Bước đầu bổ sung vi sinh vật (nấm men saccharomyces cerevisiae và vi khuẩn acetobacter aceti) trong lên men ca cao

Phan Văn Mẫn Danh sách cán bộ tham gia chính: 1 Phan Văn Mẫn Thạc sỹ Giảng viên - Khảo sát sự ảnh hưởng của việc bổ sung nấm men S.cerevisiae vào trong khối ủ lên men hạt ca cao tươi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÀ RỊA - VŨNG TÀU

BÁO CÁO

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

BƯỚC ĐẦU BỔ SUNG VI SINH VẬT (NẤM MEN

SACCHAROMYCES CEREVISIAE VÀ VI KHUẨN ACETOBACTER ACETI) TRONG LÊN MEN CA

Tên đề tài: “Bước đầu Bổ sung vi sinh vật (nấm men Saccharomyces cerevisiae và

vi khuẩn Acetobacter aceti) trong lên men ca cao”

Chủ nhiệm đề tài: ThS Phan Văn Mẫn

Danh sách cán bộ tham gia chính:

1 Phan Văn Mẫn Thạc sỹ Giảng viên

- Khảo sát sự ảnh hưởng của việc bổ sung nấm men S.cerevisiae vào trong

khối ủ lên men hạt ca cao tươi đến chất lượng hạt ca cao bán thành phẩm

- Khảo sát sự ảnh hưởng của việc bổ sung nấm men S.cerevisiae và vi khuẩn

A.aceti trong khối ủ lên men hạt ca cao tươi đến chất lượng hạt ca cao bán

thành phẩm

- Đánh giá chất lượng hạt ca cao bán thành phẩm

Kết quả đạt được

- Khoa học: Nghiên cứu ảnh hưởng của việc bổ sung nấm men S.cerevisiae và

vi khuẩn A.aceti vào khối ủ lên men hạt ca cao nhằm nâng cao chất lượng hạt

ca cao

- Kinh tế - xã hội: sử dụng vi sinh vật bổ sung vào quá trình lên men ca cao

nhằm nâng cao chất lượng hạt ca cao sau lên men, từ đó nâng cao giá thành cho hộ nông dân

- Ứng dụng: có tính ứng dụng cao, dễ thực hiện với người nông dân

Thời gian nghiên cứu: từ 10/2013 – 07/2014

CNĐT TRƯỞNG KHOA PHÒNG KH&CGCN

(Kí và ghi rõ họ tên) (Kí và ghi rõ họ tên) (Kí và ghi rõ họ tên)

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Những năm gần đây, nhu cầu tiêu thụ các sản phẩm làm từ hạt ca cao của thế giới ngày càng tăng mạnh như bánh kẹo, chocolate…, trong khi nguồn cung từ các nước vốn có truyền thống về ca cao như các nước Tây Phi, Indonesia lại giảm do tác động của biến đổi khí hậu và không đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn Việt Nam đánh giá đây là thời điểm thuận lợi để Việt Nam phát triển ngành ca cao và trở thành một trong những quốc gia tiềm năng cung cấp nguồn ca cao chất lượng cao trên thế giới Cây ca cao được khuyến khích trồng ở nhiều địa phương nhằm đạt mục tiêu diện tích trồng ca cao là 100.000 ha trên

cả nước và dự kiến vào năm 2020, Việt Nam sẽ trở thành quốc gia xuất khẩu ca cao quan trọng trên thế giới với sản lượng 100.000 tấn hạt khô mỗi năm Nhưng hiện nay,

ở nước ta việc chế biến ca cao vẫn còn bằng phương pháp thủ công, hiệu quả không cao đưa đến tình trạng cung không đủ cầu Trong công nghiệp chế biến ca cao, giai đoạn lên men là giai đoạn quan trọng nhất Đã có nhiều nghiên cứu trong nước và nước ngoài về lên men ca cao, nhưng có rất ít đề tài nghiên cứu chuyên sâu về sự kết hợp vi sinh vật bổ sung vào quá trình lên men ca cao, đặc biệt là kết hợp giữa nấm

men và vi khuẩn acetic Do đó, chúng tôi tiến hành đề tài “Bước đầu bổ sung vi sinh vật (nấm men Saccharomyces cerevisiae và vi khuẩn Acetobacter aceti) trong quá trình lên men ca cao” Trong phạm vi của đề tài này, chúng tôi bước đầu khảo sát sự

ảnh hưởng của việc bổ sung vi sinh vật trong quá trình lên men đến chất lượng hạt ca cao bán thành phẩm

2 Mục đích nghiên cứu

Mục tiêu của đề tài là khảo sát quá trình lên men ca cao khi bổ sung vi sinh vật

Từ đó, ghi nhận sự thay đổi các chỉ tiêu hóa lý (nhiệt độ, độ ẩm, khối lượng, pH, axit tổng, tanin, lipid của hạt ca cao) và mật độ vi sinh vật trong quá trình ủ ca cao Đồng thời, đánh giá chất lượng hạt ca cao bán thành phẩm (tỉ lệ lên men của hạt ca cao, hàm lượng vỏ) sau quá trình phơi sấy

3 Phương pháp nghiên cứu

- Xác định hàm lượng ẩm bằng máy sấy hồng ngoại

- Xác định hàm lượng lipid bằng phương pháp Soxhlet

- Xác định pH bằng máy đo pH

- Xác định hàm lượng axit tổng bằng phương pháp chuẩn độ NaOH 0,1N

- Xác định hàm lượng tanin bằng phương pháp chuẩn độ KMnO4

- Phương pháp đánh giá cảm quan (TCVN 7519:2005)

