Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi khuẩn oxy hóa sulfur ở vùng ven biển hải phòng ứng dụng xử lý khí độc h2s trong nuôi trồng thủy sản

Trong nuôi trồng thủy sản nguyên nhân gây ô nhiễm phần lớn cácchất hữu cơ dư thừa từ thức ăn, phân và các rác thải khác đọng lại dưới đáy ao nuôi.Ngoài ra, còn các hóa chất, kháng sinh đ

MỤC LỤC

Phần 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.2 MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU 2

1.2.1 Mục đích 2

1.2.2 Yêu cầu 2

Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 TÌNH HÌNH NTTS TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 3

2.1.1 Tình hình nuôi trồng thủy sản trên thế giới 3

2.1.2 Tình hình nuôi trồng thủy sản tại Việt Nam 6

2.2 TÌNH HÌNH Ô NHIỄM MÔI TRƯỜNG TRONG NTTS 9

2.2.1 Tình trạng ô nhiễm trong NTTS 9

2.2.2 Ảnh hưởng của khí sulfur trong NTTS 10

2.2.3 Xử lí ô nhiễm trong nuôi trồng thủy sản 11

2.3 VI KHUẨN OXY HÓA SULFUR VÀ ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÍ SULFUR 13

2.3.1 Đặc điểm vi khuẩn oxy hóa sulfur 13

2.3.2 Cơ sở của quá trình xử lí sulfur bằng vi khuẩn oxy hóa sulfur 14

2.3.3 Ứng dụng của quá trình oxy hoá sulfur trong xử lí môi trường bằng vi sinh vật 17

Phần 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

3.1 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 19

3.1.1 Đối tượng, vật liệu 19

3.1.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 19

3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 19

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

3.3.1 Sơ đồ phân tích 20

3.3.2 Phương pháp thu mẫu 20

3.3.3 Phương pháp nuôi cấy và phân lập 21

3.3.4 Phương pháp phân tích đặc điểm sinh học 24

3.3.5 Đặc điểm sinh hóa 25

3.3.6 Phương pháp lưu trữ giống 29

3.3.7 Khả năng xử lý H2S trong môi trường ô nhiễm 29

3.3.8 Phương pháp xử lí số liệu 30

Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

4.1 KẾT QUẢ THU MẪU 31

4.4.1 Địa điểm thu mẫu 31

4.4.2 Số lượng mẫu lấy 31

4.2 KẾT QUẢ ĐO CÁC THÔNG SỐ MÔI TRƯỜNG 32

4.3 PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN, MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN OXY HÓA HỢP CHẤT SUNFUR 32

4.3.1 Phân lập vi khuẩn oxy hóa sulfur 32

4.3.2 Khả năng làm giảm pH các hợp chất oxy hóa sulfur và của các chủng phân lập 33

4.3.3 Khả năng oxy hóa các hợp chất sulfur của một số chủng đã phân lập 34

4.4 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN CHỌN LỌC HOẠT TÍNH OXY HÓA SULFUR 37

4.4.1 Hình thái tế bào 37

4.4.2 Kết quả một số thử nghiệm sinh hóa 39

4.4.3 Kết quả phân loại sơ bộ 39

4.5 ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NGOẠI CẢNH ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG VÀ OXY HÓA CÁC HỢP CHẤT KHỬ CỦA LƯU HUỲNH CỦA CÁC CHỦNG LỰA CHỌN 41

4.5.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 41

4.5.2 Ảnh hưởng của độ mặn 42

4.5.3 Ảnh hưởng của pH 43

4.6 KHẢ NĂNG XỬ LÝ H2S TRONG MÔI TRƯỜNG Ô NHIỄM 47

Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49

5.1 KẾT LUẬN 49

5.2 ĐỀ NGHỊ 49

PHỤ LỤC 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến TS.Trần Đình Lân, và TS Đỗ Mạnh Hào – Trạm nghiên cứu biển Đồ Sơn- Viện TàiNguyên và Môi Trường Biển, là người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo giúp đỡcho em những kiến thức, những kinh nghiệm, lời khuyên quý báu, tạo mọi điều kiệnthuận lợi cho em trong quá trình thực hiện đề tài khóa luận

Em cũng xin được cảm ơn toàn thể các anh, các chị trong Trạm nghiên cứu biển

Đồ Sơn, giúp đỡ và tạo điều kiện cho em có cơ hội được thực tập tại đơn vị và giúp

đỡ nhiều trong quá trình thực tập

Em xin chân thành cảm ơn ThS Vũ Thị Lan Phương đã nhiệt tình chỉ bảo, giúp

đỡ em rất nhiều trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Bên cạnh đó, em xin chân thành cảm ơn các thầy, cô Trạm nghiên cứu biển ĐồSơn cùng với Lãnh đạo Viện Tài Nguyên và Môi Trường Biển đã tạo điều kiện giúp

đỡ tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu tại trường cũng như tại viện

Cuối cùng, em xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, đặc biệt là ba mẹ

đã luôn ở bên động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóaluận này

Hải Phòng, ngày tháng năm 2016

Sinh viên

Nguyễn Thị Hương

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Sản lượng NTTS thế giới trong các năm 2004 - 2009 (triệu tấn) 3

Bảng 2.2: Các nước có sản lượng NTTS cao nhất thế giới 4

Bảng 2.3: Diện tích ao nuôi nước ngọt và nước lợ tại một số nước trên thế giới 6

Bảng 4.1: Kí hiệu mẫu phân tích 31

Bảng 4.2: Các thông số môi trường tại địa điểm thu mẫu 32

Bảng 4.3: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của 11 chủng phân lập 33

Bảng 4.4: Giá trị pH của một số chủng vi khuẩn đã phân lập 34

Bảng 4.5: Khả năng oxy hóa các hợp chất khử của lưu huỳnh của các chủng vi khuẩn 35

Bảng 4.6: Khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn trên môi trường thiosulfate (đo bằng OD600) 36

Bảng 4.7: Đặc điểm khuẩn lạc và tế bào của chủng vi khuẩn được chọn 38

Bảng 4.8: Một số đặc tính sinh hóa của các chủng 39

Bảng 4.9: Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng và oxy hóa các hợp chất khử của lưu huỳnh của các chủng lựa chọn 41

Bảng 4.10: Kết quả ảnh hưởng của độ mặn đến khả năng sinh trưởng và oxy hóa các hợp chất khử của lưu huỳnh của các chủng lựa chọn 42

Bảng 4.11 Kết quả ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng và oxy hóa các hợp chất khử của lưu huỳnh của các chủng lựa chọn 44

Bảng 4.12: Kết quả ảnh hưởng của oxy hoà tan đến khả năng sinh trưởng và oxy hóa các hợp chất khử của lưu huỳnh của các chủng lựa chọn 45

Bảng 4.13: Kết quả ảnh hưởng của hợp chất nitơ đến khả năng sinh trưởng và oxy hóa các hợp chất khử của lưu huỳnh của các chủng lựa chọn 46

Bảng: 4.14: Mật độ tế bào của vi sinh vật trong thí nghiệm mô phỏng 47

Bảng 4.15 Khả năng xử lý H2S trong thí nghiệm của vi khuẩn 47

DANH MỤC HÌNH VÀ BIỂU Đ

Hình 2.1: Vòng tuần hoàn lưu huỳnh (theo J.G.Black) 15

Biểu đồ 3.1: Đường chuẩn xác định nồng độ sunfat 24

Hình 3.2: Mô hình thí nghiệm mô phỏng 30

Hình 4.1 Khả năng làm giảm pH của một số loại vi khuẩn đã phân lập 34

Biểu đồ 4.4 Hiệu suất xử lý H2S trong thí nghiệm của vi khuẩn 48

DANH MỤC VIẾT TẮT

FAO Agriculture Organization of the United Nation (Tổ

chức lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc)

