PHÁT HIỆN NGƯỜI MANG GEN BỆNH TĂNG sản THƯỢNG THẬN THỂ THIẾU ENZYM 21 HYROXYLASE BẰNG kỹ THUẬT MLPA (2)

Sự phát triển và ứng dụng của các kỹ thuật sinh học phân tử như PCR, giảitrình tự gen Sequencing, MLPA Multiplex Ligation – dependent ProbeAmplification… đã phát hiện được hầu hết các độ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

1 TS BS Trần Huy Thịnh

2 PGS.TS Nguyễn Quang Huy

Hà Nội - Năm 2015

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Khoa Sinh học, Bộmôn Sinh lý thực vật và Hóa sinh Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại họcQuốc Gia Hà Nội đã hết lòng tạo điều kiện để chúng tôi có thể học tập tốt vàđạt được những thành quả như ngày hôm nay

Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS.BS Trần Huy Thịnh,Phó trưởng Bộ môn Hóa sinh, Trường Đại học Y Hà Nội, người Thầy đã tận tìnhhướng dẫn, tạo mọi điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoànthành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Quang Huy, Chủ nhiệm KhoaSinh học, Trường Đại học khoa Học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội đã giúp đỡ

và chỉ bảo cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Lãnh đạo Trung tâm nghiên cứuGen- Protein, Trường Đại học Y Hà Nội, cùng toàn thể nhân viên trong Trungtâm đã tạo điều kiện giúp đỡ cho tôi trong quá trình nghiên cứu để hoàn thànhluận văn này

Tôi xin cảm ơn Lãnh đạo Khoa Xét Nghiệm, Bệnh viện Đại học Y Hà Nội,cùng các anh chị em trong Khoa đã giúp đỡ cho tôi trong quá trình học tập, nghiêncứu để hoàn thành luận văn

Và cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình và những người bạn đãluôn ở bên động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoànthành luận văn này

Hà Nội, ngày 10 tháng 12 năm 2015

Dương Thị Giang

Ig2 Đột biến điểm ở intron 2( 656A/C →G)

HLA Human leukocyte antigen

KCĐ Không cổ điển

MHC Major histocompatibility complex

MLPA Multiplex Ligation – dependent Probe Amplification

NHĐT Nam hóa đơn thuần

PCR Polymerase Chain Reaction

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1 GIỚI THIỆU VỀ BỆNH TSTTBS THỂ THIẾU ENZYM 21-HYDROXYLASE 3

1.1 Một số nét khái quát về bệnh TSTTBS 3

1.2 Vài nét về tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS 4

1.2.1 Tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS trên thế giới 4

1.2.2 Tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS tại Việt Nam 5

1.3 Tần suất mắc bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh 6

1.4 Cơ chế bệnh sinh của bệnh TSTTBS 7

1.5 Lâm sàng bệnh TSTTBS 8

2 CƠ SỞ PHÂN TỬ VÀ ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA BỆNH TSTTBS 10

2.1 Cơ sở phân tử của bệnh TSTTBS 10

2.1.1 Vị trí, cấu trúc, chức năng gen CYP21 10

2.1.2 Một số đột biến gen CYP21A2 gây bệnh TSTTBS 11

2.2 Đặc điểm di truyền của bệnh TSTTBS 13

2.3 Biểu hiện lâm sàng, cận lâm sàng của người mang gen dị hợp tử 14

2.4 Phát hiện người lành mang gen bệnh 15

3 CHẨN ĐOÁN BỆNH TSTTBS 16

3.1 Chẩn đoán lâm sàng và cận lâm sàng 16

3.1.1 Chẩn đoán xác định 16

3.1.2 Chẩn đoán phân biệt 17

3.2 Các phương pháp sinh học phân tử phát hiện đột biến gen CYP21A2 gây bệnh TSTTBS 18

3.2.1 Kỹ thuật PCR 18

3.2.2 Kỹ thuật giải trình tự gen (DNA Sequencing) 19

3.2.3 Kỹ thuật Souther blot 20

3.2.4 Kỹ thuật MLPA (Multiplex Ligation Dependent Probe Aplification).20 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Đối tượng nghiên cứu 24

2.2 Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu 24

2.2.1 Dụng cụ và trang thiết bị 24

2.2.2 Hoá chất 25

2.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 26

2.4 Đạo đức trong nghiên cứu 26

2.5 Phương pháp nghiên cứu 27

2.5.1 Thiết kế nghiên cứu .27

2.5.2 Tiến hành xét nghiệm 27

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 33

3.1 Kết quả tách chiết DNA 33

3.2 Kết quả phát hiện đột biến gen trên bệnh nhân và phát hiện người lành mang gen bệnh 35

KẾT LUẬN 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

danh MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Tần số mắc bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21-OH trên thế giới 6

Bảng 1.2: Các đột biến gen CYP21 thường gặp gây TSTTBS cổ điển 12

Bảng 3.1 Các thành viên trong gia đình bệnh nhân 35

Bảng 3.2 Kiểu đột biến gen của bệnh nhân và thành viên gia đình 36

danh MỤC hình

Hình 1.1: Sơ đồ tổng hợp hormon vỏ thượng thận do thiếu hụt enzym 7

Hình 1.2: Nhiễm sắc thể số 6 và vị trí gen CYP21 10

Hình 1.3: Cấu trúc phân tủ của gen CYP21 11

Hình 1.4 Quy luật di truyền gen lặn trên NST thường 13

Hình 1.5 Phả hệ của một gia đình có con bị bệnh di truyền lặn trên NST thường (Autosome Recessive) Thế hệ I, II, không có người bị bệnh, thế hệ III có người bị bệnh 14

Hình 1.6 Giá trị 17-OHP sau nghiệm pháp kích thích ACTH trong các thể bệnh và người mang gen dị hợp tử 15

Hình 1.7 Các bước cơ bản của kỹ thuật PCR 19

Hình 1.8 Các giai đoạn của kỹ thuật MLPA 21

Hình 1.9 Sơ đồ và vị trí một số probe của Kit MLPA P050B2 23

Hình 1.10 Hình ảnh minh họa kết quả MLPA 23

Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 27

Hình 2.2 Sơ đồ và vị trí một số probe của Kit MLPA P050B2 30

Hình 3.1 Kết quả kiểm tra chất lượng DNA tách từ mẫu bệnh phẩm 33

Hình 3.2 Kết quả điện di kiểm tra DNA tổng số 34

Hình 3.3 Phả hệ gia đình số 01 38

Hình 3.4 Kết quả MLPA gia đình mã số 01 39

Hình 3.5 Phả hệ gia đình số 02 40

Hình 3.6 Kết quả MLPA của gia đình mã số 02 41

Hình 3.7 Phả hệ gia đình số 03 42

Hình 3.8 Kết quả MLPA của gia đình mã số 03 43

Hình 3.9 Phả hệ gia đình số 04 44

Hình 3.10 Kết quả MLPA của gia đình mã số 04 45

Hình 3.11 Phả hệ gia đình số 05 46

Hình 3.12 Kết quả MLPA của gia đình mã số 05 48

Hình 3.13 Phả hệ gia đình số 06 49

Hình 3.14 Kết quả MLPA của gia đình mã số 06 50

MỞ ĐẦU

Tăng sản thượng thận bẩm sinh TSTTBS (congenital adrenal hyperplasia CAH) là bệnh gây ra do giảm hoặc mất hoàn toàn một trong năm enzym tham giavào quá trình tổng hợp corticosteroid, dẫn đến rối loạn quá trình tổng hợp hormon