4 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát sự ảnh hưởng của việc bổ sung nấm men S.cerevisiae vào trong khối

ủ lên men hạt ca cao tươi đến chất lượng hạt ca cao bán thành phẩm

- Khảo sát sự ảnh hưởng của việc bổ sung nấm men S.cerevisiae và A.aceti

trong khối ủ lên men hạt ca cao tươi đến chất lượng hạt ca cao bán thành phẩm

- Đánh giá chất lượng hạt ca cao bán thành phẩm

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lịch sử cây ca cao [8]

Cây ca cao (Theobroma ca cao Linn)

thuộc họ Sterculiaceae là cây công nghiệp lâu

năm sống ở vùng nhiệt đới, thuộc loài cây thân

gỗ, sống đa niên Cây ca cao có nguồn gốc từ

vùng Amazone, cây có khả năng phát triển

trong điều kiện râm mát và độ ẩm cao

Hình 1.1 Cây ca cao

Người Mayan và Aztec của Mexico đã trồng ca cao từ thế kỉ 14 Đến giữa thế kỉ

17 ca cao được chế biến thành chocolate qua các phương pháp chế biến thô sơ, được

ưa chuộng ở nhiều nơi trên thế giới

Cây ca cao du nhập vào nước ta từ rất sớm, nhưng trải qua thời gian dài, cây ca cao vẫn chiếm một vị trí rất khiêm tốn trong nền sản xuất nông nghiệp Việt Nam Những năm gần đây, công tác nghiên cứu đối với cây ca cao vẫn chưa được phát triển một cách tương xứng với giá trị thực sự của loại cây quý giá này

Ngày nay, cây ca cao đã trở nên phổ biến và được trồng ở nhiều tỉnh của Việt Nam, do có ưu thế nổi trội là có thể trồng xen với nhiều loại cây như dừa, hồ tiêu, cà phê, điều, ngoài ra khả năng chịu hạn cao nên thích hợp với điều kiện tự nhiên và thổ nhưỡng ở các tỉnh phía Nam Ở nước ta, diện tích trồng ca cao vẫn còn nhiều hạn chế (khoảng 20%) và tập trung chủ yếu ở ba vùng: các tỉnh Tây Nguyên, miền Đông Nam Bộ và vùng đồng bằng Sông Cửu Long

1.1.1 Các giống ca cao [9]

Ca cao trên thế giới được chia làm 3 nhóm chính: Criollo, Forastero, Trinitario

Bảng 1.1 Đặc điểm giữa giống Criollo - Forastero - Trinitario

Các đặc điểm

Dạng quả Quả dài Quả hình bầu

(Nguồn: Nguyễn Văn Uyên và cộng sự, 1996, Hà Thanh Toàn, 2008)

Cây ca cao có đặc điểm phát triển tốt ở những nước có khí hậu nhiệt đới, ra trái quanh năm Ngoài ra cây ca cao có nhiều bộ phận quan trọng như lá, quả ca cao, vỏ

ca cao, nhưng quan trọng nhất là hạt ca cao

a) Hạt ca cao

Bộ phận chính được sử dụng là hạt Hạt sau khi xay nhuyễn trong điều kiện gia nhiệt đến 500C-600C thành dung dịch sền sệt màu chocolate gọi là bột nhão ca cao Khi ép bột nhão ta tách đươc bơ và bánh dầu ca cao Xay nhuyễn bánh dầu ca cao cho ra bột ca cao Hạt ca cao có hàm lượng chất béo từ 50-60% trọng lượng hạt

Hình 1.2 Bột nhão ca cao (A), bơ ca cao (B)

Bột nhão, bơ và bột ca cao là những nguyên liệu chính cho công nghiệp bánh kẹo, thực phẩm Chocolate là sự pha trộn giữa bột nhão, bơ, đường và các nguyên liệu khác tùy theo công thức riêng của mỗi nhà sản xuất Bột ca cao và chocolate có

các thành phần hydratcarbon, protein, chất béo cùng với một số vitamin

Bảng 1.2 Thành phần của bột nhão ca cao [7]

b) Thành phần của cơm nhầy ca cao

Quả ca cao sau khi thu hoạch được bóc lấy hạt Hạt ca cao được bao bọc xung quanh bởi lớp cơm nhầy (Hình 1.3), lượng cơm nhầy bao bọc xung quanh hạt tùy thuộc vào mùa nắng hay mưa trong năm Dựa vào (Bảng 1.3) có thể thấy trong cơm nhầy chứa hàm lượng đường glucose khá cao tạo điều kiện cho nấm men

Saccharomyces cerevisiae phát triển, sau đó chuyển hóa thành các hợp chất có lợi

cho quá trình lên men ca cao

Báng 1.3 Thành phần cơm nhầy ca cao [13]

c) Các bộ phận khác của quả ca cao

Vỏ ca cao chứa 3-4% kali trên trọng lượng chất khô, là nguồn phân bón giàu kali Tro đốt từ vỏ đã từng được sử dụng để làm xà phòng Vỏ ca cao khô, xay nhỏ có thể độn vào thức ăn cho bò, cừu, dê với tỉ lệ lên tới 50%, cho heo 30%, cho gà 20%

Lá ca cao là nguồn thức ăn cho dê, bò, thỏ

Dịch thu từ quá trình lên men được dùng để chế biến rượu ca cao Ngoài ra, dịch cũng có thể sử dụng như nguyên liệu để sản xuất nata thay thế nước dừa trong kĩ thuật sản xuất thạch dừa

