Thử nghiệm nuôi cấy nấm men rhodotorula sp trong môi trường lỏng, trích ly β carotenoid từ sinh khối nấm men rhodotorula sp bằng dầu thực vật

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng TàuTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÀ RỊA-VŨNG TÀU KHOA HOÁ HỌC & CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM ĐINH THỊ BÍCH PHƯỢNG THỬ NGHIỆM NUÔI CẤY NẤM MEN RHODOTORULA SP.. bằng dầu thực vât” được

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÀ RỊA-VŨNG TÀU

KHOA HOÁ HỌC & CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

ĐINH THỊ BÍCH PHƯỢNG

THỬ NGHIỆM NUÔI CẤY NẤM MEN RHODOTORULA SP TRONG

MÔI TRƯỜNG LỎNG, TRÍCH LY β-CAROTENOID TỪ SINH KHỐI

NẤM MEN RHODOTORULA SP BẰNG DẦU THỰC VẬT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC Ngành CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Người hướng dẫn

CN PHẠM THỊ HỮU HẠNH

Vũng Tàu, Năm 2012

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

LỜI MỞ ĐẦU

Để đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng ngày càng cao của xã hội, ngành Công nghệ thực phẩm luôn nổ lực tìm ra những nguồn dưỡng chất mới có lợi với cơ thể con người Do đó, Công nghệ thực phẩm đã trở thành một ngành quan trọng bởi tính thiết thực mà nó đem lại Sự phát triển ngành Công nghệ thực phẩm cũng kéo theo sự phát triển của ngành sinh học, môi trường, y dược

Carotenoid là tiền sắc tố của Vitamin A, Vitamin A có vai trò quan trọng đối với sức khỏe của con người và vật nuôi Nhưng khác với thực vật, con người và vật nuôi không thể tự tổng hợp được nguồn sắc tố này mà phải được đưa vào bằng con đường thức ăn Do đó việc bổ sung carotenoid từ thiên nhiên là rất cần thiết

Trong các nguồn carotenoid được sản xuất hiện nay, carotenoid có nguồn gốc từ vi sinh vật được quan tâm hàng đầu bởi hiệu quả kinh tế mà nó đem lại Trong số đó, các

nhà khoa học đã chứng minh sinh khối nấm men Rhodotorula sp có chứa carotenoid khá

cao, ngoài ra còn có thể thu nhận được thêm protein, lipid đáng kể

Nhằm mục đích khảo sát, đánh giá khả năng thích nghi của nấm men Rhodotorula

sp trong môi trường lỏng, khả năng thu nhận β-carotenoid từ sinh khối nấm men

Rhodotorula sp nên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Thử nghiệm nuôi cấy nấm men Rhodotorula sp trong môi trường lỏng, trích ly β-carotenoid từ sinh khối nấm men Rhodotorula sp bằng dầu thực vât” được đặt ra các nhiệm vụ cụ thể sau:

- Nghiên cứu môi trường thích hợp để nuôi cấy nấm men Rhodotorula sp đạt

được hiệu suất cao

- Nghiên cứu dung môi để trích ly β-carotenoid từ nấm men Rhodotorula sp

đạt hiệu suất cao mà không ảnh hưởng đến tính chất của β-carotenoid

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học này, em xin chân thành cảm ơn sự hổ trợ kinh phí của Ban giám hiệu trường đại học Bà Rịa-Vũng Tàu giúp em có điều kiện nghiên cứu và phát triển đề tài

Em cũng xin cảm ơn Ban lãnh đạo Khoa, quý Thầy, Cô giảng dạy đã quan tâm, giúp

đỡ, cố vấn cho em những kiến thức chuyên môn

Em xin chân thành cảm ơn cô Phạm Thị Hữu Hạnh đã tạo điều kiện giúp đỡ và định hướng cho em trong quá trình tìm hiểu tài liệu và hoàn thành bài báo cáo này