-vỏ thượng thận; trong đó, thể thiếu 21- hydroxylase (21-OH) hay gặp nhất và chiếm

tỷ lệ 90 - 95%, tiếp theo là thể thiếu 11β-hydroxylase chiếm 5 - 9%, còn lại là cácthể bệnh rất hiếm gặp do thiếu hụt 3-hydroxy steroid dehydrogenase (3β-HSD),17α-hydroxylase và 20, 22- desmolase [1]

Bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh do thiếu enzym 21-hydroxylase là bệnh

di truyền đơn gen lặn, trên nhiễm sắc thể thường do đột biến gen CYP21A2 gâynên Đối với thể nặng, nếu bệnh không được chẩn đoán sớm và điều trị thích hợp sẽdẫn đến cơn suy thượng thận cấp và bệnh nhân có thể tử vong Các thể bệnh khác

có thể dẫn đến nam hóa ở trẻ gái, giả dậy thì sớm ở trẻ trai; do đó bệnh ảnh hưởngnặng nề đến sự phát triển thể chất, chức năng sinh sản, tâm lý của người bệnh và giađình [6]

Sự phát triển và ứng dụng của các kỹ thuật sinh học phân tử như PCR, giảitrình tự gen (Sequencing), MLPA (Multiplex Ligation – dependent ProbeAmplification)… đã phát hiện được hầu hết các đột biến gen CYP21A2 gây bệnhtăng sản thượng thận bẩm sinh, trong đó đột biến điểm chiếm tỷ lệ từ 70 - 75%, cácdạng đột biến mất đoạn, thêm đoạn, lặp đoạn và đảo đoạn chiếm từ 25 - 30% cáctrường hợp [25] Nhiều nghiên cứu đã tìm thấy mối tương quan giữa kiểu gen vàkiểu hình của bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh bằng cách xác định các đột biếnđặc trưng của từng thể bệnh Các đột biến gen CYP21A2 trầm trọng như: mất đoạn,đảo đoạn, chuyển đoạn gen lớn hay đột biến vô nghĩa (nonsense mutation) làm mấthoàn toàn hoạt tính enzym 21- hydroxylase gây ra những thể bệnh nặng và hay gặp

ở thể mất muối Đột biến sai nghĩa như I172N làm giảm hoạt tính enzym hydroxylase chỉ còn 1 - 2% so với bình thường gặp ở thể nam hoá đơn thuần hayP30L, V281L, P453S làm giảm hoạt tính enzym 21- hydroxylase chỉ còn 20 - 50%

21-so với bình thường gặp ở thể bệnh không điển hình Xác định chính xác các dạngđột biến gen CYP21A2 đóng vai trò quan trọng giúp chẩn đoán sớm và có nhữngbiện pháp can thiệp điều trị kịp thời nhằm giảm những tác động của việc thiếu hụtenzym 21 - hydroxylase đối với bệnh nhân Bên cạnh đó việc xác định người lànhmang gen sẽ cung cấp những thông tin hữu ích cho tư vấn di truyền và chẩn đoántrước sinh giúp giảm tỷ lệ sinh ra những đứa trẻ bị bệnh, đồng thời giúp sàng lọc sơsinh để quản lý và chăm sóc tốt những trẻ có nguy cơ cao bị bệnh tăng sản thượngthận bẩm sinh trong cộng đồng.

Các đột biến mất đoạn, lặp đoạn và đảo đoạn chiếm tỷ lệ khoảng25 - 30%, làdạng đột biến gây ra thể bệnh nặng nên cần phải có biện pháp chẩn đoán chính xác

và kịp thời Tuy nhiên, các dạng đột biến này rất khó xác định bằng các kỹ thuậtPCR thông thường Gần đây, kỹ thuật MLPA là một phương pháp mới với thời giantiến hành ngắn, đơn giản và độ nhạy cao đã phát hiện chính xác các dạng đột biếnnày trên gen CYP21A2 Việc ứng dụng kỹ thuật MLPA vẫn chưa được khai thácnhiều ở Việt Nam, đặc biệt là trong việc xác định người lành mang gen gây cácbệnh di truyền Chính vì vậy nhằm mục đích giúp quản lý tốt người mang gen vàcung cấp những thông tin hữu ích cho tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh,

chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: Phát hiện người mang gen bệnh tăng sản thượng thận thể thiếu enzym 21- Hydroxylase bằng kỹ thuật MLPA với mục tiêu:

Phát hiện người mang đột biến dị hợp tử gen CYP21A2 ở các thành viên gia đìnhbệnh nhân bị bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21 - OH

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 GIỚI THIỆU VỀ BỆNH TSTTBS THỂ THIẾU ENZYM 21-HYDROXYLASE

1.1 Một số nét khái quát về bệnh TSTTBS

Bệnh tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh hay còn gọi là hội chứng sinhdục- thượng thận, là một bệnh di truyền gen lặn trên NST thường, do sự thiếu hụtcác enzym tham gia vào quá trình tổng hợp hormon vỏ thượng thận Trong đó, sựthiếu hụt enzym 21- hydroxylase (21- OH) là hay gặp nhất, chiếm tỷ lệ 90 - 95%,tiếp đến là sự thiếu hụt enzym 11β- hydroxylase (11- OH), 3β- hydroxysteroiddehydrogenase (3β- HSD), 17α- hydroxylase (17- OH) và ít gặp hơn là sự thiếu hụt

20 - 22 desmolase [35]

Sự thiếu hụt enzym 21- hydroxylase dẫn đến sự tổng hợp cortisol và phầnlớn aldosterron của tuyến thượng thận bị suy giảm, gây tăng tiết AdrenoCorticotropin Hormon (ACTH) tuyến yên, tăng sản vỏ thượng thận và sản xuất thừaandrogen

Tùy theo mức độ thiếu hụt enzym 21- hydroxylase mà lâm sàng biểu hiện ởcác mức độ nặng hay nhẹ khác nhau Thiếu hụt hoàn toàn enzym 21- hydroxylasegây bệnh cảnh lâm sàng mất muối với các triệu chứng suy thượng thận cấp vàcường androgen, thiếu enzym 21- hydroxylase ở mức độ vừa phải (1 - 3%) sẽ biểuhiện triệu chứng nam hóa đơn thuần do cường androgen và khi enzym 21-hydroxylase giảm nhẹ (20 - 50%) sẽ xuất hiện thể bệnh không cổ điển [15]

1.2 Vài nét về tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS

1.2.1 Tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS trên thế giới

Theo y văn, trường hợp bệnh TSTTBS đầu tiên trên thế giới được mô tả bởinhà giải phẫu học De Crecchico vào năm 1865