1.2 Tổng quan về vi sinh vật chính sử dụng trong lên men ca cao

1.2.1 Nấm men Saccharomyces cerevisiae [2]

a) Đặc điểm nấm men Saccharomyces cerevisiae

 Hình dạng: Nấm men Saccharomyces cerevisiae thường có hình cầu hay hình

trứng Tuy nhiên hình dạng của chúng không ổn định, phụ thuộc vào tuổi của nấm men và điều kiện nuôi cấy

 Kích thước tế bào nấm men: Tế bào nấm men thường có kích thước rất lớn

gấp từ 5 – 10 lần tế bào vi khuẩn Kích thước trung bình từ 5 – 6 µm đến 10 - 14 µm

Kích thước cũng thay đổi, không đồng đều ở các loài khác nhau, ở các độ tuổi khác nhau và điều kiện nuôi cấy khác nhau

 Sự sinh sản của nấm men: Đối với nấm men thuộc giống Saccharomyces có 2

phương thức sinh sản Đó là sinh sản vô tính bằng cách nảy chồi và sinh sản hữu tính

bằng bào tử túi [2]

Hình 1.4 Quá trình sinh sản vô tính của nấm men

(a): tế bào nấm men nảy chồi; (b): tiến trình sinh sản bằng nảy chồi ở nấm men;

(c): vết sẹo sau khi nảy chồi b) Cơ chế quá trình lên men

Quá trình lên men gồm 2 quá trình chính là hô hấp hiếu khí và hô hấp kị khí

1.2.2 Vi khuẩn Acetobacter aceti [5]

a) Đặc điểm Vi khuẩn Acetobacter aceti

 Hình dạng: Vi khuẩn Acetobacter aceti là trực khuẩn hình que (hình 1.5), hoặc

hình dạng elip, một số loại đặc biệt có hình cầu

 Kích thước: Vi khuẩn Acetobacter aceti có kích thước rất nhỏ 0,6 – 0,8 µm

 Sinh sản: Vi khuẩn Acetobacter aceti là vi khuẩn gram âm, không sinh bào tử,

sinh sản bằng hình thức phân đôi

Hình 1.5 Hình dạng Acetobacter aceti

b) Cơ chế của quá trình lên men acetic

Lên men acetic thực chất là quá trình oxy hóa không hoàn toàn ethanol thành axit acetic dưới tác dụng của vi khuẩn

Louis Pasteur là người khám phá ra cơ chế của quá trình lên men acetic vào năm 1802 Phương trình tổng quát:

Ngoài ra vi khuẩn acetic còn có khả năng oxy hóa nhiều chất khác nhau như :

Propanol  acid propionic

Lactic acid  acetoin

Glycerine  dyhiroxyacetol

D – sorbitol  L- sorbose

Lactic acid  pyruvic acid

1.3 Tình hình phát triển ca cao hiện nay [19]

Bảng 1.4 Sản lượng ca cao trên thế giới (ngàn tấn)

(Nguồn: ICCO Annual Report 2012/2013)

Từ bảng 1.4 cho chúng ta thấy rằng: sản lượng ca cao cao nhất thuộc về các nước thuộc Châu Phi, đứng đầu là Bờ Biển Ngà đạt 1445 ngàn tấn (2012-2013), trong khi đó các nước thuộc Châu Mỹ đứng đầu là Bzaril với sản lượng 185 ngàn tấn năm (2012-2013) Đứng đầu sản lượng ca cao Châu Á là Indonesia với 420 ngàn tấn

năm (2012-2013) Sản lượng được ICCO Annual Report dự báo sẽ còn biến đổi trong

các năm tới do tình hình thiên tai, khí hậu Việt Nam được dự báo là quốc gia sản xuất ra ca cao đạt chất lượng cao trên thế giới sau cà phê và điều Nhưng thực tế còn nhiều vấn đề về canh tác, giá cả nên người dân không còn mặn mà với cây ca cao, vậy nên việc khuyến khích áp dụng công nghệ kĩ thuật cao trong canh tác, cũng như nâng cao giá thành được ưu tiên hàng đầu do Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn đưa ra năm 2013 Nhằm đạt mục tiêu diện tích trồng ca cao là 100.000 ha trên

cả nước vào năm 2020 và Việt Nam sẽ trở thành quốc gia xuất khẩu ca cao quan trọng trên thế giới với sản lượng 100.000 tấn hạt khô mỗi năm

1.4 Những biến đổi sinh hóa trong lên men hạt ca cao [14]

Hình 1.6 Biến đổi sinh hóa bên trong hạt ca cao lên men

Khi bắt đầu quá trình lên men là quá trình phân giải yếm khí lớp cơm nhầy có chứa (10-15%) đường, 1,5% peptin và pH thấp, tạo điều kiện cho nấm men phát triển mạnh, nấm men chuyển hóa đường trong cơm nhầy thành C2H5OH, CO2, năng lượng

và một số sản phẩm khác, trong điều kiện nồng độ oxy thấp

C12H22O11 + H2O → 2C6H12O6 + 18,8KJ

C6H12O6 → C2H5OH + CO2 + 93,3KJ Nấm men phân giải cơm nhầy làm thoát ẩm một phần tạo điều kiện thoáng khí (hô hấp hiếu khí) cho vi khuẩn lactic và vi khuẩn acetic phát triển Vi khuẩn lactic phát triển sử dụng đường trong cơm nhầy để chuyển hóa tạo axit lactic (theo con đường lên men đồng hình), tạo axit lactic, axit acetic và một số axit hữu cơ khác (theo con đường lên men dị hình), còn vi khuẩn acetic oxy hóa C2H5OH tạo axit acetic

C6H12O6 → CH3- CHOH – COOH + 22,5Kcal (vi khuẩn lactic)

C2H5OH → CH3- COOH + H2O + 117Kcal (vi khuẩn acetic)