Em cũng xin gởi lời cảm ơn chân thành đến thầy Nguyễn Minh Nhựt quản lí phòng thí nghiệm của khoa Hóa học và Công nghệ thực phẩm đã hỗ trợ, giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài

Tuy nhiên, trong quá trình làm đề tài và hoàn thành báo cáo em không tránh khỏi những sai sót và khuyết điểm, kính mong sự góp ý của quý thầy cô để em hoàn thiện

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

TRƯỜNG ĐH BÀ RỊA VŨNG TÀU CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

KHOA HÓA HỌC & CNTP Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

-o0o -

NHIỆM VỤ ĐỀ TÀI KHOA HỌC

Họ và tên sinh viên: Đinh Thị Bích Phượng MSSV: 0852020075

Ngày, tháng, năm sinh: 02/07/1987 Nơi sinh: Đồng Tháp

Ngành: Công nghệ thực phẩm

1 TÊN ĐỀ TÀI: Thử nghiệm nuôi cấy nấm men Rhodotorola sp trong môi trường

lỏng, trích ly β-carotenoid từ sinh khối nấm men Rhodotorula sp bằng dầu thực vật

2 NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

 Nghiên cứu môi trường thích hợp để nuôi cấy nấm men Rhodotorula sp đạt được

hiệu suất cao

 Nghiên cứu dung môi để trích ly β-carotenoid từ nấm men Rhodotorula sp đạt

hiệu suất cao mà không ảnh hưởng đến tính chất của β-carotenoid

3 NGÀY GIAO NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN: 30/02/2012

4 NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 30/05/2012

5 HỌ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: CN Phạm Thị Hữu Hạnh

Bà Rịa – Vũng Tàu, Ngày tháng năm2012

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

(Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên)

TRƯỞNG BỘ MÔN TRƯỞNG KHOA

(Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên)

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

c điểm hình thái 1 1.1.3 Đặ

c diểm sinh lý 1 1.1.4 Đặ

c điểm sinh hóa 3 1.1.5 Kh

ả năng sinh tổng hợp carotenoid của Rhodotorula sp 4

1.2 Đặ

c tính carotenoid 7 1.3 Cá

c lý thuyết cơ bản 8 1.3.1 Trí

ch ly 8 1.3.1.1 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình trích ly 8 1.3.1.2 Điều kiện chọn dung môi 9 1.3.2 Sấ

y 9 1.3.3 Ly

tâm 9 1.4 Cá

c yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy nấm men Rhodotorula sp 10

1.4.1 Ản

h hưởng của nguồn giống 10

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

1.4.2 Ản

h hưởng của điều kiện nuôi cấy 10

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Đối tượng nghiên cứu 12

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 12

2.1.2 Dụng cụ và hóa chất 12

2.2 Phương pháp nghiên cứu 13

2.2.1 Sơ đồ nuôi cấy nấm men ở môi trường lỏng 13

2.2.2 Thuyết minh quy trình 13

2.2.2.1 Nấm men Rhodotorula sp 13

2.2.2.2 Tăng sinh 14

2.2.2.3 Chuẩn bị môi trường 14

2.2.2.4 Hấp 14

2.2.2.5 Cấy giống 14

2.2.2.6 Sục Khí 14

2.2.2.7 Ly tâm 14

2.2.2.8 Thu sinh khối nấm men Rhodotorula sp 14

2.3 Nội dung thí nghiệm 14

2.3.1 Thí nghiệm 1 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ cấy giống, thời gian nuôi đến số lượng tế bào của nấm men ở MT1 15

2.3.2 Thí nghiệm 2 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ cấy giống, thời gian nuôi đến số lượng tế bào của nấm men ở MT2 15

2.3.3 Thí nghiệm 3 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ cấy giống, thời gian nuôi đến số lượng tế bào của nấm men ở MT3 16

