ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN tử TRONG CHỌN lọc cá THỂ TRONG QUẦN THỂ f5 MANG QTLGEN TĂNG số hạt TRÊN BÔNG PHỤC vụ CÔNG tác CHỌN tạo GIỐNG lúa CAO sản

LỜI CẢM ƠNĐược sự nhất trí của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhịêm Viện Sinh – Nông, Bộ môn Kỹ thuật Di truyền - Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam trong thời gian thực tập tốt nghi

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HẢI PHÒNG VIỆN SINH-NÔNG

[

HỌ VÀ TÊN: NGUYỄN MẠNH TƯỜNG

LỚP: Công nghệ sinh học K13 KHÓA: 2012-2016

TÊN ĐỀ TÀI: ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG CHỌN LỌC CÁ THỂ TRONG QUẦN THỂ F5 MANG QTL/GEN TĂNG SỐ HẠT TRÊN BÔNG

PHỤC VỤ CÔNG TÁC CHỌN TẠO GIỐNG LÚA CAO SẢN.

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

LỜI CẢM ƠN

Được sự nhất trí của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhịêm Viện Sinh – Nông, Bộ môn Kỹ thuật Di truyền - Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam trong

thời gian thực tập tốt nghiệp em đã thực hiện đề tài: “Ứng dụng chỉ thị phân tử

trong chọn lọc cá thể trong quần thể F5 mang QTL/gen tăng số hạt trên bông phục vụ công tác chọn tạo giống lúa cao sản”.

Sau thời gian 6 tháng thực tập em đã hoàn thành đề tài Để đạt được kết quả này, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ nhiệt tình của thầy cô, bạn bè và người thân

Trước tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS Trần Đăng Khánh, (Bộ môn Kỹ thuật Di truyền - Viện Di truyền Nông nghiệp Việt

Nam) đã nhiệt tình hướng dẫn và tạo điều kiện cho em được thực hiện đề tài

khóa luận tốt nghiệp này Em xin chân thành cảm ơn ThS Vũ Thị Lan Phương

(Giảng viên Viện Sinh- Nông trường Đại học Hải Phòng) đã tận tình dìu dắt và hướng dẫn em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận

Trong thời gian thực tập vừa qua em đã nhận được sự giúp đỡ và hướng dẫn tận tình của các anh chị Bộ môn Kỹ thuật Di truyền - Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó

Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy giáo, cô giáo trong Viện Sinh - Nông - Đại học Hải Phòng những người đã trực tiếp giảng dạy, trang bị những kiến thức bổ ích trong suốt thời gian em học tập tại trường

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tất cả người thân, bạn bè, gia đình và những người luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ em trong quá trình học tập và thực hiện đề tài

Hà Nội, ngày 28 tháng 04 năm 2016

Sinh viên thực hiện đề tài:

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Mạnh Tường

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

Hình 3.1 Sơ đồ chu trình nhiệt của phản ứng PCR

Hình 4.1 Kết quả kiểm tra DNA tổng số tách chiết theo phương pháp CTAB trên gel agarose 0,8%

Hình 4.2 Hình ảnh điện di sàng lọc quần thể F5 với chỉ thị RM445

Hình 4.3 Hình ảnh điện di sàng lọc quần thể F5 với chỉ thị RM500

Hình 4.4 Hình ảnh điện di sàng lọc quần thể F5 với chỉ thị RM21615

DANH MỤC VIẾT TẮT

DNA : Deoxyribonucleic Acid

RNA : Ribonucleic Acid

PCR : Polymerase Chain Reaction

KD : Kháng Dân

AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism - Đa hình chiều dài các đoạn được nhân bản chọn lọc

RAPD : Random Amplification of Polymorphic DNA - Đa hình ADN được nhân bản ngẫu nhiên

RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism – Đa hình chiều dài mảnh phân cắt giới hạn

SSR : Simple Sequence Repeat - Sự lặp lại của trình tự đơn giản

cs : Cộng sự

dNTP : Deoxynucleotide triphosphate

MAS : Marker Assisted Selection – Chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử

PCR : Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi trùng hợp

QTL/QTLs : Quantity Trait Loci(s) - Locus kiểm soát tính trạng số lượng

TBE : Tris-Boric Acid-EDTA

CTAB: Cetyl trimethyl ammonium bromide

SDS: Sodium dodecyl sulfate

TEMED: Tetramethyl ethylene diamine

APS : Amomium Persulphate (NH4)2S2O8

Phần 1: MỞ ĐẦU1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây lúa (Oryza sativa L) là cây lương thực quan trọng, với diện tích trồng

khoảng 148,4 triệu hecta trên toàn thế giới (trong đó châu Á chiếm 135 triệu hecta) Ở Việt Nam lúa gạo là một trong những sản phẩm xuất khẩu chủ lực của nền nông nghiệp và cũng là nguồn lương thực chính của hơn 90 triệu dân trong nước [Bộ Nông nghiệp và PTNT, 2014] [1] Do quá trình đô thị hóa, công nghiêp hóa diễn ra nhanh chóng, diện tích đất dành cho việc trồng lúa ngày càng bị thu hẹp, và chịu những ảnh hưởng tiêu cực từ biến đổi khí hậu làm năng suất lúa bị sụt giảm rõ rệt, cùng với áp lực dân số ngày càng tăng đòi hỏi nguồn cung lương thực ngày càng lớn Vì vậy, đáp ứng sản lượng lương thực là việc làm rất cần thiết và cấp bách Việc phát triển nguồn giống đã được cải tiến cho năng suất cao, chất lượng tốt là yếu tố quan trọng cho việc đảm bảo hệ thống sản lượng lúa

Chọn tạo giống lúa có khả năng năng suất cao là hết sức cần thiết, cấp bách và

có ý nghĩa cho an toàn lương thực và tăng thu nhập của nông dân.Trong công tác chọn giống cây trồng, các tính trạng được khảo nghiệm là những tính trạng liên quan đến năng suất, phẩm chất của sản phẩm và chủ yếu liên quan tới việc tăng cường tính chống chịu đối với sâu bệnh và điều kiện ngoại cảnh bất lợi, những đặc điểm mong muốn về hình thái luôn bị ảnh hưởng từ điều kiện môi trường hoặc không biểu hiện khi điều kiện ngoại cảnh không phù hợp Xuất phát từ

những thực tế trên tôi thực hiện đề tài: “Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn

lọc cá thể trong quần thể F5 mang QTL/gen tăng số hạt trên bông phục vụ công tác chọn tạo giống lúa cao sản.”

