGAGCGAGGGTTAGGCTCAAAGT 60 654

mPCR

AGAGAATCGTGATGCCGTCC-R

ATTACCCGCACTCCTTTCGG-R

GCTGCAAGTTTACCGCCTTT-R

3 Tách dòng và giải trình tự gen

Tiến hành nối ghép trực tiếp sản phẩm

PCR tinh sạch của 3 gen ypo2088, pla

và caf1 với vector tách dòng pJET1.2/blunt

nhờ T4-ligase (Thermo scientific) Sản

phẩm nối ghép được biến nạp vào tế

bào khả biến E coli DH5 (Invitrogen)

bằng phương pháp sốc nhiệt Tiến hành

kiểm tra các thể tái tổ hợp bằng PCR

khuẩn lạc (PCR colony), cắt bằng enzym

hạn chế AvaI và XbaI (Thermo scientific)

Xác đinh trình tự các gen đích theo cả

hai chiều theo phương pháp Sanger

với các mồi trên vector pJET1.2F/R và

mồi khuếch đại (bảng 1) Sử dụng phần

mềm Bioedit và Genious R7 để xử lý,

nối ghép tạo trình tự toàn bộ gen

ypo2088, pla, caf1, so sánh và phân tích

trình tự đã xác định với trình tự trên

Ngân hàng Gen

4 Multiplex PCR

Tham khảo trình tự các gen ypo2088,

Ngân hàng Gen kết hợp với kết quả giải trình tự trong nghiên cứu này, 3 cặp mồi tương ứng với các gen đích trên được thiết kế trong phản ứng PCR đa mồi xác

định Y pestis có độc lực (bảng 1) Thành

phần mPCR như sau: 1,2X Dream Taq Buffer; 0,25 mM dNTPs; MgCl2 0,6 mM; 0,25 μM mồi xuôi, mồi ngược mỗi loại; Dream Taq 0,8U; ~ 10 ng ADN khuôn, điều chỉnh H2O đủ thể tích 25 μl Chu trình nhiệt: biến tính 94oC/4 phút, tiếp theo là 30 chu kỳ (94oC/30 giây; 56oC/30 giây; 72oC/30 giây), sau đó hoàn thành kéo dài chuỗi ở 72º trong 6 phút Sản phẩm mPCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1,5% TBE 0,5X; nhuộm ethidium bromide và quan sát bằng hệ thống soi gel Dolphin-DOC

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN

1 Tách dòng và giải trình tự toàn bộ gen ypo2088, pla và caf1

polymerase trên gel agrose 1,2%

a) M: Thang ADN chuẩn 100 bp (Thermo Scientific); 1: Sản phẩm tổng hợp gen ypo2088 b) M: Thang ADN chuẩn 1 kb (Thermo Scientific); 1, 2: Sản phẩm tổng hợp gen pla, caf1 ADN tổng số của chủng Y pestis Yp1

được dùng để phân lập gen ypo2088, pla

và caf1 bằng PCR sử dụng Phusion

High-Fidelity ADN polymerase với các cặp mồi

tách dòng tương ứng Điện di kiểm tra

sản phẩm PCR trên gel agarose 1,2%

rất đặc hiệu, thể hiện bằng các band đậm,

rõ nét, không có band phụ, kích thước

tương đương với tính toán lý thuyết

Theo như thiết kế, nếu khuếch đại

thành công, các gen này sử dụng cặp mồi

là ypo2088F/R, plaF/R và cafF/R sẽ cho

sản phẩm có kích thước tương ứng là

645, 1019 và 654 bp, tương đương với

kích thước sản phẩm PCR trên bản gel

điện di Việc lựa chọn gen đặc trưng

của Y pestis trên NST là ypo2088 và gen

độc lực pla, caf1 trên plasmid được tham

khảo từ một số nghiên cứu trên thế giới [4, 7, 10] Nhóm nghiên cứu đã phân lập toàn bộ chiều dài của các gen này để phân tích trình tự của chủng VK dịch hạch

có độc lực ở Việt Nam nhằm xác định có

sự sai khác nào trong trình tự nucleotid với các chủng Y pestis có độc lực trên thế giới

Như vậy, từ kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại các gen đích

và gen độc lực của Y pestis như trên có

thể kết luận, bước đầu đã khuếch đại

thành công gen ypo2088, pla và caf1 của

chủng Y pestis Yp1 phân lập ở Việt Nam Sau khi tinh sạch, các sản phẩm PCR này được gắn vào vector tách dòng pJET1.2/blunt Plasmid tái tổ hợp chứa gen đích mong muốn, kiểm tra bằng PCR colony và enzym hạn chế AvaI và XbaI

(hình 2)