Các axit sinh ra nhiều, nồng độ C2H5OH cao và nhiệt độ cao sẽ ức chế sự phát triển của nấm men (phát triển từ 24-36 giờ) và phá vỡ thành tế bào, diệt chết phôi mầm Sau khi phôi mầm chết một số enzyme như lipase, protease…, có trong phôi mầm sẽ di chuyển vào bên trong nội nhũ, trong nội nhũ có 2 loại tế bào quan trọng là

tế bào dự trữ chất béo, protein và tế bào chứa các hợp chất polyphenolic và methylxanthine (là sự kết hợp của theobromine và caffeine) Khi thành tế bào bị phá

vỡ, thì các hợp chất bên trong có điều kiện tiếp xúc với nhau, dưới tác dụng của enzyme thì các phản ứng sinh hóa đã xảy ra, sản phẩm của quá trình sinh hóa này là amino axit, đường khử, polyphenol, sau đó các hợp chất này kết hợp với nhau thông qua phản ứng Maillard, phản ứng caramen hóa hình thành hương vị đặc trưng chocolate Trong lên men, polyphenol bị oxy hóa tạo ra sắc tố nâu trong ca cao, các anthoxyanin (một loại flavonoid) nhanh chóng thủy phân tạo cyanidin và đường dưới tác dụng của enzyme glucosidase để tạo nên màu nâu của quinnon, theo Schwan và cộng sự năm 1995, thì các hợp chất trên còn lại 20% sau lên men có lợi cho sức khỏe con người

1.5 Một số phương pháp lên men hạt ca cao [7]

Hiện nay, trên thế giới có nhiều phương pháp ủ ca cao khác nhau như ủ đống, ủ thúng, ủ thùng…, nhưng mỗi phương pháp lại có đặc điểm riêng Tùy vào khối lượng hạt, mùa vụ mà chúng ta chọn phương pháp thích hợp cho lên men hạt ca cao như sau:

1.5.1 Ủ đống

Hạt ca cao được đổ thành nón trên lớp lá chuối được xếp trên mặt đất Bên dưới

lá chuối, kê các cành cây để tạo độ thoáng và giúp dịch nhầy chảy ra dễ dàng Ủ kín bằng lá chuối trên bề mặt khối hạt nhằm giữ hơi nóng trong suốt thời gian ủ Nếu trời lạnh có thể phủ thêm lớp bao gai Đống hạt có thể 25-2500kg hạt tươi

Ủ đống là phương pháp phổ biến được các nông hộ tại Ghana, nhiều nước sản xuất hạt cacao tại Châu Phi và khu vực Amazon của Brazil thực hiện Thời gian ủ đống khoảng 4-7 ngày

Ủ đống có ưu điểm là không dùng dụng cụ đặc biệt, phù hợp với nhiều khối lượng khác nhau

Hình 1.7 Phương pháp ủ đống

1.5.2 Ủ thùng

Ca cao được chứa trong thùng gỗ có đục lỗ đáy Chiều dài và rộng của thùng có thể thay đổi tùy theo lượng hạt nhưng chiều cao khối không nên vượt quá 50cm Khối lượng ủ 10-1000kg

Thùng được kê cao 20-30cm cho thoáng nước và nước trong thùng ủ thoát ra được Phải giữ nhiệt độ trong thùng khoảng 500C và cứ 2 ngày một lần trộn hạt cho đều Nếu có nhiều thùng thì việc trộn đống ủ thường dễ dàng hơn: sau khi ủ hai ngày trong thùng thứ nhất, sang hạt qua thùng thứ hai (vừa sang vừa chú ý trộn đều hạt) Hai ngày sau sang qua thùng thứ ba ủ tiếp trong hai ngày nữa Trong hai ngày này cần bắt đầu chú ý xem hạt đã ủ đúng mức chưa tức là hạt đạt đã màu nâu sẫm ở ngoài

và màu tím đậm bên trong

Trong khi ủ lưu ý, đối với giống Forastero và Trinitario thường ủ khoảng 3-7 ngày

Hình 1.8 Phương pháp ủ thùng

1.5.3 Ủ thúng

Lót lá chuối quanh thúng tre, nếu lớp lá chuối dày cần thiết phải xoi lỗ để nước

dễ dàng thoát ra khỏi thúng trong quá trình lên men, đổ đầy hạt, đậy thúng lại bằng bao gai hoặc lá chuối để giữ nhiệt Ủ thúng chỉ sử dụng khi có khối lượng hạt nhỏ Trong cách ủ thúng và ủ đống, ở lớp trên khối hạt luôn duy trì nhiệt độ khoảng 45-

500C, nếu lượng hạt dưới 10kg thì phải ủ kỹ đống ủ sau khi nén thật chặt Cần thiết phải duy trì nhiệt độ đống ủ nếu thời tiết lạnh

Sau khi ủ độ 5-7 ngày, nếu ủ đúng mức thì các hạt ca cao đều có màu nâu sậm Ngược lại, nếu ủ không đúng cách thì các hạt ở phía bên ngoài có màu nâu, phía trong hơi trắng và giữa đống ủ các hạt càng trắng hơn Có thể hạt còn có màu đen, nấm mốc phát triển và hạt xuất hiện mùi amoniac khi thời gian ủ quá mức

Hình 1.9 Phương pháp ủ thúng

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Phương tiện nghiên cứu

2.1.1 Địa điểm và thời gian thực hiện

Địa điểm: thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm của bộ môn Công

nghệ thực phẩm, khoa Hóa học và Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bà Rịa – Vũng Tàu

