TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI SINH VẬT TẠO CHẾ PHẨM NHẰM XỬ LÍ NƯỚC THẢI NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

Nhóm vi khuẩn này tồn tại trong môi trường nước nuôi như một thành phần của quần thể vi sinh vật tự nhiên trong đầm nuôi nhưng khi gặp điều kiện bất lợi cho tôm, chúng trở thà

1

LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới TS Bùi Thị Việt Hà –

Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, người đã tận tình dìu dắt, hướng dẫn và chỉ bảo tôi trong suốt thời gian học tâp và nghiên cứu

Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Phòng Sau đại học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã góp ý và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và hoàn thành Luận văn

Đồng thời tôi cũng xin cảm ơn các anh chị, các bạn và các em Phòng Hóa sinh và Vi sinh môi trường đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện Luận văn

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè, những người đã tạo mọi điều kiện về vật chất và tinh thần giúp đỡ tôi hoa ̀ n thành tốt Luận văn này

Xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, tháng 12 năm 2011

Học viên

Nguyễn Thị Quỳnh Trang

2

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 9

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11

1.1 Tình hình nuôi trồng thủy sản trên thế giới : 111 1.3 Những khó khăn thách thức nghề 12

1.4 Ảnh hưởng của một số điều kiện môi trường lên quá trình nuôi trồng thủ y sản :14 1.4.1 Nhiệt đô ̣ 15

1.4.2 Độ pH .15

1.4.3 Độ mặn .16

1.4.4 Oxy hòa tan (DO) 16

1.4.5 COD, BOD 17

1.4.6 Mật đô ̣ vi tảo Vibrio spp và vi khuẩn tổng số .17

1.4.7 Nitơ tổng số .18

1.4.8 Photphat (PO43- ) 20

1.4.9 Sulphuahydro .20

1.5 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng biện pháp sinh học trong xử lý môi trường nước nuôi trồng thủy sản 21

1.5.1 Vai trò của các vi sinh vật trong quá trình làm s ạch nước nuôi tôm, cá 21

1.5.2 Biện pháp sử dụng các chế phẩm sinh học (probiotic) và vai trò của nó trong việc cải tạo nước đầm nuôi trồng thủ y sản .24

1.5.3 Ưu điểm và nhươ ̣c điểm của biê ̣n phấp sử dụng vi sinh vâ ̣t trong xử lý nước nuôi trồng thủy sản ……….………… 31

Chương 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 322

2.1 Đối tượng 32

2.1.1 Chủng giống 32

2.1.2 Hóa chất – thiết bị 32

2.1.3 Môi trườ ng 32

2.2 Phương pháp nghiên c ứu 35

2.2.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn 35

3

2.2.2 Phương pháp bảo quản giống 35

2.2.3 Phương pháp xác định hoạt tính enzym và hoạt tính kháng khuẩn 35

2.2.4 Xác định sinh khối bằng phương pháp đo mật độ quang học 36

2.2.5 Phương pháp định lượng axit lactic 36

2.2.6 Phương pháp nghiên c ứu khả năng chuyển hóa các hợp chất chứa nitơ của tế bào 36

2.2.7 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng của vi sinh vật 38

2.2.8 Phương pháp xác định một số đặc điểm sinh học của chủng lựa chọn 39

2.3 Phương pháp ta ̣o chế phẩm 43

2.3.1 Nghiên cứ u các điều kiê ̣n thích hợp cho lên men xốp .43

2.3.2 Trộn hỗn hơ ̣p giống .41

2.3.3 Bảo quản chế phẩm : 41

2.3.4 Thử nghiê ̣m chế phẩm trong xử lý nước nuôi trồng thủy sản .41

2.4 Phân loại vi sinh vật 42

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .45

3.1 Tuyển chọn các chủng vi sinh vâ ̣t 45

3.1.1 Bacillus 45

3.1.1.1 Phân lập và tuyển cho ̣n .45

3.1.1.2 Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thích hợp lên khả năng sinh trưởng và hoạt tính enzym của chủng vi Bacillus TL1 46

3.1.1.3 Một số đặc điểm sinh học của chủng nghiên cứu 51

3.1.2 Vi khuẩn Lactic .53

3.1.2.1 Phân l ập và tuyển chọn 53

3.1.2.2 Phân lo ại 53

3.1.2.3 Ảnh hưởng của một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và tổng hợp chất kháng khuẩn của L plantarum L5 56

3.1.3 Vi khuẩn nitrat hóa .60

3.1.3.1 Phân l ập và tuyển chọn vi khuẩn nitrat hóa 60

3.1.3.2 Đặc điểm hình thái, sinh hóa của 2 chủng vi khuẩn nitrat hóa lựa chọn 62

4

3.2 Tạo chế phẩm 63

3.2.1 Thử tính đối kháng lẫn nhau của các chủng vi khuẩn .63

3.2.2 Nghiên cứ u các điều kiê ̣n lên men xốp thích hợp 64

3.2.2.1 Lựa cho ̣n môi trường lên men xốp thích hợp 64

3.2.2.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ cám : trấu lên quá trình lên men xốp .66

3.2.2.3 Ảnh hưởng của thời gian lên quá trình lên men xốp 67

3.2.2.4 Ảnh hưởng của các nhiệt độ khác nhau .68

3.2.2.5 Ảnh hưởng của độ ẩm .69

3.2.3 Sản xuất chế phẩm .70

3.2.4 Đánh giá khả năng làm sa ̣ch nước đầm nuôi thủy sản của chế phẩm vừa ta ̣o đươ ̣c 72

3.2.4.1 Giá trị pH .72

3.2.4.2 Nitơ tổng số .73

3.2.4.3 Amôni .74

3.2.4.4 Nitrit 75

3.2.4.5 COD và BOD .76

KẾT LUẬN 79

KIẾN NGHI ̣ 79

TÀI LIỆU THAM KHẢO .80

PHỤ LỤC .87

5

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHƢ̃ VIẾT TẮT

BOD Biochemical Oxygen Demand Nhu cầu oxy sinh hóa CMC Cacboxymetyl Cenlluloze Cacboxymetyl xenlulozo COD Chemical Oxygen Demand Nhu cầu oxy hóa hóa ho ̣c

OD Optical Density Mâ ̣t đô ̣ quang ho ̣c

WHO World Heath Organi zation Tổ chƣ́c Y tế thế giới

6

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của tôm , cá 15

Bảng 1.2 Tiêu chuẩn chất lươ ̣ng nước nuôi trồng thủy sản 21

Bảng 3.1: Hoạt tính enzym của 5 chủng lựa chọn 45

Bảng 3.2: Hoạt tính phân giải cơ chất của chủng TL1 trên 4 loại môi trường 46

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của pH lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym của chủng TL1 47

Bảng 3.4: Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp .48

Bảng 3.5: Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym của chủng TL1 49

Bảng 3.6: Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sinh trưởng và hoạt tính enzym của chủng TL1 50

Bảng 3.7: Đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa của chủng nghiên cứu 51

Bảng 3.8: Hoạt tính ức chế các vi sinh vật kiểm định của chủng L5 53

Bảng 3.9: Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của chủng L5 53

Bảng 3.10: Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng và khả năng tổng hợp chất kháng khuẩn của L plantarum L5 57

Bảng 3.11: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự sinh trưởng và khả năng tổng hợp chất kháng khuẩn của L plantarum L5 58

Bảng 3.12: Ảnh hưởng của nồng độ muối tới khả năng sinh trưởng và tổng hợp chất kháng khuẩn của L plantarum L5 59

Bảng 3.13: Đặc điểm hình thái của các chủng oxy hóa amôni phân lập được 60

Bảng 3.14: Đặc điểm hình thái của 10 chủng oxy hóa nitrit phân lập được 61

Bảng 3.15: Hàm lượng nitrit tạo thành và sự sinh trưởng của 13 chủng oxy hóa amôni phân lập được .61

Bảng 3.16: Hàm lượng nitrat tạo thành và sự sinh trưởng của 10 chủng oxy hóa nitrit 62

Bảng 3.17: Một số đặc điểm hình thái, sinh hóa của chủng NA7 và NT2 .62

Bảng 3.18: Thử tính đối kháng lẫn nhau của các chủng vi khuẩn 64

Bảng 3.19: Ảnh hưởng của môi trường lên men xốp lên Bacillus 65

Bảng 3.20 : Ảnh hưởng của môi trường lên me n xốp lên L plantarum L5: 65

7

Bảng 3.21: Ảnh hưởng của tỉ lệ cám : trấu lên Bacillus TL1 66

Bảng 3.22: Ảnh hưởng của tỉ lệ cám : trấu lên L plantarum L5 67

Bảng 3.23: Ảnh hưởng của thời gian lên men xốp lên Bacillus TL1 67

Bảng 3.24: Ảnh hưởng của thời gian lên men xốp lên L plantarum L5 67

Bảng 3.25: Ảnh hưở ng của nhiê ̣t đô ̣ lên Bacillus TL1 68

Bảng 3.26: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên L plantarum L5 69

Bảng 3.27: ảnh hưởng của độ ẩm lên Bacillus TL1 69

Bảng 3.28: Ảnh hưởng của độ ẩm lên L plantarum L5 70

Bảng 3.29: Kết quả giá tri ̣ pH sau các ngày thí nghiệm 72

Bảng 3.30: Kết quả giá tri ̣ Nitơ tổng số sau các ngày thí nghiệm 73

Bảng 3.31: Kết quả giá tri ̣ NH3 sau các ngày thí nghiệm 74

Bảng 3.32: Kết quả giá tri ̣ nitrit sau các ngày thí nghiệm 75

Bảng 3.33: Kết quả giá tri ̣ COD và BOD sau các ngày thí nghiệm 76

Bảng 3.34: Kết quả xử lý nước đầm nu ôi thủy sản của chế phẩm .77

8

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3.1: Hoạt tính phân giải cơ chất của chủng TL1 trên 5 loại môi trường 46

Hình 3.2: Ảnh hưởng của pH lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym của chủng TL1 48

Hình 3.3: Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym ngoại bào của chủng TL1 49

Hình 3.4: Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym của chủng TL1 50

Hình 3.5: Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym của chủng TL1 50

Hình 3.6: Trình tự nucleotit của rARN 16S củ a chủng L 5 50

Hình 3.7: Vị trí phân loại của chủng L5 và các loài có quan hệ họ hàng gần… 56

Hình 3.8: Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp chất kháng khuẩn của L plantarum L5 57

Hình 3.9: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự sinh trưởng và sinh chất kháng khuẩn của L plantarum L5 58

Hình 3.10: Ảnh hưởng của nồng độ muối tới khả năng sinh trưởng và tổng hợp chất kháng khuẩn của L plantarum L5 59

Hình 3.11: Sơ đồ quy trình sản xuất chế phẩm da ̣ng rắn 71

Hình 3.12: Giá trị pH sau các ngày thí nghiệm .73

Hình 3.13: Giá trị nitơ tổng sau các ngày thí nghiệm 73

Hình 3.14: Giá trị amôni sau các ngày thí nghiệm 75

Hình 3.15 Giá trị nitrit sau các ngày thí nghiệm 76

Hình 3.16 Giá trị COD sau các ngày thí nghiệm 77

Hình 3.17: Giá trị BOD sau các ngày thí nghiệm 77

9

MỞ ĐẦU

Với đường bờ biển dài tới 3260 km cù ng với rất nhiều hòn đảo lớn nhỏ , nhiều đầm phá , eo vi ̣nh , đă ̣c biê ̣t có tới 250.000 ha rừng ngâ ̣p mă ̣n và 290.000 ha bãi triều, Viê ̣t Nam có tiềm năng lớn về diê ̣n tích nuôi trồng thủy sản nước lợ

Những năm gần đây , cơ cấu chuyển di ̣ch kinh tế cùng với các chính sách của khuyến khích của chính p hủ, phong trào nuôi trồng thủy sản ven biển ở nước ta ngày càng phát triển mạnh

