Nghiên cứu xây dựng phương pháp phổ hồng ngoại gần và trung bình kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến để định lượng đồng thời một số hoạt chất có trong thuốc kháng sinh thuộc họ β lactam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘITRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---NGUYỄN THỊ ÁNH TUYẾT NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHỔ HỒNG NGOẠI GẦN VÀ TRUNG BÌNH KẾT HƠP VỚI THUẬT TOÁN HỒI QUY ĐA BIẾN Đ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-NGUYỄN THỊ ÁNH TUYẾT

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHỔ HỒNG NGOẠI GẦN VÀ TRUNG BÌNH KẾT HƠP VỚI THUẬT TOÁN HỒI QUY ĐA BIẾN ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ HOẠT CHẤT CÓ TRONG THUỐC KHÁNG SINH THUỘC HỌ β –

Công trình được hoàn thành tại Đại học Khoa học Tự nhiên

Người hướng dẫn khoa học: TS PHAN THỊ TUYẾT MAI

TS BÙI XUÂN THÀNH

Phản biện 1: PGS.TS NGUYỄN XUÂN TRUNG

Phản biện 2: TS ĐÀO DUY TIÊN

Luận văn sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận văn thạc sĩ họp tại: Phòng bộ môn Hóa phân tích

Vào hồi 13 giờ 30 ngày 30 tháng 09 năm 2015

MỞ ĐẦU

Hiện nay hoạt động sản xuất và buôn bán kháng sinh nói riêng vàtân dược nói chung đem đến nguồn lợi nhuận khổng lồ khiến một số tổchức, cá nhân đã tung ra thị trường hàng triệu viên thuốc giả mỗi ngày.Thuốc giả không chỉ đánh lừa người tiêu dùng, còn vô hiệu hóa các liệupháp điều trị để cứu sống bệnh nhân và trong rất nhiều trường hợp thuốcgiả gây ra tác hại to lớn như gây ra các phản ứng dị ứng, nhiễm độc kimloại nặng cũng như làm bệnh nhân dễ kháng thuốc Đại diện tổ chức Y TếThế giới cảnh báo thuốc giả đang chiếm 7-15% tổng số thuốc ở các nướcphát triển, 25% ở các nước đang phát triển, trong đó các nước ở khu vựcChâu Á chiếm 50% Các mẫu thuốc giả thường được phát hiện chủ yếu làcác loại kháng sinh như Ampicillin, Penicillin…Điều khiến nhiều ngườiquan tâm là tỉ lệ thuốc giả ở Việt Nam ngày càng một gia tăng và diễnbiến trở nên phức tạp hơn dẫn đến công tác kiểm tra khó khăn hơn

Vì vậy, vấn đề kiểm định thuốc đúng hoạt chất, và đúng hàmlượng hoạt chất trong thuốc là một vấn đề hết sức cấp thiết Hiện nay córất nhiều phương pháp xác định hàm lượng kháng sinh hiệu quả cao nhưphương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC), huỳnh quang tia X, cácphương pháp quang học hay các phương pháp điện hóa để phân tíchkháng sinh được qui định trong dược điển

Xuất phát từ thực tế này, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu

xây dựng phương pháp phổ hồng ngoại gần và trung bình kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến để định lượng đồng thời một số hoạt chất có trong thuốc kháng sinh thuộc họ β-Lactam”Lactam” Với mục tiêu là nghiên cứu

quy trình phân tích nhóm β-Lactam bằng phương pháp phổ hồng ngoạigần với kĩ thuật hồi qui đa biến để kiểm định nhanh chất lượng lượngthuốc trên thị trường hiện nay.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về nhóm kháng sinh β-lactam

1.1.1.Khái niệm và phân loạinhóm β-lactam

Nhóm β-lactam là một họ kháng sinh rất lớn, bao gồm cáckháng sinh có cấu trúc hóa học chứa vòng β-lactam Cáckháng sinhβ-lactam được chia thành 4 nhóm, trong đó có hai nhóm được sửdụng phổ biến nhất là nhóm các penicillin và cephalosporin