OD Mật độ hấp thụ quang ở bước sóng nhất định (OD

600, OD 420)SO42- Hàm lượng ion sunfat trong nước

[H2S]: Hàm lượng hydrogen sulfide trong nước

Phần 1: MỞ ĐẦU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Vấn đề ô nhiễm môi trường nói chung và ô nhiễm nước nói riêng luôn là vấn đềthời sự hiện nay Trong nuôi trồng thủy sản nguyên nhân gây ô nhiễm phần lớn cácchất hữu cơ dư thừa từ thức ăn, phân và các rác thải khác đọng lại dưới đáy ao nuôi.Ngoài ra, còn các hóa chất, kháng sinh được sử dụng trong quá trình nuôi trồngcũng dư đọng lại mà không được xử lý Việc hình thành lớp bùn đáy do tích tụ lâungày của các chất hữu cơ, cặn bã là nơi sinh sống của các vi sinh vật gây thối, các visinh vật sinh các khí độc như như NH3, NO2, H2, H2S, CH4 Sự ô nhiễm này khôngchỉ ảnh hưởng xấu đến hệ sinh thái mà còn gây ra tác động không tốt đến sức khỏecon người Vì vậy, vấn đề bảo vệ môi trường, bảo vệ nguồn nước đang là nhiệm vụcấp bách trên toàn thế giới

Trong những năm qua, đã có nhiều công trình nghiên cứu cho thấy việc ứngdụng các biện pháp sinh học vào xử lý các nguồn nước thải giàu chất hữu cơ – đặcbiệt là các nguồn nước thải có chứa các hợp chất của lưu huỳnh – đã mang lại hiệuquả cao và an toàn cho môi trường Các hợp chất oxy hoá lưu huỳnh có thể bị oxyhóa thành sulphur Một số loài vi sinh vật có khả năng tận dụng nguồn năng lượngnày để chuyển hóa ATP thành năng lượng Trong điều kiện hiếu khí, nhiều nhóm vikhuẩn có thể oxy hóa các hợp chất oxy hoá lưu huỳnh thành thiosulfat, sulphur như

các loài vi khuẩn thuộc các chi: Micromonas spp., Bacillus spp., Pseudomonas

spp và Klebsiella spp, Thiobacilus …

Trên thế giới, việc sử dụng các nhóm vi khuẩn tham gia xử lý ô nhiễm (đặc biệt

là việc loại bỏ hydro sulfur trong nước) đã được biết đến qua nhiều nghiên cứu cũngnhư ứng dụng thực tế Ở Việt Nam, việc ứng dụng vi sinh vật vào xử lý nước đượcđánh giá vẫn còn han chế Trước tình hình ô nhiễm môi trường ở mức báo động nhưhiện nay thì việc nghiên cứu các nhóm vi sinh vật để đưa vào ứng dụng là rất cần

thiết Vì vậy em đã thực hiện nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu đặc điểm sinh học của

một số chủng vi khuẩn oxy hóa sulfur ở vùng ven biển Hải Phòng ứng dụng xử lý khí độc H 2 S trong nuôi trồng thủy sản.”

1.2 MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU

1.2.1 Mục đích

Tuyển chọn và xác định đặc điểm của các chủng vi khuẩn có hoạt tính oxy hóasulfur nhằm đưa ra cơ sở cho việc áp dụng nhóm vi khuẩn này vào xử lí H2S trongđầm nuôi thủy sản tại Hải Phòng, đảm bảo môi trường trong sạch cho nuôi trồnghiệu suất cao và bền vững

1.2.2 Yêu cầu

- Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính oxy hóa sulfur cao

- Xác định đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn oxy hóa sulfur phân lập được

- Thử nghiệm đánh giá khả năng xử lý H2S của vi khuẩn oxy hóa sulfur trong thínghiệm mô phỏng

Phần 2 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 TÌNH HÌNH NTTS TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM

2.1.1 Tình hình nuôi trồng thủy sản trên thế giới

Tổng sản lượng khai thác và NTTS trên toàn thế giới đạt khoảng 142 triệu tấnvào năm 2008 trong đó sản lượng từ NTTS (bao gồm cả nước ngọt và nước mặn)vào khoảng 52 triệu tấn, chiếm 46% tổng sản lượng Bảng 1 cho thấy sản lượng từNTTS liên tục tăng từ năm 2004 đến 2009 [1]

Bảng 2.1: Sản lượng NTTS thế giới trong các năm 2004 - 2009 (triệu tấn)

4

200 5

200 6

2000 7

200 8

200 9

Mỹ [1] [14]

Sản lượng từ NTTS chủ yếu làm nguồn cung cấp thực phẩm cho con người Sảnlượng từ NTTS làm thực phẩm trên toàn thế giới đã tăng từ 42,6 % năm 2006 lêntới 45,7%(2008) Riêng Trung Quốc, lượng thực phẩm thủy hải sản trong năm 1970chỉ chiếm 23,6% và tăng lên đến 80,2% trong năm 2008.Ở các nước còn lại, lượngthực phẩm thủy hải sản cũng tăng từ 4,8% trong năm 1970 lên 26,7% trong năm

2008 Mặc dù nghề NTTS có thể có truyền thống lâu đời ở một số nước, nhưng nhìnchung trên toàn thế giới thì đây còn là một nghề non trẻ, mới được phát triển nhanhtrong khoảng 50 năm qua NTTS chủ yếu phát triển ở khu vực Châu Á - Thái BìnhDương, chiếm 89% về giá trị sản lượng và 79% về giá trị kinh tế Trong đó, Trung

Quốc là quốc gia rất mạnh về NTTS, chiếm 62% tổng sản lượng toàn cầu và 52%tổng giá trị Tỉ lệ tăng trưởng trung bình về sản lượng trên toàn thế giới giữa năm

2006 và năm 2008 là 5,3% [1] [15]

Bảng 2.2: Các nước có sản lượng NTTS cao nhất thế giới

Quốc gia Sản lượng(nghìn tấn) Tỷ lệ phát triển trung bình hàng

Năm 2006, tổng sản lượng NTTS thế giới là 51 triệu tấn và sản lượng khai thác

là 92 triệu tấn Trong số này, Trung Quốc chiếm 66,7% tổng sản lượng nuôi, cácnước Châu Á khác chiếm 22,8%, và các nước khác còn lại ở Châu Âu, Châu Mỹ,Úc…chiếm 10,5% Nghề NTTS nội địa tiếp tục đóng góp chính cho nghề nuôi thủysản nói chung, với hơn 61% sản lượng và 53% tổng giá trị sản phẩm nuôi trồng.Nuôi thủy sản nước ngọt chiếm 58% sản lượng và 48% giá trị, nuôi biển chiếm 34%sản lượng và 36% giá trị Trong khi đó, nuôi nước lợ với tỷ lệ sản lượng thấp 8%nhưng cho tỷ lệ giá trị đến 16% do nuôi chủ yếu các loài tôm có giá trị cao Cơ cấu

nhóm loài nuôi cho thấy, năm 2006, cá nước ngọt cho sản lượng cao nhất là 27,8triệu tấn, đạt giá trị 29,5 triệu USD; động vật thân mềm và rong biển cho sản lượng

và giá trị tương đương nhau Trong khi đó, giáp xác có sản lượng chỉ 4,5 triệu tấnnhưng đạt giá trị đến 17,95 triệu USD [1] [15]

