Qui trình sản xuất pectinase và ứng dụng trong CNTP (sản xuất nước quả)

Lịch sử nghiên cứu pectinase bắt đầu từ khi người ta hiểu biết về cấu trúc pectin và cơ chế phân cắt pectin của những enzyme này.Enzyme pectinase là một nhóm enzyme thủy phân các chất pectin. Đây là nhóm enzyme thứ ba được ứng dụng rộng rãi sau amylase và protease.Enzyme pectinase được tìm thấy ở thực vật bậc cao và vi sinh vật. Enzyme pectinase được tổng hợp cảm ứng mạnh trên môi trường bổ sung pectin hay acid polygalacturonic và bị hạn chế khi có nhiều acid galacturonic hoặc glucose.Pectin tan trong nước, ammoniac, dung dịch kiềm, carbonat natri và trong glycerin nóng, không tan trong ethanol.Các pectin tự nhiên định vị trong thành phần của tế bào có thể liên kết với cấu trúc polysaccharide và protein để tạo thành các protopectin không tan.Protopectin tạo độ cứng cho quả xanh, không tan trong nước và có cấu tạo hoá học phức tạp

Trang 1

(sản xuất nước quả)

Qui trình sản xuất pectinase

Trang 2

STT Họ và Tên MSSV Công việc

1 Trương Quang Duy 2005130106 Phân công việc, tổng hợp, soạn P.P

3 Nguyễn Thái Huỳnh Như 2005130030 Ứng dụng trong nước quả

5 Phạm Thị Thu Thảo 2005130005 Ứng dụng trong nước quả

Giới thiêu về pectin, enzyme pectinase

8 Đặng Thủy Tiên 2005130023 Phân loại enzyme pectinase

Trang 3

A Giới thiệu đề tài [2]

• Lịch sử nghiên cứu pectinase bắt đầu từ khi

người ta hiểu biết về cấu trúc pectin và cơ chế phân cắt pectin của những enzyme này

• Enzyme pectinase là một nhóm enzyme thủy phân

các chất pectin Đây là nhóm enzyme thứ ba được ứng dụng rộng rãi sau amylase và protease

• Enzyme pectinase được tìm thấy ở thực vật bậc

cao và vi sinh vật

• Enzyme pectinase được tổng hợp cảm ứng mạnh

trên môi trường bổ sung pectin hay acid polygalacturonic và bị hạn chế khi có nhiều acid galacturonic hoặc glucose

Trang 4

A Giới thiệu đề tài [2]

• Couri và cộng sự (1995) đã nghiên cứu "Sự thao

tác gen trên chủng Aspergillus nhằm làm tăng sự sinh tổng hợp các enzyme phân giải pectin “

• Solis (1997) đã "Cải thiện việc sản xuất

pectinase dùng các thể lai giữa các chủng Aspergillus"

• Năm 2000, trong công trình nghiên cứu "Ảnh hưởng

các nguồn cacbon khác nhau đến sự sinh tổng hợp pectinase của Aspergillus japonicus 586", Maria và cộng sự đã kết hợp nhiều nguồn cacbon vào cùng một môi trường nuôi cấy như: pectin và glucose, pectin và glycerol,…

Trang 5

1 Giới thiệu về Cơ chất PECTIN [1]

Protopectinase

Pectin trong thực vật

Trang 6

• Pectin là hợp chất cao phân tử mạch thẳng có cấu tạo từ sự kết hợp của các acid D-galacturonic và các este methyl của chúng qua các liên kết α–1,4 glucoside

Cấu tạo

Trái cây chứa nhiều Pectin Cấu tạo Pectin

Trang 7

Tính chất

 Pectin tan trong nước, ammoniac, dung dịch kiềm,

carbonat natri và trong glycerin nóng, không tan trong ethanol

 Các pectin tự nhiên định vị trong thành phần của tế

bào có thể liên kết với cấu trúc polysaccharide và protein để tạo thành các protopectin không tan