Hình 2: Kết quả kiểm tra ADN plasmid từ các dòng khuẩn lạc trên gel agarose 1,2%

a Kết quả PCR colony, M: Thang ADN chuẩn 1 kb (Thermo Scientific); 1 - 4: Các dòng khuẩn lạc 1 - 4 với gen pla; 5 - 8: Các dòng khuẩn lạc 1 - 4 với gen caf1

b Kết quả cắt kiểm tra bằng cặp enzym hạn chế AvaI và XbaI, M: Thang ADN chuẩn 1 kb (Thermo Scientific); 1 - 4: Sản phẩm cắt trên các dòng khuẩn lạc 1 - 4 mang plasmid pJET1.2-pla

c Kết quả cắt kiểm tra bằng cặp enzyme hạn chế AvaI và XbaI, M: Thang ADN chuẩn 1 kb (Thermo Scientific); 1, 2: Sản phẩm cắt trên các dòng khuẩn lạc 1, 2 mang plasmid pJET1.2-caf1

Hình 2: minh họa kết quả kiểm tra các

thể tái tổ hợp chứa gen đích là pla và

trên vector là pJET1.2F/R, theo tính toán

lý thuyết, nếu đoạn ADN gen đích gắn

được vào vector thành công thì tổng kích

thước sản phẩm PCR colony sẽ bằng

kích thước của gen đích và thêm chiều dài

118 bp (là kích thước đoạn ADN trên vector

được tính từ 2 đầu mồi pJET1.2F/R đến

đầu đa điểm cắt - Multiple Cloning Site)

Hình 2a cho thấy, với gen pla, có 3 dòng

khuẩn lạc là 1, 2 và 4 có sản phẩm band

rõ nét, kích thước khoảng 1,1 kb (tương

ứng với tính toán lý thuyết 1.137 bp)

Tương tự với gen caf1, kích thước sản

phẩm PCR colony là 772 bp, đúng với

trên hình điện di kiểm tra ở các dòng

khuẩn lạc 1 và 2 Kết quả cắt kiểm tra

plasmid tái tổ hợp bằng cặp enzym hạn

chế AvaI và XbaI cho các sản phẩm có

kích thước đúng như lý thuyết Kết quả này một lần n÷a khẳng định dòng khuẩn lạc 2 - 4 (với gen pla) và dòng khuẩn lạc

1, 2 (với gen caf1) chứa các gen đích mong muốn (hình 2b), đối với vector chứa

gen pla, đường chạy số 2 - 4 cho 2 sản

phẩm có kích thước khoảng 2,9 kb (kích thước của vector) và 1,1 kb (gen pla) Với

hình 2c của vector chứa gen caf1, sản

phẩm cắt kiểm tra là 3 band rõ nét có kích thước đúng như tính toán trên cả đường chạy số 1 và 2 Sở dĩ xuất hiện

2 band có kích thước khoảng 0,2 và 0,4 kb ngoài band 2,9 kb (vector) là do trong trình tự gen caf1 chứa trình tự nhận biết của XbaI Như vậy, các dòng khuẩn lạc 2 - 4 (đối với gen pla), dòng

1, 2 (đối với gen caf1) mang plasmid

chứa gen đích tương ứng Các gen đích này đã được tách dòng thành công trong vector pJET1.2/blunt

Kết quả giải trình tự các gen đích trên vector tách dòng cho thấy, gen ypo2088 và

trên Ngân hàng Gen Chỉ có một đột biến điểm được xác định ở gen pla (TC)836 khi

so sánh với trình tự gen tương ứng trên chủng Y pestis Angola mã số CP000900 (vị trí

nucleotid đột biến được tính theo trình tự nucleotid gen pla chủng Y pestis Angola)

chiếu trên Ngân hàng Gen (đoạn nucleotid có xảy ra đột biến) Các chủng tham chiếu

được ký hiệu theo thứ tự mã số, tên chủng/phân lập, dấu chấm biểu thị nucleotid

giống nhau, nếu có đột biến sẽ được biểu thị bằng các nucleotid

Sự xuất hiện đột biến điểm này được

tìm thấy trên các chủng tham chiếu lựa chọn

là Y pestis CO92, biovar Medievalis và

Kim5 Đây là đột biến sai nghĩa, làm thay

đổi axít amin isoleucine thành threonine

Thay đổi từ axít amin không phân cực

(Isoleucine) thành axít amin phân cực

(Threonine) có ý nghĩa nhất định Tuy nhiên,

để tìm hiểu thêm cần có các công trình

nghiên cứu tiếp theo về protein tái tổ hợp

Như vậy, từ kết quả nghiên cứu có thể

kết luận, đã tách dòng và xác định trình tự

đầy đủ các gen ypo2088, pla và caf1 của

chủng Y pestis Yp1 phân lập ở Việt Nam

Trình tự các gen này đã được đăng ký

trên Ngân hàng Gen với mã số lần lượt là

KM880027, KM880025 và KM880026

2 Thiết kế phản ứng multiplex PCR

Phản ứng mPCR được thiết kế với 3

cặp mồi là ypo2088F/R, plaF/R và caf1F/R

để xác định sự có mặt của các gen tương

ứng đặc trưng cho Y pestis gây bệnh

Những chủng Y pestis chứa đầy đủ các gen này trong tự nhiên được xác định đầy đủ độc lực Để thực hiện phản ứng mPCR, 3 cặp mồi phát hiện được thiết