Đầu thế kỷ 19, Emil Huschke, một nhà giải phẫu và phôi thai học, đã phânbiệt vỏ và tủy thượng thận, đồng thời tìm thấy mối liên quan giữa tuyến thượng thận

và tuyến sinh dục [8] Bệnh nhân TSTTBS thể mất muối đầu tiên được Butler(1939) và Wilkins (1940) mô tả Năm 1950 - 1951, Wilkins, Bartter và cộng sự đãchứng minh rằng việc sử dụng cortisol có thể ức chế sự tổng hợp thừa androgentrong hội chứng sinh dục - thượng thận do TSTTBS [9] Trong giai đoạn này, cácnhà nghiên cứu đã xác định 6 steroid vỏ thượng thận có tác dụng sinh học, chúngđược tổng hợp từ cholesterol và được chia thành 3 nhóm: (i) Steroid chuyển hóamuối gồm DOC, corticosteron và aldosteron; (ii) Steroid chuyển hóa đường gồmhydrocortisone, cortisol; (iii) Steroid sinh dục nam (androgen) gồmdehydroepiandrosteron và androstendion [10]

Từ những năm 1970, nghiên cứu và định lượng 17- OHP, một tiền chất trựctiếp tạo ra cortisol, được coi là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán bệnh TSTTBS Năm

1979 - 1980, Migeon và Rosenwaks hoàn chỉnh tiêu chuẩn chẩn đoán hóa sinh củabệnh TSTTBS: do thiếu enzym 21- OH gây tích tụ các tiền chất trước chỗ ứ đọngchuyển hóa bao gồm 17- OHP và progesteron, dẫn đến tăng tổng hợp testosteron ở

vỏ thượng thận, nồng độ testostrron trong máu tăng và sản phẩm đào thải củatestosteron trong nước tiểu là 17- Cetosteroid (17-CS) tăng Nồng độ 17- OHP tăngcao trong máu là tiêu chuẩn có giá trị đặc hiệu để chẩn đoán TSTTBS thể thiếuenzym 21- OH

Quy luật di truyền của bệnh TSTTBS đã được nhận biết từ những năm 1930

và được mô tả chi tiết bởi Knudson năm 1951, đó là bệnh di truyền đơn gen lặn,nằm trên nhiễm sắc thể thường Năm 1977, Dupont thông báo bản đồ gen và sự liênkết gần giữa TSTTBS và phức hợp hòa hợp mô chủ yếu (MHC) Sau đó,Komainami phân lập được Cytochrome P450c21 là chuỗi peptid đơn Năm 1982 -

1983, O’ Neill và Fleishwicle phát hiện sự liên quan giữa gen CYP21 với MHCnhóm III gồm yếu tố B, C2, C4A, C4B [37].

Năm 1984, Hite và cộng sự đã xác định được gen CYP21A2 và giả genCYP21A2P có kích thước 3,4 kb; nằm trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể số 6, bêntrong phức hợp MHC cùng với các gen C4 bổ thể [27]

Năm 1986, Higashi và cộng sự đã phân tích trình tự nucleotid toàn bộ genCYP21A2 và giả gen CYP21A2P Sau đó, các đột biến điển hình của genCYP21A2 đã được tìm thấy, chúng được coi là nguyên nhân chính gây thiếu hụtenzym 21- OH [23]

Phương pháp lai Southern blot do Edward Southern đề xuất năm 1975 đãđược nhiều tác giả sử dụng để phát hiện các đột biến mất đoạn gen CYP21A2thường gặp [24]

Đến nay, nhờ kết hợp phản ứng PCR với một số kỹ thuật sinh học phân tửkhác như giải trình tự gen, hầu hết các đột biến của gen CYP21 gây bệnh TSTTBS

đã được phát hiện [26]

1.2.2 Tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS tại Việt Nam

Ở nước ta đã có nhiều công trình nghiên cứu về bệnh TSTTBS Các côngtrình nghiên cứu có thể kể đến như:

Năm 1991, Nguyễn Thu Nhạn và cộng sự đã tổng kết 36 bệnh nhân mắc hộichứng sinh dục - thượng thận trong giai đoạn 1981 - 1990, chiếm tỷ lệ 1,9% tổng sốbệnh nhân nội tiết, có tỷ lệ tử vong là 5,5% [9]

Năm 1994, nhóm nghiên cứu Nguyễn Nguyệt Nga, Nguyễn Thu Nhạn đãtổng kết chẩn đoán và điều trị bệnh TSTTBS Chẩn đoán dựa vào lâm sàng và xétnghiệm hóa sinh progesteron, testosteron, cortisol, Follice Stimulating Hormon(FSH), Luteinizing Hormon (LH), điện giải đồ, 17 Cetosteroid (17- CS) và 17 –Hydroxycetosteroid (17- OHCS); điều trị bệnh bằng prednisolone và nước muốiđường với thể mất muối [8]

Năm 2000, Võ Thị Kim Huệ và cộng sự công bố nghiên cứu chẩn đoán vàđiều trị bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21-OH ở 43 bệnh nhân khám và điều trị tại

Bệnh viện Nhi Trung ương 1989 - 1997 Nghiên cứu đưa ra các dấu hiệu lâm sàng

và giới hạn giá trị của 17- OHP, progesteron và testosteron giúp chẩn đoán và sửdụng Hydrocortison và Florinef điều trị bệnh thay cho Prednisolon đặc biệt tác giả

đã sử dụng kỹ thuật khuếch đại gen (PCR) để phát hiện đột biến [3]

Năm 2001, Thái Thiên Nam nghiên cứu phát hiện đột biến gen cho bệnhnhân bị bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21- OH [7]

Năm 2004, Triệu Quốc Khánh đã nghiên cứu nhận thức của bố mẹ và bệnhnhân bị bệnh TSTTBS thấy rằng bệnh ảnh hưởng nặng nề đến tình trạng tâm lý giađình và bệnh nhân [2]

Năm 2006, Trần Kiêm Hảo đã nghiên cứu xác định một số đột biến genCYP21A2 gây bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21- OH và phát hiện người lànhmang gen bệnh [4]

Năm 2008, Nguyễn Thúy Giang đã nghiên cứu sự phát triển thể chất và một

số yếu tố ảnh hưởng ở trẻ TSTTBS đang điều trị tại Bệnh viện Nhi Trung ươngnhận thấy bệnh gây ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của trẻ đặc biệt là chiều cao[1]

Nhìn chung, ở Việt Nam những nghiên cứu về lâm sàng và ảnh hưởng tâm lýcủa gia đình và bệnh nhân là phổ biến, chưa có nhiều nghiên cứu về bệnh học phân

tử bệnh TSTTBS

1.3 Tần suất mắc bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh

Tần suất mắc bệnh trên thế giới là 1/10.000 - 1/15.000 Tỷ lệ mắc bệnh cao nhất

ở hai quần thể người Eskimo Yupik (Alaska) và La Réunion (Pháp) với tần suất 1/282

và 1/2141, tỷ lệ mắc bệnh ở châu Âu là 1/14.000 [28]

Một nghiên cứu của Nhật tại thành phố Sapporo năm 1982 - 2005 đưa ra tỷ

lệ mắc bệnh TSTTBS là 1/19.634 và tỷ lệ các kiểu hình theo thứ tự thể MM : thểNHĐT : thể không điển hình là 16 : 4 : 2

Tại Việt Nam, hàng năm có từ 50 đến 70 trẻ được chẩn đoán mới, chiếm tỷ

lệ 60,7% các bệnh lý tuyến thượng thận và chiếm 2% các bệnh lý di truyền vào điềutrị tại khoa Nội tiết - Chuyển hóa - Di truyền, Bệnh viện Nhi TW [17]