2.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY LÚA

2.1.1. Nguồn gốc và phân loại

Cây lúa thuộc họ hòa thảo (Poaceae, trước đây là họ Gramineae) thân bụi, lá mềm Lúa trồng thuộc chi Oryza với nhiều loài khác nhau Hai loài được quan tâm nhiều hơn cả là Oryza sativa L và Oryza glaberrima L có nguồn gốc ở vùng

nhiệt đới và cận nhiệt đới khu vực đông nam châu Á và châu Phi Hai loài này cung cấp hơn 1/5 toàn bộ lương thực mà con người sử dụng

Loài Oryza sativa L có ba loài phụ là Indica, Japonica, và Javanica Trong đó, Indica là loại lúa được trồng nhiều ở các vùng nhiệt đới, Japonica được trồng ở vùng ôn đới Loài Oryza sativa L có số nhiễm sắc thể đơn bội n = 12 Tám trong

số 23 loài lúa dại có bộ gen tứ bội, đại đa số các loài lúa dại và lúa trồng hiện nay có bộ gen lưỡng bội (2n) Hiện có khoảng 83.000 mẫu lúa được lưu giữ ở ngân hàng gen quốc tế tại Viện nghiên cứu lúa Quốc tế (IRRI)[6], ngân hàng gen quốc gia Ấn Độ, Thái Lan, Trung Quốc, Indonesia, Việt Nam, Trong đó, có khoảng 9700 mẫu giống lúa đặc thù cho tính chịu hạn, úng, nóng, lạnh, sâu bệnh

Cây lúa Việt Nam (Oryza sativa L) còn được gọi là lúa châu Á vì nó được

thuần hóa từ lúa dại từ ba trung tâm đầu tiên ở châu Á Theo đặc điểm lúa trồng

Việt Nam thì chủ yếu là các giống Indica.

2.1.2. Đặc điểm hình thái và sinh trưởng của lúa

Đặc điểm hình thái

 Bộ rễ lúa thuộc loại rễ chùm Những rễ non có màu trắng sữa, rễ trưởng thành có màu vàng nâu và nâu đậm, rễ đã già có màu đen

- Thời kỳ mạ: Nếu mạ gieo thưa, rễ mạ có thể dài 5-6 cm Tiêu chuẩn của mạ tốt là

bộ rễ ngắn,nhiều rễ trắng

- Thời kỳ sau cấy: Bộ rễ tăng dần về số lượng và chiều dài ở thời kỳ đẻ nhánh, làm đòng

- Thời kỳ trỗ bông: Bộ rễ đạt giá trị tối đa vào thời kỳ trỗ bông Số lượng rễ có thể đạt tới 500 – 800 cái Chiều dài rễ đạt 2- 3 km/ cây khi cây được trồng riêng trong chậu.

Trên đồng ruộng, phạm vi ra rễ chỉ ở những mắt gần lớp đất mặt (0-20 cm là chính)

Khi câý lúa quá sâu (>5 cm), cây lúa sẽ tạo ra 2 tầng rễ, trong thời gian này cây lúa chậm phát triển giống như hiện tượng lúa bị bệnh ngẹt rễ Cấy ở độ sâu thích hợp (3-5cm) sẽ khắc phục được hiện tượng trên

Để tạo điều kiện cho bộ rễ phát triển tốt, cần làm cỏ sục bùn điều chỉnh lượng nước hợp lí, tạo điều kiện cho tầng đất vùng rễ thông thoáng, bộ rễ phát triển mạnh., Cây lúa sinh trưởng tốt, chống chịu được sâu bệnh, nâng xuất cao

- Số lóng dài: Từ 3-8 lóng Theo giải phẫu ngang lóng, lóng có một khoảng trống lớn gọi là xoang lỏi

- Chiều cao cây, thân:

+ Chiều cao cây

Được tính từ gốc đến mút lá hoặc bông cao nhất

+ Chiều cao thân

- Từ cây mẹ đẻ ra nhánh con (cấp 1), nhánh cấp 1 đẻ nhánh cấp 2 , nhánh cấp 2 đẻ nhánh cấp 3 Những nhánh hình thành vào giai đoạn cuối thường là nhánh vô hiệu.

- Thường thì các giống lúa mới khả năng đẻ nhánh cao, tỷ lệ nhánh hữu hiêu cũng cao hơn các giống lúa cũ, cổ truyền

- Khả năng đẻ nhánh của cây lúa phụ thuộc vào giống, nhất là điều kiện chăm sóc, ngoại cảnh Cây lúa có nhiều nhánh, tỷ lệ nhánh hữu hiệu cao, năng suất sẽ cao

 Lá lúa

* Hình thái

- Lá lúa điển hình gồm: bẹ lá, phiến lá, lá thìa và tai lá

+ Bẹ lá: là phần đáy lá kéo dài cuộn thành hình trụ và bao phần non của thân

+ Phiến lá: hẹp, phẳng và dài hơn bẹ lá ( trừ lá thứ hai)

+ Lá thìa: là vảy nhỏ và trắng hình tam giác

+ Tai lá: Một cặp tai lá hình lưỡi liềm

Lá được hình thành từ các mầm lá ở mắt thân Tốc độ ra lá thay đổi theo thời gian sinh trưởng và điều kiện ngoại cảnh

- Thời kỳ mạ non: trung bình 3 ngày ra được 1 lá

- Thời kỳ mạ khoẻ: từ lá thứ 4, tốc độ ra lá chậm lại, 7-10 ngày ra được 1 lá

- Thời kỳ đẻ nhánh: 5-7 ngày /1lá ở vụ mùa

- Cuối thời kỳ đẻ nhánh - làm đòng: khoảng 12 - 15 ngày / lá cây lúa trỗ bông cũng là lúc hoàn thành lá đòng

Số lá trên cây phụ thuộc chủ yếu vào giống, thời vụ cấy, biện pháp bón phân

và quả trình chăm sóc Thường số lá của các giống:

- Giống lúa ngắn ngày: 12 - 15 lá

- Giống lúa trung ngày: 16 - 18 lá

- Giống lúa dài ngày: 18 - 20 lá

* Chức năng của lá

Lá ở thời kỳ nào thường quyết định đến sinh trưởng của cây trong thời kỳ đó

Ba lá cuối cùng thường liên quan và ảnh hưởng trực tiếp đến thời kỳ làm đòng và hình thành hạt

* Chức năng của bẹ lá

- Chống đỡ cơ học cho toàn cây

- Dự trữ tạm thời các Hydratcacbon rước khi lúa trỗ bông

Lá làm nhiệm vụ quang hợp, chăm sóc hợp lí, dảm bảo cho bộ lá khoẻ, tuổi thọ lá (nhất là lá đòng), lúa sẽ chắc hạt, năng suất cao

Sinh trưởng của lúa

Nếu tính theo thời kỳ sinh trưởng thì cây lúa có 3 thời kỳ sinh trưởng chính:

- Thời kỳ sinh trưởng sinh dưỡng: tính từ lúc hạt thóc nảy mầm đến khi bắt đầu vào giai đoạn phân hoá hoa lúa (trên thực tế người ta tính từ khi gieo mạ, cấy lúa, cây lúa đẻ nhánh tới số nhánh tối đa)

- Thời kỳ sinh trưởng sinh thực: tính từ lúc bắt đầu phân hoá hoa lúa đến khi lúa trỗ bông và thụ tinh (bao gồm từ: làm đòng - phân hoá đòng, đến trỗ bông- bông lúa thoát khỏi lá đòng, nở hoa, tung phấn, thụ tinh)

- Thời kỳ chín: sau khi thụ tinh, bông lúa bước vào kỳ chín, kết thúc thời kỳ này là bông lúa chín hoàn toàn, sau đó tiến hành thu hoạch hạt thóc

Nếu tính theo giai đoạn sinh trưởng thì cây lúa có 10 giai đoạn sinh trưởng:

- Giai đoạn trương hạt

- Giai đoạn hạt nảy mầm

- Giai đoạn đẻ nhánh

- Gian đoạn phát triển lóng thân

- Giai đoạn phân hoá hoa

- Giai đoạn trỗ bông

- Giai đoạn nở hoa thụ phấn, thụ tinh

- Giai đoạn hạt chín sữa

- Giai đoạn hạt chín sáp

- Giai đoạn hạt chín hoàn toàn

2.2 Chỉ thị phân tử trong công tác chọn tạo giống

2.2.1. Chỉ thị phân tử

Trong một vài thập kỷ vừa qua, chúng ta đã chứng kiến sự phát triển vượt bậc của công nghệ sinh học, đặc biệt là quá trình phát triển nhanh chóng trong lĩnh vực di truyền học phân tử đã cho ra đời nhiều kỹ thuật phân tích biến dị di truyền đạt kết quả cao Chỉ thị di truyền gồm có ba loại chỉ thị hình thái, chỉ thị hoá sinh, chỉ thị phân tử Trong đó, chỉ thị phân tử được xem là công cụ rất hiệu quả

Quang Thạch và cs, 2005)[7] Vậy chỉ thị phân tử là gì? Chỉ thị phân tử (chỉ thị DNA) có thể được định nghĩa như một đoạn DNA đặc hiệu, biểu hiện khác biệt ở mức độ phân tử genome Chúng có thể có hoặc không tương quan tới biểu hiện kiểu hình của một tính trạng cụ thể.

Chỉ thị phân tử là những chỉ thị có bản chất là đa hình DNA Nó có thể là những dòng phân tử DNA có sẵn hay dưới dạng thông tin về trình tự được lưu giữ và chuyển tải trong những tệp dữ liệu được lưu trữ trong máy tính hay trên mạng internet (ví dụ như trình tự các mồi SSR, STS, RAPD, AFLP ) Chỉ thị

phân tử có thể hiểu đơn giản chúng như những “cột mốc” nằm trên trình tự DNA

trong hệ gen Sự hiện diện của các cột mốc và khoảng cách tương đối giữa chúng phản ánh mức độ biến dị giữa các cá thể, giống, loài trong một quần thể Sinh vật

có khả năng nhân bản DNA của chúng với độ chính xác cao nhưng có nhiều cơ chế xảy ra có thể làm thay đổi cấu trúc DNA, đơn giản như sự thay đổi bắt cặp hoặc phức tạp hơn như sự đảo đoạn, chuyển đoạn hoặc mất đoạn… Do đó chỉ thị phân tử được xem là công cụ cực kì hiệu quả trong việc đánh giá tính đa dạng sinh học phục vụ cho công tác nghiên cứu di truyền và chọn giống cây trồng.Chỉ thị phân tử cho phép xác định được các đặc điểm trực tiếp của kiểu gen thông qua việc xác định trình tự nhất định của gen hoặc các trình tự liên kết chặt với các gen mang tính trạng mong muốn Bằng việc sử dụng các chỉ tiêu phân tích trực tiếp kiểu gen trên, con người đã đi thẳng vào bản chất di truyền của các tính trạng, khắc phục được ảnh hưởng của các yếu tố môi trường, theo dõi và phát hiện các gen mong muốn, sự biến đổi của chúng qua các thế hệ ngay cả khi chưa có sự biểu hiện ra kiểu hình Vì vậy, chỉ thị phân tử được coi là chỉ tiêu phản ánh chân thật bản chất di truyền (Nguyễn Quang Thạch và cộng sự, 2005)[7] Các chỉ thị phân tử DNA bao gồm:

- Chỉ thị phân tử không dựa trên cơ sở lai DNA hay chỉ thị RFLP

- Chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bản DNA bằng kỹ thuật PCR như AFLP, RAPD, STS, SSR

Trong đó chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bản DNA được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu di truyền học, sinh thái học, phân loại và di truyền học tiến hoá, chọn giống do đặc điểm đơn giản và dễ sử dụng bởi PCR, sau đó thực hiện trên gel điện di biến tính để xác định kích thước alen và mức độ thông tin cao được cung cấp bởi một số lượng alen lớn trên locus

• Ưu điểm của chỉ thị phân tử so với chỉ thị hình thái

Chỉ thị phân tử rõ ràng không bị ảnh hưởng tác động của môi trường và điều kiện sống của cây trong tất cả các giai đoạn sinh trưởng So với chỉ thị hình thái, chọn lọc bằng chỉ thị phân tử có các ưu thế sau:

Kiểu gen của các locus chỉ thị phân tử có thể được xác định tại bất kỳ giai đoạn nào và ở bất kì mức độ nào: tế bào, mô hay toàn bộ cơ thể

Số lượng các chỉ thị phân tử là cực kì lớn, trong khi chỉ thị hình thái là hạn chế

Các alen khác nhau của chỉ thị phân tử thường không liên kết với những hiệu ứng có hại, trong khi sự đánh giá của các chỉ thị hình thái thường hay đi kèm với các hiệu ứng phụ không mong muốn

Các alen của các chỉ thị phân tử phần lớn là đồng trội, vì thế cho phép phân biệt mọi kiểu gen ở bất kỳ thế hệ phân ly nào, còn các alen của chị thị hình thái tương tác theo kiểu trội lặn, do đó bị hạn chế sử dụng trong nhiều tổ hợp lai.Đối với chỉ thị hình thái, các hiệu ứng lấn át thường làm sai lệch việc đánh giá các cá thể phân ly ở trong cùng một quần thể phân ly, còn đối với chỉ thị phân tử, hiệu ứng lấn át hoặc cộng tính rất hiếm gặp

2.2.2. Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử

• Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (Marker-assisted selection)

Từ lâu, các nhà chọn giống đã quan tâm đến các chỉ thị hình thái liên kết với một số tính trạng nông học quan trọng và sử dụng chúng như một phương tiện hữu ích trong quy trình chọn tạo giống mới Ở đây, thay vì phải đánh giá kiểu hình của cả một quần thể nhằm phát hiện những cá thể chứa gen mong muốn, người ta chỉ cần đi tìm những cá thể riêng biệt mang các chỉ thị hình thái liên kết với các gen đó Tuy nhiên các chỉ thị hình thái vốn có số lượng không nhiều, còn những chỉ thị “may mắn” (liên kết với gen quan tâm) lại càng hiếm gặp, vì thế giá trị thực tiễn của chỉ thị hình thái trong chọn giống gặp nhiều hạn chế Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ chỉ thị phân tử, các nhà chọn giống bắt đầu quan tâm nhiều hơn tới vấn đề chọn giống nhờ chỉ thị phân tử MAS (Marker assisted selection) với ý đồ sử dụng các chỉ thị phân tử liên kết với các gen mong muốn trong chọn tạo giống mới

Trong khi các ứng dụng kỹ thuật di truyền vào chọn giống đã dành được nhiều

sự quan tâm trên thế giới, một kỹ thuật chọn giống khác hiện đại được gọi là chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (Marker-assisted selection/MAS) có thể nói đã trải qua một cuộc cách mạng thầm lặng trong những năm gần đây