2.3.4 Thí nghiệm 4 Khảo sát lượng sinh khối thu được của nấm men Rhodotorula sp ở cả 3 môi trường 17

2.4 Sơ đồ quy trình trích ly β-carotenoid 17

2.5 Thuyết minh quy tình 18

2.5.1 Nguyên liệu 18

2.5.2 Sấy 18

2.5.3 Trích ly 18

2.5.4 Dịch trích 18

2.5.5 Ly tâm 18

2.6 Nội dung thí nghiệm 18

2.6.1 Thí nghiệm 5 Khảo sát tỉ lệ dung môi: mẫu, nhiệt độ và thời gian ảnh hưởng đến quá trình trích ly của dung môi dầu đậu nành tinh luyện 18

2.6.2 Thí nghiệm 6 Khảo sát tỉ lệ dung môi: mẫu, nhiệt độ và thời gian ảnh hưởng đến quá trình trích ly của dung môi dầu hướng dương tinh luyện 19

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

3.1.Xác định tỉ lệ giống, thời gian nuôi đến số lượng tế bào của nấm men ở MT1 21

3.2 Xác định tỉ lệ giống, thời gian nuôi đến số lượng tế bào của nấm men ở MT2 22

3.3 Xác định tỉ lệ giống, thời gian nuôi đến số lượng tế bào của nấm men ở MT3 23

3.4 Thu nhận sinh khối nấm men trên các môi trường lỏng 25

3.5 Xác định tỉ lệ dung môi: mẫu thích hợp cho quá tình trích ly β-carotenoid 27

3.6 Xác định thời gian và nhiệt độ thích hợp cho quá trình trích ly β-carotenoid 29

3.6.1 Dung môi dầu nành 29

3.6.2 Dung môi dầu hướng dương 30

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 31

4.1 Kết luận 31

4.2 Đề nghị 34

TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 1 PHỤ LỤC 2

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

TÓM LƯỢC

Đề tài “ Thử nghiệm nuôi cấy nấm men Rhodotorula sp trong môi trường lỏng,

trích ly β-carotenoid từ sinh khối nấm men Rhodotorula sp bằng dầu thực vật ” được

tiến hành và thu thập số liệu tại phòng thí nghiệm khoa Hóa học và Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Bà Rịa – Vũng Tàu Với mục đích là khảo sát các vấn đề sau:

 Quá trình nuôi:

Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ giống: 10%,15%, 20% và thời gian nuôi 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ, 72 giờ, 78 giờ, 84 giờ đến lượng tế bào của nấm men ở MT1, MT2, MT3

Kết quả cho lượng tế bào tốt nhất ở tỉ lệ giống 15%, thời gian nuôi 72 giờ với cả MT1, MT2, MT3

 Quá trình trích ly:

Khảo sát quá trình trích ly bằng dung môi dầu nành và dầu hướng dương tinh luyện:

- Tỉ lệ dung môi: mẫu là: 9:1, 10:1, 11:1

- Khảo sát Nhiệt độ là 70°C, 80°C, 90°C

- Thời gian trích ly 90 phút, 120 phút 150 phút, 180 phút

Kết quả thu hồi β-carotenoid tốt nhất ở cả 2 loại dung môi là tỉ lệ 10:1, nhiệt độ 80°C với thời gian là 120 phút

Từ những yếu tố trên mục đích cuối cùng là nghiên cứu môi trường thích hợp để

nuôi cấy nấm men Rhodotorula sp., nghiên cứu dung môi để trích ly β-carotenoid từ nấm men Rhodotorula sp đạt hiệu suất cao mà không ảnh hưởng đến tính chất của β-

carotenoid

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Giới hạn nhiệt độ của một số loài Rhodotorula sp 2

Bảng 1.2 Khả năng đồng hóa carbon của Rhodotorula sp 4

Bảng 1.3 Các nghiên cứu về khả năng tổng hợp carotenoid và βCR của nấm men Rhodotorula sp theo phương pháp nuôi cấy chìm 6

Bảng 1.4 Sắc tố carotenoid do Rho glutinis DBVPG 3853 tổng hợp được sau 120 giờ trên môi trường nước ép nho ở các nhiệt độ khác nhau 10