Bảng 1.1: Tần số mắc bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21- OH trên thế giới

1.4 Cơ chế bệnh sinh của bệnh TSTTBS

Khi thiếu enzym, một hay nhiều con đường tổng hợp hormon bị tắc nghẽn vàhormon dưới chỗ tắc không được sản xuất đủ, đặc biệt là cotisol Cơ chế điều hòangược (feed back) kích thích tuyến yên sản xuất và bài tiết ACTH, gây tăng sảntuyến thượng thận, kích thích các tế bào chứa melanin tạo hắc tố [26]

Hình 1.1 Sơ đồ tổng hợp hormon vỏ thượng thận do thiếu hụt enzym [35]

Thiếu hụt enzym 21-OH sẽ gây giảm tổng hợp cortisol, tăng các tiền thâncủa cortisol như 17- hydroxyprogesteron (17-OHP) và progesteron, tăng cáchormon sinh dục vỏ thượng thận như dehydroepiandrosterone (DHEA), D4androstenedion và testosteron (T) gây nam hóa ở trẻ gái, giả dậy thì sớm ở trẻ trai

Trong khi đó việc thiếu hoàn toàn enzym 21-OH gây giảm aldosteron làm mất natriqua nước tiểu, giảm khối lượng tuần hoàn (hội chứng mất muối) [35].

1.5 Lâm sàng bệnh TSTTBS

Sự thiếu hụt enzym 21- OH dẫn đến sự thiếu hụt cortisol và/hoặc thiếu hụtaldosteron cũng như thừa androgen thượng thận Tùy thuộc vào mức độ thiếu hụtcủa 21- OH mà sự biểu hiện lâm sàng của TSTTBS được chia thành 3 thể khác nhaubao gồm:

 Thể mất muối

Bệnh nhân thiếu hụt enzym 21- hydroxylase thể cổ điển sẽ dẫn đến suy giảmtrầm trọng khả năng hydroxyl hóa để chuyển progesterone thành 11-deoxycorticosteron, do đó không thể tổng hợp đầy đủ aldosteron và cortisol trongmáu Ngoài ra, các tiền chất steroid trước chỗ tắc được tích lũy tăng cao làprogesteron và 17- OHP có thể hoạt động như là các chất đối kháng trực tiếp cácthụ thể hormon chuyển hóa muối và làm tình trạng thiếu aldosteron trầm trọng hơn[26]

Dấu hiệu xuất hiện sớm là nôn, tiêu chảy dẫn đến mất muối, mất nước và sụtcân Nếu không được điều trị, cơn suy thượng thận nhanh chóng nặng lên với cácdấu hiệu mắt trũng, da nổi vân tím, trụy tim mạch và có thể ngừng tim do kali máutăng cao dẫn đến tử vong

Dấu hiệu nam hóa là do tăng testosteron:

+ Ở trẻ gái, ngay khi đẻ xuất hiện âm vật to, có khi to như dương vật, cácmôi có thể dính với nhau nhiều hay ít, lỗ niệu đạo có thể ở ngay dưới âm vật, làmcho dễ chẩn đoán nhầm với tật lỗ đái thấp Nếu không được điều trị, biểu hiện namhóa ngày càng rõ: trẻ mọc lông mu, lông nách, trứng cá, cơ bắp phát triển, lớnnhanh nhưng trẻ sẽ lùn ở tuổi trưởng thành và đạt chiều cao tối đa khoảng 140 

150 cm, hình dáng đàn ông, vai rộng, hông hẹp, tuyến vú kém phát triển kèm theorối loạn kinh nguyệt [26]

+ Ở trẻ trai, biểu hiện giả dậy thì sớm: mọc lông mu, lông nách, mọc trứng cá,giọng trầm, dương vật to nhanh và cương cứng, nhưng tinh hoàn vẫn nhỏ tương ứngvới tuổi thực của trẻ Chiều cao và tuổi xương phát triển nhanh và mạnh, kết thúcsớm khi trẻ khoảng 8  10 tuổi [26].

 Thể nam hóa đơn thuần

Bệnh nhân thiếu hụt enzym 21- OH mức độ vừa phải (1 - 3%), quá trình tổnghợp cortisol và aldosteron vẫn xảy ra

Ở trẻ gái, biểu hiện nam hóa bộ phận sinh dục ngoài (giả lưỡng tính) Do rốiloạn tổng hợp các steroid xảy ra sớm từ giai đoạn bào thai vào tuần thứ 7- 8 của thai

kỳ nên biểu hiện nam hóa thường ngay sau sinh: âm vật to, môi lớn dính vào nhau,

lỗ niệu đạo ở ngay dưới âm vật , sau đó các biểu hiện nam hóa ngày càng rõ nếutrẻ không được điều trị sớm

Ở trẻ trai, thường ít có biểu hiện nam hóa lúc được sinh ra (cường androgen).Cũng như trẻ gái, biểu hiện cường androgen ở trẻ nam diễn ra nhanh bắt đầu từ 2- 3tuổi gồm các dấu hiệu dậy thì sớm như mọc lông mu, lông nách, sau đó mọc trứng

cá và giọng trầm Dương vật to nhanh, thường cương cứng, tinh hoàn nhỏ so vớituổi [8], [26]

 Thể không cổ điển

Đây là thể nhẹ nhất, hoạt độ enzym 21-OH chỉ giảm nhẹ, còn khoảng 50% so với bình thường và nồng độ androgen máu tăng nhẹ nên không đủ gây namhóa ở trẻ gái và dậy thì sớm ở trẻ trai sau sinh

20-Bệnh xuất hiện muộn, triệu chứng xuất hiện ở tuổi dậy thì và thường đượcphát hiện ở nữ do nồng độ androgen cao hơn bình thường, còn ở nam giới, ảnhhưởng này không đáng kể vì ở lứa tuổi này, nồng độ testosterol đã tăng bài tiết Trẻ

em nữ sẽ có biểu hiện: tuyến vú kém phát triển, mọc trứng cá, rậm lông, rối loạnkinh nguyệt, thiểu kinh và có thể vô kinh [8], [26]

2 CƠ SỞ PHÂN TỬ VÀ ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA BỆNH TSTTBS

2.1 Cơ sở phân tử của bệnh TSTTBS

2.1.1 Vị trí, cấu trúc, chức năng gen CYP21

Hình 1.2 Nhiễm sắc thể số 6 và vị trí gen CYP21 [19]

Cấu trúc gen CYP21

Gen mã hóa cho enzym 21- OH của vỏ thượng thận là gen CYP21A2, có kích

thước 30 kb và cùng với giả gen không chức năng (nonfunctional pseudogene),

CYP21A2P, nằm trên cánh ngắn, nhiễm sắc thể số 6 (6p21.3), trong vùng phức hợp

hòa hợp mô chủ yếu (major histocompatibility complex-MAC) (cạnh gen HLA)

Gen CYP21A2 và gen tương đồng của nó, CYP21A2P, nằm xen kẽ với hai gen mã hóa cho bổ thể C4A và C4B Mỗi gen CYP21A2 và CYP21A2P bao gồm 10 exon

trình tự nucleotide của hai gen này tương đồng 98% trong các exon và khoảng 96%trong các intron do vậy trong quá trình phân bào giảm nhiễm có thể do sự đột biếnmất đoạn giữa hai allen hoặc nhân đoạn một cách hoàn toàn dẫn đến thay đổi cấutrúc của gen CYP21A2 bị thay thế một đoạn của giả gen CYP21A2P hoặc gây mất