(Mackill và cs, 2006) [19] đưa ra khái niệm chọn lọc giống lúa dựa trên chỉ thị phân tử (MAS) là sử dụng chỉ thị DNA liên kết chặt với locus mục tiêu để thay cho chọn lọc đánh giá kiểu hình với giả định chỉ thị DNA có thể dự đoán kiểu hình một cách đáng tin cậy Hay nói cách khác, chọn giống nhờ chỉ thị phân tử là việc sử dụng chỉ thị di truyền để kiểm soát khu vực chứa bộ gen mã hoá cụ thể đặc điểm của cây trồng Sử dụng chỉ thị phân tử liên kết chặt với locus mục tiêu

để xác định tính trạng mong muốn thay cho kiểm tra hay đánh giá kiểu hình Để việc chọn giống có hiệu quả, phải xác định được chỉ thị phân tử đa hình giữa giống bố mẹ và các cá thể trong quần thể phân tích Mức độ xác định chỉ thị phân tử đa hình phụ thuộc vào hệ thống chỉ thị được sử dụng Với chỉ thị phân

tử, cho phép các nhà chọn giống xác định được chính xác các gen/locus gen quy định những tính trạng mong muốn Các gen/locus gen này cũng sẽ được chuyển vào các giống mới trong quá trình chọn tạo giống bằng chỉ thị phân tử.

Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ chỉ thị phân tử, các nhà chọn giống bắt đầu quan tâm nhiều hơn đến vấn đề chọn giống nhờ chỉ thị phân

tử Trong chọn giống nhờ chỉ thị phân tử, quá trình chọn lọc được dựa trên cơ sở các chỉ thị phân tử liên kết với các gen quy định tính trạng cần quan tâm

Chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử trong chọn giống đã trở nên hữu hiệu không chỉ đối với các tính trạng được điều khiển bởi các gen chính mà đối với cả những tính trạng số lượng được điều khiển bởi các gen phụ hay các QTLs

Hiệu quả cải tiến cây trồng sẽ gia tăng gấp nhiều lần so với chọn giống cổ điển, nhờ thực hiện chọn lọc không cần trực tiếp trên tính trạng mong muốn, mà thông qua chỉ thị phân tử liên kết với tính trạng đó Phương pháp này cho phép thanh lọc kiểu hình với một khối lượng quần thể lớn Các nhà chọn giống có thể rút ngắn thời gian đánh giá kiểu hình, tập trung chọn lọc những mục tiêu quan trọng khác có giá trị về mặt kinh tế Nếu so sánh với chọn lọc kiểu hình, MAS có thể giúp các nhà chọn giống tiết kiệm từ 1 đến 16,7 lần trong chọn lọc quần thể.Thông thường, trong quy trình chọn tạo giống truyền thống, người ta đưa nguồn gen mới có tính trạng mong muốn vào 1 giống khác bằng phương pháp hồi giao liên tục qua 5 - 6 thế hệ, hoặc chọn lọc cá thể trong quần thể phân ly từ thế hệ F2 đến các thế hệ tiếp theo Với các gen kháng mỗi gen chính thường chỉ kháng được với 1 chủng gây bệnh hoặc nòi gây hại nào đó Do vậy nếu quy tụ được vài gen kháng vào một dòng hoặc giống lúa thì sẽ tạo ra được một dòng lúa kháng được với nhiều chủng gây bệnh hoặc nhiều nòi gây hại Muốn tạo ra giống lúa kháng bền vững đối với dịch hại, người ta phải đưa được vài gen kháng hiệu

quả cao vào "genom đích" Bằng phương pháp chọn giống truyền thống, việc đưa gen lặn vào tổ hợp lai, hoặc du nhập cùng một lúc vài gen mong muốn vào

"genom đích" (quy tụ nhiều gen vào một dòng ưu việt) thường gặp rất nhiều khó khăn hoặc đôi khi không thể thực hiện được (Mohan và cs, 1997) [21]

Trong chọn giống truyền thống, các cá thể cây trồng thể hiện các tính trạng mới mong muốn, chẳng hạn như độ ngọt hơn của quả dâu tây, củ to hơn của khoai tây, được chọn lọc từ các tổ hợp lai dâu tây và khoai tây Trong khi đó, các tính trạng đơn giản chẳng hạn như kích cỡ hay độ ngọt có thể dễ dàng tính toán được, các tính trạng phức tạp hơn chẳng hạn như tính kháng sâu bệnh, hay tính trạng chịu hạn gây khó khăn lớn đối với các nhà chọn giống khó có thể quan sát khi lựa chọn các cá thể biểu hiện tính trạng đó trong một quần thể cây trồng.Như vậy, chọn giống nhờ chỉ thị phân tử là một kỹ thuật ứng dụng chỉ thị phân

tử, không thay thế phương pháp chọn giống truyền thống, nhưng là một phương tiện hữu hiệu, trợ giúp đắc lực cho chọn giống truyền thống nhằm khắc phục những trở ngại mà công tác chọn giống truyền thống rất khó giải quyết

Gần đây thuật ngữ chọn giống thông minh “Smart breeding” hàm ý chọn lọc với chỉ thị và kỹ thuật công nghệ tiên tiến Chọn giống bằng phương pháp MAS mang lại hiệu quả và đáng tin cậy hơn so với chọn lọc kiểu hình MAS cũng được gọi là chọn giống nhờ chỉ thị (Marker assisted breeding/MAB), cho dù MAS không chắc chắn là đáp án cho tất cả cá lĩnh vực chọn giống, tuy nhiên MAS vẫn là một bước tiếp cận đầy hứa hẹn cho phương pháp chọn giống truyền thống

• Nội dung chỉ thị phân tử

+ Chỉ thị dựa trên cơ sở lai DNA: RFLP marker (Restriction Fragment Length Polymorphism – Đa hình chiều dài đoạn phân cắt)

Các chỉ thị RFLP được sử dụng đầu tiên trong việc lập bản đồ di truyền và đến nay vẫn được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu về genome nhờ những ưu điểm

của nó Chỉ thị này được các nhà di truyền học lần đầu tiên giới thiệu trong nghiên cứu lập bản đồ các gen liên quan đến bệnh của người (Vương Đình Tuấn

và cs, 2000) [8] Các đa hình RFLP sinh ra bởi các đột biến tự nhiên ở những điểm cắt enzym giới hạn trong DNA bộ gen, ví dụ như đảo đoạn, thêm đoạn, mất đoạn, hoặc mất đi hay thêm vào của một hay nhiều nucleotit khác nhau tuỳ thuộc vào đặc điểm riêng biệt của mỗi giống, loài, thậm chí mỗi cá thể Mỗi một loài sinh vật có một bộ DNA genom đặc hiệu trong cấu trúc, vì vậy khi sử dụng những enzyme giới hạn để cắt phân tử DNA của hệ gen, người ta có thể nhận biết những đoạn DNA có chiều dài khác nhau bằng kỹ thuật lai DNA với những mẫu dò (prope tử (AA hoặc aa) và các cá thể dị hợp tử Aa Đây là đặc điểm ưu việt và đáng tin cậy của loại chỉ thị RFLP và thường được dùng để kiểm tra các chỉ t) giúp nhận biết được những đoạn DNA có chiều dài khác nhau Chỉ thị RFLP là chỉ thị đồng trội nghĩa là có khả năng biểu hiện tất cả các alen của cùng một lôcut gen Do vậy, có thể phân biệt các cá thể đồng hợp hị phân tử khác Hạn chế của phương pháp này là tiêu tốn nhiều thời gian và sức lực, lượng công việc cồng kềnh Đặc biệt là tiêu hao một lượng lớn DNA mà số lượng đa hình thu được ít, thậm chí khó nhận được đa hình đối với một số locus gen ở một số loài