Bảng 3.1 Số lượng tế bào Rhodotorula sp thu được ở các thời gian khác nhau của MT1 21

Bảng 3.2 Số lượng tế bào Rhodotorula sp thu được ở các thời gian khác nhau của MT2 22

Bảng 3.3 Số lượng tế bào Rhodotorula sp thu được ở các thời gian khác nhau của MT3 23

Bảng 3.4 Lượng sinh khối nấm men Rhodotorula sp trên các môi trường lỏng 26

Bảng 3.5 Hàm lượng βCR thu được của dầu nành 27

Bảng 3.6 Hàm lượng βCR thu được của dầu hướng dương 27

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ VÀ HÌNH

Sơ đồ

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ nuôi cấy nấm men ở môi trường lỏng 13

Sơ đồ 2.2 Sơ đồ trích ly βCR 17

Sơ đồ 4.1 Sơ đồ nuôi cấy chính của nấm men ở môi trường lỏng 32

Sơ đồ 4.2 Sơ đồ chính của quá trình trích ly βCR 33

Biểu đồ Biểu đồ 1 Đường cong sinh trưởng của nấm men Rhodotorula sp ở MT1 21

Biểu đồ 2 Đường cong sinh trưởng của nấm men Rhodotorula sp ở MT2 23

Biểu đồ 3 Đường cong sinh trưởng của nấm men Rhodotorula sp ở MT3 24

Biểu đồ 4 So sánh 3 đường cong sinh trưởng của nấm men Rhodotorula sp ở cả 3 môi trường đối với điều kiện tốt nhất 25

Biểu đồ 5 Lượng sinh khối Rhodotorula sp trên các môi trường lỏng 26

Biểu đồ 6 Biểu đồ biểu diễn sự ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi: mẫu đến hiệu suất thu hồi βCR bang dầu nành và dầu hướng dương 28

Biểu đồ 7.Biểu đồ biểu diễn sự ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ đến hiệu suất thu hồi βCR của dung môi dầu đậu nành 29

Biểu đồ 8 Biểu đồ biểu diễn sự ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ đến hiệu suất thu hồi βCR của dung môi dầu hướng dương 30

Hình Hình 1.1 quá trình tổng hợp βCR, torulene và torularhodin từ acety CoA của Rhodotorula sp 5

Hình i.1 Máy lắc ngang

Hình i.2 Máy ly tâm

Hình i.3 Bể điều nhiệt

Hình i.4 Máy đo quang

Hỉnh i.5 Nuôi nấm men Rhodotorula sp trong các môi trường lỏng

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

Hình i.6 Môi trường lỏng chứa nấm men sau thời gian nuôi 72 giờ

Hình i.7 Sinh khối sau khi ly tâm

Hình i.8 Sinh khối sau khi sấy

Hình i.9 : Mẫu dầu hướng dương chứa βCR sau khi trích ly

Hình i.10 : Mẫu dầu hướng dương chứa βCR sau khi trích ly

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CFU : đơn vị hình thành khuẩn lạc

DM : dung môi

Dầu HD : dầu hướng dương

Dầu ĐN : dầu đậu nành

NĐT : nhiệt độ thường

MT : môi trường

OD : mật độ quang

βCR : β-carotenoid

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Phan Tú Anh (2003) – “Sinh tổng hợp sinh khối Rhodotorula giàu protein – carotenoid” – Báo cáo tổng kết nghiệm thu đề tài chương trình vườn ươm

sáng tạo khoa học kỹ thuật trẻ - Sở khoa học công nghệ

[2] Nguyễn Trọng Cẩn và cộng sự (1998) – “ Công nghệ enzyme” NXB Nông

Nghiệp TP.HCM

[3] Phạm Xuân Hưng (2003) – “Khảo sát các thành phần sinh hóa trong sinh khối nấm men Rhodotorula sp., và thử nghiệm bổ sung bột dinh dưỡng trẻ em”-