đoạn của gen CYP21A2P Các thay đổi này gây nên sự bất hoạt của gen CYP21A2

bình thường và gây nên tình trạng bệnh lý [26],[41]

Hình 1.3 Cấu trúc phân tủ của gen CYP21 [18]

Chức năng gen CYP21

Gen CYP21 mã hóa cho enzym 21-OH gồm 494 acid amin, có vai trò phiên

mã tổng hợp ARNm tiền thân Phân tử này trải qua quá trình cắt các intron nốichính xác các exon với nhau và tạo ra phân tử ARNm hoàn chỉnh Phân tử này sẽđược sử dụng làm khuôn dịch mã tổng hợp enzym 21-OH [20]

2.1.2 Một số đột biến gen CYP21A2 gây bệnh TSTTBS

Hai gen CYP21A2 và CYP21A2P có trình tự tương đồng nhau Trình tựcủa gen giả CYP21A2P có các loại đột biến thường thấy trên bệnh nhânTSTTBS Điều này có thể giải thích là do quá trình phân bào giảm nhiễm, sự bắtchéo không đồng đều giữa các cặp nhiễm sắc thể dẫn tới việc các trình tự ở vùnggen giả CYP21A2P chuyển sang CYP21A2 gây nên đột biến gen CYP21A2.Theo thống kê, 95% các đột biến trên gen CYP21A2 là do chuyển đoạn từ gengiả CYP21A2P, 5% còn lại là do gen CYP21A2 bị đột biến Các đột biến thườnggặp trên gen CYP21A2 là xóa đoạn hoặc chuyển đoạn lớn (Largedeletion/convertion), IVS- 13A/C → G, I172N Ngoài ra còn có các đột biếnQ138X, R365W, R473W, P30L, del- 8 bp cũng có tỷ lệ tương đối cao [28]

Bảng 1.2: Các đột biến gen CYP21 thường gặp gây TSTTBS cổ điển [4],[35],

 Mất đoạn và chuyển đoạn gen lớn 30kb

Thông thường các mất đoạn có chiều dài khoảng 30kb từ vị trí giữa exon 3 và 8 củagen CYP21A2P xuyên qua gen C4B đến vị trí tương ứng ở trên gen CYP21A2 Kếtquả là gen đơn CYP21A2 còn lại với đầu tận cùng 5’ tương ứng CYP21A2P và đầu3’ tương ứng CYP21A2 Mất đoạn ngăn cản sự tổng hợp protein và phá hủy tất cảhoạt tính enzym 21- hydroxylase [25] Trao đổi chéo không tương xứng có thể xảy

ra bất cứ vị trí nào bên trong đơn vị RCCX (kích thước 30 kb) bao gồm gen RP, C4,CYP21A2, TNX và tạo nên các nhiễm sắc thể có 1 hoặc 3 bản sao đơn vị 30 kb này.Các vị trí trao đổi chéo nằm trong hay ở đầu 3’ của CYP21A2 gây thiếu hụt enzym21- hydroxylase

 Đột biến mất đoạn 8 bp trên exon 3

Đột biến mất đoạn 8 bp trên exon 3 (có trình tự GAGACTAC) xuất hiện doquá trình phân bào giảm nhiễm, sự bắt chéo không đồng đều giữa các cặp NST dẫntới việc các trình tự vùng giả gen sẽ chuyển sang gen CYP21A2 gây nên hiện tượnglệch khung dịch mã và làm ngừng quá trình dịch mã sớm Kết quả là không tổnghợp được enzym 21-OH và theo cơ chế đã trình bày ở trên, gây nên thể mất muốitrên lâm sàng [24] Hoạt tính enzym 21-OH trong đột biến mất 8 bp trên exon 3 đãđược chứng minh trên thực nghiệm là 0% [35].

2.2 Đặc điểm di truyền của bệnh TSTTBS

TSTTBS do thiếu enzym 21- OH là một bệnh di truyền đơn gen lặn, nằmtrên NST thường nên tuân theo quy luật di truyền Mendel Bệnh chỉ xảy ra ở ngườimang đồng hợp tử gen lặn

Aa Aa

(25%) (50%) (25%)

Hình 1.4 Quy luật di truyền gen lặn trên NST thường

Bệnh xảy ra không liên tục, ngắt quãng qua các thế hệ Thường gặp bệnhxuất hiện trong cùng một thế hệ Tỷ lệ nam và nữ bị bệnh là như nhau

+ Nếu cha mẹ là hai dị hợp tử (Aa x Aa) khả năng con bị bệnh (aa) là 25%,con dị hợp tử (Aa) mang gen lặn là 50%, con bình thường hoàn toàn (AA) là 25%.Trong quần thể trường hợp này hay gặp nhất

+ Nếu cha (hoặc mẹ) là người bình thường (AA) kết hôn với người mang gen

dị hợp tử (Aa) thì khả năng sinh ra con bình thường (AA) là 50%, con bị dị hợp tử(Aa) là 50%

+ Nếu cha (hoặc mẹ) là người bình thường kết hôn với người bị bệnh (aa) thìkhả năng sinh con mang gen dị hợp tử (Aa) là 100%

Hình 1.5 Phả hệ của một gia đình có con bị bệnh di truyền lặn trên NST thường

(Autosome Recessive)

Thế hệ I, II, không có người bị bệnh, thế hệ III có người bị bệnh.

Đặc điểm của bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường là có người lànhmang gen bệnh, với kiểu hình là người hoàn toàn bình thường, khỏe mạnh nhưngkhi xây dựng gia đình với người mang gen bệnh và sinh con thì truyền bệnh cho contheo tỷ lệ phân ly gen bệnh của qui luật Mendel Bệnh truyền từ thế hệ này sang thế

2.3 Biểu hiện lâm sàng, cận lâm sàng của người mang gen dị hợp tử

Về mặt xét nghiệm, người mang gen dị hợp tử chứa các đột biến genCYP21A2 có tăng nhẹ nồng độ 17-OHP, cortisol sau khi kích thích thượng thận caohơn những người bình thường không mang gen [19], [26]

Chẩn đoán bệnh dựa vào lâm sàng và xét định lượng nồng độ 17- OHP, testosteron, xét nghiệm tìm đột biến gen CYP21A2 Trong đó, nồng độ 17- OHP có giá trị cao trong chẩn đoán bệnh, đây là tiền chất để tổng hợp enzym21- OH nên giá trị 17- OHP tăng sớm và tăng cao ở trên bệnh nhân và người mang

gen, người ta còn ứng dụng giá trị này để làm sàng lọc chẩn đoán sớm bệnh ở cácnước phát triển [1].