kế có chiều dài và nhiệt độ gắn mồi tương đương nhau Nồng độ các cặp mồi được tối ưu (0,25 mM mồi xuôi, mồi ngược mỗi loại), sau khi thực hiện phản ứng PCR đơn trên từng gen tương ứng Khảo sát gradient nhiệt độ gắn mồi từ

52 - 60oC, lựa chọn nhiệt độ gắn mồi tối ưu là 56oC Sản phẩm phản ứng mPCR khuếch đại đồng thời 3 gen đích của VK dịch hạch có kích thước lần lượt

là 103, 438 và 271 bp xác định các gen

tương ứng ypo2088, pla và caf1, dễ dàng

phân biệt trên bản điện di agarose 1,5%

(hình 4)

Hình 4: Hình ảnh điện di xác định VK

trên gel agarose 1,5%

M: Marker 100 bp (Thermoscientific), ĐC (-):

Đối chứng âm sử dụng chủng E coli ATCC

25922; ĐC(+): Đối chứng dương sử dụng

plasmid tái tổ hợp chứa các gen pla, caf1 và

ypo2088; Y1, Y2: Các mẫu cần kiểm tra

Trong phản ứng mPCR này, đối chứng

âm được sử dụng là VK E coli chủng

ATCC 25922 để kiểm tra phản ứng chéo

cùng họ VK đường ruột với Y pestis

Hình 4 cho thấy, ở mẫu đối chứng (-)

không xuất hiện bất kỳ band nào Trong

khi đó, ở mẫu đối chứng dương là plasmid

tái tổ hợp chứa các gen ypo2088, pla,

mPCR là 3 band có kích thước đúng với

các đoạn gen tương ứng cần khuếch đại

Mẫu kiểm tra là Y1 và Y2, đây là mẫu môi

trường đất gây nhiễm giả định Với mẫu

Y1 là mẫu đất thông thường không gây

nhiễm và mẫu Y2 là mẫu đất có gây nhiễm

canh khuẩn VK dịch hạch (với lượng

50 - 100 cfu/phản ứng) Kết quả mPCR với mẫu Y1 không xuất hiện band đích nào, cho thấy đây là mẫu âm tính với Y pestis Còn mẫu Y2 xuất hiện đầy đủ 3 band có kích thước đúng với mẫu đối chứng (+),

được xác định là mẫu Y pestis có đầy

đủ độc lực

Khi dịch bệnh xảy ra, việc xác định nhanh và chính xác mầm bệnh nghi ngờ rất cần thiết để tránh nhầm lẫn với các loài không gây bệnh có quan hệ gần gũi [7] Phương pháp PCR sử dụng đích gen

đặc trưng, gen độc lực cho Y pestis để

chẩn đoán là lựa chọn khả thi Một số tác giả trên thế giới đã xác định các vùng gen

trên NST đặc trưng cho Y pestis, từ đó

thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho PCR và chứng minh không xảy ra phản ứng chéo với loài có quan hệ gần gũi [2, 8] Những gen đặc trưng này có ưu điểm: chúng đều nằm trên NST (bền), chỉ có mặt trên VK đích (tránh hiện tượng dương tính giả), xuất hiện trên tất cả các chủng (loại bỏ hiện tượng âm tính giả) Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu trước đây tập trung vào việc xác định các gen độc lực trên hai plasmid

đặc trưng của Y pestis là pPCP1 và

pMT1 Trên thực tế, trong nhiều trường hợp các plasmid này không bền trong thao tác di truyền, có những chủng tự nhiên mất một hay nhiều hơn những plasmid này [10] Như vậy, việc xác định các chủng Y pestis có độc lực trong tự nhiên cần kết hợp gen đích trên NST và

gen trên plasmid độc lực mới cho kết quả

chẩn đoán chính xác Với phản ứng

mPCR này, nhóm tác giả đã sử dụng

đồng thời 3 cặp mồi xác định sự có mặt

của 3 gen đích là pla, caf1, ypo2088

Trong đó, pla và caf1 là gen đích thường

được sử dụng để xác định Y pestis

Ngoài ra, gen pla thường có 150 - 200

bản copy/tế bào, chính đặc điểm đó đã

tăng tính nhạy của phản ứng PCR [3]