Đại học khoa học Tự Nhiên

[4] Lê Văn Việt Mẫn và cộng sự (2010) “Công nghệ chế biến thực phẩm”

NXB Đại học Quốc Gia TP.HCM

[5] Huỳnh Thị Nga (2011) – “Nghiên cứu quá trình chiết rút astaxanthin từ phế liệu tôm bằng dầu thực vật” Đồ án tốt nghiệp – Trường Đại Học Bà Rịa -

Vũng Tàu

[6] Nguyễn Thị Minh Nguyệt (2001) – “Nghiên cứu đặc điểm sinh học và khả năng tạo sinh khối từ rỉ đường của chủng nấm men phân lập trên bề mặt lá dăm bụt tại Việt Nam” Luận văn Thạc Sỹ – Trường Đại Học Bách Khoa TP.HCM

[7] Nguyễn Thị Minh Nguyệt (2011) – “Nghiên cứu tuyển chọn Rhodotorula

có khả năng sinh tổng hợp β-carotenoid trên môi trường bán rắn làm thức ăn bổ

sung cho gà đẻ trứng ” Luận văn Tiến Sỹ – Trường Đại Học Bách Khoa

TP.HCM

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

[8] Hoàng Thị Thảo Nhi (2009) – “Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp Carotenoid của nấm men Rhodotorula sp.CBS10104 trên lõi bắp theo kỹ thuật nuôi cấy bán rắn” Luận văn tốt nghiệp - Đại học Tôn Đức Thắng

[9] Nguyễn Thị Việt Oanh (2008) – “Nghiên cứu nuôi cấy phối hợp nấm mốc Monascus với nấm men Rhodotorula theo phương pháp lên men bề mặt”– Luận

văn tốt nghiệp - Đại học mở TP.HCM

[10] Lương Đức Phẩm (2006) – “ Nấm men công nghiệp” – Nhà xuất bản khoa

[13] Trương Vĩnh (2010) - “Lý thuyết và thực hành thống kê”, Vũng Tàu

[14] Kelly C.E and Harmon A.W., 1972 : Fish Bull, page 111-113

[15] Meyers P and Thibodeaux P., 1983 J Aquaricultule & Aquatic Sceinces, III (4), page 64-70

[16] Yuan, J.P and Chen,” Purification of trans – astaxanthin from a high – yielding astaxanthin ester product strain of the microalga Haematococcus pluvilis”, J Agric Food, 2000, page 443-448

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

PHỤ LỤC 1

1 Các môi trường lỏng nghiên cứu: [3]

Nấm men Rhodotorula sp được nhân giống trong 3 môi trường lỏng

- Thêm nước dừa cho đủ 1 lít, chỉnh pH 5,0

- Thêm vài giọt dầu chống bọt

- Hấp khử trùng ở 121°C trong 20-30 phút

 Môi trường 2:

Glucose 45g

Cao nấm men 1,5g

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

Các môi trường sẽ được tiến hành trong phòng thí nghiệm phải đảm bảo điều kiện thuận lợi và tránh sự lây nhiễm từ bên ngoài Để làm được điều đó thì trước khi nuôi cấy cần khử trùng dụng cụ và hấp khử trùng môi trường

2 Phương pháp xác định trực tiếp số lượng tế bào bằng buồng đếm hồng cầu: [12] 2.1 Cấu tạo buồng đếm hồng cầu:

Buồng đếm hồng cầu là một phiến kính dày hình chữ nhật, giữa là phần lõm phẳng, tại đây có kẻ một lưới gồm 400 hình vuông nhỏ có diện tích tổng cộng là 1mm2

Ô trung tâm được khoanh tròn và có 25 ô vuông lớn, mỗi ô vuông lớn có 16 ô vuông nhỏ Vì thế diện tích 1 ô vuông nhỏ là 1/400 mm2 và một ô vuông lớn là 1/25 mm2