 Protopectin tạo độ cứng cho quả xanh, không tan

trong nước và có cấu tạo hoá học phức tạp

Trang 8

2 Giới thiệu về Enzyme Pectinase [1]

 Enzyme xúc tác sự phân hủy của các polymer

pectin

 Được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp chỉ

đứng sau amylase và protease

 Vai trò quan trọng trong quá trình bảo quản trái

cây và rau quả

Trang 9

Được phát hiện đầu tiên trong các dịch chiết trái

cây như cà rốt (phát hiện của E.Fremi năm 1840),

cà chua hay đại mạch, khoai tây, trong chanh, dứa,

cỏ ba lá

Trang 10

Trung tâm hoạt động của enzyme pectinase

• Enzyme pectinase chứa vùng có 8 – 10 vòng

xoắn kép về phía phải với 2 vòng tạo thành khe liên kết với cơ chất

• Trung tâm hoạt động có chứa axit amin

Aspartate và Lysine

• Nghiên cứu cho rằng 1 Histidine nằm gần trung tâm hoạt động sẽ ảnh hưởng đến khả năng xúc tác của enzyme

• Nhiệt độ tối ưu của enzyme pectinase khoảng

từ 45 – 550C

Trang 12

• PE xúc tác sự thủy phân của các nhóm methyl

acid pectic và methanol

Pectinesterase (PE)

3 Phân loại enzyme pectinase [2]

Trang 13

• Enzym này hoạt động đặc hiệu với nhóm methyleste của acid galacturonic nằm bên cạnh acid galacturonic không bị este hoá

Trang 14

Trang 15

Protopectinase hoà tan protopectin, tạo thành các pectin hoà tan có mức độ polymer hoá cao

Protopectinase

Trang 17

Các enzym khử

mạch polymer

Trang 18

mạch polymer

Enzym thủy phân liên kết glycoside (Hydrolase)

phân liên kết α-1-4-glycosid đặc hiệu với pectin

có mức độ ester hoá cao

α-1-4-glycosid của acid pectic (acid

polygalacturonic)

Trang 19

• Endo-PMG: phân cắt ngẫu nhiên liên kết α-1-4-glycosid của pectin.

Cơ chế hoạt động của Endo-polymethylgalacturonase

Trang 20

mạch polymer

• Exo-PMG : phân cắt lần lượt liên kết glycosid của pectin từ đầu không khử của mạch pectin

α-1-4-Cơ chế hoạt động của Exo-polymethylgalacturonase

Trang 21

mạch polymer

• Endo-PG: còn gọi là galacturonide) glycanohydrolase, xúc tác thuỷ phân ngẫu nhiên liên kết α-1-4- glycosid trong phân tử acid pectic

poly(1,4-α-D-Cơ chế hoạt động của Endo- Polygalacturonase (Endo-PG)

Polygalacturonase(PG)

Trang 22

Exo-PG: còn gọi là poly (1,4-α-D-galacturonide)

glalacturonohydrolase, xúc tác thuỷ phân lần lượt liên kết α-1-4-glycosid của acid pectic từ đầu không khử.

Cơ chế hoạt động của Exo- Polygalacturonase (Exo-PG)

mạch polymer Polygalacturonase(PG)

Trang 23

• Pectin-transeliminase (poly α–1,4-galaturonite

methylesteglucanoliase) tác dụng trên pectin và

Trang 24

B PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY CHÌM

 Lên men chìm là phương pháp được phổ biến

nhất trong quy trình lên men công nghiệp.

 Thường sử dụng môi trường lỏng thực hiện

trong thùng lên men

 Trong đó có lắp đặt các hệ thống điều khiển

cánh khuấy, hệ thống cung cấp oxy, điều chỉnh

pH, nồng độ chất dinh dưỡng.

 Phương pháp này dùng được cho cả vi sinh vật

hiếu khí và kị khí

1 Khái niệm [3]

Trang 25

Tốn ít mặt bằng trong xây dựng và lắp đặt dây chuyền

Chi phí điện năng, nhân lực và các khoản phụ cho một đơn vị sản phẩm thấp

Các thiết bị lên men chìm đễ cơ khí, tự động hóa

Lượng cơ chất sót thấp nhờ đó tiết kiệm chi phí sản xuất

Ít sinh ra các enzyme tạp nên giảm bớt chi phí cho quá trình tinh sạch

 Ưu điểm [3]

Trang 26

Đòi hỏi trang bị kĩ thuật cao, dễ nhiễm trùng toàn bộ.