Thời gian thực hiện: từ tháng 10/2013 – 6/20014

2.1.2 Nguyên liệu và hóa chất thí nghiệm

a) Nguyên liệu

Hạt ca cao: Nghiên cứu này sử dụng giống ca cao từ công ty Thành Đạt

(Nguyên liệu được cung cấp từ công ty Thành Đạt, Huyện châu Đức, Tỉnh Bà-Rịa Vũng Tàu, Việt Nam)

Vi sinh vật: S.cerevisiae và A.aceti được sử dụng thuộc thế hệ G5 có nguồn

gốc từ Đại Học Bách Khoa Tp HCM

b) Hóa chất

Hóa chất sử dụng trong phòng thí nghiệm được cung cấp bởi Bộ môn Công

nghệ Thực phẩm, khoa Hóa học và Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bà Rịa – Vũng Tàu

- Các chất chuẩn độ axit tổng: Phenolphlatein 0,1%, dung dịch NaOH chuẩn 0,1N

- Các chất chuẩn độ hàm lượng tannin: dung dịch KMnO4, indigocarmin

- Các hóa chất cần thiết khác phục vụ cho quá trình phân tích các chỉ tiêu 2.1.3 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm

- Cân phân tích, máy đo ẩm hồng ngoại, máy đo pH, nồi hấp tiệt trùng

- Tủ sấy, máy lắc ngang, máy khuấy từ, máy xay sinh tố

- Đĩa petri, bình cầu 250ml, nhiệt kế, bình tam giác…

- Một số dụng cụ định lượng như (pipet, ống đong, cốc thủy tinh…)

2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm

2.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm lên men hạt ca cao

NỘI DUNG THÍ NGHIỆM

Khảo sát thành phần hạt ca cao tươi

- Khảo sát sự ảnh hưởng của việc

bổ sung nấm men S.cerevisiae

vào trong khối ủ lên men hạt ca

cao tươi đến chất lượng hạt ca

cao bán thành phẩm

Khảo sát sự ảnh hưởng của việc

bổ sung nấm men S.cerevisiae và

vi khuẩn A.aceti vào trong khối ủ

lên men hạt ca cao tươi đến chất lượng hạt ca cao bán thành phẩm

- Mật độ S.cerevisiae và A.aceti trong quá trình lên men

- Đánh giá cảm quan hạt ca cao khô : cắt hạt, đếm hạt

Đánh giá chất lượng hạt ca cao khô

- Độ ẩm, axit tổng, tanin, lipit

b) Thí nghiệm 2: Khảo sát sự ảnh hưởng của việc bổ sung nấm men S.cerevisiae

vào trong khối ủ lên men hạt ca cao tươi đến chất lượng hạt ca cao bán thành phẩm

Mục đích:

Nhằm khảo sát sự thay đổi nhiệt độ, độ ẩm, khối lượng, pH, axit tổng, tanin,

lipid trong quá trình lên men theo phương pháp bổ sung S.cerevisiae, từ đó đánh giá

được chất lượng hạt ca cao khô

Bố trí thí nghiệm:

Tiến hành bố trí thí nghiệm 1 yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại Yếu tố cố định:

- Thời gian lên men: 6 ngày

- Lượng S.cerevisiae bổ sung vào khối ủ: 1ml/3kg (mật độ 106 CFU/ml), 3ml/3kg (mật độ 106CFU/ml), 5ml/3kg (mật độ 106CFU/ml)

Nhằm khảo sát sự thay đổi nhiệt độ, độ ẩm, khối lượng, pH, axit tổng, tanin,

lipid trong quá trình lên men theo phương pháp bổ sung S.cerevisiae và A.aceti từ đó

đánh giá được chất lượng hạt ca cao khô

Bố trí thí nghiệm:

Tiến hành bố trí thí nghiệm 1 yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại

Yếu tố cố định:

- Thời gian lên men: 6 ngày

- Tỉ lệ A.aceti và S.cerevisiae bổ sung vào khối ủ lần lượt là:

+ Tỉ lệ 1:1: 1,5ml A.aceti: 1,5ml S.cerevisiae/3kg hạt tươi (mật độ 106CFU/ml)

+ Tỉ lệ 1:2: 1ml A.aceti: 2ml S.cerevisiae/3kg hạt tươi (mật độ 106CFU/ml)

+ Tỉ lệ 1:3: 0,75ml A.aceti: 2,25ml S.cerevisiae ml/3kg hạt tươi (mật độ

2.3 Nội dung thí nghiệm [7]

Quy trình ủ hạt ca cao trong phòng thí nghiệm

Hình 2.2 Quy trình lên men ca cao

Giải thích quy trình thí nghiệm:

a) Thu hoạch trái

Sau khi được gieo trồng, cây ca cao thường mất khoảng 2 năm để bắt đầu cho trái chính vụ Trong quá trình thu hoạch, chỉ nên hái các trái ca cao chín bởi vì hạt từ trái ca cao chưa chín sẽ không được lên men hoàn toàn Trái bị hư tổn hoặc bị nhiễm nấm mốc nên được loại Tốt nhất nên thu hoạch ca cao thường xuyên để tránh trái ca cao bị quá chín

b) Tách hạt

Trái được đập vào lưỡi dao gắn ngược có bề dày cố định để tránh bị hư hạt bên trong Có thể dùng thanh gỗ để đập trái hoặc đập trái vào vật cứng để làm vỡ vỏ trái Phương pháp này nhanh nhưng cần sự khéo léo, chính xác để tránh nguy hiểm cho người lao động và hạt bên trong không tổn thương