Tuy nhiên, trong những năm gần đây ngành nuôi trồng đang phải đối mặt với những khó khăn có thể dẫn đến nguy cơ thất bại ở nhiều cơ sở nuôi trồng Nguyên nhân chính là do ô nhiễm môi trường nước đầm nuôi , dịch bệnh và hệ thống sinh thái bị phá hủy Các đầm nuôi trồng thủy sản , đặc biê ̣t là các đầm quảng canh không

có hệ thống cấp , thoát nước và xử lí nước thải nên trong quá trình n uôi, phân sinh

vâ ̣t , thức ăn thừa , xác động vật thủy sinh , xác rong , tảo, các loại hóa chất sử dụng trong quá trình nuôi , các loại vi khuẩn gây bệnh… làm cho nước trong đầm bị ô nhiễm Các chất hữu cơ tích tụ lại ở đáy đầm bị phân hủy kị khí sinh ra các sản phẩm như : NH3, H2S, NO3… làm cho tôm cá bi ̣ sốc hoă ̣c gây ha ̣i cho tôm cá và các sinh vâ ̣t khác sống trong đầm Khi đầm nuôi bị ô nhiễm thì những nhóm vi sinh vật

có hại có cơ hội phát triển mạnh mẽ, không kiểm soát được và hậu quả là vật nuôi

bị bệnh Trước đây, người nuôi thường sử dụng hóa chất, kháng sinh để xử lý môi trường ao nuôi và phòng bệnh Nhưng dùng nhiều hóa chất và kháng sinh gây ảnh hưởng lớn đến môi trường và con người Ngoài ra, việc lạm dụng thuốc kháng sinh còn gây ra vấn đề về dư lượng kháng sinh trong vật nuôi và vi phạm vấn đề vệ sinh

an toàn thực phẩm Do đó, cần chọn một giải pháp thích hợp để giải quyết vấn đề này Trước thực trạng đó, xử lý môi trường trong quá trình nuôi nhằm cải thiện môi trường nước, phòng bệnh cho tôm cá và an toàn với người sử dụng là vấn đề cấp thiết Tại một số nước có ngành nuôi trồng thủy sản phát triển với quy mô công nghiệp như Mĩ, Nhật, Trung Quốc, Thái Lan,…các biện pháp sinh học được sử dụng thay thế cho cách dùng hóa chất đã khẳng định được tính an toàn và hiệu quả trong nuôi trồng

Các loài vi sinh vật được dùng ngày càng nhiều trong xử lý môi trường nước nuôi trồng thủy sản đã đem lại nhiều lợi ích cho con người và môi trường sống mà các phương pháp khác không có được như: an toàn với người và động vật, đặc hiệu đối với vật chủ, thích hợp với các phương pháp phòng trừ khác, thời gian bán hủy

10

ngắn nên không tồn đọng lâu để gây ô nhiễm môi trường sống, có khả năng tự nhân lên và ức chế các vi sinh vật gây bệnh cho tôm cá

Với mong muốn tìm ra những chủng vi sinh vật có khả năng làm sạch môi

trường nước nuôi tôm, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Tuyển chọn các

chủng vi sinh vật tạo chế phẩm nhằm xử lý nước thải nuôi trồng thủy sản”

Mục đích của đề tài : tạo ra được chế phẩm có chứa một số chủng vi sinh vâ ̣t hữu ích nhằm xử lý nước nuôi tôm và bước đầu đưa ra những kết quả thử nghiê ̣m xử lý nước nuôi trồng thủy sản bi ̣ ô nhiễm ở quy mô phòng thí nghiê ̣m

11

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình nuôi trồng thủy sản trên thế giới

Nuôi trồng thủy sản là mô ̣t ngành sản xuất đô ̣ng thực vâ ̣t thủy sinh trong

điều kiê ̣n kiểm soát hoă ̣c bán kiểm soát , hoă ̣c như người ta vẫn thường nói , nuôi

trồng thủy sản là sản xuất nông nghiê ̣p trong môi trường nướ c [8]

Trong thời gian qua, ngành thuỷ sản ngày càng phát triển và dần trở thành ngành kinh tế mũi nhọn của nhiều quốc gia và là nguồn cung cấp thực phẩm quan trọng cho cộng đồng các dân cư trên toàn thế giới Không những phát triển về số lượng và giá trị, ngành thuỷ sản còn có những bước thay đổi cơ bản về cơ cấu sản xuất Từ một ngành thuỷ sản công nghiệp với khai thác thuỷ sản đóng vai trò chủ đạo và những quốc gia có sản lượng lớn nhất là các nước phát triển có những đội tàu khai thác xa bờ và một nền công nghiệp chế biến hiện đại trong những năm trước thập kỷ 90, trong giai đoạn từ hơn mười năm trở lại đây, ngành thuỷ sản đã phát triển theo hướng nông nghiệp, nghĩa là nuôi trồng thuỷ sản (N TTS) đã tăng nhanh tỷ lệ đóng góp của mình và các nước nông nghiệp chính là những nước có sản lượng đứng đầu thế giới Chỉ tính trong giai đoạn 10 năm từ 1993-2003, trong khi sản lượng khai thác hầu như đứng yên, chỉ tăng 1,2%, thì sản lượng NTTS tăng mỗi năm tới 9,4% Năm 2003, tỷ lệ của NTTS trong tổng sản lượng thuỷ sản thế giới đã tăng lên 31,7% [8]

Theo thống kê của FAO, năm 2003, tổng sản lượng thủy sản của thế giới đạt gần 132 triệu tấn, lĩnh vực khai thác đạt 90 triệu tấn và nuôi đạt gần 42 triệu t ấn Trong đó, lượng thuỷ sản (TS) dùng làm thực phẩm khoảng 101 triệu tấn, chiếm hơn 76,5 % [8]

Nếu phân theo môi trường nuôi, sản lượng các loài thuỷ sản nước ngọt chiếm

tỷ lệ cao hơn (năm 2003, nuôi nước ngọt đạt 25,2 triệu tấn, chiếm 60,14% sản lượng và 48,7% giá trị) Thuỷ sản nuôi nước mặn chiếm 36,5% sản lượng và 35,7% giá trị Mặc dù sản lượng nuôi nước lợ chỉ chiếm 5,8% (năm 2002), nhưng lại chiếm tới 15,9% giá trị vì phần lớn là những sản phẩm giá trị cao

1.2 Tình hình nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam

Với đường bờ biển dài hơn 3200km; Viê ̣t Nam có vùng đă ̣c quyền kinh tế trên biển rô ̣ng hơn 1 triê ̣u km2

Việt Nam cũng có vùng mă ̣t nước nô ̣i đi ̣a lớn rô ̣ng hơn 1,4 triê ̣u ha nhờ hê ̣ thống sông ngòi , đầm phá dày đă ̣c Vị trí địa lý và điều kiện

12

tự nhiên thuâ ̣n lợi giúp Viê ̣t Nam có nhiều thế ma ̣nh nổi trô ̣i để phát triển ngành

thủy sản Từ lâu Viê ̣t Nam đã trở thành quốc gia sản xuất và xuất khẩu thủy sản

hàng đầu khu vực cùng với Indon esia và Thái Lan Xuất khẩu thủy sản trở thành

mô ̣t trong những lĩnh vực quan tro ̣ng của nền kinh tế [6]

Theo số liê ̣u thống kê , 11 tháng đầu năm 2009, kim nga ̣ch xuất khẩu thủy sản đạt 3.928 triê ̣u đôla, bằng 93,8% so với cùng k ỳ năm ngoái ; chiếm 7,6% tổng kim ngạch xuất khẩu cả nước [6]

Viê ̣t Nam có hơn 1 triê ̣u km đường bờ biển và 1,4 triê ̣u hecta mă ̣t nước nô ̣i

đi ̣a vì vâ ̣y nguồn cung thủy hải sản rất dồi dào và ổn đi ̣nh Trữ lươ ̣ng hải sản ở Viê ̣ t Nam ước tính có khoảng 4,2 triê ̣u tấn và nguồn tái ta ̣i là khoảng 1,73 triê ̣u tấn Mở

rô ̣ng diê ̣n tích nuôi trồng thủy sản và cải thiê ̣n khả năng khai thác đánh cá xa bờ đã giúp sản lượng thủy hải sản Việt Nam không ngừng tăng trong những năm qua Mức tăng trưởng trung bình từ năm 2006 - 2008 là khoảng 11% Đến hết tháng 11 năm 2009, sản lượng thủy sả n đã đa ̣t hơn 4,4 triê ̣u tấn [6]

Trong những năm gần đây , các sản phẩm mặt hàng thủy sản của Việt Nam ngày càng được đa dạng hóa Các sản phẩm như tôm ,cá tra, cá ngừ , hàng khô , mực, bạch tuộc chiếm tỉ trọng lớn nhất trong kim ngạch xuất khẩu thủy sản Trong đó , tôm đứng đầu về kim nga ̣ch xuất khẩu , chiếm 38,4 %

1.3 Nhƣ ̃ng khó khăn thách thƣ́c nghề

Theo đánh giá của FAO , thủy sản và các sản phẩm là các sản phẩm được phát triển nhanh nhất trong các mă ̣t hàng thực phẩm hiê ̣n nay nói chung Lợi thế của nuôi trồng thủy sản là có thể thực hiê ̣n được kế hoa ̣ch phát triển sản xuất thủy sản , gia tăng sản lượng nhằm đáp ứng nhu cầu của thi ̣ trường tiêu thụ , không bi ̣ phụ thuô ̣c vào mùa vụ khai thác như nguồn lợi tự nhiên

Tuy nhiên , ngoài những thuận lợi đó , nuôi trồng thủ y sản ở Viê ̣t Nam cũng đã và đang phải đối mă ̣t với nhiều khó khăn như điều kiê ̣n môi trường , khí hậu , nguồn nước , ô nhiễm nước thải , nguồn giống , thức ăn , dịch bệnh , thời tiết… Ha ̣n chế trong nuôi trồng thủy sản ở Viê ̣t Nam là tính rủi ro còn cao do những nguyên nhân chủ quan và khách quan Về mă ̣t chủ quan , còn có nhiều vấn đề kĩ thuật và phi

kĩ thuật mà chúng ta chưa làm chủ được Trong điều kiện nuôi trồng thủy sản hiê ̣n nay, các đầm nuôi thường bị phú dưỡng Nguyên nhân là do chúng ta đưa vào đầm nuôi lươ ̣ng thức ăn tổng hợp rất lớn mà chỉ có phần rất nhỏ (khoảng 17%) lượng thức ăn được tôm sử dụng , còn lại là hòa tan trong nước hoặc bài tiết ra ng oài môi

Trong nuôi trồng thủy sản thường phải sử dụng các loa ̣i hóa chất , kháng sinh , thuốc diê ̣t nấm để tri ̣ bê ̣nh Tuy nhiên , chúng phải được dùng với liều lượng thích hợp và theo quy định hợp lí Nếu không , việc sử dụng thuốc kháng sinh bừa bãi sẽ gây hiê ̣n tượng kháng thuốc và gây cho người sử dụng những rủi ro tiềm ẩn như

tăng mẫn cảm với dư lượng thuốc hoă ̣c xuất hiê ̣n hê ̣ vi khuẩn đườ ng ruô ̣t kháng la ̣i các chất kháng khuẩn Rất nhiều nước trên thế giới đã có những thay đổi hoă ̣c thắt chă ̣t các quy đi ̣nh của quốc gia về viê ̣c sử dụng thuốc tri ̣ bê ̣nh trong nuôi trồng , đặc biê ̣t là kháng sinh , đây cũng là yêu cầu nghiêm ngă ̣t của nhiều nước trong đó có cả các nước nhập khẩu [7], [26]