Phải sục khí liên tục vì vi sinh vật chỉ sử dụng được oxy hòa tan trong môi trường

Thiết bị phải chịu được áp lực, kín và làm việc với điều kiện vô trùng tuyệt đối

Khí được nén qua hệ thống lọc sạch khí Hệ thống này phức tạp và dễ gây nhiễm môi trường nuôi cấy

 Nhược điểm [3]

Trang 27

Phương pháp

hiếu khí

Phương pháp yếm

khí

2 Phân loại [1]

Trang 28

 Chủng nuôi cấy: A.niger và A.awamori ủ sơ

bộ trong môi trường dinh dưỡng đến khi bắt đầu nứt nanh bào tử, thời gian ủ sơ bộ : 38-42h

 Lượng giống cấy: thường là 2%

 Trong quá trình nuôi cấy, hàm lượng các chất

hoà tan trong môi trường giảm từ 6% xuống còn 1.5-1.8%

 Phương pháp hiếu khí [1]

Trang 29

Aspergillus niger Aspergillus awamori

Trang 30

 Môi trường nuôi cấy: Pectin: 15g/l, Bột mì: 40g/

l, (NH)2SO4 2g/l, KH2PO4: 4g/l, Na2HPO4: 0.2g/l, FeSO4: 0.1g/l, CaCl2: 0.01g/l, MnSO4: 37.8mg/l,

H3PO3: 10ml/l,.

Trang 31

 Thu chế phẩm khô: cần tách sợi nấm ra khỏi

canh trường lỏng Cô đặc chân không canh trường lỏng đến khi hàm lượng chất khô đạt 5- 8% rồi sấy khô trên thiết bị sấy phun

 Điều kiện sấy phun:

 Nhiệt độ chất tải nhiệt đi vào :165-180oC

 Nhiệt độ chất tải nhiệt đi ra : 60-70oC

 Thời gian lưu của chế phẩm enzyme trong thiết

bị sấy phun phải không quá 7 giây và nhiệt độ chế phẩm sau khi sấy phải không quá 40oC

Trang 32

 Môi trường: bã củ cải 2%; (NH4)2HPO4 0.75%;

KH2PO4 0.1%; CaCO3 0.3%; nước chiết ngô

0.5%.

 Chủng nuôi cấy: C.pectinofermentants 15 ,

ở trạng thái canh trường chứa bào tử và được cấy với lượng 4% theo thể tích

 pH ban đầu: 6.5-7.0

 Nhiệt độ nuôi cấy: 35oC.

 Sự tích luỹ enzyme sẽ tối đa tương ứng với

pha ổn định của sự sinh trưởng qua 55-60h.

 Phương pháp yếm khí [1]

Trang 33

 Ngoài ra, Cl.felsineum cũng có thể được nuôi cấy yếm

khí để thu pectinase

 Thành phần môi trường: lactose 2%; pectin củ cải 1%; (NH4)2HPO4 0.4%; K2HPO4 0.7%; KH2PO4 0.3%; NaCl

0.1%; MgSO4 0.025%; FeSO4 dạng vết; CaCO3 0.5%;

dịch nấm men tự phân 0.05%; ascorbic acid 0.5%

Trang 34

 Tiến hành thu chế phẩm từ dịch lọc canh

trường:

 Kết tủa enzyme với dung môi hữu cơ :

o pH : 6.5-6.8

o Kết tủa bằng 2-2.5 thể tích aceton thì hoạt độ

enzyme trong kết tủa đạt 93-95% so với hoạt độ ban đầu.

Trang 35

 Tiến hành thu chế phẩm từ dịch lọc canh

trường:

 Kết tủa enzyme với ammonium sulfat:

o Độ bão hoà bằng 0.2 => pectinesterase và

Trang 36

 Thành phần môi trường:

 Chất cảm ứng và nguồn cacbon

 Nguồn nitơ

 Hàm lượng phốt pho

 Tỉ lệ giống cấy: 2 – 5% hoặc 0,5 – 0,6%

 Nhiệt độ nuôi cấy:

 pH môi trường: pHopt: 7 – 8

 Độ ẩm môi trường: 50-60%; thông khí 90-100%

 Sự sục khí và khuấy trộn:

 Các yếu tố ảnh hưởng

Trang 37

4 Quy trình công nghệ:

Trang 38

 Thiết bị lên men dạng đứng [3]

Thiết bị lên men dạng trao đổi khối

mạnh ΦBO - 40 - 0,6BO - 40 - 0,6 :

1 - Ống cung cấp khí đểthổi; 2 - Bộ dẫn động kín;