2.2 Cách tiến hành:

Lắc mạnh dịch huyền phù tế bào, nhỏ một giọt lên bề mặt buồng đếm kề với cạnh lame nhờ một pipep Pasteur Dịch huyền phù sẽ đi thẳng vào buồng đếm nhờ cơ chế mao dẫn Buồng đếm được chuẩn bị đúng khi chỉ có vùng không gian nằm giữa lame và buồng đếm được điền bởi dịch huyền phù tế bào Còn các rãnh xung quanh thì không bị dính ướt

Di chuyển nhẹ nhàng khung đếm để dịch huyền phù tràn đầy các khoang Khi đó dịch nằm trong khoang có độ dày khoảng 0,1mm

Đặc buồng đếm lên bàn kính hiển vi

Điều chỉnh cường độ ánh sáng để có thể quan sát rõ ràng cả tế bào lẫn các đường kẻ Tùy thuộc vào số lượng tế bào mà có thể chọn cách đếm tất cả các tế bào có trong ô trung tâm hay chỉ đếm các tế bào có trong một số các ô vuông lớn đại diện

Bắt đầu đếm tế bào sau khi nhỏ giọt từ 3-5 phút, phải đếm các tế bào nằm trên đường

kẻ nhưng không được lặp lại khi chuyển qua đếm tế bào trên một ô kế cận

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

N = [(a/b) x 400/0,1] x 103 x 10nTrong đó:

- N: số lượng tế bào trong 1ml mẫu nghiên cứu (CFU/ml)

- a: số tế bào trong 5 ô vuông lớn (80 ô vuông nhỏ)

- b: số ô vuông nhỏ trong 5 ô vuông lớn (16 x 5 = 80 ô vuông nhỏ)

- 400: tổng số ô vuông nhỏ trong ô trung tâm

- 0,1: thể tích dịch tế bào

- 103: số chuyển mm3 thành ml (1000mm3 = 1ml)

- 10n: độ pha loãng mẫu

3 Phương pháp xác định hàm lượng β-carotene: [5 ,14, 15, 16]

Cân chính xác 1g sinh khối nấm men Rhodotorula sp sau khi đã sấy khô (độ ẩm

5,998%) vào erlen 250ml, cho dầu vào theo tỉ lệ thí nghiệm 3 Hỗn hợp trên được cho vào bể điều nhiệt ở thời gian và nhiệt độ yêu cầu thí nghiêm 4 (lưu ý: là bể điều nhiệt

đã được đưa đến nhiệt độ như yêu cầu rồi) Sau khi trích ly ta tiến hành ly tâm ở 3000 vòng/phút để lấy được dịch trích không bị cặn Xác định thể tích dung dịch dầu chứa βCR, hút 3ml đem đi đo quang (tùy thuộc mức độ đậm đặc của dịch trích mà pha loãng cho phù hợp) Dung dịch sau khi pha loãng được đem đi đo độ hấp thụ màu trên máy đo

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

quang phổ ở bước sóng 487nm (cuvet thạch anh 1cm) để xác định hàm lượng βCR (dung dịch so sánh là 2 loại dung môi tương ứng: dầu đậu nành và dầu hướng dương)

Hàm lượng βCR được tính theo công thức của Chen và Meyer:

Y =

Trong đó:

 Y là hàm lượng βCR thu được (μg/g)

 A là độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 487nm

 D là hệ số pha loãng

 V là thể tích dung dịch dầu chứa βCR thu được

 W là khối lượng mẫu ban đầu đem đi chiết

 E là hệ số tắt quang của các loại dầu ở bước sóng 487nm

+ Dung môi dầu đậu nành ở bước sóng 487nm là 2145

+ Dung môi dầu hướng dương ở bước song 487nm là 2290

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

PHỤ LỤC 2

 Thiết bị sử dụng trong thí nghiệm:

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

Hình i.1:Máy lắc ngang Hình i.2: Máy ly tâm

Hình i.3: Bể điều nhiệt Hình i.4: Máy đo quang

 Thành phẩm:

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

Hình i.5: Nuôi nấm men Rhodotorula sp Hình i.6: Môi trường lỏng chứa nấm men

trong môi trường lỏng sau thời gian nuôi 72h

Hình i.7: Sinh khối sau khi ly tâm Hình i.8: Sinh khối sau khi sấy

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

Hình i.9: Mẫu dầu hướng dương chứa Hình i.10 : Mẫu dầu hướng dương chứa

βCR sau khi trích ly βCR sau khi trích ly

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

Đề tài nghiên cứu khoa học Trường ĐHBRVT

Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 1 Khoa Hóa học – Công Nghệ thực phẩm

Tế bào nấm men Rhodotorula sp có nhiều hình dạng khác nhau tùy loài và tùy

điều kiện nuôi cấy Dạng thường gặp là dạng tròn, dạng trứng, elip, hình dài hoặc hình gậy

Khuẩn lạc phát triển nhanh, láng, mềm, nhẵn bóng có ánh kim hay không ánh kim, đôi khi xù xì, ướt và nhầy nhớt Chúng có màu kem tới hồng, đỏ tươi, cam hoặc vàng Mép khuẩn lạc không có răng cưa

Thành tế bào nấm men có nhiều lớp Theo Marquardt (1962), thành tế bào nấm

men Rhodotorula sp có 3 lớp Lớp trong cùng và ngoài cùng mỏng lớp giữa dày

130-1000 A° Thành tế bào cấu tạo từ các polysaccharide bền với sự thủy phân bởi dung dịch KOH

Kích thước tế bào Rhodotorula sp dao động trong khoảng 2-5 μm chiều rộng và

khoảng 5-10μm chiều dài Kích thước này cũng thay đổi ở các loài khác nhau, ở các giai đoạn khác nhau và cả ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau

1.1.3 Đặc điểm sinh lý:

Quá trình sinh trưởng của nấm men Rhodotorula sp chịu ảnh hưởng của rất nhiều

yếu tố như nguồn cacbon, nguồn nitrogen, pH, nhiệt độ, hàm lượng oxy, khoáng

 Các yếu tố vật lý:

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

Đề tài nghiên cứu khoa học Trường ĐHBRVT

Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 2 Khoa Hóa học – Công Nghệ thực phẩm

Đối với phương pháp lên men chìm thì nhiệt độ là yếu tố cần chú ý nhất vì hầu hết nấm men đều rất mẫn cảm với nhiệt độ Ngoài ra nhiệt độ cao còn làm vô hoạt rRNA và

phá hủy tế bào Với nấm men Rhodotorula sp thì nhiệt độ nuôi cấy phải từ 4-35°C

bảng1.1

Bảng 1.1 Giới hạn nhiệt độ của một số loài Rhodotorula sp.[3]

Ngoài ra các yếu tố khác cũng ảnh hưởng rất nhiều đến quá trình sinh trưởng và

phát triển của nấm men Rhodotorula sp như độ ẩm, áp lực, sức căng bề mặt, tia bức xạ,

ánh sáng mặt trời…

 Các yếu tố hóa học:

Các yếu tố hóa học bao gồm pH môi trường, thế oxy hóa khử, các hợp chất diệt

khuẩn,… trong đó pH được quan tâm nhiều nhất Nấm men Rhodotorula sp phát triển tốt

nhất trong khoảng pH 3,5-6,0

Nguồn cacbon (C) đóng vai trò quan trọng trong việc tạo năng lượng cho tế bào đồng thời còn cung cấp hợp chất trung gian trong quá trình tổng hợp các chất xây dựng tế bào Nồng độ C quá cao cũng ức chế sự phát triển của vi sinh vật

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

Đề tài nghiên cứu khoa học Trường ĐHBRVT

Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 3 Khoa Hóa học – Công Nghệ thực phẩm

Các chất khoáng: nấm men rất cần các chất khoáng vì chất khoáng tham gia xúc tác cho các phản ứng sinh học xảy ra trong tế bào Ngoài nguồn phospho, nấm men còn cần các loại khoáng như Mg2+, Mn2+, Na+,…