Đối tượng NTTS rất phong phú Theo Pillay, đã có 465 loài thực vật thủy sinh rong tảo là đối tượng nuôi trồng [3] [15] FAO đã liệt kê 107 loài cá, 21 loài giápxác và 43 loài nhuyễn thể được nuôi từ năm 1994[4] Số lượng này chắc chắn đượctăng lên hàng năm Tuy nhiên, tùy từng nơi với mục đích nuôi khác nhau mà đốitượng nuôi cũng khác nhau Châu Á, Trung Quốc và Nam Á nuôi chủ yếu là cácloài cá chép, trong khi Đông Á nuôi chủ yếu các loài cá biển có giá trị cao VùngChâu Mỹ la tinh và Caribê, nuôi chủ yếu cá hồi và tôm; Vùng Bắc Mỹ nuôi chủ yếu

-cá hồi đại dương Một số loài thủy sản quan trọng được nuôi gồm -cá hồi Đại TâyDương, cá trắm, cá mè hoa, cá chình Châu Âu, cá chình Nhật Bản, cá hồi vân, cá rôphi vằn, tôm càng xanh, tôm sú, tôm he chân trắng, hầu Mỹ, hầu Thái Bình Dương,rong mứt, rong bẹ, rong sụn v.v

Số liệu thống kê từ các báo cáo tổng quan các nước trên thế giới về diện tích aonuôi nước ngọt và nước mặn tại một số nước của FAO cho biết Trung Quốc là nước

có diện tích lớn nhất với 5.583.276 ha ao nuôi thủy sản nước ngọt và 676.184 hanước lợ [6] [7]

Bảng 2.3: Diện tích ao nuôi nước ngọt và nước lợ tại một số nước trên thế giới

Tên nước Diện tích ao nuôi nước

ngọt (ha)

Diện tích ao nuôi nước lợ

(ha)

2.1.2 Tình hình nuôi trồng thủy sản tại Việt Nam

Việt Nam trong thập niên 1990 và 3 năm đầu của thế kỉ 21, sản lượng thủy sảnnuôi trồng có tốc độ tăng trưởng rất cao, vượt xa tốc độ tăng trưởng của khai thác.Trong thập niên cuối của thế kỷ trước, Việt Nam đã trở thành một trong 10 nước cósản lượng cá nuôi lớn nhất thế giới, sau Trung Quốc, Ấn Độ, Inđônêxia, Nhật Bản,Thái Lan, Banglađesh

Ở Việt Nam, nghề nuôi thủy sản cũng phát triển rất năng động Nghề nuôi thủysản truyền thống bắt đầu từ thập niên 1960, tuy nhiên trong vòng 10 năm nay, nghềnuôi thủy sản có tốc độ phát triển rất nhanh chóng Theo thống kê của Bộ Thủy sảntrong năm 1999 cả nước có tổng cộng trên 524.619 ha NTTS, đạt sản lượng480.767 tấn Năm 2005, cả nước có gần 1.000.000 ha nuôi thủy sản, đạt sản lượng1.437.356 tấn, trong đó, sản lượng nuôi thủy sản nước lợ - măn là 546.716 tấn, sản

lượng nuôi nước ngọt đạt 890.650 tấn Năm 2008, tổng sản lượng NTTS tại ViệtNam đạt 2.448.000 tấn, tăng 15% so với năm 2007 Sản lượng thuỷ sản nuôi trồngnăm 2009 ước tính đạt 2.569,9 nghìn tấn, tăng 4,2% so với năm trước, chủ yếu docác địa phương tiếp tục chuyển đổi và mở rộng diện tích nuôi trồng theo hướng kếthợp đa canh, đa con Bên cạnh đó, mô hình nuôi thuỷ sản lồng, bè tiếp tục pháttriển, đặc biệt là nuôi lồng, bè trên biển ở các tỉnh: Kiên Giang, Quảng Nam, NinhThuận, Phú Yên, Hải Phòng [2] [6] [7]

Hiện nay, đối tượng nuôi và mô hình nuôi thủy sản ở Việt Nam khá phong phú.Tuy nhiên, chủ lực nhất vẫn là nuôi cá tra thâm canh ở vùng nước ngọt và nuôi tôm

ở vùng nước lợ ven biển Đặc biệt, năm 2008, sản lượng nuôi cá tra và basa đạt trên1.200.00 tấn và sản lượng tôm nuôi đạt 380.680 tấn, cá biển đạt 3.510 tấn, nhuyễnthể đạt 114.570 tấn, rong biển đạt 20.260 tấn, tôm nước ngọt đạt 6.400 tấn, cá nướcngọt và một số loài khác đạt 255.272 tấn, đạt giá trị kim ngạch xuất khẩu trên 2 tỉ đô

la Mỹ Một số loài nuôi thủy sản quan trọng đang được nuôi rộng rãi tại một số tỉnhthành là cá nước ngọt nhập nội (cá rô phi, cá mè trắng, mè hoa, trắm cỏ, các loài cátrôi Ấn Độ, trê phi ), cá nước ngọt bản địa (mè vinh, thát lát, bống tượng, cá rô, cálóc, cá sặc ), cá da trơn (tra, basa), cá biển (cá trắm, bống mũn, cá kèo, cá chình, cágiò ), giáp xác (tôm sú, tôm chân trắng, tôm càng xanh, cua biển, tôm hùm ),nhuyễn thể (nghêu, sò, tu hài, ốc hương, ngọc trai, hầu ), và rong biển (rong sụn,rong câu ) Các đối tượng nuôi được phát triển trên cả nước, tùy vào từng địaphương mà phát triển nuôi nước ngọt, nước lợ hoặc nước mặn Tính đến hết ngày10/12/2010 tổng sản lượng giống sản xuất cá tra cả nước đạt 2,359 tỷ con, sảnlượng cá thu hoạch đạt 1.140.390 tấn, xuất khẩu đạt 538,2 nghìn tấn, đạt giá trị 1,15

tỷ USD, tăng 6,6% về khối lượng và 2,4% về giá trị Nuôi tôm nước lợ đạt 469.893tấn, trong đó tôm sú đạt 333.174 tấn, tôm chân trắng đạt 136.719 tấn [2] [6] [7].Diện tích NTTS được phát triển nhanh và mạnh trong khoảng 2 thập kỷ trở lạiđây Việt Nam là một quốc gia có đường bờ biển dài 3260km với 12 đầm phá, 112cửa sông, nhiều eo biển, vũng vịnh Tổng diện tích mặt nước tự nhiên khoảng1.700.000 ha trong đó bao gồm 120.000 ha là các ao nhỏ, hồ, kênh rạch; 340.000 ha

là các hồ chứa lớn; 580.000 ha là các ruộng lúa có thể NTTS và 660.000 ha là cácvùng triều Theo thống kê có khoảng 300.000 đến 400.000 ha các eo biển, vũng

vịnh, đầm phá nằm dọc theo bờ biển có thể sử dụng NTTS nhưng chưa được quyhoạch hoàn thiện Hiện nay, tổng số loài nuôi nước ngọt là 544 loài, nuôi nước lợ vàmặn là 186 loài Với tiềm năng mặt nước rất phong phú và đa dạng, các hình thức

và thủy vực nuôi trên cả nước được chia thành nuôi nước ngọt (nuôi ao, nuôi lồng),nuôi ven biển (nuôi ao, đầm, lồng) Việt Nam có nhiều tiềm năng để phát triển nuôitrồng thuỷ sản ở khắp mọi miền đất nước cả về nuôi biển, nuôi nước lợ và nuôinước ngọt Đến năm 2003, trên cả nước đã sử dụng 612.778 ha nước mặn, lợ và254.835 ha nước ngọt để nuôi thuỷ sản [2]