Mô ̣t khó khăn nữa đối với ngành nuôi trồng thủy sản đó là di ̣ch bê ̣nh , đặc biê ̣t là đối với tôm Cùng với việc tăng sản lượng tôm thì bệnh tôm ngà y càng phát triển nhiều và xuất hiê ̣n nhiều bê ̣nh la ̣ mà chưa có giải pháp điều tri ̣ Gần 30 bệnh và hội chứng bệnh của tôm nuôi với 2 nguyên nhân nhiễm trù ng và không nhiễm trùng đã được một số tài liệu gần đây nhắc đến nhưng sự hiểu biết về chúng còn rất

ít Mô ̣t số tác nhân gây bê ̣nh quan tro ̣ng nhất cho tôm cá, cũng như các thủy hải sản khác là vi sinh vật (vi khuẩn , vi rú t , nấm và nguyên sinh đô ̣ng vâ ̣ t) hay do môi trường, đô ̣c tố [30]

Các vi sinh vâ ̣t gây bê ̣nh gây ra các bê ̣nh nghiêm tro ̣ng cho thủy hải sản Ví dụ đối với tôm , chúng gây bệnh đốm trắng , bê ̣nh đầu vàng , bê ̣nh phát sáng… Nếu môi trường tiếp tục xấu đi hay số lượng vi khuẩn gây bê ̣nh tăng ma ̣nh , tôm sẽ chết nhiều trong mô ̣t thời gian ngắn hoă ̣c bê ̣nh sẽ chuyển thành da ̣ng nhiễm khuẩn mãn tính và rất khó chữa Những bê ̣nh này chỉ mang tính chất cơ hô ̣i khi nước bi ̣ ô

nhiễm, đă ̣c biê ̣t là nước bi ̣ ô nhiễm hữu cơ hoă ̣c tôm cá chi ̣ u tình tra ̣ng sốc do mô ̣t

14

trong các điều kiê ̣n gây ra như sự thay đổi nhiê ̣t đô ̣ , pH, mâ ̣t đô ̣ thả quá dày , sự thay đổi về đô ̣ mă ̣n của nước

 Vi khuẩn Vibrio gây bê ̣nh cho tôm

Các vi sinh vật gây bệnh luôn tồn tại trong môi trường sinh sống của tôm (đất, nước, không khí, thức ăn…) và tồn tại ngay trong cơ thể vật chủ Một trong số

các vi khuẩn gây bệnh nguy hại phổ biến cho tôm là Vibrio spp Đây là chủng vi

khuẩn Gram âm, có khả năng chuyển động, có hoạt tính oxidaza, hình que hoặc hình dấu phẩy, kị khí không bắt buộc, không hình thành bào tử, có thể cư trú trong nước với các độ mặn khác nhau Nhóm vi khuẩn này tồn tại trong môi trường nước nuôi như một thành phần của quần thể vi sinh vật tự nhiên trong đầm nuôi nhưng khi gặp điều kiện bất lợi cho tôm, chúng trở thành vi khuẩn có khả năng gây bệnh,

vì vậy chúng được xếp vào loại vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên tôm) [49] Vibrio spp rất phổ biến trong nước mặn, một số loài có khả năng gây bệnh cho tôm (V

cholera, V parahaemolyticus, V alginolyticus, V vulnificus, V urnissii…) Chúng

thường gây ra các bệnh nghiêm trọng cho tôm như bệnh đốm trắng, bệnh đầu vàng, bệnh phát sáng… Khi bị nhiễm vi khuẩn này, lúc đầu, một số nơi trên cơ thể tôm sẽ

bị tiêu hủy như phần đuôi ho ặc phần lưng rồi dần dần làm bế tắc hệ thống lưu thông của máu [38] Tôm thay đổi tập tính như bơi ven bờ hay gần mặt nước, lờ đờ, bỏ ăn, đổi màu đỏ hoặc xanh Nếu môi trường tiếp tục xấu đi hay số lượng vi khuẩn gây bệnh tăng mạnh, tôm sẽ chết nhiều trong một thời gian ngắn hoặc bệnh sẽ chuyển thành dạng nhiễm khuẩn mãn tính Những bệnh này chỉ mang tính chất cơ hội khi nước bị ô nhiễm, đặc biệt là nước bị ô nhiễm hữu cơ hoặc tôm cá chịu tình trạng sốc

do một trong các điều kiện gây ra như sự thay đổi nhiệt độ, pH, mật độ thả quá dày,

sự thay đổi về độ mặn của nước

Vi khuẩn Vibrio spp trong các đầm nuôi tôm rất phong phú và có xu hướng

tăng dần theo thời gian nuôi, số lượng đạt cực đại vào cuối vụ Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Trọng Nho và ctv (1996) [21] đầm tôm ở các tỉnh Nam Trung Bộ bị

bệnh có số lượng vi khuẩn Vibrio tổng số từ 110-1500 tế bào/ml Theo Phan Lương

Tâm và ctv (1998) [29], Nguyễn Việt Thắng (1998) [33] khảo sát các nguyên nhân gây chết tôm ở các tỉnh phía Nam cho rằng trong các đầm nuôi tôm bị chết, số

lượng vi khuẩn Vibrio spp tổng số cũng rất cao Sự xuất hiện, phân bố của các chủng Vibrio là theo mùa và phụ thuộc vào chế độ dinh dưỡng của nước Hiện tượng bùng nổ Vibrio xảy ra trong các trường hợp nước bị phú dưỡng Việc định

15

lượng vi khuẩn Vibrio spp rất quan trọng để chủ động kiểm tra chất lượng nước,

xác định khả năng bệnh lí có thể xảy ra trong đầm nuôi tôm

1.4 Ảnh hưởng của một số điều kiện môi trường lên quá trình nuôi trồng thủy sản

Dạng thức ăn sử dụng nuôi tôm ảnh hưởng rấ t lớn đến môi trường đầm nuôi Trong thời gian đầu , đa số các loài nuôi đều cho năng suất cao nhưng chỉ sau mô ̣t thời gian sử dụng thức ăn , đă ̣c biê ̣t là thức ăn tu ơi thì chất lượng nước suy giảm mô ̣t cách nhanh chóng Khi hàm lượ ng các chất hữu cơ và các chất chứa ni tơ tăng lên thì hàm lượng oxy hòa tan giảm Sự nh iễm bẩn môi trường nước nuô i trồng thủy sản được bắt đầu bằng sự tích tụ các sản phẩm thức ăn dư thừa và các chất thải của tôm cá Khi đó, quá trình sinh trưởng và phát triển của các loài thủy sản bị đình trệ ,

mô ̣t trong số trường hợp có thể dẫn đến hiê ̣n tượng tôm cá bi ̣ chết hàng loa ̣t , gây

thiê ̣t ha ̣i lớn cho sản xuất

1.4.1 Nhiê ̣t độ

Nhiê ̣t đô ̣ là điều kiê ̣n xác đi ̣nh đă ̣c điểm các quá trình sinh ho ̣c , lí học , hóa học… diễn ra trong nước Tôm cá là các đô ̣ng vâ ̣t biến nhiê ̣t Nhiê ̣t đô ̣ là yếu tố sinh thái quan trọng ảnh hưởng tới nhiều phương diện trong đời sống của tô m cá như : hô hấp, tiêu thụ thức ăn , đồng hóa thức ăn , tăng cường miễn di ̣ch đối với bê ̣nh tâ ̣t , sự tăng trưởng… nhiê ̣t đô ̣ thay đổi theo mùa nên ở miền Nam Viê ̣t Nam có thể nuôi

tôm cá quanh năm trong khi ở miền Bắc chỉ khai thác đ ược chủ yếu vào mùa có nhiê ̣t đô ̣ ấm áp Ở Việt Nam , nhiê ̣t đô ̣ thích hợp cho tôm cá là 28-36o

Bảng 1.1 Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của tôm , cá

(Lương Đư ́ c Phẩm , 2002) [24]

Đặc điểm môi trường pH Giơ ́ i ha ̣n thích nghi của tôm, cá

16

axit ma ̣nh 4 điểm chết đối với tôm, cá

axit yếu 5-6 tôm cá không sinh sản hoă ̣c khó sinh sản

trung tính 7-8 môi trường thích hợp cho tôm cá

kiềm yếu 9 giới ha ̣n cuối cùng cho tôm cá

kiềm ma ̣nh > 10 điểm chết đối với tôm cá

1.4.3 Độ mặn

Độ mặn được tính dựa trên tổng nồng độ các ion hòa tan trong nước , có quan

hê ̣ mâ ̣t thiết với đời sống của thủy sinh vâ ̣t Nhu cầu về độ mă ̣n thay đổi tùy theo từng loa ̣i tôm cá và thời điểm trong chu trình sống của mỗi loại Đối với tôm sú , đô ̣

mă ̣n thích hợp là 15-35‰ NaCl, đô ̣ mă ̣n tối ưu là 29 -30‰ NaCl Tôm sú sinh trưởng châ ̣m và năng suất thấp khi nuôi ở đô ̣ mă ̣n cao hơn 35‰ [21]

1.4.4 Oxy hòa tan (DO)

Oxy hòa tan trong nướ c có ý nghĩa rất lớn t rong viê ̣c đánh giá tra ̣ng thái của nước và đô ̣ giảm của nó cho thấy sự thay đổi ma ̣nh mẽ của các quá trình sinh ho ̣c , quá trình tự làm sạch , sự nhiễm bẩn của nguồn nước Nồng độ oxy hòa tan phụ thuô ̣c vào mô ̣t loa ̣t các yếu tố tự nhiên như : áp suất , nhiệt đô ̣ nước , nồng đô ̣ các muối hòa tan trong nước Khi nuôi tôm , cá, giữa mâ ̣t đô ̣ tôm , cá với hàm lượng oxy hòa tan có mối quan hệ qua lại với nhau Oxy được tôm, cá sử dụng vào quá trình

hô hấp, đồng thời oxy được tiêu thụ làm phân hủy mô ̣t lượng chất thải và thức ăn dư thừa của tôm , cá Do đó, oxy là yếu tố quan trọng trong nước nuôi , hỗ trợ cho tôm , cá phát tri ển Nước nuôi đủ tiêu chuẩn để nuôi tôm cá có nồng đô ̣ oxy hòa tan là : 5-8mg/l Trong đầm nuôi , lượng oxy hòa tan thấp sẽ làm tôm chậm lớn , có thể chết hàng loạt Mức gây ha ̣i tùy thuô ̣c vào lượng oxy hòa tan có trong đầm và giời gian tôm, cá phải chịu đựng Chanratchakool P (1995) [44] cho rằng hàm lươ ̣ng oxy hòa tan trong nước < 4mg/l làm cho tôm , cá sử dụng thức ăn kém , dễ nhiễm bê ̣nh Chiu Liao P (1992) [45] nhận thấy rằng lươ ̣ng oxy hòa tan nhỏ hơ n 3,5 mg/l sẽ gây chết tôm, cá Lượng oxy hòa tan còn liên quan đến độ mặn và nhiệt độ nước của đầm nuôi Khi nhiệt đô ̣ , đô ̣ mă ̣n tăng thì khả năng hòa tan oxy trong nướ c giảm (Gaudiosa, 1975) [50]

17

1.4.5 COD, BOD

COD là nhu cầu oxy hóa học cần thiết cho quá trình oxy hóa toàn bộ c ác chất hữu cơ trong nước thành CO 2 và H2O BOD là nhu cầu oxy sinh ho ̣c cần thiết cho vi sinh vâ ̣t tiêu thụ để oxy hóa các chất hữu cơ có trong nước