Sau khi đập vỡ vỏ, hạt được tách khỏi lõi trái là bộ phận nơi hạt dính vào Tránh

để lõi, mảnh vỏ trái lẫn vào khối hạt vì người thu mua xem đây là vật thải sẽ hạ tiêu chuẩn chất lượng sản phẩm

c) Ủ hạt

Lên men là khâu quan trọng nhất trong ngành trồng và chế biến ca cao, nhằm thủy phân cơm bao bọc xung quanh hạt ca cao và làm chết mầm hạt hoặc diệt chết phôi nha để hạt không còn nảy mầm được nữa Do đó lên men giúp khởi đầu những phản ứng sinh hóa xảy ra bên trong tử diệp hay nội nhũ, góp phần làm giảm vị đắng, chát và tạo các tiền chất của hương thơm ca cao

Hạt sau khi tách ra khỏi vỏ sẽ được tiến hành ủ trong thùng ủ 300 kg (Hình 1.8), tại phòng thí nghiệm ca cao thuộc Trường đại học Bà Rịa – Vũng Tàu

d) Làm khô hạt

Hạt được làm khô ngay bằng cách phơi nắng hay sấy để độ ẩm từ 60% xuống khoảng 7,5-8% Nếu ẩm độ hạt quá khô, ẩm độ nhỏ hơn 7%, hạt sẽ giòn dễ vỡ Khi phơi nếu hạt khô quá nhanh lớp ngoài của hạt khô cứng làm hàm lượng axit bên trong (hình thành trong quá trình lên men) không thể thấm ra ngoài và bốc thoát được nên hạt sẽ bị chua, ngoài ra một số quá trình chuyển hóa hóa học sẽ không được hoàn toàn Tuy nhiên, nếu thời gian phơi sấy kéo dài nấm mốc và các mùi lạ sẽ phát triển Nhiệt độ trong quá trình phơi sấy không nên vượt quá 650C

2.4.2 Đo pH – Xác định axit tổng [3]

Nguyên tắc

Dùng dung dịch kiềm chuẩn (NaOH hoặc KOH) để trung hòa hết các axit trong

thực phẩm với phenolphthalein làm chất chỉ thị màu

Tiến hành

Nghiền nhỏ và cân thật chính xác 1g mẫu, thêm nước cất vừa đủ 100ml, khuấy mẫu bằng máy khuấy từ, để mẫu lắng 1 giờ Lấy 10ml nước trong đem đo pH và chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N chuẩn đến điểm chuyển màu của phenolphtalein (pH = 8,20) Song song với mẫu thử, tiến hành mẫu trắng để loại trừ sai số

Tính kết quả

Phần trăm axit:

m

n V V

X(%) ( 1 0) 0,006100

Trong đó:

- X: Hàm lượng axit (%)

- V1: Thể tích NaOH 0,1 N chuẩn độ mẫu ca cao (ml)

- V0: Thể tích NaOH 0,1 N chuẩn độ mẫu trắng (ml)

- n: Hệ số pha loãng

- 0,006: Hệ số quy đổi ra axit tổng về axit acetic tương ứng với 1ml NaOH 0,1N

- m: Khối lượng mẫu đem phân tích (g)

2.4.3 Phương pháp định lượng tanin [3]

Nguyên tắc

Tanin là một hỗn hợp phức tạp gồm các hợp chất phenol đơn giản phân tử thấp

và hợp chất polyphenol phân tử lớn Tanin rất dễ bị oxi hóa bởi KMnO4 trong môi trường H2SO4 có chỉ thị indigocamin Sau khi oxi hóa hoàn toàn, các hợp chất phenol tiếp tục oxy hóa chất chỉ thị làm mất màu xanh của dung dịch

Tiến hành

Cho 2g mẫu đã nghiền nhỏ vào bình cầu dung tích 500ml, thêm 250ml nước cất đun sôi, lọc và định mức lên 500ml Chuẩn độ tanin: cho vào erlen 100ml 1ml dung dịch trên + 2,5ml dung dịch indigocamin + 20ml nước cất, dùng dung dịch KMnO4 chuẩn độ đến khi chuyển từ màu xanh đậm sang màu vàng nhạt Làm song song mẫu trắng để kiểm chứng

Hình 2.3 Sự chuyển màu của mẫu phân tích tanin

Tính kết quả

Tanin (%)  

m v

V k a b

.

100





Trong đó:

- V: hệ số pha loãng (100 lần)

- v: tổng thể tích dung dịch mẫu đem phân tích (ml)

- (b-a): hiệu số lượng KMnO4 dùng để chuẩn độ dung dịch pha chế và mẫu trắng (ml)

- k: hệ số tính tanin tương ứng với 1ml KMnO4 (k=0,00583g/l)

- m: trọng lượng mẫu pha chế (g)

2.4.4 Xác đinh hàm lượng chất béo [6]

Nguyên tắc

Dùng petroleum ether để hòa tan tất cả chất béo trong hạt ca cao Để bay hơi hết dung môi ta sấy ở 100-1050C đến khối lượng không đổi, cân và tính hàm lượng béo trong 100g hạt cacao

Tiến hành

Nghiền nhỏ và cân chính xác 10g mẫu đã sấy khô, gói mẫu lại bằng giấy lọc Cho mẫu vào ống chiết soxhlet, lắp bình cầu và ống sinh hàn vào hệ thống Cho dung môi vào khoảng 2/3 bình cầu, cho nước lạnh chảy vào ống sinh hàn Đun cách thủy bình cầu cho đến khi hết chất béo Thời gian đun khoảng 8-12 giờ (trong 1 giờ dung môi tràn từ ống chiết về bình cầu không ít hơn 5-6 lần và không nhiều hơn 8-10 lần) Khi nghỉ đun cần giữ dung môi ngập gói mẫu