Trong đó, đối tượng nuôi chủ lực là tôm với diện tích 580.465 ha Đồng bằngsông Cửu Long có diện tích NTTS lớn nhất nước, tốc độ cũng tăng nhanh nhất sovới các vùng miền khác trong cả nước Gần đây, mô hình nuôi cá tra ao đã đạt đếndiện tích trên dưới 6.000 ha, với sản lượng xuất khẩu đạt gần 600.000 tấn trong năm

2008 (gấp 3 lần sản lượng tôm xuất khẩu) Diện tích nuôi tôm sú năm 2009 ước tínhđạt 549,1 nghìn ha, giảm 10,7% so với năm trước, một số diện tích nuôi tôm sú đãchuyển đổi sang nuôi tôm thẻ chân trắng cho năng suất và thu nhập cao hơn Đếnnay diện tích nuôi tôm thẻ chân trắng năm nay ước tính đạt 13,5 nghìn ha, tăng75,5% so với năm 2008; sản lượng đạt 63 nghìn tấn, gấp trên 2 lần Tính chung sốlồng bè nuôi thuỷ sản năm 2009 của cả nước đạt 98,4 nghìn chiếc, tăng 12,6 nghìnchiếc (tăng 14,7%) so với năm 2008 Diện tích NTTS 6 tháng đầu năm 2010 đạt972.5 nghìn ha, tăng 3,2% so với cùng kỳ năm trước, bao gồm 312 nghìn ha nuôi cá(3,749 ha cá tra), tăng 8% và 623.5 nghìn ha nuôi tôm, tăng 3% Đồng bằng sôngCửu Long chiếm 70% - 75% diện tích và sản lượng nuôi trồng, tập trung chủ yếuvào cá tra, basa, tôm sú và tôm thẻ chân trắng Trong đó, An Giang, Đồng Tháp,Cần Thơ là các tỉnh có sản lượng lớn về cá tra và Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng cóthế mạnh về tôm Thống kê đến 10/12/2010, diện tích nuôi cá tra và basa đạt 5.400

ha, diện tích nuôi tôm sú đạt 613.718 ha, diện tích nuôi tôm he chân trắng 25.397ha

2.2 TÌNH HÌNH Ô NHIỄM MÔI TRƯỜNG TRONG NTTS

ít gây ô nhiễm môi trường [3]

Hình thức nuôi bán thâm canh là hình thức nuôi bón phân để phát triển thức ăn

tự nhiên hay cho ăn thêm thức ăn bổ sung có chất lượng thấp, thức ăn tự nhiên vẫnđóng vai trò quan trọng Mật độ thả nuôi cao hơn do điều kiện dinh dưỡng được cảithiện nên năng suất cũng cao, ví dụ các ao nuôi cá Hình thức này bắt đầu xuất hiện

ô nhiễm môi trường nước [3]

Hình thức nuôi thâm canh chủ yếu dựa vào thức ăn cung cấp thêm, thức ănthường có chất lượng cao (thức ăn viên, thức ăn đầy đủ) Mật độ thả thường rất cao

và năng suất cao, ví dụ nuôi cá lồng Sự gia tăng thâm canh thường gây ra mức độ ônhiễm cao hơn rất nhiều so với hai hình thức quảng canh và bán thâm canh Cụ thể

nó làm giảm DO của nước và tích lũy nhiều hydro sulfur trong nước Bệnh dịchtrong hình thức nuôi thâm canh cũng xuất hiện nhiều hơn Trong loại hình nuôi tômthâm canh và nuôi công nghiệp trên cát, một lượng lớn thức ăn, phân vô cơ, phânhữu cơ được đưa vào đầm nuôi nhằm tăng năng suất sản phẩm Hiệu quả sử dụngcủa các thành phần bổ sung này thường khá thấp, ví dụ: lượng thức ăn đưa vào chỉđược hấp thụ khoảng 25 – 30% Lượng chất hữu cơ không được hấp thụ này tích tụtrong nước làm cho vi sinh vật chuyển hóa chậm chạp khiến nước đục, hôi thối dohàm lượng vượt quá giới hạn cho phép Việc lạm dụng các chất kháng sinh, chấtbảo vệ thực vật làm cho nước ao đầm chứa nhiều thành phần độc hại Với mật độ visinh vật hữu ích thấp dẫn đến khả năng tự làm sạch của các ao đầm này là rất khó.Bên cạnh đó, việc gia tăng quá mức diện tích nuôi trồng và quy hoạch bừa bãi NH4+,NO3-, NO2-, H2S và phát sinh dịch bệnh [3] [4]

Tham khảo số liệu từ Trung tâm Quốc gia Quan trắc, Cảnh báo Môi trườngBiển - Viện Nghiên cứu Hải sản thuộc hoạt động quan trắc chất lượng môi trường

một số vùng nuôi biển trong thời gian tháng 9 - 10/2008 như sau: Khu vực nuôi cálồng bè Hải Phòng: Hàm lượng muối dinh dưỡng N-NO2- : 0,009 - 0,142mg/l; N-NO3- :0,050 - 0,403mg/l; N-NH4+ :0,003 - 0,069 mg/l; P-PO43- : 0,014 - 0,041mg/l.Nước biển khu vực nuôi cá lồng tại Bến Bèo, Tùng Gấu, gần cảng Cát Bà bị ônhiễm với chỉ số tai biến dinh dưỡng = 0,76 ở mức nguy cơ tai biến môi trường, ônhiễm nhất là NO2 - với hàm lượng vượt GHCP 1,0 - 7,1 lần; mật độ Coliform tạiBến Bèo, Tùng Gấu vượt GHCP 1,8 - 2,2 lần [2] [4]

2.2.2 Ảnh hưởng của khí sulfur trong NTTS.