Trong môi trường đầm nuôi tôm cá, hai chỉ tiêu nghiên cứu chất lượng nước COD và BOD được dùng để đánh giá mức đô ̣ nhiễm bẩn , phú dưỡng hóa đồng thời còn cho biết sự phát triển c ủa sinh vật trong thủy vực [15] COD phản ảnh lươ ̣ng tiêu hao oxy do quá trình biến đổi các chất hữu cơ (biến đổi hóa học), do đó giá trị COD phản ánh mức đô ̣ gia tăng chất hữu cơ có trong đầm như thức ăn thừa , sản phẩm bài tiết của tôm và xác sinh vâ ̣t chết Sự biến đổi COD trong đầm nuôi tôm tăng dần từ đầu vụ tới cuối vụ , thườ ng đầu vụ hàm lươ ̣ng COD thấp từ 0,5 – 1,2mg/l, cuối vụ nuôi có thể lên tới 10 - 12 mg/l [23] Trong đầm nuôi , COD thường biến đổi từ 1,9 - 6,5 mg/l tuy giá tri ̣ ở mức trung bình cao nhưng phù hợp cho tôm cá phát triển [23] BOD phản ánh lượng các chất hữu cơ dễ bi ̣ phân hủy sinh ho ̣c có trong nước Giá trị BOD càng lớn nghĩa là mức độ ô nhiễm hữu cơ càng cao Tiêu chuẩn nước thủy sản của FAO quy đi ̣nh giá tỉnh BOD < 10 mg/l, giới ha ̣n thích hợp của BOD từ 4 -8 mg/l [23]

Trong đầm nuôi trồng thủy sản , các thông số BOD , COD càng giảm càng tốt vì điều đó chứng tỏ rằng trong đầm không phải tiêu thụ một lượng lớn oxy hòa tan (DO) trong nước để oxy hóa các chất cặn bã ở đáy đầm Khi COD , BOD giảm thì

DO trong nước tăng lên , làm cho nước đầm nuôi trồng thủy sản trong lành và sạch

sẽ hơn Cả hai thông số BOD và COD đều xác định lượng chất hữu cơ có khả năng

bị oxy hóa có trong nước nhưng chúng khác nhau về ý nghĩa BOD chỉ để thể hiê ̣n lươ ̣ng chất hữu cơ dễ bi ̣ phân hủy sinh ho ̣c nghĩa là các chất hữu cơ bi ̣ oxy hóa nhờ

vi sinh vâ ̣t COD thể hiê ̣n toàn bô ̣ các chất hữu co có thể bị oxy hóa bằng các tác nhân hóa ho ̣c Do vâ ̣y , tỉ số BOD / COD luôn nhỏ hơn 1, chỉ số này cao chứng tỏ môi trường đầm nuôi bi ̣ ô nhiễm bởi các chất hữu cơ sinh ho ̣c dễ tan , dễ phân hủ y (thứ c ăn thừa , chất thải của tôm , cá, xác thủy sinh vâ ̣t ch ết) [37]

1.4.6 Mâ ̣t độ vi tảo, Vibrio spp và vi khuẩn tổng số

Vi khuẩn lam và các loài vi tảo là nhóm sinh vâ ̣t đơn giản nhất có khả năng quang hơ ̣p Chúng sử dụng cacbonic hoặc cacbonat là nguồn cabon và sử dụng các muối photpho và nitơ vô cơ để phát triển theo sơ đồ [37]:

CO2 + PO4 +nNH3 phát triển tế bào m ới +n ONăng lượng ánh sáng 2

18

Các kết quả phân tích các mẫu thực vật nổi vùng nước cửa sông ven biển đãxác định được 72 loài thuộc các ngành Tảo silic , vi khuẩn lam , tảo lục và tảo mắt Số lươ ̣ng các loài kể trên còn thấp hơn nhiều so với số thực có trong mặt nước tự nhiên Trong số thành phần loài đã xác đi ̣nh đươ ̣c , tảo silic có 62 loài, chiếm ưu thế về số lươ ̣ng loài (86,1% tổng số loài ) Hầu hết các loài trong ngành tảo silic là những loài nhiê ̣t đới trong nhóm sinh thái xa bờ , thích nghi với độ muối rộng Ở những thủy vực có đô ̣ muối cao, tảo silic chiếm ưu thế gần như tuyệt đối Tảo silic là thức ăn quan trọng cho động vật phù du (zooplankton) và tôm Ở vùng nước nằm sâu trong sông có đô ̣ mă ̣n thấp hoă ̣c ngo ̣t hoàn toàn thì ngành tảo lam chiếm ưu thế [11] Mật đô ̣ tảo là cơ sở cho chuỗi thức ăn ở nước Giữa năng suất tôm và mâ ̣t đô ̣ tạo có sự liên hệ vô cùng quan trọng Mă ̣t nước có mâ ̣t đô ̣ tảo thấp là mă ̣t nước chết về phương diê ̣n sản xuất Tuy nhiên , đầm nuôi có mâ ̣t đô ̣ tả o quá lớn cũng gây nhiều bất lươ ̣ng cho năng suất và môi trường [37], [38] Mâ ̣t đô ̣ tảo cũng là chỉ thị ô nhiễm nước do phú dưỡng hóa trong đầm nuôi thủy sản

Vi khuẩn Vibrio spp trong các đầm nuôi rất phong phú , có xu hướng t ăng

dần theo thời gian nuôi , đa ̣t giá tri ̣ cực đa ̣i vào cuối mùa vụ Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Tro ̣ng Nho và ctv (1996) [23] ở các tỉnh Nam Trung Bộ , đầm nuôi bi ̣ bê ̣nh

có số lươ ̣ng vi khuẩn Vibrio spp tổng số từ 110 – 1500 tế bào/ml Viê ̣c đi ̣nh lượng

vi khuẩn Vibrio sp rất quan trọng để chủ động kiểm tra chất lượng nước cũng như

xác định khả năng bệnh lí có thể xảy ra trong đầm nuôi tôm

Lươ ̣ng vi khuẩn tổng số là chỉ tiêu xác đi ̣nh điều kiê ̣n v ệ sinh cũng như mức

đô ̣ nhiễm bẩn do các hợp chất hữu cơ, chất thải của tôm cá, thức ăn thừa , xác thủy sinh vâ ̣t chết đồng thời dự báo tình hình di ̣ch bê ̣nh trong đầm nuôi và nguồn nước

cung cấp cho đầm nuôi Lươ ̣ng vi khuẩn tổng số có chiều hướng tăng dần theo thời gian nuôi , đặc biê ̣t vào thời gian có lượng mưa lớn , nguồn nước bi ̣ ô nhiễm từ các con sông đổ ra Lươ ̣ng vi khuẩn tổng số ở nguồn nước cung cấp cho đầm nuôi tôm cao hơn nhiều so với tr ong đầm nuôi Môi trường nước có mâ ̣t đô ̣ vi khuẩn cao hơn

107 tế bào/ ml có dấu hiê ̣u bi ̣ ô nhiễm nhe ̣ , dịch bệnh có thể phát sinh [2]

1.4.7 Nitơ tổng số

Trong nước , ammon thường tồn ta ̣i ở da ̣ng NH 3 và NH 4+ Ammon là sản phẩm k hoáng hóa đầu tiên của các chất hữu cơ , có thể được thực vật phù du hấp thụ trong quá trình quang hợp hoă ̣c bi ̣ oxy hóa tạo thành muối nitrit và nitrat dưới tác dụng của vi sinh vật , quá trình này được gọi là quá trình n itrat hóa Amôni ở dạng

19

NH4+ không gây đô ̣c cho các loài thủy sinh vâ ̣t trừ khi hàm lượng quá cao NH3 là chất gây đô ̣c cho các l oài thủy sinh vật , tuy nhiên NH3 chịu ảnh hưởng của pH , nhiê ̣t đô ̣ và đô ̣ mă ̣n Khả năng gây độc của N H3 đối vớ i tôm sú cũng có sự khác nhau theo nhiê ̣t đô ̣ và đô ̣ mă ̣n của đầm nuôi Trong đầm nuôi tôm sú , nếu ở nhiê ̣t đô ̣ thấp và đô ̣ mă ̣n cao thì khả năng chi ̣u đựng của tôm sú với NH 3 kém hơn và ngược lại, khi ở nhiê ̣t đô ̣ cao v à độ mặn thấp thì khả năng chịu đựng đối với NH 3 tốt hơn

Nitrit (NO2- ) rất cần thiết cho hoạt đô ̣ng của thực vâ ̣t phù du NO2- thường tồn ta ̣i ở da ̣ng trung gian và hàm lượng trong nước rất thấp Ngoài ra , NO2- còn là chỉ t iêu vê ̣ si nh, yếu tố chỉ thi ̣ của quá trình tự làm sa ̣ch nước trong tự nhiên [1] Dạng nitrit thường vô hại nhưng trong môi trường nước mà hàm lượng chlorinity (chlorinity là khối lươ ̣ng của clo tính bằng gram chứa trong 1 kg nướ c biển sau khi bromua và iod được thay thế bằng cloride Chlorinity được xác đi ̣nh bằng phương pháp chuẩn độ , đây là mô ̣t trong những phương pháp xác đi ̣nh nồng đô ̣ muối của nước biển ) thấp thì nitrit sẽ gây đô ̣c cho tôm cá Nitrit gây đô ̣c cho tôm , cá là vì chúng tạo thành chất methemoglobin làm giảm quá trình vận chuyển oxy tớ i tế bào Nitrit cũng có thể kết hợp với hợp chất mang gốc CN -

và giải phóng gốc này ra khỏi phức chất xianua gây đô ̣c ma ̣nh ch o đầm nuôi

Nitrat (NO3- ) là sản phẩm của sự khoáng hóa các chất hữu cơ chứa nitơ, cần thiết cho sự p hát triển của thực vật phù du Tuy nhiên , nếu hàm lượng nitrat trong đầm tôm cá vượt quá 7 mg/l thì môi trường bi ̣ phú dưỡ ng và bi ̣ nhiễm bẩn [2]

Trong môi trường nước , mối quan hê ̣ giữa NH 4

+

, NH3, NO2-, NO3-, có tính liên tục và liên quan chă ̣t chẽ với nhau

Nitrosomonas bacteria

Nitrobacter bacteria

[14] Hàm lượng PO43- thườ ng thấp , ít khi vượt quá 1 mg/l, đa phần hàm lượng PO43-

được bùn đáy hấp thu và trở lại môi trường Trong cá c đầm nuôi

có chất đáy phèn chua nhiều ion nhỏ và sắt thì lượng PO43- bị kết tủa nhiều Vì vậy , các đầm nuôi có đáy chua phèn cần được bón nhiều phân lân Hàm lượng PO43-

thích

hơ ̣p cho đầm nuôi là 0,5 mg/l [38]

Trong nước , tảo sử dụng CO 2, nitơ vô cơ , orthophotphat và các chất dinh dưỡng khác để phát tri ển Tuy nhiên , khi nồng đô ̣ amônia và photphat cao , rong tảo phát triển mạnh tạo sinh khối tới mức động vật phù du và tôm cá trong đầm không thể tiêu thụ hết sẽ dẫn đến tình tra ̣ng bùng nổ các loa ̣i rong , tảo Tình trạng này kéo dài sẽ làm cho đầm , hồ bi ̣ phú dưỡng hóa , nước đục và có că ̣n lắng , có mùi khó chịu

do tảo bi ̣ phân hủy , gây giảm oxy trong nước Trong điều kiê ̣n đó thì tôm, cá sẽ sinh trưởng châ ̣m và dễ mắc bê ̣nh [37]

1.4.9 Sulphuahydro

Sulphuahydro trong thủy vực được hình thành do hoa ̣t đô ̣ng phân hủy chất

hữu cơ của vi khuẩn trong điều kiê ̣n yếm khí và vi khuẩn lưu huỳnh kh ử sulphat trong nước nơi có nhiều sulphat [31] Trong môi trường nước các đầm nuôi trồng thủy sản , sulphuahydro thường tồn ta ̣i ở mô ̣t số da ̣ng như : H2S, HS-, S2- Tuy nhiên , trong các da ̣ng trên chỉ có da ̣ng H 2S là gây đô ̣c cho các thủ y sinh vâ ̣t , mức đô ̣ gây