Thử xem đã trích ly hết béo chưa bằng cách lấy vài giọt dung môi ở ống chiết nhỏ lên mảnh giấy lọc Để bay hơi hết dung môi, nếu không thấy vết loang thì coi như đã chiết hết béo trong mẫu

Khi dung môi đã chảy hết xuống bình, nhắc gói mẫu ra khỏi ống chiết, rút bình cầu ra để bay hơi hết dung môi ở nhiệt độ thường Cho vào tủ sấy ở nhiệt độ 100-

1050C đến khối lượng không đổi, để nguội trong bình hút ẩm khoảng 30 phút và cân

Hình 2.4 Xác định hàm lượng lipid bằng phương pháp Soxhlet

- m1: khối lượng mẫu trước khi sấy (g)

- m2: khối lượng mẫu sau khi sấy (g)

- m: khối lượng đem phân tích (g)

2.5 Phương pháp đánh giá chất lượng hạt ca cao khô (TCVN 7519:2005) [10]

2.5.1 Kiểm tra cắt hạt

Kiểm tra cắt hạt cho biết sự hiện diện các khuyết tật của hạt ca cao mà nó có thể

là nguyên nhân gây nên mùi vị xấu và nó còn cho biết mức độ lên men của hạt ca cao Mức độ lên men ảnh hưởng rất lớn đến hương vị và chất lượng của ca cao

Các khuyết tật của hạt bao gồm hạt bị chai xám, hạt bị côn trùng cắn phá, hạt lên men quá độ và hạt bị nhiễm mốc Dựa trên tiêu chuẩn quốc tế thì hạt ca cao bị nhiễm nấm mốc không được vượt quá 3%, hạt chai xám không được vượt quá 3% và hạt bị cắn phá do côn trùng, hạt nảy mầm hoặc lép là 3%

Hình 2.5 Bàn cắt magra

2.5.2 Xác định số lượng hạt trong 100 g mẫu

Từ mẫu đã được lấy theo TCVN 7521: 2005 (ISO 2292: 1973), trộn kỹ và chia bốn, lấy hai phần chéo góc hoặc bằng dụng cụ chia mẫu thích hợp, sao cho một phần chỉ vừa khoảng 300 hạt Đếm số hạt nguyên thực tế sau khi đã loại bỏ các hạt lép và hạt vỡ

Cân số hạt nguyên chính xác đến 0,05 g Số hạt có trong 100g được tính:

Số đếm hạt = ố ượ ạ ê

ố ượ ạ ê ∙ 100 Kết quả được lấy đến số nguyên theo qui tắc làm tròn số

2.5.3 Hiệu suất thu hồi hạt ca cao khô

Hiệu suất thu hồi hạt cacao khô được xác định dựa vào khối lượng hạt khô thu được:

Hiệu suất thu hồi = ọ ượ ạ đã ê ơ ô

ọ ượ ủ á ươ ∙100 2.5.4 Xác định tạp chất

Từ mẫu đã được lấy theo TCVN 7521: 2005 (ISO 2292: 1973), trộn kỹ và chia bốn hoặc sử dụng dụng cụ chia mẫu thích hợp

Tách riêng phần tạp chất và cân Lượng tạp chất được tính như sau:

Tạp chất ca cao (%) = ố ượ ạ ấ

ố ượ ẫ ∙100

2.6 Phương pháp xác định mật độ tế bào [4]

2.6.1 Phương pháp đếm tế bào S.cerevisiae

Dùng buồng đếm hồng cầu để đếm tế bào nấm men Số tế bào có trong 1ml mẫu ban đầu được tính theo công thức:

S h

F A

10 25

1000



Trong đó:

- A: số tế bào trong 1 ô

- 1000: hệ số chuyển đổi mm3 sang cm3

- F: hệ số pha loãng

- h: chiều cao buồng đếm, h= 0,1mm

- S: diện tích ô, S= 1/250 (mm)

2.6.2 Phương pháp đếm tế bào vi khuẩn A.aceti

Vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường thạch MRS Sau 48 giờ tiến hành đếm khuẩn lạc, giới hạn tế bào từ 5 đến 300 tế bào Số tế bào đếm được tính theo công thức:

n n d

C N

1 ,

- N: số khuẩn lạc có trong 1ml mẫu huyền phù ban đầu

- C: số khuẩn lạc đếm được trên các hộp petri đã chọn

- n1, n2: số hộp petri ở hai độ pha loãng liên tiếp đã chọn thứ nhất và thứ hai

- d: hệ số pha loãng của độ pha loãng thứ nhất

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả phân tích thành phần hạt ca cao tươi

Bảng 3.1 Kết quả phân tích thành phần hóa học của hạt ca cao tươi (%)

Thành phần (%) Ca cao BRVT Ca cao Bến Tre [1] Ca cao Tây Phi [9]

( Thành phần của ca cao Tây Phi theo F.Hardy, trích dẫn bởi Nguyễn Minh Thủy, 2000)

Dựa vào bảng 3.1, ta thấy hàm lượng chất béo của hạt ca cao tỉnh BRVT là 37,6% cao hơn hàm lượng béo hạt ca cao Tây Phi 31,3% nhưng vẫn thấp hơn hạt ca cao Bến Tre 49,52% Đồng thời, hàm lượng tanin trong hạt ca cao tươi của tỉnh BRVT, chúng tôi khảo sát là 3,8% thấp hơn so với hàm lượng tanin trong hạt ca cao tươi tỉnh Bến Tre (4,21%) và hạt ca cao tươi Tây Phi (5,2%) Ngoài ra, hàm lượng axit tổng của hạt ca cao tỉnh BRVT đạt 0,52% cao hơn so với hàm lượng axit tổng trong hạt ca cao Bến Tre (0,35%) nhưng lại thấp hơn hàm lượng tanin trong hạt ca cao Tây Phi Theo chúng tôi, có nhiều nguyên nhân dẫn đến sự khác biệt trên: do sự khác nhau về khí hậu, kỹ thuật canh tác, giống và thời điểm thu hoạch theo mùa vụ của từng địa phương…, Các yếu tố trên ảnh hưởng đến thành phần hóa học của hạt ca cao tươi như tỉ lệ cơm nhầy, chất béo, tanin… dẫn đến sự khác nhau về chất lượng hạt ca cao bán thành phẩm giữa các vùng, khu vực trên thế giới