3 - Nắp; 4 - Cơ cấu khử bọt; 5 - Miếng đệm với buồng trao đổi nhiệt; 6 - Hộp không khí; 7 - Khối trụ đứng; 8 - Cơ cấu chuyển đảo; 9 - Ống để nạp nước lạnh; 10 - Động cơ; 11 - Bánh đai; 12 - Truyền động bằng đai hình thang; 13 - Cơ cấu tháo dỡ; 14 - Ống để thải nước; 15 - Các ống trao đổi nhiệt; 16 - Ống thải không khí; 17 - Ống để khử bọt; 18 - Cửa quan sát

Trang 39

 Cho phép thực hiện quá trình nuôi cấy chìm

khi vận tốc của dòng môi trường bằng 2 m/s

và lớn hơn.

 Thiết bị lên men dạng đứng [3]

Trang 40

C PHƯƠNG PHÁP NUÔI BỀ MẶT

1 Khái niệm

• Các cơ thể vi sinh vật tồn tại ở bề mặt môi

trường, các tế bào hướng về khoảng không khí được cung cấp đầy đủ oxy.

• Phương pháp dùng để sản xuất một số

enzyme, acid citric.

• Thích hợp cho một số nấm mốc, xạ khuẩn và

vi sinh vật hiếu khí.

Trang 41

Ưu điểm

• Nguồn nguyên liệu môi trường dễ kiếm, giá thành rẻ.

• Có thể loại bỏ phần nhiễm trùng, phần còn lại vẫn còn dùng được.

• Nồng độ enzyme tạo thành lớn.

• Ít tiêu tốn chi phí thiết bị.

Trang 43

2 Môi trường

• Môi trường rắn hoặc bán rắn có cơ chất dinh

dưỡng : Cám có trộn các loại bột ngũ cốc, đậu tương và một số thành phần dinh dưỡng khác

• Bổ sung thêm bã củ cải đường, bột cà rốt làm

chất cảm ứng thu hàm lượng pectinase cao

• Các loại hạt được nghiền vở thành mảnh có kích thước 1–3 mm

• Độ ẩm :55 - 60%

Trang 44

Cám trấu

Trang 46

Môi trường

Phối vào dụng cụ

Khử trùng Dụng cụ

Trang 47

3 Cách thực hiện

• Giống: A.niger, A.oryase, A.terreus,…

• Tỉ lệ nhân giống vào khoảng 0,2 – 2%

• Mỗi gram bào tử mốc cấy vào 10 kg môi trường

• Điều kiện và thời gian nuôi cấy phụ thuộc mỗi loài

Ví dụ:

Ở giống A.awamori

• Độ ẩm: 60%

• Thời gian nuôi cấy:

o Ban đầu: to = 30oC, thời gian: 40h

o Lúc sau: to = 24oC, thời gian: 48 - 52h

Trang 48

• Bắt đầu hình thành enzyme và thông khí

• Khối môi trường rời rạc, chất dinh dưỡng bắt

đầu có sự thay đổi.

.

Trang 49

Giai đoạn 2: Kéo dài 14-18h:

• Mốc phát triển nhanh, hô hấp mạnh, có thể quan

sát

• Chất dinh dưỡng tiêu hao nhanh

• Nhiệt độ môi trường tăng nhanh 40-45oC

• Thông khí mạnh 60 thể tích khí/ thể tích phòng/ h

để cung cấp O2 và giảm nhiệt độ buồng nuôi

• Nhiệt độ 28-30oC và độ ẩm đạt 90%

 Enzyem pectinase được hình thành nhiều nhất.

Quá trình nuôi cấy chung cho nấm mốc:

Trang 50

Giai đoạn 3: Kéo dài từ 10 – 20h:

• Quá trình trao đổi chất yếu dần do mức độ giảm chất dinh dưỡng chậm lại

• Thông khí không quá 20 - 25 thể tích không

khí/thể tích phòng/giờ

• Nhiệt độ buồng nuôi duy trì ở 30oC

• Kết thúc tại điểm mà lượng enzyme tối đa (tùy thuộc vào giống)

• Sấy khô dưới 12%, nghiền nhỏ, đựng trong bao chống ẩm

 Thu được chế phẩm enzyme khô.