đô ̣c có liên quan đến nhiê ̣t đô ̣ và pH của đầm nuôi pH và nhiê ̣t đô ̣ thấp (nhiê ̣t đô ̣

200C và pH = 5) tồn ta ̣i tới 99% là H2S gây đô ̣c [48] Các giai đoạn biến đổi tạo ra

Vì vậy , môi trường axit cung cấp nhiều ion H +

phản ứng phân hủy chất hữu

cơ trong nước luôn t ạo ra H2S gây đô ̣c cho tôm cá và các thủy sinh vâ ̣t khác Theo

21

Nguyễn Tro ̣ng Nho (1994) [21], trong đầm nuôi tôm cá , hàm lượng H 2S không đươ ̣c quá 0,1 mg/l

Bảng 1.2 Tiêu chuẩn chất lượng nước nuôi trồng thủy sản

(Khoa thủ y sản , trường đa ̣i ho ̣c Cần Thơ , 2000) [16]

nhiê ̣t đô ̣ nước (0C) 23-30 màu nước xanh nõn chuối

Độ mặn (%0) 18 - 30

1.5 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng biện pháp sinh học trong xử lý môi

trường nước nuôi trồng thủy sản

1.5.1 Vai trò của các vi sinh vật trong quá trình làm sạch nước nuôi tôm, cá

Đầm nuôi tôm, cá là những hệ sinh thái nước không đặc trưng do chịu nhiều tác động của con người Tuy vậy, cũng giống như khu hệ sinh thái nước tự nhiên khác, hệ sinh thái đầm nuôi tôm, cá được cấu thành bởi nước, khoáng chất, các hợp chất hữu cơ hòa tan và hệ thủy sinh vật Vi sinh vật là một thành phần quan trọng của hệ thủy vi sinh vật ở đây bởi chúng không những đóng vai trò chủ đạo trong các chu trình chuyển hóa các nguyên tố cơ bản cấu tạo nên hợp chất hữu cơ mà tác động trực tiếp hoặc gián tiếp lên nguồn lợi thủy sản của người nuôi trồng [13], [35]

Vi sinh vật hữu ích trong nước nuôi tôm bao gồm các nhóm có khả năng phân giải

22

và tái vô cơ hóa các hợp chất hữu cơ, chuyển hóa các hợp chất vô cơ, đồng thời bản thân chúng cũng không gây hại với tôm (không sinh ra sản phẩm độc hại, không gây bệnh) Hoạt động sống của chúng sẽ giúp ích cho việc cải thiện chất lượng môi trường nước, ổn định pH, tạo điều kiện môi trường không thuận lợi đối với các vi sinh vật gây hại, cạnh tranh và ức chế sự phát triển của nhóm vi sinh vật gây bệnh ở tôm cá, qua đó giúp tôm, cá tăng trưởng nhanh, khỏe mạnh và môi trường sinh thái trong đầm được cân bằng [28]

Trong môi trường nước nuôi tôm, cá luôn tồn tại các hợp chất hữu cơ từ nhiều nguồn khác nhau như: lượng thức ăn dư thừa, phân tôm cá, chất tiết ra từ mọi quá trình trao đổi chất của thủy sinh vật, xác động vật, thực vật phù du…[4] Do đó, nếu nồng độ của chúng trong nước quá cao sẽ gây ô nhiễm nguồn nước và dẫn tới các hội chứng sốc ở tôm, cá Hoạt động tích cực của các vi sinh vật phân giải các hợp chất hữu cơ sẽ giúp giải phóng những tồn tại hữu cơ gây ô nhiễm nguồn nước, đồng thời bổ sung trực tiếp hoặc gián tiếp vào nguồn dinh dưỡng cần thiết cho động vật nuôi trồng [43] Cơ chế các hoạt động phân giải chất hữu cơ ở vi sinh vật hữu ích chính là cơ chế của các quá trình trao đổi chất và trao đổi năng lượng trong cơ thể chúng Nấm, động vật nguyên sinh và đa số vi khuẩn là vi sinh vật dị dưỡng nên chúng cần chất hữu cơ từ bên ngoài môi trường để làm thức ăn Chúng sử dụng những chất này để thu nhận các tiền chất cho việc xây dựng nên tế bào của mình và thu nhận năng lượng cho các quá trình sống Khi đó vật chất hữu cơ được vi sinh vật biến đổi thành các chất nghèo năng lượng và cuối cùng trong những điều kiện phù hợp thì chuyển hóa ngược lại thành những chất vô cơ ban đ ầu Trong môi trường nước nuôi tôm, cá các loại chất hữu cơ thường chiếm tỷ lệ lớn là: protein, cacbonhidrat, kitin,… Sự phân hủy protein trước hết là nhờ nhiều loại vi khuẩn như

Pseudomonas, Clostridium, Bacillus và họ vi khuẩn Enterobacteriaceae [34] Đại

diện cho nhóm vi sinh vật hữu ích chuyển hóa các hợp chất cacbonhidrat bao gồm

các chi Bacillus, Lactobacillus, Streptococus, Cellulomonas, Aerobacter … Các

nghiên cứu cụ thể hơn còn cho thấy bên c ạnh khả năng phân giải chất hữu cơ, nhóm

vi khuẩn này còn có khả năng c ạnh tranh sinh học, ức chế sự phát triển của các vi

khuẩn gây bệnh ở tôm là Vibrio và Aeromonas [35], [39], [61]

Môi trường nước nuôi tôm, cá vốn là một môi trường giàu dinh dưỡng, thức

ăn giàu đạm luôn được con người cung cấp dư thừa, ngoài ra còn từ phân tôm, cá và xác động vật thủy sinh Mặt khác, một số hợp chất nitơ vô cơ như NH3 là một khí

23

độc với tôm và NO3

là tác nhân gây ung thư đối với nhiều động vật Do đó, vai trò phân giải hợp chất nitơ hữu cơ c ủa nhóm vi khuẩn amôn hóa, nhóm vi khuẩn nitrat hóa và nhóm vi khuẩn phản nitrat hóa đặc biệt được quan tâm Tuy nhiên, chỉ một số ít vi sinh vật (vi khuẩn sống tự do trong đất và nước, vi khuẩn sống cộng sinh với thực vật, vi khuẩn quang hợp,…) có khả năng cố định nitơ phân tử thành dạng nitơ hợp chất mà các vi sinh vật khác có thể sử dụng được Dạng amôniac (NH3) và nitrat (NO3-) được tảo và nhiều vi sinh vật hấp thụ tạo nên nguồn nitơ hữu cơ, sau

đó có thể chúng lại trở thành nguồn thức ăn cho động vật thủy sinh

- Nhóm vi khuẩn amôn hóa: Nhóm này phân gi ải protein và các hợp chất

hữu cơ chứa nitơ tạo thành amôniac, ho ạt động của nhóm vi khuẩn amôn hóa giúp loại bỏ các hợp chất hữu cơ gây ô nhiếm nguồn nước nuôi tôm, cá góp phần tạo nên một môi trường trong s ạch cho tôm cá phát triển

- Nhóm vi khuẩn nitrat hóa: vi khuẩn amôn hóa là vi khuẩn hữu ích, song

sản phẩm mà chúng sinh ra là NH3, nếu trong nước nồng độ NH4+ quá cao vượt mức cho phép sẽ gây hại cho động vật nuôi trồng [1] Nhóm vi khuẩn nitrat hóa đó

là các chi Nitrosomonas, Nitrococus, Nitrobacter, Nitrospira,… được xếp vào

nhóm vi khuẩn hữu ích trong môi trường nước nuôi tôm cá vì chúng có khả năng chuyển hóa NH4+ thành NO3- (dạng không độc với môi trường và các sinh vật khác trong đầm) Mặt khác, NO3-

do hoạt động của chúng sinh ra lại có thể được đồng hóa trong tổng hợp protein c ủa nhiều sinh vật và tảo Như vậy, nhóm vi khuẩn nitrat hóa không chỉ làm giảm độ độc của nước mà còn góp phần làm mới nguồn nước, mang lại các chất dễ hấp thụ cho động vật thủy sinh [51], [55 ]

Pseudomonas, Bacillus, Paracoccus… là các vi khuẩn có khả năng khử NO3

-thành N2 khí quyển, giúp khép kín vòng tuần hoàn nitơ trong thủy vực, đồng thời hạn chế một tác nhân gây hại cho động vật nuôi trồng Trong nước nuôi tôm cá cũng như tại các nhà máy xử lý nước thải, số lượng và hoạt động sinh lý của nhóm

vi khuẩn nitrat hóa và vi khuẩn phản nitrat hóa được xem như các thông số giới hạn tốc độ quá trình chuyển hóa sinh học của nitơ trong nước [26]

Vi sinh vật dị dưỡng sinh trưởng và thu nhận năng lượng bằng nhiều phản ứng xúc tác enzym Các enzym có tính đặc hiệu cơ chất cũng như có hiệu quả xúc tác chuyển hóa cao Một số enzym cũng tham gia vào chuỗi các phản ứng sinh hóa

để hiệp đồng chuyển hóa một số cơ chất khó phân hủy Có 2 loại enzym là enzym nội bào vào enzym ngoại bào Enzym ngoại bào phân hủy các cơ chất cao phân tử

24

thành các phân tử nhỏ hơn để có thể di chuyển vào tế bào qua màng sinh chất Enzym nội bào xúc tác các phản ứng oxy hóa cơ chất thu năng lượng và sinh tổng hợp trong tế bào Trong quá trình phân hủy cơ chất hữu cơ, vai trò hàng đầu thuộc về các vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp các enzym thủy phân ngoại bào

1.5.2 Biện pháp sử dụng các chế phẩm sinh học (probiotic) và vai trò của nó trong việc cải tạo nước đầm nuôi t rồng thủy sản

 Định nghĩa về Probiotic

Theo định nghĩa của tổ chức y tế thế giới WHO, probiotic là “những vi sinh

vật còn sống khi đưa vào cơ thể một lượng đầy đủ sẽ có lợi cho sức khỏe của cơ thể” [48] Probiotic có nguồn gốc từ tiếng Hy La ̣p , ghép từ chữ pro l à vì và biotic là sự sống, nên tiếng Viê ̣t thường go ̣i là trợ sinh Thuâ ̣t ngữ probiotic được dùng để

mô tả những chất sinh ra từ vi sinh vâ ̣t có tác dụng tăng trưởng vi sinh vâ ̣t hoă ̣c sinh

vâ ̣t khác Năm 1959, Rl Fuller đi ̣nh nghĩ a rõ hơn Probiotics hay vi sinh vâ ̣t probiotic là những vi sinh vâ ̣t sống , bổ sung vào thức ăn có tác dụng cân bằng hê ̣ vi khuẩn đường ruô ̣t và có tác dụng hữu ích cho đô ̣ng vâ ̣t chủ [54] Gần đây , định nghĩa này được mở rộng hơ n Probiotic là chế phẩm bao gồm vi sinh vâ ̣t sống có tác dụng hữu ích cho động vật và người sử dụng Tác dụng hữu ích bao gồm tác dụng làm cân bằng hệ vi sinh đường ruột hay sinh chất đối kháng làm giảm số lượng cá thể hay tăng lươ ̣ng kháng thể kích thích hê ̣ thống miễn di ̣ch hoă ̣c là cung cấp enzym trong quá trình trao đổi chất của vi khuẩn Probiotic là giảm các vi sinh vâ ̣t có ha ̣i (các vi sinh vật cạnh tranh th ức ăn và tiết các chất đô ̣c ản h hưởng xấu tới hoa ̣t đô ̣ng sống của vâ ̣t chủ ), làm tăng các vi sinh v ật có lợi (đó là các sinh vâ ̣t ca ̣nh tranh th ức