Điều quan trọng nữa, pla quyết định tính

độc của Y pestis bằng con đường lây truyền

qua da; các chủng VK thiếu mất gen pla

có độc lực rất thấp [4] Gen caf1 mã hóa

kháng nguyên vỏ F1 (fraction 1), có tác

dụng giúp cho Y pestis không bị hấp thu

bởi đại thực bào [8] Việc xác định sự có

mặt của các gen này cho phép khẳng

định tính độc của chủng Y pestis trong

tự nhiên Gen đích đặc trưng thứ ba

được sử dụng trong công trình này thuộc

NST ypo2088 mã hóa cho một putative

methyltransferase, 1 trong 28 marker

được Zhou và CS xác định [10] Trước

đây, các nhà khoa học chỉ sử dụng gen

pla để phát hiện Y pestis trong các mẫu

lâm sàng Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu đã

chỉ ra, có một tỷ lệ các chủng Y pestis bị

mất gen pla do nó định vị trên một

plasmid có kích thước tương đối nhỏ

Vì vậy, việc sử dụng thêm ypo2088 - gen

đích nằm trên NST, đặc trưng cho Y pestis

được ưu tiên lựa chọn, cho phép chẩn đoán

chính xác VK dịch hạch [4, 6] Với kết quả

trên, phản ứng mPCR được thiết kế đã

xác định nhanh, chính xác VK Y pestis có

độc lực trong tự nhiên

KẾT LUẬN

Đã tách dòng và giải trình tự thành công toàn bộ chiều dài 3 gen là ypo2088,

phân lập ở Việt Nam Xác định được 1 đột biến sai nghĩa (TC)836 làm thay đổi axít amin (IsoleucineThreonine) trên

gen pla, hai gen còn lại có mức độ tương

đồng 100% khi so sánh với trình tự tham chiếu Kết quả này phù hợp với những nghiên cứu trên thế giới cho thấy trình tự

3 gen ypo2088, pla và caf1 rất bền vững,

không có sự khác biệt đáng kể giữa các chủng Y pestis Thiết kế thành công phản ứng mPCR khuếch đại đồng thời 3 gen đích, xác định chính xác VK dịch hạch có độc lực, có ý nghĩa trong phát hiện sớm

và dự phòng dịch bệnh này

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Lê Thanh Hòa, Nguyễn Thị Bích Nga, Nguyễn Thị Ngọc Dao, Đỗ Ngọc Khuê Xây

dựng phương pháp chẩn đoán nhanh VK dịch hạch (Yersinia pestis) từ mẫu đất và nước nhiễm khuẩn Tạp chí Nghiên cứu Y học

2005, 38 (5), tr.1-6

2 Chain P S G, Carniel E, Larimer F W

et al Insights into the evolution of Yersinia pestis through whole-genome comparison

with Yersinia pseudotuberculosis Proceedings

of the National Academy of Sciences of the United States of America 2004, 101 (38), pp.13826-13831

3 Leal N C, Almeida A M Diagnosis of plague and identification of virulence markers in Yersinia pestis by multiplex-PCR Rev Inst Med Trop Sao Paulo 1999, 41 (6), pp.339-342

4 Matero P, Pasanen T, Laukkanen R et al Real-time multiplex PCR assay for detection of Yersinia pestis and Yersinia pseudotuberculosis APMIS 2009, 117 (1), pp.34-44

5 Pham H V, Dang D T, Tran Minh N N et al Correlates of environmental factors and human

plague: an ecological study in Vietnam Int J Epidemiol 2009, 38 (6), pp.1634-1641

6 Radnedge L, Agron P G, Worsham P L et al Genome plasticity in Yersinia pestis

Microbiology 2002, 148 (Pt 6), pp.1687-1698

7 Radnedge L, Gamez-Chin S, McCready P M et al Identification of nucleotide sequences for

the specific and rapid detection of Yersinia pestis Appl Environ Microbiol 2001, 67 (8),

pp.3759-3762

8 Rollins S E, Rollins S M, Ryan E T Yersinia pestis and the plague Am J Clin Pathol

2003, 119 Suppl, pp S78-85

9 Thoerner P, Bin Kingombe C I, Bogli-Stuber K et al PCR detection of virulence genes in Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis and investigation of virulence gene

distribution Appl Environ Microbiol 2003, 69 (3), pp.1810-1816

10 Zhou D, Han Y, Dai E et al Identification of signature genes for rapid and specific

characterization of Yersinia pestis Microbiol Immunol 2004, 48 (4), pp.263-269.