Trong quá trình nuôi, các chất thải được máy quạt nước gom tụ vào giữa đáy ao(đối với ao đáy bùn đất thì một lượng chất thải vẫn còn phân bố xung quanh nềnđáy) Đống chất thải này phân thành 2 lớp Lớp ngoài rất mỏng (khoảng 5 mm)được oxy hoá nên có màu tương đối sáng, có chức năng bao phủ và hạn chế khí độcthoát ra ngoài Lớp bên dưới có màu đen, chất thải ở điều kiện thiếu oxy nên vikhuẩn khử lưu huỳnh tạo ra khí độc H2S

Hydrosulfur (H2S) là chất khí, mùi trứng thối, hòa tan trong nước, khi tan thểhiện tính acid yếu Nó được hình thành trong lớp bùn đáy, ao dưới điều kiện yếmkhí, độc tính cao đối với thủy động vật H2S là một hợp chất không bền trong môitrường nước có chứa oxy và trong khoảng pH gần vùng trung hòa nó bị oxy hóathành SO42- theo con đường hóa học hoặc vi sinh H2S cũng có thể bốc hơi vàokhông khí khi nước được sục khí mạnh nhưng không nhiều do độ hòa tan của nótrong nước cao hơn nhiều so với các loại khí khác Khi tiếp xúc với một kim loạinặng như Fe, Zn, Cu sẽ tạo thành các hợp chất sulfide có độ hòa tan thấp, kết tủa vàlắng có màu đen trong đáy bùn, ao

Nước từ đáy bùn, ao có thể chứa lượng lớn H2S sinh ra từ quá trình khử SO4trong môi trường yếm khí H2S có thể bị khuếch tán tới lớp nước mặt và dễ tích tụ ởlớp nước sâu sát đáy Mặc dù dễ phân hủy trong môi trường yếm khí nhưng do tốc

2-độ phản ứng chậm nên chúng vẫn tồn tại trong nước dưới điều kiện hiếu khí ở mộtthời điểm nhất định nào đó

H2S là một chỉ tiêu quan trọng trong đánh giá chất lượng nước Tuy H2Skhôngảnh hưởng trực tiếp tới sức khỏe của các loại tôm, cá nuôi trong nước nhưng nếu ởmột hàm lượng cao, nó sẽ gây hại cho hệ sinh thái ao đầm và ảnh hưởng tới chất

lượng và sản lượng nuôi trồng bởi H2S là một chất khí cực độc đối với thủy sinhvật H2S liên kết với sắt trong thành phần của hemoglobine, không có sắt thìhemoglobine không có khả năng vận chuyển oxy cung cấp cho các tế bào, thủy sinhvật sẽ chết vì thiếu oxy Độ độc của H2S đối với cá phụ thuộc vào nhiều yếu tố như

pH, nhiệt độ của nước Theo Bonn và Follis (1957) thì ở nhiệt độ 25-30oC, pH = 6,8thì nồng độ H2S gây chết 50% cá sau 3 giờ thí nghiệm (LC50-3 giờ) là 0,8 mg/L.Còn pH bằng 7 thì LC50-3 giờ của khí H2S đối với cá Nheo bột Mỹ là 1,0 - 1,3 mg/

L đối với cá tiền trưởng thành và 1,4 mg/L đối với cá trưởng thành Ở những nồng

độ thấp hơn, khí H2S không gây độc hại trực tiếp nhiều đối với cá mà làm tiêu haonhiều oxy của môi trường (để oxy hóa hoàn toàn 1mg khí H2S thành SO42- phải tiêutốn đến 1,3 mg oxy của môi trường Trong mùa hè, khí H2S thường được hình thànhnhiều ở nền đáy thủy vực, hạn chế sự phát triển của nhiều loại động vật đáy, hạnchế thức ăn tự nhiên của một số loài cá, năng suất cá nuôi bị giảm Vào mùa đông,

sự tích lũy khí H2Sở đáy ao nhiều bùn gây nên hiện tượng thiếu oxy có thể dẫn đến

cơ có trong chất thải từ NTTS Quá trình phân hủy này được gọi là quá trình phânhủy ôxy hóa sinh hóa Có thể phân phương pháp này thành hai loại là: [3] [26]

Phương pháp hiếu khí: là phương pháp sử dụng các nhóm vi sinh vật hiếu khí.

Ðể đảm bảo hoạt động sống của chúng cần cung cấp oxy liên tục cho chúng và duytrì ở nhiệt độ khoảng 20 - 40 độ C

Phương pháp kị khí: là phương pháp sử dụng các vi sinh vật kị khí Trong xử

lý nước thải công nghiệp, phương pháp xử lý yếm khí được sử dụng rộng rãi

2.2.3.2 Phương pháp sử dụng hệ động thực vật để hấp thụ các chất ô nhiễm.

Bản chất của việc sử dụng hệ động, thực vật để loại bỏ các chất ô nhiễm dựatrên cơ sở quá trình chuyển hóa vật chất trong hệ sinh thái thông qua chuỗi thức ăn

Thông thường người ta sử dụng thực vật làm các sinh vật hấp thụ các chất dinhdưỡng là nitơ và photpho, cacbon để tổng hợp các chất hữu cơ làm tăng sinh khối(sinh vật tự dưỡng), đó là tảo hay thực vật phù du, rong câu và các loài thực vậtngập mặn khác.

Kế tiếp trong chuỗi thức ăn là các động vật bậc 1 - động vật ăn thực vật Ðiểnhình của các động vật bậc 1 ở vùng nước ven biển là các loại ngao, hàu các loài này

có thể tiêu thụ các thực vật phù du và cải thiện điều kiện trầm tích đáy Các loài cá

ăn thực vật phù du và mùn bã hữu cơ như cá măng, cá đối cũng được thử nghiệm sửdụng ở các kênh thoát nước thải

Rừng ngập mặn (RNM) là một hệ sinh thái ở vùng đất ngập nước rất phổ biến ởven biển Việt nam Có thể sử dụng RNM như một bể lọc sinh học các chất ô nhiễmhữu cơ từ chất thải đô thị, công nghiệp và nuôi trồng thủy sản Theo tính toán lýthuyết, ở điều kiện Việt Nam, 1ha RNM mỗi năm tăng trưởng 56 tấn sinh khối và

có thể hấp thụ được 219 kg nitơ, 20 kg photpho Ngoài ra, RNM với bộ rễ có cấutạo đặc biệt là nơi bẫy các trầm tích có chứa các kim loại nặng, các hóa chất bảo vệthực vật Thực vật ngập mặn cùng với toàn bộ hệ sinh thái trong RNM là một bể lọcsinh học đối với các chất thải từ hoạt đông nuôi trồng thủy sản ven biển [3] [26]Trong thực tế, để đảm bảo đạt hiệu suất xử lý cao các chất ô nhiễm với chi phívận hành tối thiểu, người ta thường sử dụng kết hợp nhiều phương pháp, kết hợpnhiều hệ thống và các tác nhân khác nhau Tùy theo hàm lượng chất ô nhiễm trongnước thải và điều kiện cụ thể của từng khu vực

Các hệ thống làm sạch nước thải trong điều kiện tự nhiên

 Hồ sinh học: được gọi là hồ oxy hóa hay hồ chứa lắng, bao gồm một chuỗi

từ 3 đến 5 hồ Trong hồ, nước thải được làm sạch bằng quá trình tự nhiên thông quacác tác nhân là tảo và vi khuẩn Hồ sinh học bao gồm các loại hồ:

a Hồ hiếu khí tự nhiên: độ sâu từ 0,2 - 0,4 m, diện tích đất rất lớn, chi phí vận

hành gần như bằng 0

Tải lượng BOD: 250 kg- 300 kg/ngày cho một diện tích hồ rộng khoảng 1 ha

Nước thải được đưa vào và thoát ra theo đường chéo của hồ sẽ tăng hiệu suất xử

lý hơn

b Hồ kỵ khí: độ sâu nước 2,4 -3,6 m, thời gian lưu nước từ 2-5 ngày Diện tích

nhỏ hơn chỉ khoảng 10-20% diện tích hồ hiếu khí

Nhiệt độ tối ưu: 30-350C, pH: 6,5-7,5, thời gian tối ưu là 5 ngày

2.3 VI KHUẨN OXY HÓA SULFUR VÀ ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÍ

SULFUR.