ăn và vi ̣ trí bám vào các mô với vi sinh vâ ̣t có ha ̣i , chún g tiết ra các chất diê ̣t khuẩn và vitamin K cho cơ thể )

Ngày nay, khái niệm probiotic còn được mở rộng sang lĩnh vực môi trường Đưa probiotic vào môi trường nước để tạo sự cân bằng giữa các vi sinh vật trong môi trường Ở nước ta, việc sử dụng các chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy sản và sản xuất giống chỉ mới ứng dụng nhiều từ năm 2000 trở lại đây, qua thực tế sử dụng đã cho thấy kết quả tốt Hiện nay ở Việt Nam, hầu hết các cơ sở nuôi tôm cá đều sử dụng chế phẩm vi sinh vật probiotic Với mục tiêu tăng nhanh sản lượng, người ta thả tôm, cá với mật độ quá dày trong khi không có biện pháp xử lý môi trường thích hợp, dẫn đến hiện tượng thối đầm, làm giảm oxy hòa tan khiến tôm, cá ngạt thở Hàm lượng các NH3, NH4+, NO2-, NO3-, H2S… tăng cao sẽ khiến tôm cá

25

giảm sự chống đỡ với môi trường bất lợi và tác nhân gây bệnh, nếu vượt quá ngưỡng sẽ chết

 Probiotic trong nuôi trồng thuỷ sản

Probiotic là chế phẩm của công nghê ̣ sinh ho ̣c ứng dụng vi sinh vâ ̣t trong các vấn đề thực tiễn Trong nuôi trồng thủy sản , probiotic hiê ̣n đang được coi là mô ̣t liê ̣u pháp an toàn và hiê ̣u quả nhằm thay thế cho các loa ̣i thuốc kháng sinh và hóa

chất đã được sử dụng trước đây [26]

Probiotic có thành phần là mô ̣t chủng đơn hoă ̣c mô ̣t h ỗn hợp các chủng vi sinh vâ ̣t hữu ích Nhóm vi sinh vật hữu ích ấy tham gia tích cực vào các quá trình phân hủy sinh ho ̣c bùn và chất thải hữu cơ , chúng có khả năng cạnh tranh ức chế các vi sinh vật gây bệnh cho động vật hủy sinh , chúng rất an toàn với môi trườ ng và cũng không gây độc hại đối với người và vật nuôi Đối với các hình thức nuôi trồng khác nhau , viê ̣c sử dụng chế phẩm sinh ho ̣c được nhìn nhâ ̣n như biê ̣n phấp tích cực nhất bởi vì chế phẩm sinh ho ̣c có tác dụng giảm đô ̣c tố trong đầm , chủ yếu là NH 3và H2S, giảm mùi hôi , cải thiện màu nước , ổn định pH và cân bằng hệ sinh thái trong đầm Chế phẩm sinh ho ̣c cũng có tác dụng phòng bê ̣nh , giảm thiểu hiện tượng gây bê ̣nh cho tôm Ngoài ra , việc áp dụng chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy sản còn giúp đối tượng nuôi hấp thụ thức ăn dễ hơn , giảm hệ số tiêu thụ thức ăn , tăng năng suất thu hoa ̣ch từ 20 – 30% [60] Bên ca ̣nh đó , viê ̣c sử dụng chế phẩm sinh ho ̣c tron g nuôi trồng thủy sản sẽ ha ̣n chế viê ̣c sử dụng hóa chất và chất kháng sinh, yếu tốt gây ra hậu quả của viê ̣c nuôi trồng thủy sản kém bền vững Thực tế cho thấy , những cơ sở sử dụng chế phẩm sinh ho ̣c đã đa ̣t năng suất thủy sản khá

cao, giảm thiểu nguy cơ mắc bệnh

Sử dụng chế phẩm probiotic cho kết quả ưu viê ̣t hơn hẳn sử dụng hóa chất cũng như thuốc kháng sinh vì hóa chất chỉ làm sạch nước tạm thời và chúng giết

chết hàng loa ̣t tảo tro ng đầm Hơn nữa , thay vì cần phải làm sa ̣ch chất hữu cơ và lắng că ̣n bùn thì hóa chất la ̣i góp phần hình thành nên lớp bùn dày hơn ở đáy đầm , tạo điều kiện cho các vi sinh vật gây hại phát triển Bên ca ̣nh đó , nhiều loài tôm, cá và động vật thủy sinh khác cũng có thể bị giết chết bởi hóa chất Hâ ̣u quả của viê ̣c dùng thuốc kháng sinh cũng không kém phần nghiêm trọng Chất kháng sinh cũng giết chết nhiều loa ̣i vi khuẩn , kể cả vi khuẩn gây ha ̣ i lẫn vi khuẩn có ích , do đó làm giảm tốc độ các quá trình các quá trình chuyển hóa sinh học trong nước , đồng thờ i , giảm khả năng tạo miễn dịch tự nhiên của chúng Hơn nữa , sử dụng thuốc kháng

26

sinh lâu dài sẽ dẫn đến xuất hiê ̣n các chủng vi khuẩn gây bê ̣nh kháng thuốc Hiện tươ ̣ng kháng thuốc cũng có thể xuất hiê ̣n ở người thông qua chuỗi thức ăn khi con người sử dụng các sản phẩm thủy sản nuôi trồng Vì thế , hiện nay các loa ̣i thuốc kháng sinh đều bi ̣ cấm sử dụng trong nuôi trồng thủy sản Mặt khác , tôm cá là những sinh vâ ̣t rất nha ̣y cảm với bê ̣nh tâ ̣t , dễ bi ̣ tổn thương và bi ̣ tấn công bởi nhiều tác động, đôi khi viê ̣c sử dụng chất kháng sinh liên tục đã là m mất đi sản lượng tôm cá khổng lồ , ví dụ vở nhiều nơi trên thế giới đã từng bị mất đến 80% sản lượng thủy sản Như vâ ̣y , rõ ràng cần phải có một sự kiểm soát khác thay thế thuốc kháng sinh , hóa chất và probiotic đã t hể hiê ̣n được vai trò ấy

Hiện nay các loài vi sinh vật: Bacillus, Lactobacillus, nhóm vi khuẩn quang

dưỡng, hóa dưỡng… được sử dụng chủ yếu để sản xuất các chế phẩm sinh học Những nghiên cứu cho thấy rằng các loài vi khuẩn này đều không độc hại, dễ nuôi cấy, dễ tồn tại trong môi trường nước và đất nghèo dinh dưỡng Chúng có khả năng phân huỷ thức ăn thừa, chất thải hữu cơ và làm sạch môi trường nhờ enzym do chúng tổng hợp được Ngoài ra chúng còn có khả năng sinh các chất kháng khuẩn như bacteriocin, một chất có hoạt tính kháng sinh được dùng nhiều trong chăn nuôi, bảo quản thực phẩm để nâng cao hiệu suất tăng trưởng, hiệu suất sử dụng thức ăn của vật nuôi, làm giảm sự phát triển của những vi sinh vật có hại Chính nhờ những đặc điểm này mà chúng được dùng để sản xuất các chế phẩm nhằm cải thiện môi trường nước, nâng cao hiệu suất kinh tế, hạn chế dịch bệnh cho tôm cá

 Mục đích của việc sử dụng chế phẩm probiotic

Trong nuôi trồng thủy sản sử dụng chế phẩm probiotic nhằm các mục đích:

- Giảm độc tố trong ao ở mức thấp nhất, giảm mùi hôi thối của nước

- Cải thiện màu nước, ổn định pH, cân bằng hệ sinh thái trong ao

- Phân hủy các chất hữu cơ, phòng tảo nở hoa, hấp thu nguồn tảo chết trong

ao, giảm độ nhớt của nước

- Cạnh tranh thức ăn làm giảm lượng vi khuẩn có hại, phòng bệnh

- Tăng sự hòa tan oxy

- Kích thích hệ miễn dịch trong tôm để kháng bệnh, giảm sốc khi môi trường thay đổi đột ngột

- Giúp tôm cá hấp thu thức ăn tốt, giảm hệ số tiêu tốn thức ăn

- Hạn chế được sử dụng thuốc kháng sinh và hóa chất

27

- Giảm số lần thay nước trong quá trình nuôi

 Một số nhóm vi khuẩn thường được sử dụng trong sản xuất probiotic cho tôm cá

 Nhóm Bacillus

Vi khuẩn thuộc chi Bacillus phân bố rất rộng trong tự nhiên, trong rất nhiều

môi trường (đất, nước, không khí, thực phẩm…) và gồm nhiều nhóm sinh lí sinh thái khác nhau (ưa ấm, ưa nhiệt, ưa lạnh…), với gần khoảng gần 500 loài và dưới loài Do sự đa dạng sinh thái và đa dạng loài như vậy các ho ạt chất sinh học của chúng cũng vô cùng phong phú: các enzym ngoại bào, các chất kháng khuẩn và kháng nấm, các chất kích thích sinh trưởng thực vật, các chất ho ạt động bề mặt…[32]

Bacillus là những vi khuẩn Gram dương, hình que, có bào tử, sinh trưởng

trong điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc, thuộc nhóm vi khuẩn dị dưỡng

hoại sinh Về dinh dưỡng và sinh trưởng nhìn chung Bacillus là những vi khuẩn hóa

tự dưỡng hữu cơ tùy tiện có khả năng sử dụng nhiều các hợp chất hữu cơ đơn giản như là các đường, axit amin, các axit hữu cơ Trong một số trường hợp chúng lên men cacbonhydrat thông qua chuỗi các phản ứng phức tạp tạo ra glycerol và

butanediol Một số ít loài như Bacillus megaterium lại không cần đến các yếu tố

sinh trưởng hữu cơ, một số khác sinh trưởng lại cần có vitamin B hoặc các axit

amin Phần lớn Bacillus là các vi khuẩn ưa ấm với nhiệt độ sinh trưởng tối ưu từ

30 - 45oC một số loài có thể sinh trưởng ở nhiệt độ 65oC Một số loài ưa lạnh có thể sinh trưởng và hình thành nội bào tử ở 0oC pH sinh trưởng rất khác nhau từ 2 -11

Đa số Bacillus sinh trưởng tốt ở pH = 7, một số phù hợp với pH = 9 như Bacillus

alcalophillus, hay có loài phù hợp với pH = 2 - 6 như Bacillus acidocaldrius [32]

Trừ Bacillus anthracis gây bệnh than cho người, tất cả các Bacillus khác được coi là không độc hại cho người Bacillus làm sạch môi trường nước nhờ khả

năng sinh enzym phân hủy chất hữu cơ nguồn gốc từ thức ăn thừa, chất thải từ tôm cá: proteaza phân hủy protein, amylaza phân hủy tinh bột, xenlulaza phân hủy xenlulozơ, kitinaza phân giải kitin Ngoài chức năng phân giải các hợp chất hữu cơ làm sạch môi trường thì chúng còn có tác dụng kiểm soát sự phát triển quá mức vi sinh vật gây bệnh do cơ chế cạnh tranh nguồn dinh dưỡng, giữ cho môi trường luôn

ở trạng thái cân bằng sinh học Đặc điểm quan trọng nhất của chi Bacillus là có khả

năng tạo nội bào tử, nhất là trong những điều kiện bất lợi như cạn kiệt nguồn dinh

28

dưỡng hay điều kiện bất lợi về nhiệt độ cao, tia bức xạ hóa chất… Bào tử Bacillus

có thể tồn tại rất lâu thậm chí trong nhiều năm, khi gặp điều kiện thuận lợi có thể nảy mầm, phát triển thành tế bào dinh dưỡng Trong quá trình hình thành bào tử,