1.1.1.1 Nhóm penicillin

Kháng sinh thuộc họ penicillin có cấu trúc mạch vòng lactam (amin nội vòng) gắn với mạch ngang R-CO-NH, được gọi làcác amin của 6-Amino penicillanie (A.6.A.P) có công thức chung R –C9H11N2O4S

beta-1.1.1.2.Nhóm cephalosporin

Cấu trúc hóa học của các kháng sinh nhóm cephalosporin đều làdẫn xuất của Axit 7-aminocephalosporanic (viết tắt là A7AC) Cấutrúc chung gồm vòng β- lactam 4 cạnh gắn với 1 dị vòng 6 cạnh Khithay đổi các gốc R1, R2 được các cephalosporin có độ bền, tính khángkhuẩn và dược động học khác nhau

1.1.1.3.Các kháng sinh β-lactam khác

Gồm nhóm Carbapenem và nhóm Monobactam

1.1.2 Tính chất vật lý và hóa học các kháng sinh nhóm β- Lactam

1.2 Các phương pháp phân tích định lượng nhóm kháng sinh β-lactam.

1.2.1 Phương pháp đo quang

1.3.2 Các ứng dụng của phổ hồng ngoại kết hợp với Chemometric để định lượng thuốc kháng sinh β – lactam

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Chất phân tích

 Penicillin V (phenoxymethyl penicillin)

Công thức phân tử: C6H18N2O5S; Tên quốc tế, tên khoa học:

axit (2S, 5R, 6 R) 3,3 dimethyl – 7- oxo – 6 ( 2 phenoxyacetamido]4-thia – 1- azabicyclo [3,2,0] heptan – 2 carboxylic

 Cephalexin.

Công thức phân tử: C16H17N3O4S.H2O; Tên quốc tế, tên khoa

học: axit 7 (α amino αphenylacetamido) 3 methylcephem –

4-carboxylic monohyrat

2.1.2 Mẫu phân tích

Mẫu 1: Hoạt chất Penicillin V:

Tên thuốc: PEN-VEE-K; VEETIDS…

Dạng dùng: Viên nén 125mg, 250mg, 500mg… Dung dịchuống: 125mg/5ml, 250mg/5ml

Thành phần hoạt chất: Phenoxymethylpenicilin Kali

Tá dược thường dung: Amidon, bột talc, magnesistearat, tinhbột

Mẫu 2: Hoạt chất Cephalexin:

Tên thuốc: Cephalexin

Dạng dùng : Nang và viên nén 250 mg, 500 mg; viên nén 1 g.Nhũ dịch 125 mg, 250 mg/5 ml (sau khi pha thêm nước cho chếphẩm) Siro 250 mg, 500 mg/5 ml (sau khi pha thêm nước cho chếphẩm) Thuốc giọt dùng cho trẻ em 125 mg/1,25 ml (sau khi phathêm nước cho chế phẩm)

- KBr dùng cho hồng ngoại (Merck)

- Tinh bột sắn (Nhà máy sản xuất tinh bột mì Quảng Ngãi),đạt tiêu chuẩn đã kiểm tra theo DĐVN 4

- Magie stearat : Mã sản phẩm: dp004; quy cách: 20kg/bao.Nước sản xuất: PETER GREVEN – MALAI, hàm lượng: 6.8 - 8.3%

- Bột Talc (Công ty cổ phần hóa dược Việt Nam), đạt tiêuchuẩn đã kiểm tra theo DĐVN 4

- Hóa chất tinh khiết phân tích: Axit Acetic, NaOH,Acetonitril, triethylamin, Metanol (Merck)

2.2.2 Dụng cụ và trang thiết bị đo

- Cân phân tích Sartorious độ chính xác ± 0,0001g

- Máy quang phổ hồng ngoại Agilent Technologies Cary 600Series FTIR spectrometer, dải bước sóng đo trong vùng 7500-2800

2.3 Nội dung nghiên cứu

2.4 Phương pháp định lượng bằng phổ hồng ngoại gần 2.4.1 Nguyên tắc phương pháp phân tích

2.4.2 Nội dung phương pháp

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THỰC NGHIỆM

3.1 Khảo sát các điều kiện đo phổ hồng ngoại xác định đồng thời Penicillin và Cephalexin trong cùng hỗn hợp

3.1.1 Khảo sát phổ hấp thụ các hoạt chất penicillin và cephalexin

3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của các tá dược

3.1.3 Khảo sát tỷ lệ khối lượng mẫu/KBr

Bảng 3.4.Kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ khối lượng mẫu/KBr đến độ

hấp thụ quang tại các số sóng đặc trưng.