2.4 Phát hiện người lành mang gen bệnh

Người mang gen bệnh (dị hợp tử) rất khó phát hiện không biểu hiện tínhtrạng ra ngoài Người mang gen bệnh thường có dấu hiệu về lâm sàng hoặc sinh họcnhẹ hoặc hoàn toàn không có dấu hiệu gì Tuy vậy có thể phát hiện dị hợp tử bằngphương pháp sinh hóa Định lượng 17- OHP cho những người là thành viên của giađình người bệnh, với 17- OHP < 300 ng/ml thì là bình thường và 17- OHP > 300 -

1499 ng/ml được chứng minh là dị hợp tử sau nghiệm pháp kích thích bằngcorticotropin (Lee HH el al 2000) Do thiếu hụt enzym 21-OH có liên quan đến typHLA, nên có thể xác định đột biến gen CYP21A2 hoặc phát hiện người lành manggen bằng cách phân loại typ huyết thanh HLA dựa trên các dấu ấn của bệnh nhân và

tế bào ối thai nhi hoặc đối tượng có nguy cơ cao Nếu kết quả typ HLA giống nhau

và có thể chẩn đoán thai nhi bị bệnh TSTTBS thể thiếu 21-OH hoặc người lànhmang gen với độ tin cậy cao [4], [19]

Hình 1.6 Giá trị 17-OHP sau nghiệm pháp kích thích ACTH trong các thể bệnh

và người mang gen dị hợp tử [36].

Phòng bệnh TSTTBS bằng sàng lọc người mang gen được tiến hành ở giađình, dòng họ của trẻ bị bệnh hoặc trong quần thể có tỷ lệ mắc bệnh cao để quản lýngười mang gen và người bệnh Qua sàng lọc này để có thể đưa ra lời khuyên di

17-hôn giữa những người mang gen bệnh (Aa x Aa) hoặc giữa người mang gen bệnhvới người bị bệnh (Aa x aa) Nếu kết hôn giữa các đối tượng có nguy cơ cao thì cầnphải được tư vấn, quản lý thai nghén về phương diện di truyền và làm sàng lọc sơsinh [4].

- Định lượng 17- OHP: 17- OHP là chỉ số đặc trưng để chẩn đoán TSTTBS

do thiếu enzym 21- OH và tăng nồng độ trong máu hoặc tăng nồng độ qua nghiệmpháp ACTH [28]

Chẩn đoán TSTTBS sớm trong giai đoạn sơ sinh:

+ Trẻ sơ sinh có triệu chứng nôn nhiều, nhất là từ 2- 3 tuần tuổi

+ Trẻ có bộ phận sinh dục ngoài không rõ ràng, không sờ thấy tinh hoàn.+ Điện giải đồ: natri máu giảm, kali máu tăng

+ Nồng độ 17- OH tăng

Chẩn đoán TSTTBS ở trẻ lớn:

+ Trẻ trai 2-3 tuổi có các dấu hiệu dậy thì sớm giả, dương vật phát triển nhanh.+ Trẻ gái 2-3 tuổi có âm vật phì đại nhanh như dương vật, không có tinh hoàn.+ Cả 2 giới: Chiều cao tăng nhanh, có lông mu, trứng cá, phát triển cơ bắp.+ Xét nghiệm: Định lượng 17- OHP tăng cao, testosteron tăng, FSH và LH giảm.+ Xét nghiệm nhiễm sắc thể để xác định giới tính

- Dậy thì sớm thật đồng giới, trẻ trai có tinh hoàn phát triển cùng với dươngvật, thể tích tinh hoàn > 4 ml Nồng độ FSH và LH tăng cao, không có các rối loạnhormon khác.

- Dậy thì sớm giả khác giới ở trẻ gái do u thượng thận nam hóa (Carcinome)

U thường lớn 3- 6 cm Phát hiện u nhờ các chẩn đoán hình ảnh 17- CS nước tiểutăng cao Dehydroepiandosterone (DHEA) huyết tương tăng 17- OHP máu khôngtăng Khi làm test ức chế bằng dexamethason, nồng độ DHEA huyết tương và nồng

độ 17- CS niệu đều không giảm, giúp chẩn đoán phân biệt với TSTTBS [28]

- U buồng trứng gây nam hóa: Ít gặp, DHEA huyết tương và 17- CS niệukhông tăng

- Buồng trứng đa nang: Nguyên nhân thường gặp nhất do tăng tiết androgen

do buồng trứng, triệu chứng nam hóa ít gặp Hay gặp nhất là triệu chứng rậm lông,bệnh nhân có thể mập phì, tăng insulin máu, rối loạn dung nạp glucose FSH và LHtăng, testosterol tăng ít, andostenedion huyết tương tăng cao [28]

* Các đối tượng cần được xác định người mang gen, tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh với bệnh TSTTBS:

+ Những bà mẹ đã được phát hiện là dị hợp tử mang gen đột biến CYP21A2

khi mang thai cần được chẩn đoán trước sinh

+ Các bà mẹ đã một lần sinh con bị bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21- OH

có thai cần thiết chẩn đoán trước sinh

+ Các bà mẹ mang thai mà trong gia đình nội, ngoại có cô, chú, bác ruột, cậuruột, dì ruột, bị bệnh thì cũng cần thiết chẩn đoán trước sinh

+ Các anh, chị em họ bị bệnh cùng thế hệ với thai nhi

3.2 Các phương pháp sinh học phân tử phát hiện đột biến gen CYP21A2 gây bệnh TSTTBS

3.2.1 Kỹ thuật PCR

Nguyên tắc của PCR dựa vào đặc điểm của quá trình sao chép DNA EnzymTaq polymerase (DNA ployme chịu nhiệt) dùng các đoạn mạch đơn làm khuôn đểtổng hợp nên sợi DNA mới bổ sung và cần phải có các mồi oligonucleotid để khởiđầu quá trình tổng hợp

Mỗi chu kỳ phản ứng gồm 3 giai đoạn khác biệt nhau và điều hòa bởi nhiệt độ:

- Giai đoạn 1: là giai đoạn biến tính (denaturation) Phân tử DNA được biến tính ở

nhiệt độ cao hơn Tm (nhiệt độ nóng chảy) của phân tử, thường là 94oC - 95oC trongvòng 30 giây - 1 phút

- Giai đoạn 2: là giai đoạn bắt cặp (annealing) Nhiệt độ được hạ thấp dưới nhiệt độ

nóng chảy Tm của các mồi, cho phép các mồi liên kết bắt cặp với các sợi đơn DNAkhuôn theo nguyên tắc tạo cặp bổ sung Trong quá trình gắn mồi, enzym DNApolymerase bền với nhiệt sẽ được hoạt hóa và bắt đầu giai đoạn kéo mồi, thườngnhiệt độ khoảng 40oC - 70oC, tuỳ thuộc vào kích thước và Tm của các mồi sử dụng

và kéo dài từ 30 giây - 1 phút

- Giai đoạn 3: là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extension) Nhiệt độ được tăng

lên 72oC để cho DNA polymerase là các polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase, Tth polymerase, Pfu polymerase,…) hoạt động tổng hợp tốt nhất Thời gian phụ

thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giâyđến nhiều phút

Sau mỗi chu kỳ, các chuỗi đôi mới được tạo thành sẽ tiếp tục được dùng làmDNA khuôn cho sự tổng hợp các DNA mới trong các chu kỳ tiếp theo Sản phẩmcuối cùng của phản ứng PCR là đoạn DNA chuỗi đôi có chiều dài bằng khoảngcách giữa hai đoạn gen mồi, hai đầu tận cùng của sản phẩm được xác định bởi đầutận cùng 5’ của hai đoạn gen mồi [13]