Bacillus thường sản sinh ra các hợp chất có hoạt tính sinh học, ứng dụng trong

nhiều lĩnh vực Một trong những đặc tính đó là sinh enzym phân hủy hữu cơ như proteaza, amylaza, xenlulaza Proteaza là enzym xúc tác sự thủy phân liên kết peptit (CO-NH) trong phân t ử protein và các chất tương tự Sản phẩm thủy phân là các axit amin, sản phẩm trung gian là các peptit có mạch dài ngắn khác nhau Enzym amylaza có tác dụng thủy phân tinh bột Quá trình trải qua giai đoạn dextrin hóa, khi đó chỉ một số liên kết trong phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lượng dextrin và giai đoạn đường hóa Trong giai đoạn này các dextrin vừa được tạo thành

bị phân hủy tiếp thành các phân t ử thấp hơn như maltozơ, isomaltozơ, glucozơ Enzym xenlulaza xúc tác sự thủy phân xenlulozơ thành s ản phẩm trung gian xenlubiozơ và sản phẩm cuối cùng là glucozơ Các sản phẩm cuối cùng của sự phân hủy chất hữu cơ nhờ hệ enzym proteaza, amylaza, xenlulaza là các axit amin và glucozơ Đó là nguồn dinh dưỡng cho nhiều loại vi sinh vật có ích, giúp cho chúng phát triển mạnh và làm c ải thiện chất lượng nước [32]

 Nhóm vi khuẩn lactic

Một trong những nhóm vi khuẩn điển hình có ích đối với môi trường đầm nuôi tôm cá là nhóm vi khuẩn lactic Các vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ

Lactobacteriacae Chúng không đồng nhất về mặt hình thái, các giống khác nhau có

hình dạng và kích thước khác nhau Nhưng nhìn chung chúng được chia thành hai loại hình cầu và hình que Ngoài ra hình dạng và kích thước tế bào vi khuẩn lactic còn phụ thuộc vào môi trường, điều kiện nuôi cấy, sự có mặt của oxy và tuổi tế bào

Streptococcus có tế bào hình c ầu ho ặc hình ovan, đường kính khoảng

0,5 -1,0 µm, sắp xếp riêng biệt, cặp đôi ho ặc thành chuỗi dài Tuy nhiên, một số chủng thuộc loài này có thể có dạng hơi giống trực khuẩn vì có kích thước chiều dài

lớn hơn chiều rộng, chẳng hạn như Streptococus lactic [9]

Leuconostoc có hình dạng hơi dài ho ặc hình ovan, đường kính từ 0,5 - 0,8µm

và chiều dài khoảng 1,6µm Đôi khi chúng có dạng hơi tròn, chiều dài khoảng

1 - 3µm, sắp xếp thành chuỗi và không tạo thành đám [9 ]

Lactobacillus có hình que Đây là loại vi khuẩn phổ biến nhất Hình dạng của chúng thay đổi từ hình c ầu cho đến hình que dài Chẳng hạn L plantatum có

29

dạng hình que kích thước từ 0,7-1,1µm đến 3-8µm, sắp xếp thành chuỗi ho ặc đứng

riêng lẻ, trong khi L casei có dạng hình que ngắn hoặc hình que dài, tế bào hình

que mảnh, đôi khi hơi cong, sắp xếp thành cặp hay chuỗi [9]

Về hình thái, vi khuẩn lactic có hình dạnh không đồng nhất Nhưng về mặt sinh lý chúng lại có những điểm tương đối đồng nhất Chúng đều là những vi khuẩn Gram (+), không có khả năng tạo bào tử, không di động, sinh axit lactic trong quá trình phát triển, catalase, oxydase và khử nitrat âm tính, không chứa các xitocrom,

hô hấp kỵ khí hoặc vi hiếu khí [10]

Mỗi loài vi khuẩn khác nhau có nhu cầu về dinh dưỡng cũng khác nhau Chúng không những cần cung cấp đủ các chất dinh dưỡng: cacbon, nitơ, muối khoáng… mà còn cần các chất kích thích sinh trưởng

Nhóm vi khuẩn lactic có khả năng kiểm soát vi sinh vật gây bệnh trong môi trường nhờ sinh chất đối kháng như axit lactic, bacteriocin Ngoài vai trò kiểm soát

vi sinh vật gây bệnh trong môi trường thì chúng cũng có tác dụng làm giảm mùi hôi của đầm nuôi Quan trọng hơn c ả, sử dụng nhóm vi khuẩn này còn có tác dụng hạn chế việc sử dụng kháng sinh, đảm bảo tiêu chuẩn vệ sinh thực phẩm cho sản phẩm thủy sản Khi sử dụng nhóm vi khuẩn lactic để bổ sung vào thức ăn tôm cá, ngoài mục đích làm cân bằng khu hệ vi sinh vật đường ruột, ngăn cản sự xâm nhập của vi sinh vật có hại, tăng khả năng phòng ngừa một số bệnh đường ruột thì chúng còn có tác dụng tăng khả năng tiêu hóa và hấp thụ thức ăn, giúp cho tôm cá nuôi phát triển khỏe mạnh, tăng trưởng nhanh [5]

 Nhóm vi khuẩn nitrat hóa tự dƣỡng

Trước đây, theo phân loại truyền thống đã xếp các chủng vi khuẩn nitrat hóa

chung vào cùng một nhóm thuộc họ Nitrobacteriaceae sau đó, dựa vào khả năng

oxy hóa các cơ chất vô cơ của vi khuẩn nitrat hóa mà người ta đã chia chúng thành

2 nhóm, đó là nhóm vi khuẩn oxy hóa amôni và nhóm vi khuẩn oxy hóa nitrit [53]

 Vi khuẩn oxy hóa amôni hay còn gọi là vi khuẩn nitroso là nhóm vi khuẩn Gram âm, hóa t ự dưỡng và hiếu khí bắt buộc Vi khuẩn này lấy năng lượng từ quá trình oxy hóa amôni thành nitrit Quá trình oxy hóa amôni xảy

ra theo phương trình sau:

Trong hệ thống phân loại hiện nay, người ta chia nhóm vi khuẩn amôni hóa thành 3 chi, dựa vào sự khác biệt về hình dạng tế bào, kiểu hình và tổ chức nội bào

Đó là các chi Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosospira Tế bào vi khuẩn thuộc chi Nitrosomonas có hình que thẳng, chi này là phổ biến nhất trong nhóm vi khuẩn

amôni hóa, có vùng phân bố rộng, chúng sống trong đất, nước ngọt, bùn, nước lợ,

biển Chi Nitrosococcus tế bào có hình cầu đặc trưng, tế bào có roi nên có khả năng

di chuyển Tế bào vi khuẩn thuộc chi Nitrosospira có hình xoắn ốc[62]

 Nhóm vi khuẩn oxy hóa nitrit tự dưỡng được biết đến như là vi khuẩn tự dưỡng hóa năng (chemoautotroph), Gram âm và hiếu khí Giống như vi khuẩn oxy hóa amôni, vi khuẩn oxy hóa nitrit sử dụng nguồn cacbon là CO2thông qua chu trình Calvin-Benson [41] Quá trình oxy hóa nitrit xảy ra như sau:

Tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn oxy hóa nitrit phụ thuộc vào nồng độ cơ chất, nhiệt độ, pH, ánh sáng và nồng độ oxy hòa tan Các chủng vi khuẩn nitrit hóa

tự dưỡng sinh trưởng tốt ở nồng độ nitrit từ 2 - 30 mM, nồng độ nitrit quá cao có thể gây ức chế sinh trưởng của tế bào Vi khuẩn oxy hóa nitrit có thể sinh trưởng bình thường trong môi trường tự nhiên ở dải pH = 6 - 8 Điều kiện tối ưu cho sinh trưởng là pH = 7 - 8 Nhiệt độ lý tưởng cho sinh trưởng của chúng là 25 - 30o

C trong môi trường không khí [62]

Tốc độ của giai đoạn (1) xảy ra nhanh gấp 3 lần so với giai đoạn (2) Bằng thực nghiệm người ta đã chứng minh rằng lượng oxy tiêu hao để oxy hóa 1mg nitơ của muối amôni ở giai đoạn tạo nitrit là 343 mg O2, còn ở giai đoạn tạo nitrat là 4,5

mg O2 Sự có mặt của nitrat trong nước thải phản ánh mức độ khoáng hóa hoàn thành các chất bẩn hữu cơ Năng lượng sinh ra từ phản ứng nitrat hóa được vi khuẩn sử dụng trong quá trình tổng hợp tế bào [5]

31

Ngày nay, vi khuẩn oxy hóa nitrit được phân loại thành 4 chi: Nitrobacter,

Nitrococcus, Nitrospina và Nitrospira Tế bào vi khuẩn thuộc chi Nitrobacter có

hình que ngắn, màng trong tế bào chứa mũ phân cực Tế bào vi khuẩn thuộc chi

Nitrococcus có hình tròn, màng trong tế bào hình ống Tế bào vi khuẩn thuộc chi Nitrospina có hình que, màng trong tế bào dạng túi Tế bào vi khuẩn thuộc chi Nitrospira có hình xo ắn và không xuất hiện màng trong tế bào [62]

Các vi khuẩn oxy hóa nitrit có khả năng thích nghi cao với các điều kiện môi trường khác nhau và chúng thường tồn tại cùng với vi khuẩn oxy hóa amôni do các

vi khuẩn này đã cung cấp nitrit cho chúng trong môi trường hiếu khí [41]

Trong các chế phẩm dùng cho ao, đầm nuôi tôm cá hiện nay người ta thường

bổ sung nhóm vi khuẩn nitrat hóa tự dưỡng cụ thể là chi Nitrosomonas và chi

Nitrobacter Vi khuẩn thuộc hai chi này đóng vai trò quan trọng trong việc giảm các

độc tố trong môi trường nước, chuyển hóa các chất độc như amôni và hợp chất nitơ,

do đó sẽ làm giảm mùi hôi trong nước, giúp tôm cá nuôi phát triển tốt [7]

1.5.3 Ưu điểm va ̀ nhược điểm của biê ̣n phấp sử du ̣ng vi sinh vâ ̣t trong xử lý nước nuôi trồng thủy sản

- Ưu điểm: các loài vi sinh vật được dùng ngày càng nhiều trong xử lý môi trường nước nuôi trồng thủy sản và đem lại nhiều lợi ích cho con người và môi trường sống mà các phương pháp khác không có được như : an toàn đối với người và động vật , đă ̣c hiê ̣u đối với vâ ̣t chủ , thích hợp với các phương pháp phòng trừ khác, thời gian bán hủy ngắn nên không tồn đọng lâu để gây ô nhiễm môi trường sống, có khả năng tự nhân lên (tự sinh sản ), có khả năng ức chế các vi sinh vật đã kháng thuốc hóa học

- Nhược điểm: thời gian phát huy tác dụng châ ̣m , tác động không triệt để , hiê ̣u quả phương pháp chi ̣u ảnh hưởng lớn vào điều kiê ̣n ngoa ̣i cảnh , kết quả thu đươ ̣c thường không ổn đi ̣nh

Để ha ̣n chế các nhược điểm này , chúng ta cần phải tuyển chọn các chủng vi sinh vâ ̣t có tính đối kh áng tốt nhất , nghiên cứu sử dụng kết hợp nhiều chủng

32

Chương 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng

2.1.1 Chủng giống

- Các chủng VSV dùng trong nghiên cứu được tuyển chọ n từ các chủng vi

khuẩn phân lập từ các mẫu đ ất, nước tại địa bàn Hà Nội

- Các chủng Vi sinh vật kiểm định lấy từ bảo tàng giống chuẩn VSV, Viện

VSV và Công Nghệ Sinh học- ĐH Quốc gia Hà Nội, bao gồm các chủng E coli

ATCC 25922; Salmonella typhi ATCC 14028; Proteus mirabilis; Staphylococcus

aureus ATCC 25923; Vibrio parahaemolyticus; Shigella flexneri ATCC 29903D;