+ Chỉ thị dựa trên nguyên tắc nhân bội DNA bằng PCR (Amplification- based markers hoặc PCR-based markers)

Phản ứng chuỗi nhờ polymeraza (polymerase chain reaction = PCR) được Kary Mullis và cs phát minh năm 1985 Cơ sở chính của kỹ thuật PCR là sự tổng

hợp DNA được thực hiện dưới sự xúc tác của enzym DNA polymeraza chịu nhiệt

(Taq DNA polymerase, Pfu, AmpliTaq ) khiến cho phản ứng tổng hợp DNA có thể diễn ra liên tục từ chu kỳ này đến chu kỳ khác Trong phản ứng PCR, DNA được nhân lên theo cấp số nhân theo công thức: N = D.2n-1, với D là lượng DNA ban đầu, N là tổng số DNA được tổng hợp (mới) sau n chu kỳ

* Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

Loại chỉ thị này được sinh ra bởi phản ứng PCR để nhân bội những đoạn DNA

hệ gen Chỉ thị RAPD sử dụng những đoạn mồi ngẫu nhiên (random primers) xác định, dài khoảng 10 nucleotide với nhiệt độ kết cặp thấp (khoảng 37°C) Phản ứng PCR trong trường hợp RAPD chỉ sử dụng mồi đơn lẻ, nghĩa là mỗi phản ứng chỉ sử dụng 1 cặp mồi (vừa là mồi thuận vừa là mồi nghịch) Do mồi ngẫu nhiên có chiều dài 10 nucleotide nên trên suốt chiều dài của hệ gen, trung bình cứ khoảng 410 (≈106) nucleotide lại bắt gặp 1 vị trí mà mồi ngẫu nhiên xác định có thể kết cặp được Nếu kích thước của hệ gen khoảng 109 nucleotide, thì trên mỗi sợi đơn DNA của toàn bộ hệ gen sẽ có khoảng một nghìn vị trí mà mồi ngẫu nhiên đó có thể kết cặp được

Tuy nhiên, do phản ứng PCR chỉ có thể nhân được 1 đoạn DNA có kích thước tối đa chừng 4-5 kb, nghĩa là phản ứng PCR xảy ra chỉ khi khoảng cách tối đa giữa mồi thuận và mồi nghịch không vượt quá 4-5 x 103 nucleotide Như vậy đối với hệ gen có kích thước khoảng 109 nucleotide, phản ứng PCR với mỗi mồi ngẫu nhiên xác định chỉ cho sản phẩm trung bình là vài băng DNA Sau khi phản ứng PCR kết thúc, sản phẩm PCR (các băng DNA) được phân tách bằng điện di trên gel agarose, nhuộm trong ethidium bromide và quan sát dưới đèn cực tím

Do các băng DNA của RAPD là không xác định, nên người ta coi mỗi băng DNA với kích thước đặc trưng là tương đương với 1 lôcut và locus đó chỉ có 1 alen Như vậy RAPD là chỉ thị trội, biểu hiện bởi sự có mặt (ký hiệu bằng “1” hay “+”) hay vắng mặt (ký hiệu bằng “0” hay “- ”) những băng ADN đặc trưng

Do đó chỉ thị RAPD không phân biệt được thể dị hợp tử Đó là hạn chế của loại chỉ thị này so với chỉ thị đồng trội RFLP Ngoài ra chỉ thị RAPD, do sử dụng mồi ngắn (10 gốc) và nhiệt độ kết cặp thấp, nên độ nhạy của PCR bị phụ thuộc vào điều kiện của phản ứng, và phản ứng PCR thường có độ chính xác kém, nhất là khi phải thao tác với những sinh vật có hệ gen lớn, thí nghiệm cần được lặp lại

nhiều lần để có kết quả chính xác Lợi thế của loại chỉ thị này là không cần biết những thông tin về trình tự DNA cần thiết để thiết kế mồi và thí nghiệm có chi phí rẻ với thao tác nhanh gọn và đơn giản.

* Chỉ thị SSR (Microsatellite hay Simple Sequence Repeates)

Vi vệ tinh, hay ở thực vật còn gọi là Simple Sequence Repeates (SSR) (ở người

và động vật, người ta gọi “vi vệ tinh” là “Short Tandem Repeats” – STR) là những đoạn DNA lặp lại một cách có trật tự, gồm những đơn vị lặp lại gồm từ 2 đến 6 nucleotid, theo kiểu lặp lại ngắn vài chục lần SSR đã được nghiên cứu lần đầu tiên trên người (Kakunaga và cs 1982) [15] , (Weber và cs, 1989) [27] và cho đến nay nó được tìm thấy trong các hệ gen của tất cả các Eukaryota khác như gia cầm (Crittenden va cs, 1994) [12], cá (Estoup A và cs, 1993)[13], côn trùng (Renz và cs, 1984)[22] và trên vài loài cây một lá mầm và hai lá mầm (Morgante M và cs, 1993)[20], (Wang Z và cs, 1994)[28] Bản chất đa hình của

vi vệ tinh có thể được sinh ra do sự nhân bội từ DNA tổng số của hệ gen nhờ sử dụng 2 đoạn mồi bổ trợ với trình tự gần kề hai đầu của vùng lặp lại

Giá trị của SSR là ở chỗ nó sinh ra đa hình từ rất nhiều vùng tương ứng, bao phủ rộng khắp hệ gen và có bản chất đồng trội, dễ dàng phát hiện bằng PCR, do đó được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu Những chuỗi đa hình đơn giản này đã được ứng dụng trong việc lập bản đồ ở cả hai đối tượng động vật và thực vật (Bell C.J và cs,1994)[10] Ở người, vi vệ tinh được gọi là thế hệ thứ hai của các chỉ thị phân tử Ở thực vật, tần số và số lượng vi vệ tinh đã được xác định trên các cây rừng nhiệt đới (Hubbel và cs, 1992)[14], cây bắp cải (Largercrantz U và

cs, 1993)[16], lúa mì (RoderM.S… và cs, 1995)[23] và 34 giống cây trồng khác (Morgante M và cs, 1993) [20] Những kết quả nghiên cứu này đã chỉ ra ở thực vật, vi vệ tinh mang trình tự lặp lại (AT)n nhiều hơn so với ở động vật, trong khi

ở những loài động vật thì lại giàu vi vệ tinh kiểu (GT)n hơn

• Các bước chọn giống nhờ chỉ thị phân tử

Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử đề cập đến một phương pháp chọn giống, trong đó việc xác định chỉ thị DNA và chọn lọc được lồng ghép vào chuơng trình chọn giống truyền thống (Khánh và cs, 2012)[4] Thực hiện lai đơn là một ví dụ, các bước thực hiện:

- Chọn lọc bố mẹ và thực hiện lai tạo, ít nhất một hoặc cả hai có alen chỉ thị DNA cho tính trạng mong muốn

- Phát triển quần thể F1 và xác định sự có mặt của các alen chỉ thị để loại bỏ các cây lai không đủ điều kiện

- Phát triển quần thể F2 phân ly, sàng lọc các cá thể bằng các chỉ thị và thu các cá thể mang alen chỉ thị mong muốn

- Trồng cây F2:3 và sàng lọc các cá thể bằng chỉ thị Số lượng lớn cá thể F3 trong phạm vi một hàng có thể được sử dụng cho việc sàng lọc chỉ thị nhằm xác định hơn nữa trong trường hợp cần thiết nếu thấy cây F2 trước là đồng hợp tử với chỉ thị Chọn lọc và thu các cá thể với alen chỉ thị và các tính trạng mong muốn khác

- Trong thế hệ tiếp theo (F4 và F5) thực hiện sàng lọc chỉ thị và chọn lọc tương tự như ở thế hệ F2:3, nhưng cần chú ý với những cá thể có đặc tính nổi trội của các dòng đồng hợp tử

- Trong thế hệ F5:6 hoặc F4:5, dựa trên dữ liệu chỉ thị các dòng tốt nhất theo đánh giá kiểu hình của tính trạng mục tiêu và cũng như kiểu hình của các tính trạng khác

- Đánh giá năng suất cây trồng toàn diện để lựa chọn ra các dòng năng suất, chất lượng và tính chống chịu cũng như các đặc tính quan tâm khác

Trong đó, một số bước đơn giản thực hiện MAS với chỉ thị DNA như sau:

- Tách DNA từ mô tế bào của mỗi cá thể trong quần thể lai

- Sàng lọc các mẫu DNA sử dụng PCR cho các chỉ thị liên kết với QTL quan tâm

- Phân tích các sản phẩm PCR, sử dụng kỹ thuật phù hợp để phân biệt và xác định sản phẩm chẳng hạn như điện di trên gel agarose

- Xác định các cá thể có các alen chỉ thị mong muốn liên kết với QTL mục tiêu

- Kết hợp kết quả của chỉ thị với một số tiêu chí chọn lọc khác, chọn lọc các con lai của quần thể tin cậy bởi sàng lọc alen chỉ thị và các cá thể trội trong các quần thể của chương trình lai tạo

2.2.3. Phương pháp MAS

Phương pháp MAS và sự sàng lọc trong các thế hệ chọn giống

Từ lâu, các nhà chọn giống đã quan tâm đến các chỉ thị hình thái liên kết với một số tính trạng nông học quan trọng và sử dụng chúng như một phương tiện hữu ích trong quy trình chọn tạo giống mới Ở đây, thay vì phải đánh giá kiểu hình của cả một quần thể nhằm phát hiện những cá thể chứa gen mong muốn, người ta chỉ cần đi tìm những cá thể riêng biệt mang các chỉ thị hình thái liên kết với các gen đó

Sự phát triển của công nghệ chỉ thị phân tử đã giải phóng các nhà chọn giống khỏi một lượng lớn công việc khi phải chọn lọc, phát hiện một lượng ít ỏi những

cá thể quan tâm trong số vô vàn các cá thể khác nhờ việc xác định sự có mặt hay vắng mặt của những chỉ thị phân tử liên kết với những alen đặc hiệu mà không cần đánh giá kiểu hình Phương pháp này còn có thể giúp ta chọn lọc những cá thể mang những tổ hợp gen cần thiết và loại bỏ các nhiễu do các tương tác trong cùng alen hay giữa các alen gây ra - những tương tác này thường không thể phát hiện được bằng các phân tích kiểu hình Phương pháp này đặc biệt hiệu quả trong trường hợp cần đưa gen lặn hoặc thậm chí đưa cùng lúc nhiều gen khác nhau vào một genôm đích Nguồn gen mới nhập được phát hiện gián tiếp thông qua các chỉ thị phân tử liên kết chặt với những gen đó

Như vậy, chỉ thị phân tử làm tăng thêm hiệu quả sàng lọc trong các chương trình chọn giống nhờ cung cấp thêm:

- Khả năng chọn lọc ngay từ giai đoạn cây con đang nẩy mầm trong khi nhiều dấu hiệu chỉ có thể sàng lọc khi chúng được biểu hiện ở những giai đoạn muộn hơn trong quá trình sống nếu chỉ sử dụng phương pháp chọn giống cổ điển (ví dụ: chất lượng quả và hạt, tính bất dục đực, khả năng phản ứng chu kỳ quang)

 Ưu điểm và ứng dụng của phương pháp MAS trong chọn giống

• Sinh học phân tử là một công cụ mới trong nghiên cứu di truyền và chọn giống cây trồng Hiệu quả của phương pháp này trong chọn giống là rất lớn như: nhanh, rẻ, chính xác, nâng cao được năng suất sản lượng

• Chỉ thị di truyền và bản đồ di tuyền cho phép nhà chọn giống thấy rõ mối quan hệ: “Tính trạng - Gen (QTLs) - Môi trường” Do vậy ứng dụng quan trọng nhất của MAS là sử dụng những chỉ thị phân tử cho ba mục đích sau:

• Tìm kiếm phát hiện những biến dị di truyền, các gen quan tâm trong số các cá thể, giữa các giống, loài

• Phân lập nhanh các cá thể cần quan tâm trong quần thể dựa trên thành phần của gen hay các chỉ thị liên kết với các alen quan tâm đối với các locus mong muốn

• Chuyển một vùng gen, đối với những tính trạng quan tâm được quy định bởi đơn gen hay một gen chịu trách nhiệm phần lớn biểu hiện kiểu hình của tính trạng

• Trong chọn giống lúa, MAS ngày càng được sử dụng rộng rãi để rút ngắn các quá trình phục hồi các dòng bố mẹ trong các chương trình lai lại MAS sẽ giúp cho quá trình những gen quan tâm vào các giống có cấu trúc hệ gen khác nhau một cách nhanh chóng do MAS cho phép tối ưu hoá số cây cần chọn, số lần lai trở lại, hoặc loại bỏ các cá thể không liên quan đến những gen quan tâm, các chỉ thị phân tử có thể được áp dụng chọn giống nhằm phân biệt giữa các cá thể trong một quần thể phân ly và xác định giống Khi so sánh với chọn giống truyền

thống, vai trò trợ giúp của chỉ thị phân tử có thể cải thiện hiệu quả chọn giống ở các điểm:

- Phân biệt kiểu gen đồng hợp tử và dị hợp tử Để phân biệt các kiểu gen trong phương pháp chọn giống truyền thống là dựa trên chọn lọc kiểu hình Chọn lọc kiểu hình ít hiệu quả hơn trong việc phân biệt kiểu gen đồng hợp tử và dị hợp tử Khả năng xác định sự khác nhau là cần thiết tại một số bước trong các chương trình chọn giống

- Phân biệt thế hệ đầu Trong chọn giống truyền thống, các nhà chọn giống thường xuyên tạo số lượng cá thể lớn để xác định hiệu quả và chọn lọc các kiểu gen mong muốn Điều này sẽ kéo dài chương trình chọn giống MAS cho phép nhà chọn giống loại bỏ các kiểu gen không mong muốn trong chương trình chọn giống bằng việc sàng lọc các cá thể ngay ở giai đoạn cây con