2.3.1 Đặc điểm vi khuẩn oxy hóa sulfur

Nhóm vi khuẩn oxy hóa sulfur được phát hiện năm 1887 do nhà khoa họcSergeri Winogradsky Ông đã tham gia nghiên cứu các đặc điểm sinh hóa của vikhuẩn oxy hóa lưu huỳnh trong các phòng thí nghiệm tại Bary Các vi khuẩn oxyhóa lưu huỳnh luôn gắn liền với sự xuất hiện của các hydro sulfur tự do trong tựnhiên Nhóm vi khuẩn oxy hóa sulfur sống chủ yếu trong môi trường hiếu khí vàmột số chủng lại sống trong điều kiện kị khí Chính vì vậy đặc điểm hình thái khuẩnlạc của nhóm vi khuẩn này khá đa dạng khuẩn lạc tròn, có màu trắng đục, màuvàng, màu hồng hoặc vàng đậm Hoặc khuẩn lạc bề mặt bóng, mép nhăn, nhớt và ănsâu vào mặt thạch [9] [20] [23]

Các loài vi khuẩn có khả năng oxy hoá các hợp chất lưu huỳnh vô cơ ở trạngthái khử như là sulfide (S2-), sulfur (S0) và thiosulfate (S2O32-) thành các hợp chấtsulfate được gọi là nhóm vi khuẩn oxy hoá sulfur hay nhóm vi khuẩn sulfur [9][20] [23]

Nhóm vi khuẩn này thuộc nhiều đơn vị phân loại với các đặc tính trao đổi chấtrất khác nhau Có thể chia thành 2 nhóm chính là vi khuẩn sulfur có màu (bao gồm

vi khuẩn sulfur tía và sulfur xanh) và vi khuẩn sulfur không màu (colorless sulfurbacteria)

Vi khuẩn sulfur có màu là nhóm vi khuẩn có sắc tố quang tổng hợp gắn vàomàng nội chất và nối với màng tế bào chất Hầu hết tất cả các loài thuộc nhóm nàyđều có sắc tố bacteriochlorophyll a và carotenoid 1, 3 hoặc 4 Dưới điều kiện kỵkhí, tất cả các loài vi khuẩn này đều có khả năng trao đổi chất quang địa tự dưỡngvới sulfide hoặc sulfur là chất nhận điện tử Nhiều loài có khả năng sử dụng

hydrogen phân tử như làm chất cho điện tử thay thế sulfur dạng khử Tất cả các loạithuộc nhóm này cũng có khả năng đồng hoá các chất hữu cơ như acetate vàpyruvate Nhiều loài có đặc điểm trao đổi chất là quang tự dưỡng bắt buộc trongđiều kiện kỵ khí Một số loài có khả năng sinh trưởng dị dưỡng dưới điều kiện vihiếu khí đến hiếu khí hoàn toàn Vi khuẩn sulfur có màu gồm nhiều loài vi khuẩn

khác nhau thuộc giống Chromatium, Thiocystis, Thiospirillum, Ectothiorhodospira,

Chlorobium, v.v…[20] [23]

Vi khuẩn sulfur không màu là vi khuẩn sinh trưởng tự dưỡng hay dị dưỡng dướiđiều kiện hiếu khí trong tối và sử dụng các hợp chất sulfur dạng khử làm nguồnnăng lượng Nhóm vi khuẩn này gồm hàng loạt các giống vi khuẩn thuộc các nhóm

phân loại khác nhau Chúng bao gồm các giống Thiobacterium, Thiobacillus,

Thiosphaera, Beggiatoa, Sulfolobus, Thermothrix, v.v [9] [10] [20]

2.3.2 Cơ sở của quá trình xử lí sulfur bằng vi khuẩn oxy hóa sulfur.

2.3.2.1 Chu trình chuyển hóa lưu huỳnh trong nước.

Chu trình lưu huỳnh trong nước là một vòng tuần hoàn quan trọng nhất đối vớicuộc sống thủy sinh Đây là cơ sở lý luận của việc sử dụng các loại vi khuẩn oxyhoá lưu huỳnh và khử lưu huỳnh để xử lý ô nhiễm H2S trong nước [4] [27]

Trong môi trường tự nhiên, lưu huỳnh tồn tại ở các dạng khác nhau, từ lưuhuỳnh phân tử ở dạng khí tới các hợp chất hữu cơ phức tạp như hydro sulfur,thiosulfate có trong môi trường Trong ao đầm NTTS, lưu huỳnh ở dạng hợp chất,trong thức ăn, sản phẩm bài tiết và xác chết của tôm, cá và bị phân hủy thành, SO32-,S2O3- hoặc SO42- bởi vi khuẩn oxy hoá sulfur Quá trình đó còn gọi là quá trình oxyhoá sulfur Sau đó được chuyển thành dạng H2S bởi vi khuẩn khử sulfur Các hợpchất sulfur được chuyển thành dạng lưu huỳnh phân tử thông qua quá trình khửsulfur

Hình 2.1: Vòng tuần hoàn lưu huỳnh (theo J.G.Black).

Vi khuẩn quang hợp dùng hợp chất lưu huỳnh làm chất cho electron để chuyển

hóa lưu huỳnh Đó là chức năng của Thiobacillus và các vi sinh vật tự dưỡng hóa

năng tương tự có khả năng chuyển hóa lưu huỳnh Ngược lại, khi sulfate khuếch tánđến môi trường có trạng thái khử thì chúng sẽ tạo cơ hội cho những nhóm vi sinhvật khác tiến hành khử sulfate Chẳng hạn, khi tồn tại một chất khử hữu cơ có thể sử

dụng được thì vi khuẩn Desulfovibrio sẽ dùng sulfur để làm chất oxy hóa, sử dụng

sulfate như chất nhận electron ngoại lai để hình thành sulfur tích lũy lại trong môitrường Đó là ví dụ điển hình của quá trình khử dị hóa và hô hấp kỵ khí Ngược lại,việc khử sulfur trong quá trình sinh tổng hợp amino acid và protein được coi là mộtquá trình khử đồng hóa Nhiều vi sinh vật khác cũng được biết đến là loại khử dị

hóa lưu huỳnh nguyên tố, đó là Desulfuromonas, cổ khuẩn ưa nhiệt, và cả các vi

khuẩn lam trong các trầm tích có độ muối cao Sulfur là một dạng trung gian quantrọng khác, nó có thể bị nhiều loại vi sinh vật oxy hóa khử thành sulfur, đó là các vi

khuẩn như Alteromonas, Clostridium và Desulfomaculum Vi khuẩn Desulfovibrio

thường được coi là loại kỵ khí bắt buộc Tuy nhiên các nghiên cứu gần đây cho biếtkhi chúng tồn tại trong môi trường có mức oxy hòa tan là 0,04% thì chúng cũng cóthể dùng oxy để hô hấp [4] [27]

Ngoài ra, các vi khuẩn oxy hóa lưu huỳnh thuộc nhóm tự dưỡng quang năng rấtquan trọng, có thể tác động mạnh trong điều kiện kỵ khí nghiêm ngặt dưới chiều sâu

của nước, một nhóm lớn các vi khuẩn khác nhau có thể thực hiện quang hợp hiếukhí không sinh oxy Trong môi trường nước biển và nước ngọt phát hiện thấy các vikhuẩn quang hợp hiếu khí không sinh oxy này sử dụng sắc tố bacterioclorophyl a vàcarotenoid, chúng thường là thành phần chính của khuẩn lạc vi sinh vật Các chi:

Erythromonas, Roseococcus, Porphyrobacter và Roseobacter [4] [27].