3.2 Ảnh hưởng của việc bổ sung nấm men S.cerevisiae vào trong khối ủ lên men

hạt ca cao tươi đến chất lượng hạt ca cao bán thành phẩm

Quá trình lên men hạt ca cao tươi là một khâu quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng hạt ca cao bán thành phẩm, với hàng loạt các phản ứng sinh hóa phức tạp diễn

ra bên trong nhờ hệ vi sinh vật lên men tự nhiên có trong ca cao Điều đó ảnh hưởng rất lớn đến các thông số của khối ủ như nhiệt độ, pH, axit hữu cơ, tanin và một số thành phần khác của khối hạt trong quá trình lên men

Hình 3.1 Sự thay đổi nhiệt độ của khối ủ trong quá trình lên men

Kết quả thực nghiệm hình 3.1 cho thấy rằng mẫu 1, mẫu 2, mẫu 3 có bổ sung

lượng S.cerevisiae tương ứng là 1ml/3kg (mật độ 106 CFU/ml), 3ml/3kg (mật độ 106CFU/ml, 5ml/3kg (mật độ 106 CFU/ml) có nhiệt độ cao hơn mẫu đối chứng trong 3

ngày đầu Mẫu đối chứng không bổ sung S.cerevisiae có sự tăng cao nhiệt độ trong 3

ngày lên men, điều này chứng tỏ đã diễn ra quá trình lên men tự nhiên của hạt ca cao

ở mẫu đối chứng, tăng từ 29,570C đến 42,10C Tuy nhiên, các mẫu có bổ sung

S.cerevisiae với tỉ lệ khác nhau như mẫu 1, mẫu 2, mẫu 3 thì nhiệt độ tăng cao có sự

khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê với độ tin cậy 95%, lần lượt là 43,30C, 47,40C

và 470C Nhiệt độ ổn định và có sự thay đổi không đáng kể trong 2 ngày cuối đạt 45,980C (mẫu 3) Kết quả của chúng tôi khảo sát trong quá trình lên men ủ hạt ca cao tươi tại địa bàn tỉnh BRVT, thấp hơn kết quả nghiên cứu ủ ca cao của Đỗ Thị Ngọc Hân, Đại học Cần Thơ (2009) đạt 480C [1], cao hơn kết quả nghiên cứu ủ ca cao tại

Australia đạt 400C của Graham Fleet và cộng sự (2013) [18] Kết quả của chúng tôi

cũng thấp hơn kết quả nghiên cứu ủ ca cao của M.Ardhana và cộng sự (2003), tại Cộng hòa Dominican đạt 480C sau 48 giờ lên men [16] Ngoài ra một số nghiên cứu

cho rằng việc bổ sung nấm men vào trong quá trình ủ làm tăng nhiệt độ của khối ủ Ngược lại các chất dinh dưỡng trong cơm nhầy tạo điều kiện cho nấm men phát triển

Hình 3.2 Sự thay đổi mật độ S.cerevisiae của khối ủ trong quá trình lên men

Kết quả khảo sát thể hiện trên hình 3.2 cho thấy rằng, sau khi bổ sung

S.cerevisiae vào mẫu 2, mẫu 3 thì sau 24 giờ lên men mật độ S.cerevisiae đạt các giá

trị là 4,84.107CFU/g, 5,04.107CFU/g (không có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống

kê với độ tin cậy 95%) Mẫu 1 cho mật độ S.cerevisiae thấp hơn và đạt giá trị mật độ

là 3,56.107CFU/g, mẫu đối chứng đạt giá trị mật độ thấp nhất là 1,83.107CFU/g sau

24 giờ lên men Sau đó mật độ S.cerevisiae giảm vào các ngày tiếp theo ở tất cả các

mẫu và đạt giá trị thấp nhất sau 120 giờ lên men, mẫu lên men tự nhiên có mật độ nấm men đạt 2,57.106 CFU/g sau 72 giờ lên men Kết quả trên được giải thích như sau:

Khi chưa lên men hạt ca cao tươi chứa 10-15% đường, tạo điều kiện cho vi sinh

vật phát triển trong đó có S.serevisiae Giống nấm men này phát triển trong điều kiện

yếm khí vào giai đoạn đầu của quá trình lên men trong khoảng từ 24-48 giờ, ở giai đoạn này nấm men sử dụng đường để chuyển hóa tạo thành ethanol, CO2, năng lượng

và một số sản phẩm phụ khác Quá trình này sản sinh ra nhiệt lượng là 93,3 KJ Năng lượng sinh ra trong quá trình chuyển hóa đã làm cho nhiệt độ khối ủ tăng

cao Đặc biệt là các mẫu có bổ sung nấm men, theo Ravelomanana và cộng sự (1984)

đã chứng minh rằng nấm men sử dụng tất cả các loại đường đơn để sản sinh ra

C2H5OH và CO2, đây là phản ứng tỏa nhiệt (sinh ra nhiệt lượng 93,3 KJ) dẫn đến