- Thuận tiện sàng lọc: Đối với tính trạng khó đánh giá kiểu hình, chọn lọc đối với một chỉ thị alen cây bố mẹ cho gen tại vị trí locus gần với gen quan tâm có thể làm tăng hiệu quả và độ chính xác của chọn lọc Mục tiêu của chọn giống tương

tự như lai tạo tính kháng bệnh thối có rễ thì tốn công sức để có được kết quả bởi

vì cây trồng phải cần được đào ra khỏi mặt đất để đánh giá Các chỉ thị liên kết với các tính trạng như vậy có thể sẽ tạo dễ dàng cho các nhà chọn giống để tiến hành nhanh chóng trong chương trình chọn giống và chí phí sàng lọc

- Giảm không gian sàng lọc: Bởi vì ảnh hưởng của điều kiện môi trường lên kiểu hình đặc biệt đối với các tính trạng phức hợp, chọn giống truyền thống yêu cầu chọn lọc được thực hiện trên các nhóm cá thể phân ly được trồng trong nhóm Giai đoạn đầu của MAS có thể được thực hiện ngay ở giai đoạn cây non trong một không gian hẹp ví dụ như trong nhà kính

- Giảm thời gian chọn lọc: thử nghiệm ngay ở giai đoạn đầu và dễ dàng sàng lọc

để lựa chọn có thể rút ngắn chương trình chọn giống

Nhược điểm:

Cho đến nay, ứng dụng MAS đã đạt được nhiều thành công khác nhau trong chọn giống cây trồng, tuy nhiên để ứng dụng MAS trở nên phổ biến thì vẫn có một số tồn tại Hạn chế lớn nhất là rào cản tồn tại của MAS là cải tiến tính trạng

đa gen Lý do chính tồn tại của rào cản này là xác định vị trí chính xác QTL trên bản đồ Vì QTL thiếu các ảnh hưởng kiểu hình riêng biệt và không thể lập bản đồ QTL như thể chúng là locus định lượng hoặc locus di truyền Menden riêng biệt Mặc dù các công cụ tính toán thống kê phức tạp được sử dụng, khả năng luôn tồn tại là vị trí hợp lý tối đa theo quy định có thể không là vị trí chính xác của QTL Một trong những thách thức chính trong chọn giống các tính trạng định lượng là bị ảnh hưởng lớn từ điều kiện môi trường biểu hiện lên tính trạng đó, do vậy có tính di truyền thấp Các nghiên cứu cũng chứng minh rằng MAS là hiệu quả nhất khi các giá trị chọn giống dự đoán bởi chỉ số giá trị QTL kiểu gen, như

từ kiểu gen chỉ thị liên kết và ước lượng hiệu ứng QTL và các giá trị kiểu hình

2.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG CÔNG

TÁC CHỌN TẠO GIỐNG

2.3.1. Tình hình nguyên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trên thế giới

Từ hơn hai thập kỷ trước người ta đã dự đoán rằng công nghệ chỉ thị phân tử

sẽ định hình lại các chương trình chọn giống và thúc đẩy nhanh trong chọn lọc các tính trạng kinh tế của cây trồng Khoảng 14 năm trước đây (Concibido và cs, 1996) [15] đã mô tả ứng dụng MAS chọn tạo giống đậu tương kháng u nang tuyến trùng (Heterodera glycines) Tuy nhiên, trong khi đó MAS được sử dụng hiệu quả hơn trong chọn tạo các tính trạng đơn gen, nhưng lại không hiệu quả trong chọn tạo tính trạng đa gen, đặc biệt trong trường hợp nhiều alen với các hiệu ứng nhỏ liên quan đến một kiểu hình cụ thể MAS đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong các chương trình chọn giống để chuyển gen và quy tụ gen, đặc biệt các gen kháng sâu bệnh của các loại cây trồng chính, mà còn đối với cả các nhóm cây trồng thứ yếu

Các nhà khoa học ở Trường ĐHTH Cornel (Mỹ) là những người đầu tiên định

vị hàng loạt các chỉ thị phân tử RFLP trên bản đồ di truyền ở lúa Trong chương trình genom lúa do Nhật chủ trì, các nhà khoa học đã phát hiện và tách dòng hơn

3000 đoạn ADN bổ trợ Đến nay đã có khoảng chục nghìn chỉ thị phân tử SSR (vi vệ tinh) ở lúa đã được phát hiện và thiết kế, trong đó có nhiều chỉ thị liên kết với gen có ý nghĩa kinh tế quan trọng (Linh và cs, 2006) [18]

Cho đến nay, hàng nghìn QTL/gen liên kết với hầu hết các tính trạng ở lúa đã được xác định Trong đó nhiều QTLs/gen quy định tính trạng có ý nghĩa kinh tế quan trọng đã được xác định lập bản đồ và ứng trong cải tiến giống Hiện nay có khoảng 27 QTLs/gen kháng bệnh bạc lá, 30 QTL/gen kháng đạo ôn, 27 gen kháng rầy nâu và một số QTL kháng đạo ôn đã được phát hiện (Nguyễn Trí Hoàn và cs, 2009)[3], (Lã Tuấn Nghĩa, 2011) [5]

Phân tích, lập bản đồ di truyền phân tử đã được thiết lập rất phổ biến bằng việc sử dụng quần thể phân ly F2 hay dòng cập phối (RIL) từ tổ hợp lai xa về di

truyền như giữa hai loài phụ Indica và Japonica, thế hệ tái tổ hợp thu được nhiều

đa hình hơn là trong cùng loài phụ (Wang Z và cs 1994) [28]

Một số tiến bộ về ứng dụng MAS đã được thực hiện tại Viện nghiên cứu Lúa Quốc tế (IRRI), các nhà khoa học đã chuyển các QTL/gen kháng vào cá nền di truyền của giống lúa ưu tú (Li và cs, 2004) [17] Số lượng QTL liên quan đến tính chịu hạn ở lúa mạch đã được lập bản đồ, bao gồm một số tính trạng sinh lý, sinh hóa chẳng hạn như khả năng điều chỉnh thẩm thấu, hàm lượng protein, khí khổng dẫn, hay carbonhydrate bão hòa trong nước nhưng ứng dụng MAS vẫn còn là những thách thức (Li và cs, 2004) [17]

Trong số các ức chế phi sinh học, như hạn hán và nhiễm mặn là một trong những ức chế chính gây thiệt hại kinh tế lớn Một tiến bộ đạt được nhờ ứng dụng

MAS đã phát triển một số giống cây trồng chịu hạn và chịu mặn sử dụng phương pháp lai truyền thống kết hợp với ứng dụng chỉ thị phân tử Nhiều QTL kiểm soát tính kháng hạn và chịu mặn đã được phân lập (Zhang G và cs, 2005) [30] cho thấy ảnh hưởng của sự thay đổi trong các màng acid béo trên khả năng chịu hạn và chịu mặn Tuy nhiên, mức độ áo dụng của những phát hiện này đối với các chương trình chọn giống vẫn còn bị hạn chế.