2,1177

2,2265

2,1544

2,4533

2,1851

2,7659

2,1982

2,4487

3.1.4 Khảo sát độ lặp lại của quá trình ép viên

Tiến hành đo phổ hồng ngoại của 5 mẫu viên Cephalexin với tỷ

lệ 3/97 trong vùng phổ 4000 – 2800cm-1

3.2 Xây dựng mô hình hồi qui đa biến tuyến tính phân tích hoạt chất Penicillin

3.2.1 Mô hình đường chuẩn đa biến xác định hoạt chất Penicillin khi có chứa tá dược

Tiến hành mô hình hồi quy đa biến để xác định hỗn hợp gồmPeniciilin và các tá dược được thực hiện dựa trên ma trận chuẩn(23x2) và ma trận kiểm tra (12x2), các mẫu chuẩn có hàm lượng khốilượng khác nhau dao động trong khoảng 15-40 mg

Kết quả phân tích trị riêng của các PC về ma trận hệ số tương quantrên tập số liệu (23x51), phần trăm phương sai của mỗi PC(proportion) và phần trăm phương sai tích lũy (Cumulative)thu đượcnhư sau:

Principal Component Analysis: C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, ….C51

Eigenvalue 22.529 0.465 0.006 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000….

Proportion 0.980 0.020 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 ….

Cumulative 0.980 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000

1.000 1.000 1.000….

Bảng 3.6.Ma trận chuẩn hàm lượng của penicillin và tá dược

trong hỗn hợp

Mẫu Penicillin(g)

Tá dượcTinh

3.2.2 Đánh giá tính phù hợp của phương trình hồi quy

Để kiểm chứng tính phù hợp của phương pháp hồi quy đa biến, lập ma trận kiểm tra có kích thước (12x2)

Bảng 3.7.Ma trận hàm lượng của penicillin và tá dược để kiểm tra

độ đúng của mô hình hồi qui PCR.

Mẫu Penicillin (g)

Tá dượcTinh bột (g) Tacl (g) Ʃ tá

dược(g)

Mẫu Hàm lượng tìm thấy(g) Sai số tương đối (%)

Penicillin Ʃ Tá dược Penicillin Ʃ Tá

dược

Xác định các vectơ riêng hay các PC

Principal Component Analysis: C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11…C101

Eigenanalysis of the Correlation Matrix

Eigenvalue 17.406 1.520 0.816 0.179 0.021 0.012 0.010 0.008 0.006

Proportion 0.870 0.076 0.041 0.009 0.001 0.001 0.001 0.000 0.000

bột(g) stearat (g)Magie Ʃ Tá dược(g)1

3.3.2 Đánh giá tính phù hợp của phương trình hồi qui

Để kiểm chứng tính phù hợp của phương pháp hồi quy ta chuẩnlập ma trận kiểm tra có kích thước (2x12)

Bảng 3.10 Ma trận kiểm tra của cephalexin và tá dược

có trong hỗn hợp

Tá dược Tinh

bột(g)

Magie stearat

Ʃ Tá dược (g)

Mẫu Hàm lượng tìm thấy(g) Sai số tương đối (%)

Cephalexin Ʃ Tá dược Cephalexin Ʃ Tá

3.4.1 Xây dựng mô hình đường chuẩn đa biến xác định đồng thời Penicillin và Cephalexin có chứa tá dược.

Mô hình hồi qui được xác định dựa trên nồng độ của 40 mẫu trong đó

25 mẫu dùng cho mô hình chuẩn và 15 mẫu dùng cho mô hình đánhgiá gồm 3 cấu tử: Penicillin, Cephalexin, tá dược gồm tinh bột vàmagie stearat

Xác định các vectơ riêng hay các PC

 Principal Component Analysis: C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11…C101

(g)

Magiestearat(g)

Ʃ Tá dược(g)

Bảng 3.13 Ma trận kiểm tra hàm lượng của 3 cấu tử PEN,CEP và tá

dược để đánh giá tính phù hợp mô hình hồi qui.

Mẫu Penicillin

(g)

Cephalexin (g)

Tá dượcTinh

bột (g)

Magiestearat(g)

Ʃ Tádược(g)1

0,0243 0,0252 0,0071 0,0431 0,05022

0,0177 0,0192 0,0072 0,0425 0,04973

0,0217 0,0222 0,0058 0,0346 0,04054

0,0245 0,0250 0,0057 0,0356 0,04135

0,0247 0,0244 0,0048 0,0306 0,03546

0,0298 0,0269 0,0060 0,0372 0,04337

0,0282 0,0285 0,0060 0,0372 0,04328

0,0299 0,0307 0,0055 0,0338 0,03939

0,0304 0,0327 0,0052 0,0320 0,0371

0,0287 0,0286 0,0039 0,0242 0,028111

0,0350 0,0348 0,0048 0,0250 0,029812

0,0284 0,0273 0,0034 0,0210 0,024413

0,0295 0,0299 0,0031 0,0192 0,022314

0,0302 0,0309 0,0035 0,0221 0,025615

Cephalexin

Ʃ Tádược

3.4.3 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng của phép

đo (LOQ) xác định đồng thời Penicillin, cephalexin và tá dược bằng phương pháp PCR.