Giống như nhiều bệnh lý di truyền, PCR được sử dụng rộng rãi để khuếchđại gen CYP21A2 xác định các đột biến xoá đoạn và phối hợp với các kỹ thuật sinh

học phân tử khác để xác định đột biến đặc hiệu Tuy nhiên do gen giả CYP21A2P

có tính tương đồng cao với gen thật CYP21A2 nên việc khuếch đại gen CYP21A2không dễ thực hiện do đó việc thiết kế mồi phải có trình tự đặc hiệu với genCYP21A2 mà không đặc hiệu CYP21A2P [22]

Hình 1.7 Các bước cơ bản của kỹ thuật PCR

3.2.2 Kỹ thuật giải trình tự gen (DNA Sequencing)

Đoạn DNA cần giải trình tự được sử dụng như trình tự mẫu cho phản ứngkhuếch đại gen (PCR) bắt đầu từ vị trí gắn mồi Hỗn hợp của cả deoxynucleotid vàdideoxynucleotid được sử dụng trong phản ứng với nồng độ sao cho cácdideoxynucleotid sẽ gắn vào vị trí mà các deoxynucleotid thường gắn trên đoạnDNA đang được tổng hợp Sự gắn các dideoxynucleotid sẽ làm gián đoạn quá trìnhkéo dài các DNA được tổng hợp, kết quả sẽ tạo ra hỗn hợp các sợi DNA có kích

thước khác nhau Nucleotid tận cùng trên các sợi DNA có thể được xác định bằngcách chạy đồng thời 4 phản ứng riêng biệt trong đó mỗi phản ứng chứa một loạidideoxynucleotid (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) hoặc bởi một phản ứng hỗnhợp nhưng từng loại dideoxynucleotid được đánh dấu bằng các chất huỳnh quangđặc hiệu khác nhau Kết quả là hỗn hợp các sợi DNA tổng hợp từ sợi khuôn đượcphân tách bằng điện di trên gel acrylamid có độ phân giải cao, cho phép phân biệtđược các sợi đơn DNA kém nhau 1 nucleotid Trình tự các nucleotid được xác địnhtương ứng với trình tự của các vạch trên gel ứng với mỗi loại dideoxynucleotid [12].

3.2.3 Kỹ thuật Souther blot

Souther blot là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất để phát hiện độtbiến xóa đoạn gen lớn, đột biến lặp đoạn… Đây là phương pháp mất nhiều thời gian

và công sức nhưng lại rất hiệu quả Các đoạn dò DNA đặc hiệu được sử dụng đểphát hiện đoạn gen CYP21A2 sau khi DNA được cắt bằng enzym giới hạn, điện ditrên gel agarose và được biến tính trên màng nilon hay nitrocellulose, màng đã đượclai với đầu dò được xác định nhờ film có độ nhạy đặc biệt với phóng xạ So sánh kếtquả lai giữa người bình thường và người bệnh để có thể xác định được vị trí độtbiến [12], [13]

3.2.4 Kỹ thuật MLPA (Multiplex Ligation Dependent Probe Aplification)

Nguyên tắc của MLPA là sử dụng các đoạn dò DNA (probe) có khả năng laiđặc hiệu với các phân tử DNA đích Mỗi probe gồm 2 chuỗi oligonucleotid dài vàngắn [32]

+ Phân tử oligonucleotid ngắn gồm 2 đoạn:

 Đoạn 1 có trình tự nucleotid đặc hiệu với đoạn DNA đích và sẽ lai với

DNA đích khi tiến hành phản ứng lai Đoạn này có khoảng 2130 nucleotid nằm ởđầu 3’ của probe

 Đoạn 2 nằm ở đầu 5’, chứa khoảng 19 nucleotid Trình tự nucleotid củađoạn này giống nhau cho các probe Đây là vị trí gắn với mồi Y để khuếch đạiprobe khi tiến hành phản ứng PCR [32]

Hình 1.8 Các giai đoạn của kỹ thuật MLPA

+ Phân tử oligonucleotid dài gồm 3 đoạn:

 Đoạn 1’ chứa 25  43 nucleotid, gắn đặc hiệu với DNA đích ở đầu tận 5’  Đoạn 2’ gồm 36 nucleotid ở đầu 3’, trình tự nucleotid giống nhau cho cácprobe Đây là vị trí gắn với mồi X đặc hiệu để khuếch đại probe

 Đoạn 3’ còn gọi là đoạn nucleotid đệm (stuffer) nằm giữa hai đoạn 1’ và2’, cấu tạo gồm từ 19 đến 370 nucleotid Trình tự nucleotid không đặc hiệu vớiDNA đích nên nó không gắn vào DNA đích Chiều dài đoạn stuffer khác nhau ở cácprobe, vì vậy các probe khác nhau sẽ có chiều dài khác nhau Do đó, sản phẩmkhuếch đại của các probe sẽ được phân tách bằng điện di

Trong mỗi phản ứng có chứa các probe nội chuẩn, khi probe nội chuẩn lên đỉnhtương ứng là điều kiện đảm bảo độ tin cậy khi nhận định kết quả Ngoài ra trong kỹthuật MLPA có sử dụng chứng là DNA của người bình thường, chạy song songcùng mẫu bệnh nhân để so sánh [32]

Sau phản ứng PCR, mỗi probe sẽ được khuếch đại thành nhiều bản sao Cácprobe khác nhau sẽ có kích thước khác nhau do độ dài đoạn đệm của chúng khácnhau Do vậy, chúng sẽ được phân tách bằng phương pháp điện di (thường sử dụng

phương pháp điện di mao quản) Số lượng sản phẩm khuếch đại của mỗi probe sẽ tỷ

lệ thuận với số bản copy của đoạn DNA đích đặc hiệu với probe đó [32]

Nghiên cứu này sử dụng kit MLPA (MRC- Holland): Kit gồm các probe sửdụng trong chẩn đoán đột biến gen CYP21A2 gọi là P050B2 Hỗn hợp probe nàybao gồm 5 probe cho gen CYP21A2 (Ex1, Ex3, Ex4, Ex6, Ex8) tương đương vớicác đột biến mất đoạn 8 bp, I172N, E6 cluster và Q318X Hỗn hợp probe này cònbao gồm 3 probe đặc hiệu cho gen CYP21A1P (E1P, I2P, E10P), 2 probe cho bổthể (C4A, C4B) Ngoài ra, có 22 probe đặc trưng cho gen của người cũng được sửdụng trong hỗn hợp để làm đối chứng và 2 probe cho nhiễm sắc thể X và Y để xácđịnh giới tính Vị trí và kích thước của các probe được mô tả như bảng 1.3

Bảng 1.3 Tên, kích thước và vị trí của các sản phẩm PCR

trong Kit MLPA P050B2 (MRC- Holland)

Vị trí của probe trên gen

Kích thước (bp)

Hình 1.9 Sơ đồ và vị trí một số probe của Kit MLPA P050B2

Chú thích: Ex1, Ex3, Ex4, Ex6, Ex8, là các probe tương ứng với các exon 1, 3, 4, 6, 8 của

gen CYP21A2; E1P, I2P, E10P là các probe tương ứng với vị trí exon 1, intron2, exon 10 của gen CYP21A1P; C4A, C4B là probe tương ứng với gen C4A, C4B.