Tiến sỹ Makill của IRRI đã thành công trong việc phát triển một số giống lúa

chịu hạn ngập sử dụng locus Sub I (Septiningsih và cs, 2009) [24] Hai giống cải tiến mang gen Sub I đã được phóng thích gần đây MAS được ứng dụng nhằm

giảm số lần lai hồi giao (BC) và giảm bớt các liên kết kéo theo Giống cải tiến

“Swarna-Sub I” được trồng ở Ấn Độ và Bangladesh, giống IR64-Sub I được trồng ở những vùng thường bị ảnh hưởng ngập lụt ở Philipin và Indonesia Tiến

sỹ Varshney (IRRI) và ICRISAT đã công bố rằng đang thực hiện chuyển một QTL chính kiểm soát 30% biến dị kiểu hình rễ ở đậu Hà lan (Chickpea) Tiến sỹ

Xu (CIMMYT) cũng công bố xác định được locus chịu hạn

Ngoài các QTLs/gen quy định năng suất và yếu tố cấu thành năng suất, gen thơm của giống Jasmin, gen điều khiển tính trạng hạt dài, gen điều khiển thời gian sinh trưởng và nhiều gen và QTL có liên quan đến các tính trạng khác của cây lúa như chịu hạn, chịu mặn, chịu độc nhôm, chịu thiếu phốt-pho, bất dục đực nhân nhậy cảm quang chu kỳ, nhiệt độ, gen tương hợp rộng cũng được phát hiện hay được lập bản đồ phân tử để đưa vào sử dụng trong chọn giống Ngoài

ra, ứng dụng chỉ thị phân tử thông qua việc đánh giá đa dạng di truyền và khoảng cách di truyền, chỉ thị phân tử còn giúp các nhà chọn giống xác định gián tiếp các cặp lai có khả năng cho ưu thế lai.( Bùi Chí Bửu và cs, 2004)[2], (Nguyễn Trí Hoàn, 2009)[3]

Ở Trung quốc các nhà khoa học đã thành công quy tụ các QTL/gens quy định yếu tố cấu thành năng suất vào một giống (Bai và cs, 2012) [9] Những giống

lúa cải tiến này được tạo ra bằng sự kết hợp cả hai phương pháp chọn giống truyền thống và hiện đại Bước đột phá trong việc chọn giống lúa siêu cao sản trở nên có thể thực hiện được sau khi locus điều khiển tính trạng tăng năng suất (QTLs) được xác định Bằng việc sử dụng phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử và lai trở lại đã đẩy nhanh quá trình quy tụ các gene đó vào những giống mới năng suất cao (Thomson và cs., 2009)[26]; (Septiningsih và cs., 2009)[24]; (Singh và cs., 2009)[25]

Các nhà khoa học ở Viện ngiên cứu lúa quốc tế (IRRI) đã phát hiện ra một gene có tên là PSTOL1 (Phosphorus Starvation Tolerance), gene này làm cho lúa phát triển rễ lớn hơn và tốt hơn, giúp tăng hấp thu phốt pho của cây lúa khoảng

20% Gene PSTOL1 được trích xuất từ giống lúa Kasalath - vốn được trồng trên

các cánh đồng nghèo dinh dưỡng tại khu vực phía đông Ấn Độ - đã được phát hiện bởi Tiến sĩ Matthias Wissuwa từ Trung tâm Nghiên cứu Khoa học Nông nghiệp Quốc tế Nhật Bản Hiện tại, các nhà khoa học đã áp dụng kỹ thuật cấy gene để đưa gene PSTOL1 vào các giống lúa thuộc 2 phân loài lúa lớn là Indica

và Japonica Kết quả cho thấy, sản lượng lúa đã tăng thêm 60% so với giống lúa không cấy gene PSTOL1

Ông Hont Ma, giáo sư trường Đại học Quốc gia Pennsylvania và cộng sự đã tìm ra loại gen quy định khối lượng và kích thước của hạt gạo hướng tới sự đẩy mạnh sản lượng cây trồng Các nhà khoa học đã tiến hành điều tra và định dạng dòng đột biến gây giảm khối lượng của hạt trên cây lúa Sau khi kiểm tra đột biến này các nhà khoa học đã đưa ra kết luận sự đột biến ở trong gen GIF1 Gen GIF1 có trách nhiệm trong việc điều khiển hoạt động của enzyme invertase, nằm

ở màng tế bào và biến đổi sucrose thành chất nào đó và thường cấu tạo nên tinh bột Nhóm đã tạo một số dòng cây lúa chuyển gen GIF1, so sánh với dòng bình thường, cây chuyển gen thân to và cho hạt nặng hơn Kết quả nghiên cứu được

Đại học Quốc gia Pennsylvania công bố vào ngày 28/9/2008 trên (Báo Nature Genetic)[33].

Các nhà khoa học Trung Quốc đã xác định được một gen đơn lẻ có tên là GHD7, có vai trò kiểm soát sản lượng, cũng như chiều cao và thời gian trổ bông của cây lúa Những nghiên cứu trước đây đã từng định dạng được một vùng trên nhiễm sắc thể số 7, được cho là nơi quyết định 3 đặc điểm trên của cây lúa, nhưng không thể tập trung vào một gen cụ thể nào Tiến sĩ Zhang Qifa và đồng nghiệp ở Trường Đại học Huazhong, tỉnh Vũ Hán đã thực hiện cuộc nghiên cứu này ở 19 đồng lúa khác nhau trên khắp châu Á và thấy rằng, những cây lúa thấp hơn, ít hạt hơn và trổ sớm hơn có dấu hiệu thiếu gen GHD7 Sau khi được bổ sung loại gen này đã xuất hiện sự thay đổi theo chiều hướng tăng rõ rệt: tăng năng suất, tăng thời gian trổ bông và tăng 67% chiều cao (Báo khám phá sinh vật học thực vật)[34]

Các nhà nghiên cứu Trung Quốc đã xác định được một gene quan trọng trong

hạt thóc có thể giúp tăng vượt trội đồng thời cả năng suất và chất lượng lúa Đầu

tiên, các nhà khoa học tại Hàn lâm Viện Khoa học Xã hội (Trung Quốc) thực hiện nghiên cứu loại lúa Basmati từ Pakistan, một loại lúa gạo ngon nổi tiếng trên thế giới, và tìm thấy gene GW8 có ảnh hưởng lớn đến việc tăng chất lượng gạo Gene GW8 còn có thể cải thiện cả hình dáng và màu sắc của hạt gạo Khi tiếp tục nghiên cứu gene GW8, các nhà khoa học còn phát hiện thấy gene này cũng tồn tại ở một số loại lúa cao sản trồng tại Trung Quốc Nhưng nó là một biến thể gene GW8 khác, tuy không ảnh hưởng tới chất lượng song lại có vai trò trong trọng lượng hạt và tăng năng suất của lúa Sau đó, nhóm nghiên cứu đã xác định được biến thể thứ ba của gene GW8 có thể kết hợp những ưu điểm của hai biến thể gene kia, hứa hẹn một giống lúa mới giúp tăng cả năng suất và chất lượng của lúa Biến thể GW8 mới nếu được ghép vào loại lúa Basmati có thể