- Buồng cấy vô trù ng (Pháp)

- Máy lắc Inforsagch – 4103 (Pháp)

- Tủ sấy , tủ ấm (Trung Quốc )

- Cân phân tích (Nhâ ̣t )

- Nồi khử trùng Tomy SS 325 (Nhâ ̣t )

- Máy đo DO meter Hanna HI 8043 (Hàn Quốc )

- Máy đo pH Hanna 8733 (Hàn Quốc )

- Tủ cấy (Trung Quốc )

- Tủ ổn nhiệt (Nhật )

- Tủ lạnh (Nhật )

- Kính hiển vi quang học OLYMPUS (Nhật Bản)

- Máy li tâm

2.1.3 Môi trươ ̀ng

2.1.3.1 Môi trươ ̀ ng phân lập và nuôi cấy vi sinh vật

- Môi trườ ng tha ̣ch thường cải t iến (g/l):

1 lít

K2HPO4

CH3COONa.2H2O MgSO4

MnSO4.4H2O CaCO3

Thạch

2g 5g 0,58g 0,28g 5g 14-15g

- Môi trườ ng ISP 4 (g/l) pH = 7

1ml

1 lít

CaCO3(NH4)SO4Tinh bô ̣t tan Thạch

2g 2g 10g

14 - 15 g

Dịch vi lượng : 0,1g FeSO4.7H2O + 0,1g MnCl + 0,1g ZnSO4

Môi trườ ng giữ giống thêm 5g peptone

Đun sôi môi trường sau đó đổ vào bình tam giác và ống nghiê ̣m đã khử

trùng Khử trùng môi trường ở 1210

C/ 30 phút , làm nghiêng mặt thạch Để 370C trong 48h trướ c khi dụng hoă ̣c giữ ở 40C

- Môi trườ ng nuôi Nitrosomonas:

C trong 30 phút , để nguội môi trường trong 24h giữ ở

4oC

35

2.2 Phương pha ́ p nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp phân lập vi khuẩ n

- Lấy 1ml mẫu đưa vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất đã được khử trùng để được độ pha loãng 10-1 Vontex đều sau đó lấy 1ml dung dịch ở độ pha loãng 10-1

cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng ta được độ pha loãng 10-2 Tiếp tục như vậy đến nồng độ 10-6

2.2.2 Phân loại vi sinh vật

Phân loại theo phương pháp truyền thống

Phương pháp phân loại cổ điển là phương pháp phân loại các chủng vi khuẩn dựa vào các đặc điểm về hình thái, đặc điểm sinh lí, sinh hóa Dựa vào đó, người ta phân loại chúng vào các chi

Phân lọai theo phương pháp sinh học phân tử

 Phương pháp tách ADN vi khuẩn

- Lấy 2 vòng que cấy vi khuẩn hoà vào 200 l TE trong ống Eppendoff

- Thêm lyzozym vào, trộn đều, sau đó ủ ở 37oC trong 30 phút

- Thêm 100 l SDS 10%, ủ ở 37oC trong 30 phút

- Thêm 300 l PCI (phenol: chloroform: isoamyl alcohol) vào, trộn đều trong đá lạnh, sau đó ly tâm với vận tốc 15.000 vòng/phút, sau ly tâm, l ấy dịch trên

- (Bước này được lặp lại 2 lần)

- Dùng etanol lạnh với thể tích gấp 2 lần thể tích mẫu để tủa ADN

- Rửa tủa bằng etanol 70%

- Làm khô ADN bằng máy làm khô chân không

- Thêm 30-50 l nước, bảo quản để dùng dần

 Điện di trên gel agaroza

36

- Đây là kỹ thuật quan trọng vì đó là cách chủ yếu làm cho các đoạn axit nucleic hiển thị trực tiếp Phương pháp này dựa trên một đặc tính của axit nucleic là ở pH trung tính mang điện tích âm nhờ các nhóm photphat nằm trên khung photphodieste của các sợi axit nucleic Điều đó có nghĩa là các phân tử sẽ chạy về cực dương khi đặt trong điện trường Kỹ thuật này được tiến hành trên một đệm gel

có tác dụng phân tách các axit nucleic theo kích thước

- Tiến hành: Đun tan 1% agaroza trong dung dịch đệm TAE 1x đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập trong 300ml dung dịch 1X TAE Trộn đều 2l dung dịch loading buffer 6x với 5l mẫu, nhỏ vào giếng Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế 100V, cường độ dòng điện 80mA trong 30 phút, bỏ ra ngâm trong dung dịch EtBr (nồng độ 0,5 l/ml) 20 phút vớt ra Quan sát vạch ADN trên máy soi gel

Mồi cho phản ứng PCR

Mồi xuôi: 5'- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3' tương ứng với vị trí nucleotit 27 đến 47

Mồi ngược: 5'- AAAGGAGGTGATCCAGCC -3' tương ứng với vị trí

nucleotit 1525 đến 1507

- Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR

Bước tiến hành Nhiệt độ ( 0

 Phản ứng khuếch đại ADN cho giải trình tự

Terminator Ready Reaction Mix 8 l Mồi 1 l

Sử dụng bộ kít Cycle sequencing với hỗn hợp phản ứng như sau :

- Chu trình nhiệt

Bước tiến hành Nhiệt độ (o

 Xác định hàm lượng axit nucleic

Do trong thực tế thường phải sử dụng những lượng axit nucleic rất nhỏ (thường

là micro-, nano- hoặc picogram) khi tiến hành các thí nghiệm tách dòng Không thể xác định số lượng này một cách trực tiếp mà nồng độ của dung dịch axit nucleic được xác định bằng cách đo độ hấp thụ tại bước sóng 260 nm (A260) trong máy đo quang phổ kế Một đơn vị (1,0) giá trị hấp thụ bước sóng 260 nm tương đương với nồng độ 50g/ml của ADN sợi kép, hoặc tương đương với nồng độ 40g/ml của ADN hoặc ARN mạch

38

đơn Tỉ số A260/A280 là chỉ số cho thấy độ nhiễm các chất như phenol hoặc protein Tỷ số

A260/A280 là 1,8 đối với mẫu ADN sạch

 Đọc trình tự ADN

Trình tự của rADN 16S của các chủng vi khuẩn được đọc trực tiếp trên máy đọc trình tự tự động ABI 3100 Avant Sau đó kết quả trình tự được so sánh với các trật tự của các loài đã có trong ngân hàng gen quốc tế để xác định đến tên loài

2.2.3 Phương pháp bảo quản giống

Vi khuẩn được nuôi trong ống thạch nghiêng thạch thường, nuôi ở nhiệt độ phòng Sau kho ảng 10 - 14 ngày khi vi khuẩn đã mọc tốt cất vào tủ mát ở nhiệt độ 4-6oC Sau 1 - 2 tháng c ấy truyền lại một lần

Nhằm bảo quản được giống lâu hơn, để giống trong ố ng cát, trong paraffin lỏng vô trùng giữ lạnh sâu trong glycerin ho ặc đông khô, bảo quản được từ 6 tháng đến 2 năm

2.2.4 Phương pháp xác định hoạt tính enzym và hoạt tính kháng khuẩn

Xác định hoạt tính enzym

Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào (proteaza, kitinaza, xenlulaza, amylaza) trong dịch nuôi cấy bằng phương pháp khuyếch tán trên thạch chứa 1% cơ chất tương ứng (cazein, kitin, CMC, tinh bột tan)

Môi trường gồm cơ chất và thạch được khử trùng ở 1atm trong 30 phút, sau

đó được đổ vào các đĩa peptri đã được vô trùng, với độ dày thạch khoảng 3mm, đợi nguội, dùng khoan nút chai để đục các lỗ thạch trên môi trường Nhỏ 200µl dịch nuôi c ấy vi sinh vật vào các lỗ thạch, rồi để vào tủ lạnh 4 - 5 giờ cho enzym khuyếch tán vào thạch, sau đó chuyển vào tủ ấm 30 - 32oC Sau 24 giờ đem ra hiện vòng phân giải bằng cách nhuộm màu các đĩa bằng dung dịch Lugol (với cơ chất là CMC, kitin, tinh bột) và bằng axit triclo axetic với cơ chất là cazein

Hoạt tính enzym được xác định qua kích thước vòng phân giải theo công thức: Ho ạt tính enzym = D - d (mm)

Trong đó: D là đường kính vòng phân giải, d là đường kính lỗ khoan

Xác định hoạt tính kháng khuẩn

* Phương pháp đục lỗ thạch

39

Dùng khoan nút chai đục các lỗ trên môi trường thạch đã cấy VSV kiểm định trong đĩa peptri Dịch nuôi vi khuẩn 2 ngày ở nhiệt độ thích hợp được ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút, ở 4oC trong 15 phút sau đó được nhỏ với lượng 0,1 ml vào mỗi

lỗ thạch Đọc kết quả sau 3 ngày ho ạt tính kháng sinh xác định dựa vào kích thước vòng vô khuẩn (D - d, mm) Trong đó, D là kích thước vòng vô khuẩn, d là kích thước thỏi thạch

* Phương pháp đặt thỏi thạch

Vi sinh vật được nuôi trong môi trường ở nhiệt độ thích hợp trong các đĩa petri Dùng khoan nút chai khoan các thỏi thạch đặt vào môi trường đã cấy VSV kiểm định Để trong tủ lạnh từ 4 - 8 giờ cho chất kháng sinh khuếch tán vào môi trường, rồi đặt vào tủ ấm (30o

C) Đọc kết quả sau một ngày đối với vi sinh vật kiểm định là vi khuẩn

Hoạt tính enzym/hoạt tính kháng sinh (HTE/HTKS) xác định theo công thức:

HTE/HTKS = D – d (mm)

D: Đường kính vòng phân giải/vòng vô khuẩn + đường kính thỏi thạch

2.2.5 Xác định sinh khối bằng phương pháp đo mật độ quang học

Số lượng tế bào VSV trong dịch nuôi có thể xác định gián tiếp bằng cách đo mật độ quang học OD Dịch nuôi được pha loãng 5 lần, đo OD ở bước sóng 660nm

2.2.6 Phương pháp định lượng axit lactic

Nuôi vi khuẩn trong môi trường lỏng Lấy 10ml dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 20ml nước cất, thêm 3 giọt chỉ thị phenolphtalein 1% Chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1% cho đến khi xuất hiện màu hồng không đổi trong 1 phút

Lấy số ml NaOH tiêu tốn khi chuẩn độ nhân với 10 ta được số độ Therner (oT) 10o tương đương với 9mg axit lactic

2.2.7 Phương pháp nghiên cứu khả năng chuyển hóa các hợp chất chứa nitơ của tế bào

5mg/l

Lập đường chuẩn: Lấy 6 ống nghiệm cho lần lượt dung dịch nitrit chuẩn nồng độ từ 0,1 đến 5 mg/l và một mẫu trắng Làm tuần tự các thao tác đã trình bày ở trên Sau đó mang đi đo mật độ quang học, vẽ đường chuẩn và xác định phương trình hồi quy của đường chuẩn trên Kết quả thu được trình bày ở bảng và biểu diễn trên đồ thị

Định lượng NO 3

theo phương pháp Brucine [49]

Phương pháp dựa trên nguyên tắc giữa phản ứng của nitrat và hợp chất brucine tạo thành phức hợp màu nâu vàng có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 410 mm

Hóa chất: Dung dịch nitrat chứa 100mg N/l; Natri asenit: Hòa tan 0,5g NaAsO2 trong 100 ml nước cất; thuốc thử brucine: hòa tan 1g brucine-sulfate và 0,1g axit sulfanilic trong 70ml nước cất nóng, thêm 3ml axit HCl , làm l ạnh và bổ sung nước cất đến thể tích cuối cùng là 100ml; dung dịch axit sunfuric: bổ sung cẩn