Hình 1.10 Hình ảnh minh họa kết quả MLPA

Chú thích: Trục hoành biểu hiện kích thước sản phẩm PCR tăng dần theo chiều từ trái

sang phải Trục tung thể hiện nồng độ của các sản phẩm phẩm PCR tỉ lệ thuận với chiều cao của các đỉnh Bệnh nhân có đột biến xóa đoạn khi không xuất hiện đỉnh tương ứng với exon bị xóa đoạn và là người lành mang gen bệnh khi chiều cao đỉnh bằng ½ so với chiều cao đỉnh của mẫu đối chứng Ex1, Ex3, Ex4, Ex6, Ex8, là các đỉnh tương ứng với vị trí exon 1, 3, 4, 6, 8 của gen CYP21A2 E1P, I2P, E10P là các đỉnh tương ứng với vị trí exon

1, intron2, exon 10 của gen CYP21A1P C4A, C4B là đỉnh tương ứng với gen C4A, C4B Y

là đỉnh tương ứng với nhiễm sắc thể Y.

Ex 1

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

10 bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu enzym 21-hydroxylaseđược chẩn đoán và điều trị tại Khoa Nội tiết - Chuyển hóa - Di truyền, Bệnh việnNhi Trung ương; các thành viên trong gia đình bệnh nhân bao gồm bố, mẹ, anh, chị,

em ruột của bệnh nhân

Tiêu chuẩn chẩn đoán: Bệnh nhân có biểu hiện mất muối, mất nước từ nhẹ đếnnặng, Na+ giảmvà K+ tăng; biểu hiện mơ hồ giới tính sau sinh ở trẻ gái và dậy thìsớm ở trẻ trai Nồng độ 17- OH tăng trên 10.000 ng/dl ở thể cổ điển và tăng từ 200-10.000 ng/dl ở thể không cổ điển [2] [28]

Tất cả các thành viên trong gia đình gồm: Cha, mẹ, anh, chị, em ruột củabệnh nhân được khám xét lâm sàng theo phương pháp mô tả, tư vấn để tiến hành xét

nghiệm phát hiện đột biến gen CYP21A2.

2.2 Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu

2.2.1 Dụng cụ và trang thiết bị

- Máy Gene Amp PCR System 9700 (USA)

- Pipet, đầu côn các loại dùng cho kỹ thuật sinh học phân tử

- Tủ lạnh sâu: -30°C; -80°C (SANYO)

- Máy điện di: Mupid (Nhật Bản)

- Máy soi gel và chụp ảnh tự động: Chemidoc EQ-Bio-Rad (USA)

- Máy ly tâm lạnh Beckman (USA) và ly tâm để bàn Eppendorf (Đức)

Hóa chất để thực hiện phản ứng MLPA:

- SALSA MLPA Kit P050- B2- CAH.

- Hãng MRC - Holland, Amsterdam, HàLan

- Nghiên cứu này sử dụng kit MLPA P050B2 (MRC- Holland): Kit này gồmcác Probe sử dụng trong chẩn đoán đột biến gene CYP21 gọi là P050- B2

- Thành phần hóa chất:

SALSA MLPA Buffer: KCl, Tris- HCl, EDTA và PEG- 6000, pH 8,5

SALSA Ligase- 65: Glycerol, BRIJ 0,05%, EDTA, KCl, Tris- HCl,

Beta-Mercaptoethanol 0.1%, pH 7,5, Ligase- 65 enzyme (từ vi khuẩn)

Ligase buffer A: NAD (nguồn gốc vi khuẩn), pH 3,5

Ligase buffer B: Tris- HCl, non- ionic detergents, MgCl2, pH 8,5

SALSA PCR Primer Mix: Chứa oligonucleotides tổng hợp có gắn huỳnh

quang Cy5, dNTPs, Tris- HCl, KCl, EDTA, BRIJ 0.04%, pH 8,0

SALSA Polymerase: Glycerol, BRIJ 0,5%, EDTA, DTT 0,1%, KCl, Tris-

HCl, Polymerase enzyme (nguồngốc vi khuẩn), pH 7,5

Probemix: Chứa oligonucleotides tổng hợp, oligonucleotides tinh chế từ vi

khuẩn, Tris- HCl, EDTA, pH 8,0

Bảo quản: Hóa chất được bảo quản ở nhiệtđộ -250C đến -150C, bảo quản trong hộp và tránh ánh sáng

Thành phần hỗn hợp probe (probemix): Hỗn hợp probe này bao gồm 5 probe

cho exon 1, 3, 4, 6 và 8 của gene CYP21A2, tương đương với các đột biến mất đoạn8bp, I172, E6 cluster and Q318 Hỗn hợp probe này còn bao gồm 3 probe đặc hiệu cho gene CYP21A2P 19 probe đặc trưng cho gene của người cũng được sử dụng trong hỗn hợp để làm đối chứng trong đó có 3 probe trên nhiễm sắc thể số 6 nhưng ngoài vùng 6p21.3 Kỹ thuật MLPA trong chẩn đoán trước sinh còn có thể xác định chính xác giới tính của thai nhi dựa vào probe đặc trưng cho nhiễm sắc thể X (có độ

lớn là 100 bp) và 1 probe đặc trưng cho nhiễm sắc thể Y (gene UTY- có độ lớn là

105 bp)

2.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Đề tài được tiến hành tại Khoa Nội tiết - Chuyển hóa - Di truyền và PhòngXét nghiệm Sinh hóa, Huyết học, Chẩn đoán hình ảnh của Bệnh viện Nhi Trungương là nơi chẩn đoán, điều trị và quản lý bệnh nhân

Các xét nghiệm sinh học phân tử thực hiện tại Trung tâm Nghiên cứu Gen Protein, Trường Đại học Y Hà Nội

Thời gian nghiên cứu 1 năm: từ tháng 9 năm 2014 đến 9 năm 2015.

2.4 Đạo đức trong nghiên cứu

Trước khi tiến hành thu thập thông tin, mẫu bệnh phẩm phải có sự đồng ý củađối tượng nghiên cứu: Tham gia tự nguyện vào nghiên cứu

Bệnh nhân và các thành viên gia đình bệnh nhân được giải thích rõ ràng vềmục tiêu nghiên cứu, được thông báo về kết quả xét nghiệm gen, đồng thời giảithích về khả năng điều trị và phòng bệnh của con họ để gia đình sẵn sàng hợp tácvới các bác sĩ trong quá trình điều trị và thực hiện tư vấn di truyền Bác sĩ di truyền

sẽ lập hồ sơ theo dõi lâu dài cho thai nhi và các thành viên gia đình Các thông tincủa bệnh nhân và gia đình sẽ được đảm bảo bí mật

Nghiên cứu đảm bảo tuân thủ các quy định đạo đức trong nghiên cứu sinh học

Y-2.5 Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu tiến cứu mô tả, cắt ngang.

2.5.1 Thiết kế nghiên cứu

10 bệnh nhân và 22 thành viên gia đình bệnh nhân TSTTBS

2.5.2.1 Quy trình thu thập mẫu nghiên cứu và tách chiết DNA

Bệnh nhân và các thành viên của gia đình bệnh nhân lấy 2 - 5 ml máu ngoại

vi Tách chiết DNA bằng Phenol/Chloroform theo phương pháp thường quy của