Vitamin: một số loài vi sinh vật cần được bổ sung các vitamin, cung cấp coenzyme cho các phản ứng sinh hóa trong tế bào Thường vitamin được đưa vào môi trường nuôi cấy dưới dạng cao nấm men hoặc nấm men tự phân Do đó, nếu ta chọn cao nấm men là nguồn N thì không cần bổ sung các vitamin

1.1.4 Đặc điểm sinh hóa:[3,11]

Nấm men Rhodotorula sp có một số đặc tính sinh hóa như sau:

- Không lên men các loại đường như: D-galactose, mantose, α-trehalose và nhiều loại đường khác nhưng chúng lại sử dụng các loại đường này để cung cấp nguồn carbon cho việc xây dựng tế bào

- Tạo ra enzyme urease

- Đồng hóa DBB (Diazonium Blue B)

- Không tạo thành hợp chất loại tinh bột

- Không tạo ra acid acetic

- Không đồng hóa được inositol, đây là nét đặc trưng cơ bản nhất của Rhodotorula

sp khác với các giống nấm men Cryptococus, Candida

- Khả năng sinh tổng hợp sắc tố β-carotenoid

- Có khả năng tích lũy lipid từ 40-80% sinh khối khô

Giống nấm men Rhodotorula sp còn được gọi là vi sinh vật sắc tố carotenoid (carotengensis) Các sắc tố carotenoid chính trong nấm men Rhodotorula sp là: β-

carotene, torulahodin và torulene Đã có nhiều công trình nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp sắc tố carotenoid trên từ nhiều các nguồn cơ chất khác nhau với các phương pháp nuôi cấy khác nhau như: nuôi cấy gián đoạn, bán liên tục, lên men dịch thể, lên men

bán rắn,… chỉ từ giống Rhodotorula sp hay nuôi cấy kết hợp với một chủng vi sinh vật

khác như: nấm men, nấm mốc, vi khuẩn

Khả năng đồng hóa các hợp chất carbon của Rhodotorula sp được trình bày trong

bảng 1.2

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

Đề tài nghiên cứu khoa học Trường ĐHBRVT

Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 4 Khoa Hóa học – Công Nghệ thực phẩm

Bảng 1.2 Khả năng đồng hóa carbon của Rhodotorula sp

1.1.5 Khả năng sinh tổng hợp carotenoid của Rhodotorula sp.:[6,7]

Khả năng hình thành sắc tố carotenoid là một đặc điểm sinh lý quan trọng dùng để

phân loại giống Rhodotorula sp Carotenoid hình thành được kết hợp với màng tế bào và chỉ tồn tại bên trong tế bào Các sắc tố carotenoid ở Rhodotorula sp có khả năng hấp thu

ánh sáng ở bước sóng rộng từ 450÷550 nm Cường độ màu của nấm men sinh sắc tố tăng lên rất nhiều so với giống men trắng khi chúng sống ở các vùng địa lý có tia cực tím mạnh Tuy nhiên, khi cường độ phóng xạ quá cao, các carotenoid không còn khả năng che chở tế bào

Perrier V và cộng sự (1995) khi khảo sát thành phần các sắc tố có trong 13 chủng

Rhodotorula sp đã tìm thấy từ 1 đến 10 sắc tố thuộc nhóm carotenoid Kết quả của

nghiên cứu này cho thấy sắc tố β-carotene luôn hiện diện trong các chủng Rhodotorula sp

Trường ĐH Bà Rịa - Vũng Tàu

Đề tài nghiên cứu khoa học Trường ĐHBRVT

Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 5 Khoa Hóa học – Công Nghệ thực phẩm

khảo sát và tác giả cũng đưa ra đã kết luận rằng β-carotene là sắc tố chính của

Hình 1.1 Quá trình tổng hợp beta-carotene, torulene và torularhodin từ acetyl CoA của Rhodoturula

sp