2.3.2.2 Cơ sở sinh học của quá trình xử lý sulfur

Trong môi trường nước tự nhiên sulfur tồn tại dưới dạng khí H2S được hòa tantrong nước Khi đó quá trình lưu hóa hay oxy hóa lưu huỳnh (sulfur oxydation) có

sự tham gia của vi khuẩn lưu hóa và vi khuẩn lưu hùynh ôxy hóa H2S, S, FeSO4thành gốc sulfat và năng lượng [4] [26]

- Vi khuẩn lưu hóa: Những loài thuộc chi Thiobacillus có thể oxy hóa lưu

huỳnh phân tử hoặc sulfur để thu năng lượng, sinh ra H2SO4, đồng hóa CO2 và tổnghợp nên chất hữu cơ, thường bên trong tế bào không chứa trữ các hạt lưu huỳnh,

như Thiobacillus thiooxidans chẳng hạn:

2S + 3O2 + 2H2O → 2H2SO4 + năng lượng

Na2S 2O 3 + 2O2 + H2O → Na2SO4 + H2SO4+ năng lượng

H2S + O2 → 2H2O + năng lượng

Vi khuẩn Thiobacillus ferrooxydans có thể thu được năng lượng từ FeSO4 quatrình oxy hóa thành Fe2(SO4)3:

4FeSO4 + O2 + H2SO4→ 2 Fe2(SO4)3 + H2O

Vi khuẩn Thiobacillus ferrooxydans chịu được acid mạnh, Fe2(SO4)3 lại là chất

dễ hòa tan, vì vậy có thể dùng vi khuẩn này để tách được đồng, sắt ra từ các dạng xỉquặng hay quặng nghèo:

FeS + 7 Fe2(SO4)3 + 8 H2O → 15 FeSO4 + 8 H2SO4

Cu2S + 2 Fe 2(SO4)3 → 2Cu SO4 + 4 FeSO4 + S

Vi khuẩn lưu huỳnh: Có thể oxy hóa H2S thành S và tích trữ hạt S trong tế bào.Khi môi trường thiếu H2S, chúng sẽ oxy hóa tiếp S thành H2SO4 năng lượng sinh rađược dùng để cố định CO2

2 H2S + O2 → 2S + 2 H2O + năng lượng

cơ chất khác nhau từ tinh bột, cellulose, hợp chất nitơ, kim loại nặng …Thực chấtcủa phương pháp này là nhờ hoạt động sống của vi sinh vật (sử dụng một số hợpchất hữu cơ, chất khoáng có trong nước ô nhiễm làm nguồn dinh dưỡng và nănglượng) để biến đổi các chất hữu cơ cao phân tử trong nước ô nhiễm thành các hợpchất đơn giản hơn, ít ảnh hưởng đến môi trường hơn [3] [6] [27]

Trong nuôi trồng thuỷ sản sulfur là thành phần được quan tâm nhiều bởi vì tầmquan trọng của nó trong các chất cặn thiếu khí Trong điều kiện hiếu khí, lưu huỳnhhữu cơ bị phân hủy thành sulfur rồi sau đó bị oxy hóa thành sulfur Sulfur tan rấtmạnh trong nước và phân tán trong các cặn bã Sự oxy hóa sulfur liên quan đến các

vi sinh vật trong lớp bùn Trong điều kiện kỵ khí, sulfate được sử dụng là chất nhậnđiện tử trong quá trình trao đổi chất của vi sinh vật Quá trình này dẫn đến việc sảnsinh ra khí H2S H2S được sản sinh qua nhiều bước trung gian liên quan đến quá

H2S là thành phần tan trong nước nên sự tích lũy H2S trong nước là nguyên nhângây hủy hoại mang và các triệu chứng khác ở tôm và cá H2S ở dạng tự do là mộtchất cực kỳ độc với tôm và cá ở nồng độ bình thường trong nước tự nhiên cũng nhưnước ao nuôi Các thử nghiệm sinh học trên nhiều loài đã chứng minh rằng, ở bất kỳnồng độ H2S nào trong nước đều ảnh hưởng lớn đến sự sản xuất động vật thủy sản.[3] [6] [27]

Một số vi khuẩn sống ở tầng đáy có khả năng xử lý H2S được sử dụng rộng rãitrong nuôi trồng thủy sản để duy trì điều kiện nước ao nuôi Một trong những chủng

có hiệu quả trong việc xử lý H2S là Rhodopseudomonas Quá trình loại bỏ H2S đượcthực hiện theo quá trình như sau:

Việc xử lý sinh học với độc tính của H2S vi khuẩn có thể nuôi cấy để tạo sinhkhối và được đưa vào ao dưới dạng probiotic

Một số chế phẩm sinh học (men vi sinh) thường được sử dụng trong ao sẽ làmgiảm nguy cơ độc tính của hydrogen sulfur thông qua quá trình điều chỉnh sinh học,giảm thiểu lớp bùn tích tụ ở đáy ao, dẫn đến giảm nguồn hình thành hydrogensulfur

Đã có nhiều nghiên cứu hướng đến việc nâng cao chất lượng nước ao nuôi bằngcách ứng dụng các enzyme hoặc các vi sinh vật có lợi vào trong ao nuôi, gọi là

“điều chỉnh sinh học” Điều chỉnh sinh học được định nghĩa là quá trình sử dụngmột lượng vi sinh vật có lợi - chế phẩm sinh học và các enzyme phù hợp để thảxuống các ao nuôi nhằm tăng cường sự phân hủy chất hữu cơ và loại bỏ các tạpchấp khác không cần thiết trong ao, giảm sự tích tụ của các chất cặn bã và bùn đáy,làm tăng lượng oxy hòa tan trong nước ao nuôi nhờ vậy chất lượng nước trong aonuôi được cải thiện, giúp tăng sản lượng nuôi [3] [6] [27]

Vi khuẩn quang hợp phá vỡ hydrogen sulfur ở đáy ao đã được sử dụng rộng rãitrong nuôi trồng thủy sản để duy trì môi trường nước thích hợp Các vi khuẩn nàybao gồm bacteria - chlorophyll hấp thụ ánh sang và thực hiện quá trình quang hợptrong điều kiện kỵ khí Chúng là các vi khuẩn lưu huỳnh màu tía có thể phát triểntrong điều kiện kỵ khí ở đáy ao Vi khuẩn quang hợp không lưu hình màu tím có thểphân hủy các chất hữu cơ, H2O, NO2 và các chất thải độc hại trong ao Vi khuẩn lưuhuỳnh màu tía phân nhỏ hydrogen sulfur để tận dụng bước sóng của ánh sáng không

bị thực vật phù du hấp thụ Vi khuẩn lưu huỳnh màu tía lấy các hạt electron từhydrogen sulfur ở mức năng lượng thấp hơn H2O chia nhỏ sinh vật quang tự dưỡng,

do vậy đòi hỏi cường độ ánh sáng thấp hơn cho quá trình quang hợp [3] [6] [27]

Phần 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Địa điểm nghiên cứu: Trạm nghiên cứu biển Đồ Sơn

- Địa điểm lấy mẫu: khu vực đầm nuôi trồng thủy sản, rừng ngập mặn tại Bàng

La, và khu vực đền Bà Đế

- Thời gian nghiên cứu: Tháng 12/2015- 5/2016

3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU.

- Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính oxy hóa sulfur cao

- Xác định đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn oxy hóa sulfur phân lậpđược

- Thử nghiệm đánh giá khả năng xử lý H2S của vi khuẩn oxy hóa sulfur trongthí nghiệm mô phỏng

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

3.3.1 Sơ đồ phân tích

3.3.2 Phương pháp thu mẫu

Về nguyên tắc cần thu mẫu sao cho mẫu thu được có tính đại diện cho khốinước cần kiểm nghiệm Do chủng loại và mật độ vi sinh vật trong nước thay đổi rấtnhiều theo bề mặt, độ sâu và chất lượng nước nên cần đánh giá chất lượng chung về

vi sinh vật, khi thu mẫu nước cần chọn nhiều vị trí thu mẫu khác nhau

Trên bình chứa cần ghi chú rõ ràng, đầy đủ các thông tin cần thiết liên quan đếnmẫu (địa điểm, thời gian, mục đích, người thu…)

Thử khả năng làm giảm pH của

một số chủng

Chuyển vào môi trườngdịch thể Na2S2O3

Sau 1-3 ngày ktra nồng độ SO4

2-tăng lên trong mt Chọn khuẩn lạc có hoạt tính cao

Xác định hình thái, đặc điểmsinh hóa, sinh lí, phân loại Giữ giốngKhả năng xử lý H2S trong môi

trường bị ô nhiễm

Mẫu nên được phân tích trong vòng 6 giờ sau khi thu mẫu Trường hợp khôngthực hiện phân tích ngay thì cần bảo quản mẫu ở 0 – 5oC trong tủ lạnh và ta nênphân tích trong vòng từ 6 – 8 giờ [8].

 Các vật liệu cần chuẩn bị để lấy mẫu: Dụng cụ lấy mẫu (chai nhựa, lọ thủy

tinh đã khử trùng), cồn, bông vô trùng, xô đựng, túi đựng mẫu, thùng làmlạnh

- Khu vực Đền Bà Đế - Đồ Sơn

- Đầm nuôi trồng thủy sản tại Bàng La – Đồ Sơn

- Rừng ngập mặn tại khu vực Bàng La – Đồ Sơn

- Dùng lọ nhựa lấy 50ml mẫu tại các điểm đã định

- Mỗi lọ đều ghi đầy đủ các thong số: vị trí lấy mẫu, ngày, giờ lấy mẫu

- Bảo quản mẫu ở nhiệt độ 0-5ºC trong thùng làm lạnh

- Mẫu nên phân tích trong vòng 48h kể từ khi lấy mẫu

- Nhiệt độ nước được đo bằng nhiệt kế thuỷ ngân chuyên dụng hoặc máy đonhiệt độ, chính xác đến 0,10C

- Độ muối của nước biển (S ‰) xác định bằng máy đo độ muối - khúc xạ kếcầm tay (Hand Refrectometer) với độ chính xác đến 1‰

- pH của nước được đo bằng máy đo pH, chính xác đạt 0,01 đơn vị

- Oxy hòa tan trong nước được đo bằng máy đo oxy hoặc chuẩn độ theophương pháp Winkler, chính xác đến 0,01 mg/l

3.3.3 Phương pháp nuôi cấy và phân lập

Vi khuẩn ôxy hoá sulfur sau khi được làm giàu bằng môi trường Thiosulfatedịch sẽ được phân lập trên thạch đĩa bằng phương pháp cấy trải và ria cấy 3 pha.Chọn khuẩn lạc đặc trưng dựa trên đặc điểm hình thái, kích thước, màu sắc để thuầnkhiết và test hoạt tính để nghiên cứu khả năng xử lý H2S trong môi trường nước bị ônhiễm

Môi trường Thiosulfate dịch thể phân lập vi khuẩn oxy hóa sulfur

Khi làm môi trường, chú ý điều chỉnh pH về 7 -7,2

Các loại môi trường sau khi pha cần hấp khử trùng 1210C,15 phút, dry: 15 phút

Trong các thử nghiệm phân lập được lấy từ các mẫu khác nhau của vi khuẩnoxy hóa lưu huỳnh vừa bị oxy hóa Trong số đó, chủng phân lập được lựa chọn dựatrên khả năng giảm độ pH tốt hơn trên xanh bromophenol chứa sulfur oxy hóa trong

dịch thể bằng cách thay đổi màu sắc của các môi trường nuôi cấy từ màu xanh tímsang màu vàng nhạt dần Các vi khuẩn oxy hóa sulfur phân lập được từ các mẫu đãthu có thể làm giảm độ pH lên đến 4,3 - 4,2 từ pH ban đầu 8,0 môi trườngthiosulphate trong vòng 1 tuần Giảm độ pH của môi trường phát triển của vi khuẩnoxy hóa lưu huỳnh đã được báo cáo bởi Donati et al [21] Việc giảm độ pH của môitrường là do sự sản xuất axit sunfuric

Stock MgSO4 1000 ppm: Hòa tan 0,1025 MgSO4.7H2O trong 50 ml nước cất

Xây dựng đường chuẩn sulfate [13]

Từ dung dịch stock tạo ra 6 ống nghiệm tiêu chuẩn với nồng độ 10, 20, 40, 60,

80, 100 mg/l Bổ sung vào mỗi ống nghiệm tiêu chuẩn 5 ml nước cất và 2,5ml thuốcthử, rồi khuấy nhẹ

Mẫu đối chứng là nước cất và tiến hành tương tự như mẫu thí nghiệm Bổ sungvào mỗi ống nghiệm 0,75g BaCl2 rồi khuấy nhẹ trong vòng 1 phút

Cuối cùng, tiến hành xác định hàm lượng sulfate trên máy quang phổ tại bướcsóng 420nm Từ các kết quả đo được, ta lập được đường chuẩn sulfate như:

Cách xác định hàm lượng sulfate - [13]

Mẫu thí nghiệm: Hút 5ml dịch nuôi rồi bổ sung thêm 5 ml nước cất và 2,5mlthuốc thử, rồi khuấy nhẹ Sau đó, bổ sung 0,75g BaCl2 vào rồi khuấy nhẹ trongvòng 1 phút Cuối cùng, tiến hành xác định hàm lượng sulfate trên máy quang phổtại bước sóng 420 nm

Mẫu đối chứng: làm tương tự như vậy môi trường nuôi cấy Lượng sulfate đượctính theo đường chuẩn sulfate:

Hàm lượng sulfate (mg/l) = 524.35*x – 5.89

Đường chuẩn sunfat

Biểu đồ 3.1: Đường chuẩn xác định nồng độ sunfat.

Kết quả sau đó được xử lý bằng phần mềm Microsoft office excel

3.3.4 Phương pháp phân tích đặc điểm sinh học

3.3.4.1 Phương pháp xác định hình thái

Phương pháp nhuộm Gram: Theo phương pháp Hucker cải tiến [Smith CA,

Hussey AM (2005) Gram Stain Protocols American society for microbiologyConference for Undergraduate Educators – American [20]

- Cố định tế bào vi khuẩn bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn (2-3 lần)

- Nhỏ tiếp một giọt tím tinh thể phủ lên trên vết bôi trong 1 phút, rửa nướcthấm khô

- Nhỏ vài giọt lugol cho phủ đều vết bôi trong 1 phút

- Rửa nhanh bằng cồn 96o tới khi hết màu tím