Bảng 3.15.Giá trị LOD, LOQ khi xác định đồng thời các cấu tử PEN,

CEP và tá dược bằng phương pháp PCR

(mg/viên)Penicillin

SốđăngkýC1

Cephalexi

n

Công ty cổphần xuấtnhập khẩu ytếDOMESCO

Cephalexin500mg trongviên nang

24tháng

VD7067 09

-C2 Cephalexi

n MKP

Công ty cổphần hóadượcMekohar

Cephalexin500mg trongviên nang

36tháng

VD –21430

- 14C3

Ospexin

Công ty cổphần DượcphẩmIMEXPHA

RM - VIỆTNAM

Cephalexin500mg trongviên nang

24tháng

1438-06

1000

SandozGmbH

1000000UIPhenoxymethylpenicillin

48tháng

VD –

2021 07P2 Penicillin Công ty Penicillin 36 VD –

-V Kali dược TƯ

V Kali

1000000U

I

Công ty CPDược VTXThanh Hóa

1000,000UI 24

tháng

12486– 10

)

(mg)

HL mẫu bột thực

tế

mTá dược (mg)

Tá dược thêm vào

3 569,7

Bảng 3.18 Khối lượng mẫu bột thực tế penicillin và

tá dược thêm vào hỗn hợp

mTá dược (mg)

Tá dược thêm vào

Bảng 3.19 Hàm lượng hoạt chất CEP thực tế tìm thấy trong các mẫu

thực tế

Mẫu

Hàm lượng CEP (mg / viên)

PP hồng ngoại

PP đối chứng (HPLC)

HL trên bao bì

PP đối chứng (HPLC)

HL trên bao bì

P3 596,3 ± 2,0 604,3 ± 0,4 625

CHƯƠNG 4.KẾT LUẬN

1 Đã lựa chọn các điều kiện tối ưu xác định đồng thời Penicillin

và Cephalexin trong cùng một hỗn hợp: vùng số sóng khảo sát phổ

4000 – 2800 cm-1 Tỷ lệ khối lượng mẫu/ KBr = 3: 97

2 Đã xây dựng được mô hình hồi qui đa biến tuyến tính PCR xácđịnh cho từng hoạt chất PEN,CEP dựa trên các mô hình chuẩn và đãđánh giá được tính phù hợp cho từng mô hình Đã tiến hành xây dựng

mô hình hồi qui PCR xác định đồng thời các hoạt chất PEN và CEPtrong cùng hỗn hợp khi có mặt các tá dược, các kết quả sai số thuđược từ các mô hình trên phần lớn có sai số ≤ 10% (có sai số nằmtrong giới hạn cho phép) Do đó có thể dùng mô hình này để địnhlượng nhanh các mẫu thuốc thực tế

3 Giá trị LOD, LOQ cho xác định đồng thời các hoạt chất PEN và CEP

là nhỏ , các giá trị LOD,LOQ thu được lần lượt đối PEN: 0,42 và 1,3 ; CEP:0,13 và 0,44

4 Đã ứng dụng mô hình hồi qui tuyến tính PCR kết hợp vớiphương pháp phổ hồng ngoại gần để xác định nhanh các mẫu thuốcthực tế đang lưu hành trên thị trường hiện nay Qua phân tích mẫuthực tế cho ta thấy.Từ kết quả ở bảng trên cho thấy độ chệnh củaphương pháp nghiên cứu hoạt chất Penicilli theo phương pháp phổhồng ngoại gần so với kết quả đối chiếu trên bao bì lần lượt: 7,7%;8,4%; 4,5% và so với phương pháp đối chứng lần lượt là:5,9%;6,24%;1,3% , Độ chệch của Cephalexin so với phương phápphổ hồng ngoại gần là 10,7%;12,5%;8,7% và so với phương pháp đốichứng lần lượt là: 5,9%; 6,2%; 1,3%