Trang 51

3 Thiết bị

Trang 52

7 Cơ cấu đẩy

8 Rửa các phòng

9 Bàn dỡ liệu 10.Phòng nuôi cấy 11.Buồng

12.Băng tải 13.Phòng nuôi cấy môi trường rắn

14.Bulông ghép 15.Đường ray

Trang 53

3 Thiết bị

• Dây chuyền công nghệ

tự động hóa => Hiện đại

• Giảm thải bụi và bào tử

• Chiếm diện tịch lớn để láp đặt

• Tốn năng lượng và kim loại

• Năng suất thấp

Trang 55

3 Thiết bị

• Tăng chiều cao lớp canh

trường gấp 10 lần nhờ

phương pháp thổi khối

• Không tốn nhân công

• Năng suất cao

• Cấu tạo phức tạp

• Chiếm diện tịch lớn

• Khó bảo quản thiết bị

Trang 57

4 Thu nhận enzyme

• Kết tủa enzyme: etanol, izopropanol và axeton

• Hằng số điện môi của môi trường giảm và lực hút

tĩnh điện tăng =>Enzyme có phân tử thấp sẽ kết tủa và lắng xuống

Lưu ý:

Làm lạnh xuống 3÷5oC tránh mất hoạt tính enzyme

Trộn phải khuấy mạnh, khi enzyme kết tủa và lắng cần trích ly ngay

Trang 58

D XÁC ĐỊNH HOẠT LỰC

1 Phương pháp nhớt kế

• 9 bình tam giác: mỗi bình 50ml dd pectin 0.6% ủ

ấm 50 độ C, thời gian 15 phút

• Sau đó cho enzyme vào với lượng từ 0.1-0.9 ml

và bổ sung nước cất cho đủ 1ml

• Duy trì 9 mẫu này ở nhiệt độ 50 độ C, thời gian

1h, sau đó làm lạnh xuống 2-3 độ C, lọc qua vải 2 lần

• Lấy 5ml dd thí nghiệm này cho qua nhớt kế để đo

độ nhớt thông qua thời gian chảy của 9 mẫu dung dịch chứa pectine đem thí nghiệm nói trên

Trang 59

D XÁC ĐỊNH HOẠT LỰC

2 Phương pháp đông chung(Cu-pectat)

• Thủy phân pectin dưới tác dụng pectinase.Sau

đó dùng CuSO4 5% để kết tủa axit pectinic dưới dạng đồng pectat(Cu-pectat)

• Hòa tan kết tủa bằng NH4OH 25%

• Xác địng lượng đồng nhờ iốt

• Một đơn vị họat động pectinase theo phương

pháp này là một lượng emzyme có khả năng xúc thủy phân hết 1 mg pectin trong thời gian 1 giờ ở điều kiện tiêu chuẩn

Trang 60

Protein tạp, tạp chất phân tử lượng cao

Tủa bằng muối trung tính hoặc dung môi hữu cơ, sắc ký trao đổi ion

Loại bỏ

Trang 61

Phương pháp thẩm tích

- Dùng để loại bỏ các phân tử hoà tan nhỏ

E Tinh sạch enzyme [1]

Trang 62

Phương pháp lọc gel sephadex

- Dựa vào sự khác nhau về kích thước,

hình dáng, và phân tử lượng của các chất

có trong hỗn hợp.

Trang 63

- Phân riêng chọn lọc các hợp chất bằng màng lọc.

- Vật ngăn để phân riêng các cấu tử là membrane.

- Áp lực là động lực duy nhất của quá trình.

Phương pháp siêu lọc

Trang 64

- Dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi ion giữa enzyme tan trong nước hoặc dung

Phương pháp sắc ký trao đổi ion

Nhựa trao đổi ion

Dẫn xuất ester của cellulose

Trang 65

Phương pháp sắc ký trao đổi ion

Trang 66

- Muối nồng độ cao tác dụng với nước quanh enzyme làm chuyển hóa điện tích, thay đổi tính hòa tan của enzyme

- Cần làm lạnh dung dịch muối và dung dịch enzyme trước khi trộn lại với nhau.

- Kết tủa có thể tách ra bằng cách ly tâm hoặc lọc.

Phương pháp kết tủa bằng muối trung tính

Trang 67

Phương pháp kết tủa bằng muối trung tính

Yếu tố ảnh hưởng

Tính chất ion

Nồng

độ enzyme

Nồng

độ enzyme

Nhiệt độ

Định dạng
Số trang	86
Dung lượng	5,56 MB